Summary
Kvantitativa mat-intag analyser med färgade mat ger en robust och hög kapacitet innebär att utvärdera utfodring motivation. Att kombinera mat konsumtion analysen med thermogenetic och optogenetic skärmar är en kraftfull metod att undersöka neurala kretsar underliggande aptit i vuxen Drosophila melanogaster.
Abstract
Livsmedelskonsumtion är under tät kontroll av hjärnan, som integrerar fysiologiska status, smaklighet och näringsmässiga innehållet i mat, och problem-kommandon för att starta eller stoppa utfodring. Dechiffrera de processer som ligger bakom beslutsfattande lägligt och måttlig utfodring bär stora konsekvenser i vår förståelse av fysiologiska och psykologiska sjukdomar relaterade till utfodring kontroll. Enkel, kvantitativa och robusta metoder krävs att mäta mat intag av djur efter experimentell manipulation, såsom våld öka verksamheten i vissa mål nervceller. Här, infört vi märkning-färgbaserade utfodring analyser för att underlätta neurogenetic studien av utfodring kontroll i vuxen bananflugor. Vi granskar tillgängliga utfodring analyser, och sedan beskriva vår stegvisa från setup till analysen, som kombinerar thermogenetic och optogenetic manipulation av nervceller som styr utfodring motivation med dye-märkt mat intag analys metoder. Vi diskuterar också de fördelar och begränsningar av våra metoder, jämfört med andra utfodring analyser, att hjälpa läsarna att välja en lämplig analys.
Introduction
Kvantifiera mängden mat som intas är viktigt för att utvärdera flera aspekter av utfodring kontroller av hjärnan i svar på interna behov (till exempel hunger staterna) och externa faktorer (såsom livsmedlens kvalitet och smaklighet)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. under de senaste åren ansträngningar dechiffrera de neurala substratesna av utfodring kontroll i Drosophila leda till utvecklingen av flera analyser direkt kvantifiera mängden mat intas eller fungera som en indikator av utfodring motivation 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
Den kapillära FEeder (CAFE) assay12,13 utvecklades för att mäta mängden konsumtion av flytande livsmedel i ett glas microcapillary. CAFE analysen är mycket känsliga och reproducerbara17 och förenklar mätning av livsmedelskonsumtion, särskilt för att kvantifiera långfristiga utfodring18. Denna analys kräver dock flugor att klättra till toppen av microcapillary och foder uppochner, som inte är lämplig för alla stammar. Dessutom eftersom flugorna till testas med CAFE-analys måste födas på flytande livsmedel, återstår effekten av dessa uppfödningsförhållanden på metabolism status eller potentiella undernäring bestämmas.
Snabel förlängning svar (PER) assay11,14 räknar frekvensen av snabel förlängning svaren mot milda inslag av mat droppar. PER analys som bevisas som ett utmärkt sätt att utvärdera utfodring motivation enskilda fluga och åsnor påverkan av smaklighet och innehållet i mat18,19. Det är dock inte en direkt kvantifiering av intaget belopp.
Nyligen, en halvautomatisk metod, manuell utfodring assay (MAFE)15, utvecklades. I MAFE matas en enda immobiliserade fluga manuellt med en microcapillary som innehåller mat. Med tanke på att snabel förlängning svaren och livsmedelskonsumtion kan övervakas samtidigt, är MAFE lämplig för att bedöma näringsvärden och effekter av farmakologisk manipulation. Dock kan immobilisera en fluga negativt påverka dess beteende prestanda, inklusive utfodring.
Flyger dessutom Snabel och aktivitet detektor (FlyPAD)10 utvecklades för att automatiskt beräkna utfodring beteende. FlyPAD med maskin vision metoder, och registrerar fysisk interaktion mellan en fluga och mat att kvantifiera frekvens och varaktighet av snabel-tillägg som en indikator på utfodring motivation. FlyPAD ger en hög genomströmning strategi att övervaka utfodring beteenden av en gratis-flytta farten, även om känslighet och robusthet av detta system återstår bekräftas ytterligare av mer studier12.
