Summary
Kvantitativ matinntaket analyser med farget mat gir robust og høy gjennomstrømming betyr å evaluere fôring motivasjon. Kombinere mat forbruk analysen med thermogenetic og optogenetic skjermer er en effektiv tilnærming til å undersøke nevrale kretser underliggende appetitt i voksen Drosophila melanogaster.
Abstract
Matforbruk er under stram kontroll av hjernen, som integrerer den fysiologiske status, palatability og ernæringsmessige innholdet av mat og problemer-kommandoer for å starte eller stoppe fôring. Tyde prosessene underliggende beslutningsprosessen betimelig og moderat fôring bærer store konsekvenser i vår forståelse av fysiologiske og psykologiske sykdommer relatert til fôring kontroll. Enkel, kvantitative og robust metoder er pålagt å måle mat inntak av dyr etter eksperimentelle manipulasjon, for eksempel øke makt aktivitetene til visse mål neurons. Her introdusert vi fargestoff-merking-baserte fôring analyser for å lette neurogenetic studiet av fôring kontroll i voksen frukt fluer. Vi se tilgjengelige fôring analyser og deretter beskriver vår metoder trinnvise fra oppsettet for analyse, som kombinerer thermogenetic og optogenetic manipulering av neurons kontrollere fôring motivasjon med fargestoff-merket mat inntak analysen. Vi diskuterer også fordeler og begrensninger av våre metoder, sammenlignet med andre fôring analyser, å hjelpe leserne velge en passende analysen.
Introduction
Kvantifisere mengden mat inntak er viktig for å vurdere flere aspekter av fôring kontroller av hjernen i å svare på de interne behov (for eksempel sult stater) og eksterne faktorer (som mat og palatability)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. i de siste årene, innsatsen til tyde nevrale substrater av fôring kontroll i Drosophila føre til utviklingen av flere analyser direkte kvantifisere mengden mat inntatt eller tjene som en indikator på fôring motivasjon 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
Kapillær mater (CAFE) analysen12,13 ble utviklet for å måle mengden av forbruk av væsken mat i et glass microcapillary. CAFE analysen er svært sensitive og reproduserbar17 og forenkler måling av matforbruk, spesielt for kvantifisere langsiktige fôring18. Denne analysen krever imidlertid fluene å klatre til spissen av microcapillary og fôr opp-ned, som passer ikke for alle stammer. I tillegg fordi fluene skal testes med CAFE analysen har ekteskapsløftene på flytende mat, gjenstår effekten av disse oppdrett forholdene på metabolisme status eller potensielle underernæring for å bli bestemt.
Snabel forlengelsen svar (PER) analysen11,14 teller svarfrekvensen snabel forlengelsen mot mild innslag mat dråper. PER analysen viste seg som en utmerket måte å evaluere fôring personlige fly og esler påvirkning av palatability og innhold mat18,19. Men er det ikke en direkte kvantifisering av inntak beløp.
Nylig ble en halvautomatisk metode, manuell mating analysen (MAFE)15, utviklet. I MAFE mates en enkelt immobilisert fly manuelt med et microcapillary som inneholder mat. Gitt at snabel forlengelsen svar og matforbruk kan overvåkes samtidig, er MAFE egnet for å vurdere næringsstoffer verdier og effekten av farmakologiske manipulasjon. Imidlertid kan immobilizing et fly negativt påvirke sin opptreden ytelse, inkludert fôring.
I tillegg fly snabel og aktivitet detektor (FlyPAD)10 ble utviklet for å automatisk kvantifisere fôring atferd. Bruker maskinen visjon metoder, poster FlyPAD fysisk interaksjon mellom fly og mat å kvantifisere hyppighet og varighet av snabel utvidelser som indikator for fôring motivasjon. FlyPAD gir en høy gjennomstrømming tilnærming til å overvåke fôring atferd av et fritt bevegelige fly, selv om den sensitivitet og robusthet av dette systemet gjenstår for å bekreftes av flere studier12.
