Summary
Kvantitative fødeindtagelse assays med farvet mad giver en robust og høj overførselshastighed betyder at evaluere fodring motivation. Kombinere mad forbrug assay med thermogenetic og optogenetic skærme er en kraftfuld tilgang til at undersøge de neurale kredsløb underliggende appetit i voksen Drosophila melanogaster.
Abstract
Fødevareforbrug er under stram kontrol af hjernen, som integrerer de fysiologiske status, smagen og ernæringsmæssige indhold i fødevarer og spørgsmål kommandoer til at starte eller stoppe fodringen. Decifrere de processer, der ligger til grund for beslutningstagningen af rettidig og moderat fodring bærer store konsekvenser i vores forståelse af fysiologiske og psykologiske lidelser relateret til fodring kontrol. Enkel, kvantitative og robuste metoder er forpligtet til at måle mad indtagelse af dyr efter eksperimentel manipulation, som med magt stigende aktiviteter af visse mål neuroner. Her, indført vi dye-mærkning-baseret fodring assays for at lette den neurogenetic undersøgelse af fodring kontrol i voksen bananfluer. Vi gennemgå tilgængelige fodring assays, og derefter beskrive vores metoder trin for trin fra opsætning til analyse, som kombinerer thermogenetic og optogenetic manipulation af neuroner kontrollerende fodring motivation med farvestof-mærket mad indtag assay. Vi diskuterer også de fordele og begrænsninger af vores metoder, sammenlignet med andre fodring assays, til at hjælpe læserne med at vælge en passende analyse.
Introduction
Kvantificering af mængden af mad, der indtages er vigtig for evaluering af flere aspekter af fodring kontrol af hjernen i at reagere på interne behov (såsom sult stater) og eksterne faktorer (som fødevarekvalitet og smagen)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. i de seneste år, bestræbelser på decifrere de neurale substrater af fodring kontrol i Drosophila føre til udviklingen af flere assays til direkte at kvantificere mængden af mad indtages eller tjene som en indikator for fodring motivation 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
Kapillar FEeder (CAFE) assay12,13 blev udviklet til at måle mængden af forbrug af flydende mad i et glas microcapillary. CAFE assay er meget følsomme og reproducerbare17 og forenkler måling af forbruget af fødevarer, især for kvantificering langsigtede fodring18. Denne analyse kræver imidlertid fluer til at klatre på spidsen af microcapillary og feed hovedet, der er ikke egnet til alle stammer. Derudover fordi fluer skal testes ved hjælp af CAFE analysen skal opdrættes på flydende fødevarer, henstår effekten af disse opdræt betingelser på stofskifte status eller de potentielle underernæring bestemmes.
Snabel udvidelse svar (PER) assay11,14 tæller hyppigheden af Snabel udvidelse svar mod blid hånd mad dråber. PER Analysen viste sig som en glimrende måde at evaluere fodring motivation af individuelle fly og æsler indflydelse af smagen og indholdet i mad18,19. Det er imidlertid ikke en direkte kvantificering af indtag beløb.
For nylig, en halvautomatisk metode, manualen fodring assay (MAFE)15, blev udviklet. I MAFE, er en enkelt immobiliseret flue fodret manuelt med en microcapillary indeholdende mad. I betragtning af at Snabel udvidelse svar og fødevareforbrug kan overvåges samtidigt, er MAFE velegnet til vurdering af næringsstof værdier og effekter af farmakologisk manipulation. Dog kan immobilisere en flue negativ indflydelse sine adfærdsmæssige ydeevne, herunder fodring.
Flyver Derudover Snabel og aktivitet detektor (FlyPAD)10 blev udviklet for at automatisk kvantificere fodring adfærd. Bruger maskinen vision metoder, registrerer FlyPAD fysiske interaktioner mellem en flue og fødevarer til at kvantificere hyppighed og varighed af Snabel udvidelser som en indikator for fodring motivation. FlyPAD giver en høj overførselshastighed tilgang til at overvåge fodring adfærd af en fri bevægelse flyve, selvom følsomhed og robusthed af dette system er fortsat at være yderligere bekræftet af flere undersøgelser12.