Märkning strategier används ofta för att uppskatta mat intag i flugor. Det är vanligt att märka livsmedel med kemiska spårämnen och, efter utfodring, mäta mängden intas tracer att beräkna kvantiteten av födointaget. Radioaktiva spårämnen16,17,20,21,22,23,24,25 möjliggör detektion genom nagelbanden utan homogenisering av flugor. Denna metod ger anmärkningsvärt låg variabilitet och hög känslighet18, och är genomförbart för långsiktig studie av födointaget. Dock bör tillgängligheten av användbara radioisotoper och olika priser absorbans och utsöndring beaktas när du arbetar med denna analys.
Märkning och spårning födointag med giftfri mat färger är en säkrare och enklare alternativ2,3,26,27,28. Flugor är homogeniserad efter utfodring med mat som innehåller färgämnen lösliga och icke-absorberbara och mängden intas färgämnet kvantifieras senare med en spektrofotometer3,24,28,29 . Märkning strategin är enkel att utföra och ger hög verkningsgrad, men med en varning. Volymen av födointag beräknas från intagna färgämnet är mindre än den faktiska volymen eftersom utsöndring börjar så tidigt som 15 min efter flugor börja mata17. Dessutom bedömer analysen mat intag vanligtvis inom en 60-minuters period, som är avsedd för utredning av kortsiktiga utfodring beteende24,28. Dessutom parad flera interna och externa faktorer, såsom genotyp17, kön17, staten17, uppfödning densitet30, dygnsrytmen31,32och mat kvalitet3 , 8 , 16, inflytande födointag. Därför behöva hela utfodring justeras enligt specifika försöksbetingelser. Förutom att underlätta kvantifiering av födointag, används mat färger också att bedöma mat val2,19,27, och att visualisera menisken i en microcapillary i CAFE assay12.
Här introducerar vi en protokoll kombineras manipulation av neuronal aktivitet med dye-märkning strategi. Denna strategi har visat sig användbar i vår neurogenetic studie på utfodring kontroll i vuxen bananflugor24. Den visuella poängmetoden möjliggör en snabb uppskattning av livsmedelskonsumtion; Därför är det användbart för screening genom ett stort antal stammar i tid. Kandidater från skärmen sedan analyseras i detalj med en kolorimetrisk metod för att ge objektiv och exakt kvantifiering i ytterligare en studie.
Förutom de utfodring analyserna beskriver vi också thermogenetic27,33,34,35 optogenetic36 metoderna och med våld aktivera target nervceller i Drosophila. Aktivera nervceller genom thermogenetic är användningen enkel och bekväm med Drosophila Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (dTRPA1), som är en temperatur - och spänningskänsliga katjon-kanal som ökar neuronal excitabilitet när omgivande temperaturen stiger över 23 ° C33,37; men kan testa djur vid höga temperaturer ge negativa effekter på beteendet. En annan effektiv metod till aktivera nervceller i Drosophila använder optogenetik med CsChrimson36, vilket är en röd-skiftat variant av channelrhodopsin som ökar retbarhet av nervceller när det exponeras för ljus. Optogenetik erbjuder högre temporal upplösning och mindre störningar för beteenden än thermogenetics. Att kombinera kvantitativa mätningen av födointag med manipulation av neuronal aktivitet representerar ett effektivt tillvägagångssätt för att studera de neurala mekanismerna av utfodring.
Vi beskriver i detalj utarbetandet av utfodring kammaren och flugorna som testas. Med Taotie-Gal4 flugor som en modell24, beskriver vi aktiverande nervceller genom thermogenetics och optogenetik. Två analyser av kvantifiering av livsmedelskonsumtion med dye-märkt mat beskrivs också i protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förbereda utfodring kammaren
Obs: Utfodring kammaren för dye-märkning utfodring analysen består av två delar: utanför behållaren (som täcker) och insidan behållare (som näringskälla).