Merking strategier brukes ofte til å estimere mat inntak i fluer. Det er vanlig å merke mat med kjemiske tracers og, etter mating, måle mengden av inntatt tracer til å beregne mengden av matinntaket. Radioaktivt tracers16,17,20,21,22,23,24,25 tillater påvisning gjennom cuticle uten homogenisering fluene. Denne metoden gir usedvanlig lave variasjon og høy følsomhet18, og mulig for langsiktige studier av matinntaket. Men bør tilgjengeligheten av brukbare radioisotopes og ulike priser absorbansen og ekskresjon tas i betraktning når du arbeider med denne analysen.
Merking og spore matinntaket med giftig mat farger er en tryggere og enklere alternativ2,3,26,27,28. Fluene er homogenisert etter fôring med mat som inneholder løselig og ikke-absorberbare fargestoffer, og mengden av inntatt fargestoff er senere kvantifisert bruker et spektrofotometer3,24,28,29 . Merking strategien er enkel å utføre og gir høy effektivitet, men med en påminnelse. Volumet av matinntaket beregnet fra inntatt fargestoff er mindre enn det faktiske volumet fordi utskillelse begynner så tidlig som 15 min etter fluer startfôring17. I tillegg vurderer analysen mat inntak vanligvis innen en 60 minutters periode, som er kun egnet for undersøkelse av kortsiktige fôring atferd24,28. Dessuten parret flere interne og eksterne faktorer, for eksempel genotype17, kjønn17, staten17, oppdrett tetthet30, døgnrytmen31,32og mat kvalitet3 , 8 , 16, innflytelse matinntaket. Fôring varigheten må derfor kan justeres i henhold til bestemte eksperimentelle forhold. I tillegg til å tilrettelegge kvantifisering av matinntak, brukes også mat farger å vurdere mat valg2,19,27, og visualisere meniscus i en microcapillary i CAFE analysen12.
Her introduserer vi en protokoll kombinert manipulering av neuronal aktivitet med fargestoff-merking tilnærming. Denne strategien har vist seg nyttig i vår neurogenetic studie om fôring kontroll i voksen frukt fluer24. Den visuelle scoring metoden tillater en rask estimering av matforbruk; Dermed er det nyttig for screening gjennom et stort antall stammer i tide. Kandidater fra skjermen analyseres deretter i detalj ved hjelp av en kolorimetrisk metode mål og presis kvantifisering i flere studier.
Foruten de fôring analyser beskriver vi også thermogenetic27,33,34,35 og optogenetic36 metodene for aktivering makt mål nerveceller i Drosophila. Aktiverer nerveceller ved thermogenetic drift er enkelt og bekvemt med Drosophila forbigående reseptor potensielle Ankyrin 1 (dTRPA1), som er en temperatur - og spenning-gated kasjon kanal som øker neuronal excitability når omgivende temperaturen stiger over 23 ° C33,37; men kan tester dyr ved høye temperaturer produsere bivirkninger på atferd. En annen effektive tilnærmingen å aktivere nerveceller i Drosophila bruker optogenetics med CsChrimson36, som er en rød-skiftet variant av channelrhodopsin som øker excitability av neurons når de utsettes for lys. Optogenetics tilbyr høyere midlertidig løsning og mindre forstyrrelser til atferd enn thermogenetics. Kombinere kvantitativ måling av matinntaket med manipulering av neuronal aktivitet representerer en effektiv tilnærming for å studere nevrale mekanismer av fôring.
Vi beskriver i detalj utarbeidelse av fôring kammeret og fluene skal testes. Bruker Taotie-Gal4 flyr som en modell24, beskriver vi aktivere neurons av thermogenetics og optogenetics. To analyser for kvantifisering av matforbruk med fargestoff-merket mat er også beskrevet i protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargjør fôring kammeret
Merk: Fôring kammeret for fargestoff-merking fôring analysen består av to deler: utenfor beholderen (som et lokk) og innsiden beholder (som matkilde).