Mærkning strategier er ofte bruges til at anslå mad indtagelse i fluer. Det er almindeligt at mærke fødevarer med kemiske sporstoffer og efter fodring, måle mængden af indtaget sporstof til at beregne antallet af fødeindtagelse. Radioaktive sporstoffer16,17,20,21,22,23,24,25 give mulighed for afsløring gennem neglebånd uden homogenisering af fluer. Denne metode giver bemærkelsesværdigt lavt variabilitet og høj følsomhed18, og er muligt for langsigtet undersøgelse af fødeindtagelse. Men, tilgængeligheden af anvendelige radioisotoper og forskellige satser af absorbans og udskillelse bør tages i betragtning når du arbejder med denne analyse.
Mærkningsbestemmelserne og sporing fødeindtagelse med giftfri mad farver er et sikrere og enklere alternativ2,3,26,27,28. Fluer er homogeniseret efter fodring med fødevarer, der indeholder opløselige og ikke-resorberbare farvestoffer, og mængden af de indtagne farvestof kvantificeres senere ved hjælp af et spektrofotometer3,24,28,29 . Den mærkning strategi er let at udføre og giver høj effektivitet, men med en advarsel. Omfanget af fødeindtagelse anslået fra den indtagne farvestof er mindre end den faktiske mængde fordi udskillelse begynder så tidligt som 15 min efter fluer begynde at fodre17. Analysen vurderer derudover mad indtagelse typisk inden for en 60-minutters periode, som er kun egnet til undersøgelse af kortsigtede fodring adfærd24,28. Desuden parret flere interne og eksterne faktorer, såsom genotype17, køn17, stat17, opdræt af densitet30, døgnrytme31,32og mad kvalitet3 , 8 , 16, indflydelse fødeindtagelse. Fodring varighed kan derfor skal tilpasses specifikke forsøgsbetingelser. Udover at lette kvantificering af fødeindtagelse, bruges food farver også til at vurdere mad valg2,19,27, og at visualisere menisk i en microcapillary i CAFE assay12.
Her introducerer vi en protokol kombineret manipulation af neuronal aktivitet med farvestof-mærkning tilgang. Denne strategi har vist sig nyttig i vores neurogenetic undersøgelse af fodring kontrol i voksen bananfluer24. Den visuelle scoring metode giver mulighed for en hurtig vurdering af mad forbrug; Det er således nyttigt for screening gennem et stort antal stammer i tide. Kandidater fra skærmen er derefter analyseret i detaljer ved hjælp af en kolorimetriske metode til at give objektive og præcis kvantificering i yderligere undersøgelse.
Udover de fodring assays beskrive vi også thermogenetic27,33,34,35 og optogenetic36 metoderne til fremtvinge aktivering target neuroner i Drosophila. For at aktivere neuroner ved thermogenetic drift er enkel og praktisk med Drosophila forbigående Receptor potentielle Ankyrin 1 (dTRPA1), som er en temperatur - og spænding-gated kation kanal, der øger neuronal ophidselse når det omgivende temperaturen stiger over 23 ° C33,37; men test dyr ved høje temperaturer kan producere bivirkninger på adfærd. En anden effektiv fremgangsmåde til at aktivere neuronerne i Drosophila bruger optogenetics med CsChrimson36, som er en rød-forskudt variant af channelrhodopsin, der øger ophidselse af neuroner når de udsættes for lys. Optogenetics tilbyder højere tidsmæssige opløsning og mindre forstyrrelser i adfærd end thermogenetics. Kombinerer kvantitativ måling af fødeindtagelse med manipulation af neuronal aktivitet udgør en effektiv tilgang til at studere de neurale mekanismer af fodring.
Vi beskriver i detaljer, forberedelse af fodring kammeret og fluer skal testes. Ved hjælp af Taotie-Gal4 fluer som en model24, beskriver vi aktiverende neuroner ved thermogenetics og optogenetics. To assays af kvantificering af mad forbrug med farvestof-mærket mad er også beskrevet i protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af fodring kammer
Bemærk: Fodring salen for dye-mærkning fodring assay består af to dele: uden for containeren (som en dækning) og indvendigt beholder (som fødekilde).