- Ändra utanför behållaren från en injektionsflaska av glas för odling Drosophila (en inre diameter på 31,8 mm) och en höjd av 80 mm (figur 1A, 1 C). Täcka botten av behållaren med ett lager av 1% agaros (5 mL) att hålla den utfodring setup ordentligt fuktad och fungera som en mjuk substrat för flugorna att gå på (figur 1B). Behållaren erbjuder därmed en kontrollerad men naturalistiska miljö med minimal stress eller störningar för flugorna.
- Förbereda behållaren utanför. Avbryta 0,5 g agaros i 50 mL dubbel destillerat vatten, värme med täta agitation, och koka för att lösa upp helt på en magnetomrörare med en värme platta.
- När 1% agaros kyls till ca 60 ° C, överföra 5 mL 1% agaros till en tom utanför behållaren (figur 1B), och låt behållaren håller öppet tills svalnat till rumstemperatur för att ge en agaros pad.
- Förbereda dye-märkt mat. Sammansättning av färgämne-märkt mat varierar mellan olika experimentella syften. Här är ett exempel för att förbereda den dye-märkt mat som innehåller bara sackaros.
- Tillsätt 0,5 g agaros till 50 mL dubbel destillerat vatten, värme med täta agitation, och koka för att lösa upp helt på en magnetomrörare med en värme platta.
- När de ovan 1% agarosen kyls till ca 60 ° C, lägga till Agarens att erhålla 100 mM sackaros 1.71 g sackaros.
- Tillsätt 0,25 g blått färgämne (erioglaucine dinatrium) till agaros lösning 0,5% (w/v) dye-märkt mat.
- Förbereda insidan behållare. Sätt tomt inuti behållare på en plan horisontell yta och sedan lägga till 750 µL av blått färgämne-märkt mat till enskilda matbehållare, låt den stelna i minst 5 min.
Obs: Insidan behållare är en liten plast skålen med en innerdiameter på 13,6 mm och en höjd av 7.5 mm (figur 1A, 1 C). Den är fylld med dye-märkt mat och placeras sedan i mitten av agaros dynan i behållaren utanför. - Överför en fylld inuti behållaren till en beredda utanför behållare och placera det i mitten av agaros pad. Låt utfodring kamrarna hålla öppet i rumstemperatur i 40 min tills väggen i behållaren utanför är fri från kondens.
Obs: Den torra väggen är nödvändigt att förhindra att flugor som fastnat på väggen genom att kontakta vattendroppar. - Förbereda foder kammare med dye-fri mat (samma sammansättning men utan färga) för bakgrunden subtraktion.
2. beredning av flugor
Obs: Vuxen kvinna flyger 5 till 10 dagen efter eclosion normalt används för utfodring analyser. Det rekommenderas att förbereda flugor av olika genotyper, inklusive genetiska kontroller, och testa parallellt. 20 flugor (från en utfodring avdelningen) generera en datapunkt.
- Överväga befolkningstätheten för uppfödning av vuxna flugor. Typiskt, styra befolkningstätheten genom att variera antalet föräldrarnas flugor enligt stammar och dimensioner på kultur flaskor. Som ett exempel, överföra 15 män och 30 kvinnor för Canton-S till en kultur flaska med (31,8 mm i diameter) och en höjd av 80 mm och låt honorna för att lägga ägg för en dag och sedan ta bort vuxen flugor.
- Förbereda flugor för thermogenetic aktivering.
- Använd de Gal4/UAS system38 att uttrycka dTRPA133 i olika nervceller genom korsning UAS-dTrpA1 flugor med olika GAL4 driver linjer (figur 2B).
- Hålla de vuxna flugorna på standard mat vid 22 ° C, 60% relativ luftfuktighet och en 12 h/12 h ljus-mörker cykel.
- Två dagar före utfodring assay, sortera och samla flugor på en CO2 flyga pad under en stereo Mikroskop i en injektionsflaska av färska livsmedel och hålla en täthet av 20 flugor per injektionsflaska.
- Förbereda flugor för optogenetic aktivering.
- Använd de Gal4/UAS system38 att uttrycka CsChrimson36 i olika nervceller genom korsning UAS-CsChrimson flugor med olika GAL4 driver linjer.