- Endre beholderen utenfor fra et hetteglass for dyrking Drosophila (en indre diameter 31,8 mm) og en høyde på 80 mm (figur 1A, 1 C). Dekke bunnen av beholderen med et lag av 1% agarose (5 mL) å holde fôring oppsettet riktig fuktet og tjene som en myk underlaget for fluene til å gå på (figur 1B). Beholderen gir dermed en kontrollert, men naturalistiske innstilling bærer med minimal belastning eller forstyrrelse å fluene.
- Forberede utenfor beholderen. Avbryte 0,5 g agarose 50 mL av dobbel destillert vann, varme med hyppige agitasjon, og kok for å oppløse helt på en magnetisk rørestang med en varme plate.
- Når 1% agarose kjøler til ca 60 ° C, overføre 5 mL 1% agarose til en tom utenfor beholderen (figur 1B), og la beholderen åpent til kjølt ned til romtemperatur å gi en agarose pad.
- Forberede fargestoff-merket mat. Sammensetningen av fargestoff-merket maten varierer med ulike eksperimentelle formål. Her er et eksempel på forbereder fargestoff-merket mat som inneholder bare sukrose.
- Legge til 0,5 g agarose 50 mL av dobbel destillert vann, varme med hyppige agitasjon, og kok for å oppløse helt på en magnetisk rørestang med en varme plate.
- Når over 1% agarose kjøler til ca 60 ° C, legge 1.71 g av sukrose til agarose å få 100 mM sukrose.
- Legge til 0,25 g av Blåfarge fargestoff (erioglaucine disodium) agarose løsningen å skaffe 0,5% (w/v) fargestoff-merket mat.
- Forberede innsiden beholder. Sette tomme i beholdere på en flat horisontal overflate, og deretter legge 750 µL av blått fargestoff-merket mat til individuelle mat container, la det stivne i minst 5 minutter.
Merk: Innsiden beholderen er en liten plast parabol med en indre diameter 13.6 mm og en høyde på 7,5 mm (figur 1A, 1 C). Det er fylt med fargestoff-merket mat, og er deretter plassert i midten av agarose puten til beholderen utenfor. - Overføre en fylte inne beholderen til en forberedt utenfor beholder og plasser det i midten av agarose puten. La fôring kamrene åpent ved romtemperatur for 40 min til veggen av utenfor beholderen er fri for kondens.
Merk: Den tørre veggen er nødvendig for å hindre fluene fra å bli sittende fast på veggen ved å kontakte vanndråper. - Forberede fôring kamre med fargestoff-fri mat (samme sammensetning men uten farge) for bakgrunnen subtraksjon.
2. forberedelse av fluer
Merk: Voksen kvinne flyr 5 til 10 dagers etter eclosion er vanligvis brukt for fôring analyser. Det anbefales å forberede flyr av ulike genotyper, inkludert genetisk kontroller, og teste parallelt. 20 fluer (fra en fôring kammer) genererer ett datapunkt.
- Vurdere befolkningstettheten for oppdrett voksen fluer. Vanligvis kontrollere befolkningstettheten ved varierende antall foreldrenes fluer i henhold til stammene og dimensjoner på kultur flasker. Som et eksempel, overføre 15 menn og 30 kvinner i Canton-S til en kultur flaske med (31,8 mm diameter) og en høyde på 80 mm og la kvinner å legge egg for en dag så fjerne voksen fluer.
- Forberede fluer thermogenetic aktivisering.
- Bruk det Gal4/UAS system38 å uttrykke dTRPA133 i ulike neurons ved krysset UAS-dTrpA1 flyr med forskjellige GAL4 driveren linjer (figur 2B).
- Holde voksne fluene på standard mat på 22 ° C, 60% relativ fuktighet og en 12 h/12 h lys og mørke syklus.
- To dager før fôring analysen, sortere og samle fluer på en CO2 fly pute under stereo mikroskop i fersk mat ampuller og holde en tetthet av 20 fluer per medisinglass.
- Forberede fluer optogenetic aktivisering.