- Ændre den udvendige container fra et hætteglas til dyrkning Drosophila med (indvendig diameter på 31,8 mm) og en højde på 80 mm (figur 1A, 1 C). Dække bunden af beholderen med et lag af 1% Agarosen (5 mL) til at holde den fodring setup korrekt fugtet og tjene som en blød substrat for fluer til at gå på (figur 1B). Beholderen er dermed kontrolleret men naturalistiske omgivelser transporterer med minimal stress eller forstyrrelse at fluerne.
- Forberede den eksterne beholder. Suspendere 0,5 g Agarosen i 50 mL dobbeltdestilleret vand, varme med hyppige agitation, og kog for at opløses fuldstændigt på en magnetomrører med varme plade.
- Når 1% Agarosen køler til ca. 60 ° C, overføres 5 mL 1% Agarosen til et tomt uden for containeren (figur 1B), og lad containeren forblive åbent indtil køles ned til stuetemperatur til at give en Agarosen pad.
- Forberede dye-mærket mad. Dye-mærket fødevares sammensætning varierer afhængigt af forskellige eksperimentelle formål. Her er et eksempel på forberedelse af dye-mærket mad der indeholder kun saccharose.
- Tilsættes 0,5 g Agarosen til 50 mL dobbeltdestilleret vand, varme med hyppige agitation, og kog for at opløses fuldstændigt på en magnetomrører med varme plade.
- Når de ovennævnte 1% Agarosen køler til ca 60 ° C, skal du tilføje 1,71 g saccharose til Agarosen at opnå 100 mM saccharose.
- Tilføje 0,25 g blå farvestof (erioglaucine dinatrium) til Agarosen løsningen til at opnå 0,5% (w/v) dye-mærket mad.
- Forberede indvendigt beholder. Sætte tomt inde i containere på en plan og vandret overflade, derefter tilføje 750 µL af blå farvestof-mærket mad til enkelte fødevarer beholder, lad den størkne i mindst 5 min.
Bemærk: Indvendigt beholder er en lille plastik skål med indvendig diameter på 13,6 mm og en højde på 7,5 mm (figur 1A, 1 C). Det er fyldt med farvestof-mærket mad, og er derefter placeret i midten af Agarosen pad uden for containeren. - Overføre en fyldt inde i beholderen i en rede uden for beholder og Placer det i midten af Agarosen pad. Lad fodring afdelingerne holde åbent ved stuetemperatur i 40 min. indtil væggen i den eksterne beholder er fri for kondens.
Bemærk: Tør væg er nødvendig for at forhindre fluerne fra at blive hængende på væggen ved at kontakte vanddråber. - Forberede fodring kamre med dye-fri mad (samme sammensætning, men uden farve) for baggrunden subtraktion.
2. forberedelse af fluer
Bemærk: Voksen kvinde flyver 5-10 dage efter eclosion er normalt anvendes til fodring af assays. Det anbefales at forberede fluer af forskellige genotyper, herunder genetiske kontrol, og at teste sideløbende. 20 fluer (fra én fodring afdeling) generere et datapunkt.
- Overveje befolkningstæthed til opdræt af voksne fluer. Typisk, styre befolkningstætheden ved at variere antallet af forældrenes fluer ifølge stammer og dimensioner af kulturen flasker. Som et eksempel, overføre 15 mænd og 30 kvinder i Canton-S til en kultur flaske (diameter 31,8 mm) og højde 80 mm og lad hunner til at lægge æg i en dag og derefter fjerne voksen fluer.
- Forberede thermogenetic aktivering fluer.
- Bruge Gal4/UAS system38 at udtrykke dTRPA133 i forskellige neuroner ved passage UAS-dTrpA1 flyver med forskellige GAL4 driver linjer (figur 2B).
- Holde de voksne fluer på standard mad ved 22 ° C, relativ luftfugtighed 60% og en 12 h/12 h lys-mørke cyklus.
- To dage før fodring assay, sortere og indsamle flyver på en CO2 flyve pad under et stereo mikroskop i en frisk mad hætteglas og holde en tæthed af 20 fluer per vial.
- Forberede optogenetic aktivering fluer.