- Samla nya eclosed (inom 24 h) flugor och överföra dem till en injektionsflaska med vanlig mat som innehåller 400 µM all-trans-retinal.
- För att förhindra för tidig aktivering, wrap uppfödning injektionsflaskorna med aluminiumfolie och sedan sätta dem i en mörk låda att skydda flugor från oönskat ljus stimulering. Hålla flugorna vid 25 ° C, 60% luftfuktighet i mörkret för 4-6 dagar.
- Två dagar före utfodring analysen, flyger sortera kvinna på CO2 flyga pad under en stereo Mikroskop. Samla 20 flugor i en mat-flaskan och förvara dem i mörkret innan det utfodring testet.
- Utföra alla operationer vid dåliga ljusförhållanden så snabbt som möjligt att undvika de effekter som orsakas av omgivande ljus. Använda en LED-lampa placerad för långt bort från arbetsområdet, intensiteten på arbetsområdet är 5 µW/cm2.
Obs: Använd svalt Canton-S flugor som positiv kontroll för utfodring analysen. Beröva dessa flugor av mat och underhålla på 1% agaros för 24 h före utfodring provningen. Nivåerna av livsmedelskonsumtionen av dessa flugor hjälpa utvärdera de dagliga fluktuationerna.
3. thermogenetic aktiveringen
- Genomföra alla utfodring experiment på samma tid på dagen, runt Zeitgeber tid 4-631,32, för att minimera variationer på grund av dygnsrytmen.
- Förbereda en inkubator (eller ett litet rum med en temperatur-kontrollerad värmare) som uppvärmning miljön.
- Innan beteende experiment, temperera beredda utfodring kamrarna vid experimentell temperatur (30 ° C) för 2 h att säkerställa temperaturen är relativt enhetliga i utfodring kammaren.
- För att starta processen utfodring, noggrant överföra 20 flugor från deras hem injektionsflaska i en förvärmd utfodring kammare genom skonsam att trycka. Fortsätta utfodring vid 30 ° C i 60 min ( figur 3A), .
Obs: Frekventa agitations, bör såsom öppna och stänga den inkubator, negativt påverkar den utfodring beteenden, således minimeras. - Upphöra utfodring på 60 min genom frysning utfodring kamrarna vid-80 ° C (eller -20 ° C) i 30 min.
Obs: Frysning hjälper till att stoppa matning i alla avdelningar samtidigt. Frysa flugor vid-80 ° C tjänar två syften, för euthanizing flugorna och för lagring tills homogenisering i upp till en vecka. - För kontrollgruppen temperatur över 20 flugor till rumstemperatur utfodring kammare med dye-färgad mat att starta utfodring processen vid 22 ° C i 60 min.
- Upphöra utfodring av gruppen temperatur kontroll genom frysning kamrarna vid-80 ° C (eller -20 ° C) i 30 min.
4. Optogenetic aktiveringen
- Genomföra alla utfodring experiment på samma tid på dagen, runt Zeitgeber tid 4-631,32, för att minimera variationer på grund av dygnsrytmen.
- Noggrant överföra 20 flugor från en injektionsflaska i en utfodring kammare av mild avlyssning, och sedan lägga i kammaren i sidled på belysning setup (figur 4A, 4B).
- För optogenetic manipulation, använda en array av orange lysdioder (607 nm) som källa av ljus stimulans, och fixa en horisontell plexiglasskiva ovan lysdioderna att stödja utfodring kammare under belysning. Hålla setup i en inkubator vid 25 ° C med 60% luftfuktighet (figur 4A, 4B).
- Stimulera genetisk kontroll flugorna parallellt med den Taotie > CsChrimson flyger, men i olika utfodring chambers.
- Fortsätt med utfodring processen för 60 min med bakre belysning av orange ljus.
- Avgöra optimal belysning stödnivåerna för optogenetik experimentellt36. För den Taotie > CsChrimson flugor, en intensitet 2,2 mW/mm2 inducerar förlamning (upphörande av förflyttning) och förlust av postural kontroll, därför, använda en mellanliggande intensitet av 0,1 mW/mm2 för att stimulera Taotie > CsChrimson flyger under testet utfodring.