- Bruk det Gal4/UAS system38 å uttrykke CsChrimson36 i ulike neurons ved krysset UAS-CsChrimson fluer med forskjellige GAL4 driveren linjer.
- Samle nylig eclosed (innen 24 timer) fluer og overføre dem til ampuller med standard mat som inneholder 400 µM all-trans-retinal.
- For å hindre tidlig aktivering, vikle oppdrett hetteglass med aluminiumsfolie og deretter sette dem inn i en mørk for å beskytte flyr fra uønsket lys stimulering. Holde fluene ved 25 ° C, 60% fukt i mørket for 4-6 dager.
- To dager før fôring analysen, flyr Sorter kvinnelige på CO2 fly pute under stereo mikroskop. Samle 20 fluer i ett mat medisinglass og holde dem i mørket før fôring testen.
- Utføre alle operasjoner under svakt lys så raskt som mulig for å unngå effekten forårsaket av omgivelseslys. Bruk en LED-lampe plassert langt fra arbeidsområdet, intensiteten på arbeidsområdet er 5 µW/cm2.
Merk: Bruk sultet Canton-S flyr som en positiv for fôring analysen. Frata disse fluer mat og vedlikehold på 1% agarose for 24 timer før fôring testen. Nivåene av matforbruk av disse fluer å vurdere de daglige svingningene.
3. thermogenetic aktivisering
- Utføre alle fôring eksperimenter på samme tid av dagen, Zeitgeber tid 4-631,32, for å minimere variasjoner på grunn av biologiske rytmer.
- Forberede en inkubator (eller et lite rom med en temperatur-kontrollerte Varmeapparat) som varme miljø.
- Før atferdsmessige eksperimenter, equilibrate forberedt fôring kamrene ved eksperimentelle temperatur (30 ° C) 2 h å sikre temperaturen er relativ uniform i fôring kammeret.
- Start fôring prosessen, nøye overføre 20 fluer fra deres hjem ampullen i en forvarmet fôring kammer av milde tappe. Fortsette mate prosessen på 30 ° C for 60 min ( figur 3A) .
Merk: Hyppig agitations, bør slik som åpne og lukke inkubator døren, påvirke fôring atferd, dermed minimaliseres. - Opphøre mate for 60 min ved å fryse fôring chambers på-80 ° C (eller 20 ° C) i 30 min.
Merk: Frysing bidrar til å stoppe feedings i alle kamrene samtidig. Frysing fluer-80 ° c tjener to formål, for euthanizing fluene og lagring inntil homogenisering for opptil en uke. - For temperatur kontrollgruppe, overføre 20 flyr til romtemperaturen fôring kammer med fargestoff-farget mat systemfeilkoden fôring på 22 ° C for 60 min.
- Opphøre mate av gruppen temperatur kontroll ved å fryse chambers på-80 ° C (eller 20 ° C) i 30 min.
4. Optogenetic aktivisering
- Utføre alle fôring eksperimenter på samme tid av dagen, Zeitgeber tid 4-631,32, for å minimere variasjoner på grunn av biologiske rytmer.
- Nøye overføre 20 flyr fra en flaske til en fôring kammer av milde tappe, og deretter sette kammeret sidelengs på belysning oppsett (figur 4A, 4B).
- Optogenetic manipulasjon, bruker en rekke orange lysdioder (607 nm) som kilden til lys stimulering og fikse en vannrett pleksiglass plate ovenfor lysdioder å støtte fôring chambers under belysning. Beholde oppsettet i en inkubator ved 25 ° C med 60% fukt (figur 4A, 4B).
- Stimulere genetisk kontroll fluene parallelt med den Taotie > CsChrimson flyr, men i ulike fôring kamre.
- Fortsette mate prosessen for 60 min med tilbake belysning av oransje lys.
- Bestemme de optimale belysning intensiteter for optogenetics eksperimentelt36. For den Taotie > CsChrimson fluer, en intensitet av 2.2 mW/mm2 induserer lammelse (opphør av bevegelse) og tap av postural kontroll, derfor, bruke en mellomliggende intensitet av 0,1 mW/mm2 for å stimulere Taotie > CsChrimson flyr under fôring testen.