- Bruge Gal4/UAS system38 at udtrykke CsChrimson36 i forskellige neuroner ved at krydse UAS-CsChrimson fluer med forskellige GAL4 driver linjer.
- Indsamle nyligt eclosed (indenfor 24 timer) fluer og overføre dem til et hætteglas med standard mad der indeholder 400 µM all-trans-retinal.
- For at forhindre for tidlig aktivering, wrap de opdræt hætteglas med aluminiumsfolie og derefter sætte dem ind i en mørk kasse at beskytte fluer fra uønskede lys stimulation. Holde fluerne ved 25 ° C, 60% fugtighed i mørke for 4-6 dage.
- To dage før fodring analysen fluer form kvindelige på CO2 flyve pad under et stereo mikroskop. Indsamle 20 flyver ind i en mad hætteglas og holde dem i mørke før fodring testen.
- Gennemføre alle operationer under svagt lys så hurtigt som muligt for at undgå virkningerne forårsaget af omgivende lys. Bruge en LED lampe placeret langt væk fra arbejdsområdet, intensitet på arbejdsområdet er 5 µW/cm2.
Bemærk: Brug hungrende Canton-S flyver som en positiv kontrol for fodring analysen. Fratage disse fluer af fødevarer og vedligeholde på 1% Agarosen i 24 timer før fodring testen. Niveauer af mad forbrug af disse fluer hjælpe med at vurdere de daglige udsving.
3. thermogenetic aktivering
- Udføre alle fodring eksperimenter på det samme tidspunkt på dagen, omkring Zeitgeber tid 4-631,32, for at minimere variationer på grund af døgnrytmen.
- Forberede en inkubator (eller et lille rum med en temperatur-kontrolleret varmelegeme) som varme miljø.
- Blandingen henstår rede fodring afdelingerne på den eksperimentelle temperatur (30 ° C) i 2 h at sikre, at temperaturen er relativ ensartet i fodring salen før adfærdsmæssige eksperimenter.
- For at starte den fodring proces, omhyggeligt overføre 20 fluer fra deres hjem hætteglas ind i en forvarmet fodring kammer af blid aflytning. Fortsætte opfodring ved 30 ° C i 60 min ( figur 3A) .
Bemærk: Hyppige bevægelsen, bør som åbner og lukker døren inkubator forringe fodring adfærd, således minimeres. - Ophøre med fodring på 60 min ved nedfrysning fodring afdelingerne på-80 ° C (eller -20 ° C) i 30 min.
Bemærk: Frysning hjælper til at stoppe fodringer i alle afdelinger samtidig. Frysning fluer ved-80 ° C tjener to formål, for euthanizing fluer og opbevaring indtil homogenisering op til en uge. - For kontrolgruppen temperatur overføre 20 flyver ind i en stuetemperatur fodring kammer med farvestof-farvet mad at starte fodring processen ved 22 ° C til 60 min.
- Ophøre med fodring af gruppen temperatur kontrol ved nedfrysning kamre på-80 ° C (eller -20 ° C) i 30 min.
4. Optogenetic aktivering
- Udføre alle fodring eksperimenter på det samme tidspunkt på dagen, omkring Zeitgeber tid 4-631,32, for at minimere variationer på grund af døgnrytmen.
- Omhyggeligt overføre 20 fluer fra et hætteglas til en fodring kammer af blid aflytning, og derefter sætte i salen sidelæns på belysning setup (figur 4A, 4B).
- Optogenetic manipulation, bruge en bred vifte af orange lysdioder (607 nm) som kilde til lys stimulation, og lave en vandret plexiglas plade over lysdioder til at støtte fodring kamre under belysning. Holde opsætningen i en inkubator ved 25 ° C med 60% fugtighed (figur 4A, 4B).
- Stimulere de genetiske kontrol fluer i parallel med den Taotie > CsChrimson flyver, men i forskellige fodring kamre.
- Fortsætte opfodring processen i 60 min. med tilbage belysning af den orange lys.
- Bestemme optimal belysning støtteintensiteter for optogenetics eksperimentelt36. For den Taotie > CsChrimson fluer, en intensitet på 2,2 mW/mm2 inducerer lammelse (ophør bevægelse) og tab af postural kontrol, derfor, bruge en mellemliggende intensitet på 0.1 mW/mm2 til at stimulere Taotie > CsChrimson flyver under fodring testen.