- Upphöra att utfodra genom frysning utfodring chambers vid-80 ° C (eller -20 ° C) i 30 min.
5. visuella uppskattning av livsmedelskonsumtion
Obs: Den visuella poängsystem ger en semikvantitativ uppskattning av mat förbrukningsvärden. Även om det inte är så objektiv som metoden optisk, tillåter denna metod för att gå igenom ett stort antal flyga stammar i tid, vilket gör den lämplig för först omgången av en genetisk skärm att snabbt begränsa listan över kandidater för ytterligare tester.
- Efter utfodring processen, söva och Poäng flugorna på en CO2 flyga pad i stereo Mikroskop. Ge enskilda poäng till varje fluga baserat på volymen och intensiteten i dye-färgad mat i dess buk (figur 2A).
Obs: Kriterier för visuell uppskattning: Poäng systemet har 4 nivåer av födointaget motsvarar olika volymer och intensiteter av färgade livsmedel i buken.- Poäng flugor utan påvisbara dye-färgad mat en poäng på 0; ge de med svag (knappt detekterbara) blått färgämne eller med dye-färgad mat upptar mindre än en tredjedel av volymen av buken till 1 Poäng.
- Poäng flyger med intensiv dye-färgad mat upptar hälften av buken en poäng 2.
- Bra de med intensivt färgat innehåll ockuperar större än hälften av buken en poäng av 3 (figur 2A).
- Beräkna andelen flugor med olika poäng i varje experimentella villkor (figur 2B).
6. kolorimetriska kvantifiering av livsmedelskonsumtion
- Efter upphörande av utfodring, hälla ut alla 20 flugor från en utfodring kammare på en bit väger papper och sedan överföra dem i ett 1,5 mL rör med en mjuk borste.
Obs: Ta inte alla avdelningarnas-80 ° C med lagringsutrymme på samma gång undvika flugor sticker till kammaren väggen på grund av kondens på kalla kammaren. - Tillsätt 500 µL PBST i röret och homogenisera flugor med en slipning kvarn vid 60 Hz för 5 s.
- Bekräfta tillräcklig homogenisering av iakttagelse när det finns inga detekterbara fragment av kroppsdelar.
- Snurra rören med homogenates i 30 min på 13.000 rpm att rensa skräp.
- Efter centrifugering, överföra 100 µL av supernatanten till en brunn av en plattan med 96 brunnar.
- Efter alla prover är lastade, satte plattan i en tallrik läsare att mäta absorbansen av proverna vid 630 nm.
- Ta bort bakgrundsabsorbansen, subtrahera absorbans supernatanterna från flugor utfodras med mat utan färgämne från absorbansen av supernatanten från blå mat matad flugorna.
Obs: Detta steg är valfritt, beroende på sammansättningen av den mat som används. När en fluga mat (utan färgämnet) genererar absorbansen vid 630 nm, är det nödvändigt att utföra detta steg för att eliminera bakgrunden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thermogenetic skärmen.
Onormalt ökad aptit orsakar förhöjda födointag, oavsett fysiologiska behov. Vi utnyttjade detta system att utforma en hög genomströmning beteendemässiga skärmen få genetiska handtag av nervceller i samband med hunger och mätta stater (figur 1). Skärmen gav Taotie-Gal424. När Taotie-Gal4 nervceller aktiverades med våld vid 30 ° C, den Taotie > TrpA1 flyger intagna större mängder mat än kontrollerna (figur 2, figur 3).
Visuellt scoring livsmedelskonsumtionen.
Eftersom vissa signalsubstanser och neuropeptider har angivits i regleringen av utfodring beteende, har vi testat de motsvarande GAL4 raderna, inklusive NPF20, sNPF39, oktopamin21, dopamin27, 40, serotonin41,42, AKH35och Dilp27,8,35. För att kvantifiera den utfodring svaren, vi visuellt inspekterade och gjorde flugor med olika mängder detekterbara färgämne i tarmen (figur 2A). Efter aktivering av Taotie nervceller, ca 58% av Taotie > dTrpA1 flugor uppvisade stark utfodring beteenden, och 23% av dessa visade mild utfodring beteenden (figur 2B). Däremot endast marginell utfodring beteenden observerades hos flugor med andra nervceller som aktiveras via dTrpA1 (figur 2B).