- Opphøre mate ved å fryse fôring chambers på-80 ° C (eller 20 ° C) i 30 min.
5. visuelle estimering av matforbruk
Merk: Den visuelle scoring tilnærmingen gir en semi kvantitative estimering av mat forbruk. Selv om det ikke er så objektiv som metoden optisk, kan denne metoden gå gjennom en rekke fly stammer i tide, slik at det passer for første runde av en genetisk skjerm å raskt begrense listen over kandidater for ytterligere tester.
- Etter fôring prosessen, bedøve og score fluene på en CO2 fly puten under stereo mikroskop. Gi individuelle score til hvert fly basert på volum og intensitet av fargestoff-farget mat i buken (figur 2A).
Merk: Kriterier for visuell vurdering: score systemet har 4 matinntaket tilsvarer ulike volumer og intensiteter av farget mat i magen.- Score flyr uten synlig fargestoff-farget mat skåren 0; gi de med svak (knapt påvisbare) blå farge eller med fargestoff-farget mat opptar mindre enn en tredjedel av volumet av magen en score på 1.
- Score flyr med intens fargestoff-farget mat opptar halvparten av magen en score på 2.
- Resultat de med intens farget innhold har større enn halvparten av magen en score på 3 (figur 2A).
- Beregne andelen av fluer med ulike score i hver eksperimentelle tilstand (figur 2B).
6. kolorimetrisk kvantifisering av matforbruk
- Etter opphør av fôring, helle ut alle 20 flyr fra en fôring kammer på et stykke veier papir og deretter overføre dem til en 1,5 mL tube med en myk børste.
Merk: Ikke ta alle kamrene av-80 ° C lagring samtidig unngå fluer stikker til chamber veggen på grunn av vann kondens på kalde kammeret. - Legg til 500 µL av PBST til røret og homogenize fluene bruker en sliping mill på 60 Hz for 5 s.
- Bekreft tilstrekkelig homogenisering ved observasjon når det er ingen påvisbare fragmenter av kroppsdeler.
- Spinne rør med homogenates i 30 min 13.000 RPM fjerne rusk.
- Etter sentrifugering, overføre 100 µL av nedbryting til et godt av en 96-brønns plate.
- Etter alle prøvene er lastet, setter platen inn en plate leseren å måle absorbansen prøvene på 630 nm.
- Fjerne bakgrunnen absorbansen, trekke absorbansen av supernatants fra fluer matet på mat uten fargestoff fra absorbansen av nedbryting fra blå mat-matet fluene.
Merk: Dette trinnet er valgfritt, avhengig av komposisjonene til maten brukes. Når et fly mat (uten fargestoff) genererer absorbans ved 630 nm, er det nødvendig å utføre dette trinnet for å fjerne bakgrunnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thermogenetic skjermen.
Unormalt økt appetitt forårsaker opphøyet matinntak, uavhengig av fysiologiske behov. Vi utnyttet denne ordningen til å utforme en høy gjennomstrømming atferdsmessige skjermen å få genetisk håndtak av neurons knyttet til å sult og mett stater (figur 1). Skjermen ga Taotie-Gal424. Når Taotie-Gal4 neurons ble tvangsflyttet aktivert ved 30 ° C, den Taotie > TrpA1 flyr inntatt større mengder mat enn kontrollene (figur 2, Figur 3).
Visuelt scoring matforbruk.
Fordi noen signalstoffer og neuropeptides har blitt vist i regulering av fôring atferd, har vi testet de tilsvarende GAL4 linjene, inkludert NPF20, sNPF39, octopamine21, dopamin27, 40, serotonin41,42, AKH35og Dilp27,8,35. For å kvantifisere fôring svaret, vi visuelt inspisert og scoret fluer med forskjellige mengder synlig fargestoff i tarmen (figur 2A). Etter aktivering av Taotie neurons, ca 58% av Taotie > dTrpA1 fluer utstilt sterk fôring atferd og 23% av disse viste mild fôring atferd (figur 2B). Derimot bare marginale fôring atferd ble observert i fluer med andre neurons aktivert via dTrpA1 (figur 2B).