- Ophøre med fodring af frysning fodring kamre på-80 ° C (eller -20 ° C) i 30 min.
5. visuel vurdering af forbruget af fødevarer
Bemærk: Den visuelle scoring tilgang giver et semi-kvantitative skøn over mad forbrug. Selv om det ikke er så objektiv som den optiske metode, denne metode gør det muligt for at gå gennem et stort antal fly stammer i tide, hvilket gør det velegnet til først runde af en genetisk skærm til hurtigt at indsnævre listen over kandidater til yderligere tests.
- Efter fodring processen, bedøver og score fluer på en CO2 flyve pad under et stereo mikroskop. Give individuelle score til hvert fly, baseret på mængden og intensiteten af dye-farvet mad i sin underlivet (figur 2A).
Bemærk: Kriterier for visuel vurdering: score system har 4 niveauer af fødeindtagelse svarende til forskellige mængder og intensiteter af farvede mad i maven.- Score flyver uden påviselige dye-farvet mad en score på 0; give dem med svag (knap påviselig) blå farvestof eller med farvestof-farvede fødevarer indtager mindre end en tredjedel af mængden af maven en score på 1.
- Score flyver med intens dye-farvede fødevarer indtager halvdelen af maven en score på 2.
- Score dem med intens farvet indhold besætter mere end halvdelen af maven en score på 3 (figur 2A).
- Beregn andelen af fluer med forskellige scores i hver eksperimentelle betingelse (figur 2B).
6. kolorimetriske kvantificering af forbruget af fødevarer
- Efter ophør med fodring, udøse alle 20 fluer fra en fodring kammer på et stykke af vejning papir, derefter overføre dem til en 1,5 mL rør ved hjælp af en blød børste.
Bemærk: Tag alle kamre af-80 ° C oplagring ikke på samme tid at undgå fluer stikning til kammerets væg på grund af kondensvand på den kolde kammer. - Tilsættes 500 µL af PBST til røret og homogeniseres fluer ved hjælp af en slibning mølle ved 60 Hz for 5 s.
- Bekræfte tilstrækkelig homogenisering af observation, når der er ingen påviselige fragmenter af dele af kroppen.
- Spin rør med homogeniseret for 30 min på 13.000 rpm at rydde resterne.
- Efter centrifugering, overføres 100 µL af supernatanten til et godt af en 96-brønd plade.
- Når alle prøver er indlæst, sætter pladen i et Pladelæser til absorbansen af prøverne på 630 nm.
- Hvis du vil fjerne baggrundsabsorbansen, subtrahere absorbansen af analysere fra flyver fodret på mad uden farvestof fra absorbansen af supernatanten fra de blå mad-fed fluer.
Bemærk: Dette trin er valgfrit, afhængigt af sammensætningen af fødevarer anvendes. Når et fly mad (uden farvestof) genererer absorbans på 630 nm, er det nødvendigt at udføre dette trin for at fjerne baggrunden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thermogenetic skærm.
Unormalt øget appetit medfører forhøjede fødeindtagelse, uanset fysiologiske behov. Vi udnyttede denne ordning til at designe en høj overførselshastighed adfærdsmæssige skærmen for at få genetiske håndtag af neuroner i forbindelse med sult og mæt stater (figur 1). Skærmen viste Taotie-Gal424. Når Taotie-Gal4 neuroner med magt blev aktiveret ved 30 ° C, den Taotie > TrpA1 flyver indtagne større mængder af mad end kontrol (figur 2, figur 3).
Visuelt scoring mad forbrug.
Fordi nogle neurotransmittere og neuropeptider har været nævnt i reguleringen af fodring adfærd, har vi testet de tilsvarende GAL4 linjer, herunder NPF20, sNPF39, octopamine21, dopamin27, 40, serotonin41,42, AKH35og Dilp27,8,35. For at kvantificere den fodring svar, vi visuelt inspiceret og scorede fluer med forskellige mængder af påviselige farvestof i tarmen (figur 2A). Efter aktivering af Taotie neuroner, ca. 58% af Taotie > dTrpA1 fluer udstillet stærk fodring adfærd, og 23% af disse viste mild fodring adfærd (figur 2B). Derimod kun marginal fodring adfærd blev observeret i fluer med andre neuroner aktiveret dTrpA1 (figur 2B).