Kolorimetriska kvantifiering av födointag.
För att kvantifiera födointag med hög precision och objektivitet, mätte vi absorbans flyga utvinning vid en våglängd som är specifika till den extra färgämnen i livsmedel2,27,28. För att korrelera ett absorbansvärde med volymen av mat-intag, en standardkurva erhölls genom att mäta absorbansen hos lösningarna som provet (samma bufferten för homogenisering flugor, PBST) blandat med olika mängder av färgämnen). Som våra resultat visar, aktiveras akut Taotie-GAL4 nervceller av TRPA1 dramatiskt ökat matintag jämfört med genetiska kontrollen och temperaturkontrollen under samma testperiod (figur 3B), tyder på att Taotie-GAL4 märkt nervceller delta i regleringen av födointag av vuxen Drosophila.
Optogenetic aktivering för att främja matintag i Drosophila.
Vi använde UAS -CsChrimson för att aktivera Taotie nervceller genom belysning med en orange ljus36 (figur 4A, 4B). När Taotie > CsChrimson flugor stimuleras av LED-lampor på 607 nm, de intas betydligt mer mat än kontroller (figur 4 c). Dessutom mängder intas mat korrelerade väl med stödnivåerna som ljusets stimulering (figur 4 d). Således, förutom thermogenetics med dTrpA1, optogenetic aktivering med CsChrimson i Taotie nervceller främjar också utfodring motivation i mätta flugor.
Figur 1 . En utfodring paradigm för att analysera aptit i vuxna flugor. (A) utfodring avdelningen innehåller en inre behållare fylld med dye-färgad mat och en extern behållare vadderad med 1% agaros. Från vänster till höger, insidan behållare, utanför behållaren och komplett utfodring kammaren. (B), insidan behållaren sitter ovanpå agaros pad på botten av behållaren utanför. (C) ovanifrån av utfodring kammaren. (D) ett Schematisk visar ”aptit skärm” experimentet. Normala mätta flugor åt sällan mat (vänster flaska), medan våld aktivera vissa utfodring kontroll nervceller orsakade mätta flugor att förtära ytterligare mat, således uppvisar dye-färgad mat i buken (rätt flaska). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Visuella uppskattning av mat intag. (A) föredöme bilder för att Visa kriterier för scoring mat innehållet i buken. (B) fördelningen av utfodring noter i flugor med angivna nervceller som aktiveras av dTrpA1 vid 30 ° C. Nr-Gal4: UAS-dTrpA1 (genetisk kontroll), NPF-GAL4: neuropeptid F positivt nervceller; sNPF-GAL4: kort neuropeptid F positivt nervceller; TDC1-GAL4 och TDC2-GAL4: oktopamin nervceller; TH-GAL4: dopaminneuron; 5-HT: serotonin neuroner; AKH: adipokinetic hormon positiva nervceller; DIP2: insulin-liknande peptid 2 positiva nervceller; Taotie-GAL4: Taotie-GAL4 etiketter nervceller (n = 120 flugor per tillstånd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Thermogenetic-aktivering av Taotie nervceller ökar livsmedelskonsumtion i vuxna flugor. (A) en bild visar inställningen av thermogenetic aktivering experimentet. Det utfodring testet utfördes i en inkubator vid 30 ° C. (B) livsmedelskonsumtion genom kolorimetrisk kvantifiering i mätta flugor testade antingen vid 30 ° C eller vid 22 ° C för 1 h. Mängden matkonsumtion av en enda fluga beräknades för 20 flugor i en utfodring kammare (n = 6). n.s. indikerar inte signifikant (p > 0,05); p < 0,001. Envägs ANOVA följt med Tukey's post hoc test användes för att analysera flera jämförelser. Felstaplar visar medelvärde ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Optogenetic-aktivering av Taotie nervceller ökar mängden matintag på intensitet-beroende sätt. (A, B) Två vyer av inställningen för optogenetic aktivering. Utfodring kamrarna lades sidledes på en stödjande tallrik och belysta från botten av en rad orange lysdioder. Framsidan av rutan belysning togs bort för att Visa insidan