Kolorimetrisk kvantifisering av matinntaket.
For å kvantifisere matinntaket med høy presisjon og objektivitet, målt vi absorbansen fly utvinning på et bestemt bølgelengde til ekstra farge i mat2,27,28. For å sammenligne en absorbansen verdi med volumet av inntaket av mat, en standardkurve ble oppnådd ved å måle absorbansen utvalg løsninger (samme bufferen for homogenisere fluene, PBST) blandet med ulike mengder fargestoffer). Som våre resultater viser, aktivert akutt Taotie-GAL4 neurons av TRPA1 dramatisk økt matinntaket sammenlignet med genetisk kontroll og temperatur kontrollen i samme testperioden (figur 3B), tyder på at Taotie-GAL4 merket neurons delta i regulering av matinntaket av voksen Drosophila.
Optogenetic aktivisering å fremme matinntak i Drosophila.
Vi brukte UAS -CsChrimson for å aktivere Taotie neurons ved belysning med en oransje lys36 (figur 4A, 4B). Når Taotie > CsChrimson fluer ble stimulert av LED-lys på 607 nm, de inntatt betydelig mer mat enn kontroller (figur 4C). Videre mengder inntatt mat korrelert med intensiteten av stimulering lys (Figur 4 d). Dermed tillegg thermogenetics med dTrpA1 fremmer optogenetic aktivisering med CsChrimson i Taotie neurons også fôring motivasjon i satiated fluer.
Figur 1 . En fôring paradigmet for å analysere appetitt i voksen fluer. (A) fôring kammeret inneholder en innvendig container fylt med fargestoff-farget mat og en utenfor container fylt med 1% agarose. Fra venstre til høyre, innsiden beholderen utenfor beholderen og komplett fôring kammeret. (B) innsiden beholder sitter på toppen av agarose pad nederst utenfor beholderen. (C) ovenifra fôring kammeret. (D) en skjematisk viser "appetitt skjermen" eksperimentet. Normal satiated fluer spiste sjelden mat (venstre medisinglass), mens makt aktivere visse fôring kontroll neurons forårsaket satiated flyr til ingest ekstra mat, dermed viser fargestoff-farget mat i magen (høyre medisinglass). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Visuell vurdering av mat inntak. (A) Exemplar bilder for å vise vilkårene for scoring mat innhold i magen. (B) distribusjon av fôring score i fluer med angitte neurons aktiveres av dTrpA1 på 30 ° C. No-Gal4: UAS-dTrpA1 (genetisk kontroll); NPF-GAL4: neuropeptide F positiv neurons; sNPF-GAL4: kort neuropeptide F positiv neurons; TDC1-GAL4 og TDC2-GAL4: octopamine neurons; TH-GAL4: dopamin neurons; 5-HT: serotonin neurons; AKH: adipokinetic hormon positiv neurons; dip2: insulin-lignende peptid 2 positiv neurons; Taotie-GAL4: Taotie-GAL4 etiketter neurons (n = 120 fluer per betingelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Thermogenetic-aktivering av Taotie neurons øker matforbruk i voksen fluer. (A) et bilde viser oppsettet av thermogenetic aktivisering eksperimentet. Fôring testen ble utført i en inkubator på 30 ° C. (B) matforbruk av kolorimetrisk kvantifisering i satiated fluer testet 30 ° C eller 22 ° C 1t. Hvor mye matforbruk av en enkelt fly ble beregnet fra det 20 fluer i en fôring kammer (n = 6). født angir ikke signifikant (p > 0,05); p < 0,001. Enveis ANOVA fulgte med Tukey's post hoc test ble brukt til å analysere flere sammenligninger. Feilfelt viser gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Optogenetic-aktivisering Taotie neurons øker mengden av matinntaket på en intensitet-avhengige måte. (A, B) To visninger av oppsettet for optogenetic aktivisering. Fôring chambers ble lagt sidelengs på en støtte plate og opplyst fra bunnen av en rekke orange lysdioder. Forsiden av boksen belysning var