Kolorimetrisk kvantificering af fødeindtagelse.
For at kvantificere fødeindtagelse med høj præcision og objektivitet, målte vi absorbans af flyve ekstraktion ved en bestemt bølgelængde til den tilsat farvestof i fødevarer2,27,28. For at korrelere en absorbans værdi med mængden af indtagelse af fødevarer, en standardkurve er opnået ved måling af absorbansen for prøven løsninger (de samme buffer til homogenisering fluer, PBST) blandet med forskellige mængder af farvestoffer). Som vores resultater viser, aktiveret akut Taotie-GAL4 neuroner ved TRPA1 dramatisk øget fødeindtagelse sammenlignet med genetiske kontrol og temperaturkontrol den samme testperiode (figur 3B), tyder på, at Taotie-GAL4 mærket neuroner deltage i regulering af fødeindtagelse af voksen Drosophila.
Optogenetic aktivering til at fremme fødeindtagelse i Drosophila.
Vi brugte UAS -CsChrimson til at aktivere Taotie neuroner ved belysning med en orange lys36 (figur 4A, 4B). Når Taotie > CsChrimson fluer blev stimuleret af LED lys på 607 nm, de indtages betydeligt mere mad end kontrol (figur 4 c). Derudover mængder af indtaget mad korreleret godt med intensitet stimulation lys (figur 4D). Således, udover thermogenetics med dTrpA1, optogenetic aktivering med CsChrimson i Taotie neuroner også fremmer fodring motivation i mæt fluer.
Figur 1 . En fodring paradigme til at analysere appetit i voksne fluer. (A) fodring salen indeholder en indvendig container fyldt med farvestof-farvet mad og en uden for beholder polstret med 1% agarosegelelektroforese. Fra venstre til højre, indvendigt beholder, den eksterne beholder og komplet fodring kammer. (B) indvendigt beholder sidder på toppen af Agarosen pad nederst i den eksterne beholder. (C) Top view for fodring afdeling. (D) A skematisk viser "appetit skærmen" eksperiment. Normal mæt flyver spiste sjældent mad (venstre vial), under tvinges aktivering af visse fodring kontrol neuroner forårsaget mæt fluer at indtage ekstra mad, således udstiller dye-farvet mad i maven (højre hætteglas). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Visuel vurdering af fødevarer indtagelse. (A) Exemplar billeder for at vise kriterierne for scoring mad indhold i maven. (B) fordelingen af fodring scores i fluer med angivne neuroner at blive aktiveret af dTrpA1 ved 30 ° C. No-Gal4: UAS-dTrpA1 (genetiske kontrol); NPF-GAL4: neuropeptid F positive neuroner; sNPF-GAL4: korte neuropeptid F positive neuroner; TDC1-GAL4 og TDC2-GAL4: octopamine neuroner; TH-GAL4: dopamin neuroner; 5-HT: serotonin neuroner; AKH: adipokinetic hormon positive neuroner; DIP2: insulin-lignende peptid 2 positive neuroner; Taotie-GAL4: Taotie-GAL4 etiketter neuroner (n = 120 fluer per betingelse). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Thermogenetic-aktivering af Taotie neuroner øger fødevareforbruget i voksne fluer. (A) et billede viser opsætningen af thermogenetic aktivering eksperiment. Fodring testen blev udført i en inkubator ved 30 ° C. (B) mad forbrug af kolorimetriske kvantificering i mæt fluer testet på enten 30 ° C eller 22 ° C i 1 h. Mængden af mad forbrug af en enkelt flue blev beregnet fra de 20 fluer i én fodring kammer (n = 6). n.s. angiver ikke signifikant (p > 0,05); p < 0,001. En-vejs ANOVA efterfulgt med Tukey's post hoc test blev anvendt til at analysere flere sammenligninger. Fejllinjer angive gennemsnit ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Optogenetic-aktivering af Taotie neuroner øger mængden af fødeindtagelse på en intensitet-afhængige måde. (A, B) To visninger af opsætningen for optogenetic aktivering. Fodring afdelingerne blev lagt sidelæns på en understøttende plade og belyst fra bunden af en bred vifte af orange lysdioder. Forsiden af boksen belysning er blevet