lysdioder. De beteendemässiga experimenten utfördes inne i en inkubator vid 25 ° C, 60% RH. (C) livsmedelskonsumtion av mätta flugor av angivna genotyper när testas under optogenetic belysning eller i mörkret för 1 h (n = 6). (D) mat intag av mätta Taotie > CsChrimson flugor var korrelerad med belysning intensitet (n = 6). n.s. indikerar inte signifikant (p > 0,05); p < 0,001, envägs ANOVA följt med Tukey's post hoc test användes för att analysera flera jämförelser, Student's t-test för två gruppen jämförelser. Felstaplar visar medelvärde ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna rapport fokuserar på den tekniska processen av färgämne-märkning utfodring analyser av livsmedelskonsumtionen i sammanhanget av thermogenetic och optogenetic aktiveringen att manipulera nervceller styra utfodring. Detta enkla och tillförlitliga protokoll hjälper till att belysa funktionen av kandidat nervceller i utfodring kontroll, att mäta mat preferensen av flugor, och att identifiera nya spelare i utfodring styrkretsarna via utfodring-baserade genetiska skärmar24.
Färgämnet märkning strategi är möjligt utreda kortsiktiga utfodring beteenden. Färgämnet, erioglaucine dinatrium, upplöstes och intas med mat, är en kritisk indikator av livsmedelskonsumtionen. Deshpande et al. visade att den blå färgen själv visade ingen påverkan på utfodring mätt med både CAFE analysen och den radioisotop märkning mat intag assay17. Likaså anges våra PER resultat (stimulera flugans ben med dye-märkt eller dye-fri 100 mM sackaroslösning) att flugor uppvisade ingen signifikant skillnad i sina svar mot dye-märkt eller dye-fri mat. Dock finns det fortfarande inga tydliga uppgifter om huruvida färgämnet är smaklös i Drosophila.
Förutom de kritiska steg som anges i protokollet, särskilt uppmärksamma allmänna statusen för flugorna att testas. Förutom att vara uppfödda och underhålls på ett icke-överfulla densitet, flugorna ska hanteras försiktigt och undvika onödiga chocker eller spänningar, för att ge konsekvent utfodring resultat.
Den matande paradigm som presenteras här har vissa begränsningar. Först, våra metoder kvantifiera livsmedelskonsumtion under 60 min. För att utvärdera mat intag under längre perioder, såsom en dag, skulle en annan metod, till exempel CAFE, behövas. Andra är jämfört med kvantifiering metoder med radioisotoper, den kolorimetriska metoden mindre känsliga och svåra att lösa meningsskiljaktigheter när mängder av livsmedelskonsumtion är låga. För det tredje, med tanke på att några flugor skulle börja ansvarsfrihet så tidigt som 15 min efter starten av utfodring, detta protokoll faktiskt mäter resultatet av födointag och utsöndring i en befolkning17. Fjärde, kolorimetrisk kvantifiering av födointag som beskrivs här var för en fluga grupp, uppskattning av mat intag av en enda fluga beror på andra utfodring analyser, såsom radioisotop märkning, MAFE assay eller FlyPAD. Dock vissa fördelar med kolorimetriska kvantifiering av födointag, såsom att vara en enkel, stabil, synlig och hög genomströmning metod, göra det ett utmärkt val för kvantifiering av stort antal stammar, särskilt för utfodring-baserade genetiska skärmar och de uppföljande studierna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete var stöds delvis av grundläggande forskning Program Kinas nationella (2012CB825504), National Natural Science Foundation Kina (91232720 och 9163210042), Kinesisk Akademi av vetenskaper (CAS) (GJHZ201302 och QYZDY-SSW-SMC015), Bill och Melinda Gates Foundation (OPP1119434) och 100-talanger Program för certifikatutfärdare för att Y. Zhu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels - Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