fjernet for å vise innsiden lysdioder. Atferdsmessige forsøkene ble utført i en inkubator ved 25 ° C, 60% RH. (C) matforbruk av satiated flyr av angitte genotyper når testet under optogenetic belysning eller i mørket 1t (n = 6). (D) mat inntak av mett Taotie > CsChrimson fluer var korrelert med belysning intensitet (n = 6). født angir ikke signifikant (p > 0,05); p < 0,001, enveis ANOVA fulgte med Tukey's post hoc test ble brukt til å analysere flere sammenligninger, Student t-test for to gruppe sammenligninger. Feilfelt viser gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapporten fokuserer på teknisk prosessen med fargestoff-merking fôring analyser mat forbruk i konteksten av thermogenetic og optogenetic aktivisering å manipulere neurons fôring. Denne enkel og pålitelig protokollen vil bidra til å belyse funksjonen kandidat neurons fôring måle mat preferanse av fluer, og å identifisere romanen spillere i fôring kontroll kretser via fôring-baserte genetisk skjermer24.
Fargestoff merking strategi er mulig i gransker kortsiktige fôring atferd. Fargestoff, erioglaucine disodium, oppløst i og svelget med mat, er en viktig indikator for matforbruk. Deshpande et al. vist at blått fargestoff seg viste ingen innflytelse på mate med både CAFE analysen og radioisotop merking mat inntak analysen17. Tilsvarende indikerte våre PER resultatene (stimulerende fly's Ben med fargestoff-merket eller fargestoff gratis 100 mM sucrose løsning) at fluer utstilt ingen signifikant forskjell i deres reaksjon mot fargestoff-merket eller fargestoff-fri mat. Men er det fortsatt ingen klare data om om fargestoff er smakløs i Drosophila.
Dessuten angitt kritiske trinnene i protokollen, Betal særlig oppmerksomhet til generelt statusen for fluene skal testes. Dessuten blir oppdratt og opprettholdt på en ikke-overfylte tetthet, fluene skal håndteres forsiktig, og unngå unødvendig støt eller påkjenninger, for å produsere konsistente fôring resultater.
Fôring paradigmet presenteres her har visse begrensninger. Først kvantifisere vår metoder matforbruk løpet 60 min. En annen metode, for eksempel CAFE, ville være nødvendig for å evaluere mat inntak over lengre perioder, for eksempel en dag. Andre er sammenlignet med kvantifisering metoder med radioisotopes, kolorimetrisk metoden mindre sensitive og vanskelige å løse forskjeller når mengder matforbruk er lave. Tredje, vurderer at noen fluer ville begynne å lade så tidlig som 15 min etter starten av fôring, denne protokollen faktisk måler av matinntaket og ekskresjon i en befolkning17. Fjerde, den kolorimetrisk kvantifiseringen av matinntaket beskrevet her var for en fly gruppe, beregning av mat inntak av en enkelt fly avhenger av andre fôring analyser, for eksempel radioisotop merking, MAFE analysen eller FlyPAD. Likevel visse fordeler av kolorimetrisk kvantifisering av matinntak, som er en enkel, stabil, synlig og høy gjennomstrømming metode, gjør det et førsteklasses valg for kvantifisering av mange stammer, spesielt for fôring-baserte genetisk skjermer og oppfølging studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet var støttes delvis av nasjonale grunnleggende forskning Program i Kina (2012CB825504), National Natural Science Foundation i Kina (91232720 og 9163210042), kinesiske Academy of Sciences (CAS) (GJHZ201302 og QYZDY-SSW-SMC015), Bill og Melinda Gates Foundation (OPP1119434) og 100-talenter programmet for ca Y. Zhu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels - Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