fjernet for at vise indersiden lysdioder. De adfærdsmæssige eksperimenter blev udført i en inkubator ved 25 ° C, 60% RH. (C) mad forbrug af mæt fluer af angivne genotyper når testet under optogenetic belysning eller i mørke for 1 h (n = 6). (D) mad indtagelse af mæt Taotie > CsChrimson fluer var korreleret med belysning intensitet (n = 6). n.s. angiver ikke signifikant (p > 0,05); p < 0,001, en-vejs ANOVA efterfulgt med Tukey's post hoc test blev anvendt til at analysere flere sammenligninger, Student's t-test for to gruppe sammenligninger. Fejllinjer angive gennemsnit ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne betænkning fokuserer på den tekniske proces af dye-mærkning fodring assays af mad forbrug inden for rammerne af thermogenetic og optogenetic aktivisering hen til manipulere neuroner kontrollerende fodring. Denne enkle og pålidelige protokol vil bidrage til at belyse funktionen af kandidat neuroner i fodring kontrol, til at måle mad præferencer af fluer, og til at identificere nye spillere i de fodring kontrol kredsløb via fodring-baserede genetiske skærme24.
Farvestoffet mærkning strategi er muligt undersøge kortsigtede fodring adfærd. Farvestof, erioglaucine dinatrium, opløst i og indtages med mad, er en kritisk indikator for fødevareforbrug. Deshpande et al. demonstreret, at det blå farvestof, sig viste ingen indflydelse på fodring målt ved både CAFE analysen og radioisotop mærkning mad indtag assay17. På samme måde, vores PER resultatet (stimulere den flue ben med farvestof-mærket eller dye-fri 100 mM rørsukkeropløsning) anført, at fluerne udstillet ingen signifikant forskel i deres reaktion mod dye-mærket eller dye-fri fødevarer. Men der er stadig ingen klar data om, hvorvidt farvestoffet er smagløst i Drosophila.
Udover anført de kritiske trin i protokollen, være særlig opmærksom på generelt status af fluer skal testes. Udover at være opdrættet og vedligeholdes på en ikke-overfyldte tæthed, fluer skal håndteres forsigtigt, og undgå unødige stød og understreger, for at fremstille ensartet fodring resultater.
Fodring paradigme præsenteres her har visse begrænsninger. For det første kvantificere vores metoder fødevareforbrug over en periode på 60 min. For at evaluere mad indtag over længere perioder, såsom en dag, ville en anden metode, som CAFE, være nødvendig. Andet, sammenlignet med kvantificering metoder ved hjælp af radioaktive isotoper, den kolorimetriske metode er mindre følsomme og vanskelige at løse forskelle når mængder af mad forbrug er lavt. For det tredje, i betragtning af at nogle fluer ville begynde at decharge så tidligt som 15 min efter start af fodring, denne protokol faktisk måler Nettoresultatet af fødeindtagelse og udskillelse i en befolkning17. For det fjerde var kolorimetriske kvantificering af fødeindtagelse beskrevet her for en flyve gruppe, estimering af fødevarer indtagelse af en enkelt flue afhænger af andre fodring assays, såsom radioisotop mærkning, MAFE assay eller FlyPAD. Dog visse fordele ved kolorimetriske kvantificering af fødeindtagelse, såsom at være en simpel, stabil, synlige og høj overførselshastighed metode, gør det en førsteklasses valg til kvantificering af stort antal stammer, især for fodring-baserede genetiske skærme og de opfølgende undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist understøttet af nationale grundlæggende forskning Program af Kina (2012CB825504), National Natural Science Foundation of China (91232720 og 9163210042), kinesiske akademi for Videnskaber (CAS), (GJHZ201302 og QYZDY-SSW-SMC015), Bill og Melinda Gates Foundation (OPP1119434) og 100-talenter Program af CAS til Y. Zhu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels - Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
