Summary
염색 음식 양이 많은 음식 섭취 량 분석 제공 하는 강력한 고 높은 처리량 먹이 동기 평가를 의미 합니다. 결합 식품 소비 분석 결과 thermogenetic 및 optogenetic 스크린은 성인에서 식욕을 기본 신경 회로 조사 하는 강력한 접근 방식을 초파리 melanogaster.
Abstract
식품 소비는 생리 적 상태, palatability, 음식, 그리고 문제 명령을 시작 하거나 수 유 중지의 영양 내용을 통합 하는 두뇌의 꽉 제어. 밑에 시기 적절 하 고 적당 한 먹이 제어와 관련 된 생리 적, 심리적 장애의 우리의 이해에 운반의 주요 의미를 먹이의 의사 결정 프로세스 파악 간단 하 고, 양적, 강력한 메서드는 강제로 특정 대상 뉴런의 활동을 증가 하는 등 실험적인 조작 후 동물의 음식 섭취를 측정 하는 데 필요한. 여기, 우리는 성인 초파리에 제어를 먹이 기의 neurogenetic 연구를 촉진 하기 위하여 먹이 분석 염료-라벨-기반으로 도입. 우리가 사용할 수 먹이 분석, 검토 하 고 우리의 방법 thermogenetic 결합 분석 및 염료 표시 된 음식 섭취 량 분석 결과와 먹이 동기를 제어 하는 신경 세포의 optogenetic 조작 설치에서 단계별 설명. 우리는 또한 장점과 독자 적절 한 분석 결과 선택할 수 있도록 다른 먹이 분석 실험에 비해 우리의 방법의 한계를 설명.
Introduction
섭취 하는 음식의 양을 측정 하는 것이 먹이 (기아 상태) 등 내부 요구와 외부 요인 (예: 식품 품질과 palatability)1, 에 두뇌에 의해 컨트롤의 여러 측면을 평가 하기 위한 중요 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. 최근 몇 년 동안, 초파리 에서 제어를 먹이 기의 신경 기질을 해독의 노력 직접 섭취 하는 음식의 양을 계량 또는 동기 부여를 먹이의 지표로 서 역할을 다 분석 실험의 발전으로 이어질 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
모 세관 급지대 (카페) 분석 결과12,13 유리 microcapillary에서 액체 식품의 소비 금액을 측정 하기 위해 개발 되었다. 카페 분석 결과 매우 민감하고 재현할 수17 이며 음식 소비, 특히 장기 먹이18측정의 측정을 간소화 합니다. 그러나,이 분석 결과 microcapillary의 끝에 상승 하 고 있는 모든 긴장에 적합 하지 않습니다 거꾸로, 피드 파리를 요구 한다. 또한, 카페 분석 결과 사용 하 여 테스트할 파리 액체 식품에 reared 하기 때문에, 이러한 대사 상태 또는 잠재적인 영양 조건을 양육의 효과 결정 될 남아 있습니다.
코 확장 응답 (%) 분석 결과11,14 식품 상품의 부드러운 접촉으로 코 확장 응답의 주파수를 계산합니다. 분석 결과 평가 하는 우수한 방법으로 입증 당 palatability의 영향 및 음식18,19의 내용을 개별 비행 및 엉덩이의 동기 부여를 먹이. 그러나, 그것의 섭취 양 직접 정량화 아니다.
최근, 반자동 방법, 분석 결과 (MAFE)15, 먹이 매뉴얼 개발 되었다. MAFE에서 하나의 고정된 비행 수동으로 음식을 포함 하는 microcapillary와 함께 먹이입니다. 그 코 확장 반응과 식품 소비를 동시에 모니터링할 수 있습니다, MAFE는 영양 가치와 약리 조작의 효과 평가 적합 합니다. 그러나, 비행을 immobilizing 수 있습니다 부정적인 영향을 행동 성능, 먹이 포함 하 여.
또한, 코를 비행 하 고 활동 검출기 (FlyPAD)10 자동으로 먹이 행동 척도를 개발 되었다. 머신 비전 방법을 사용 하 여, FlyPAD 비행 및 동기 부여를 먹이의 지표로 서 주파수와 코 확장의 기간을 계량 하는 음식 간의 실제 상호 작용을 기록 합니다. FlyPAD는 민감도이 시스템의 견고를 더욱 더 남아 있지만 무료 이동 파리의 먹이 행동을 모니터링 하는 높은 처리량 접근 연구12제공 합니다.
레이블 전략 자주 파리에 음식 섭취를 추정 하는 데 사용 됩니다. 그것은 일반적인 음식 화학 추적기와 라벨, 수 유, 후 음식 섭취 량의 수량을 계산 하기 위해 섭취 한 추적의 양을 측정. 방사성 트레이 서16,17,20,21,22,23,,2425 표 피를 통해 검색 허용 파리 균질 하지 않고 이 방법은 현저 하 게 낮은 다양성 및 높은 감도18, 제공 하 고 음식 섭취 량의 장기 유학 가능. 그러나, 사용 가능한 radioisotopes의 가용성 및 흡 광도 배설의 다른 비율 취해야 한다 고려 사항으로이 분석 결과 사용 하는 경우.
라벨링 및 비 독성 식품과 음식 섭취 량을 추적 한 안전 하 고 간단 하 게 대체2,3,26,,2728이다. 파리는 수용 성 및 비 흡수 염료를 포함 하는 음식을 먹이 후 무 균 그리고 섭취 염료의 금액은 나중에 분 광 광도 계3,,2428,29 사용 하 여 계량 . 라벨 전략 수행 쉽습니다 및 높은 효율성을 제공 하지만 경고와 함께. 음식 섭취 량 섭취 염료에서 추정의 볼륨은 배설 파리17수 유 시작 후 15 분 일찍 시작 되기 때문에 실제 볼륨 보다 작습니다. 또한, 분석 결과 일반적으로 기간 내에 60 분만 단기 먹이 행동24,28의 조사를 위해 적합 하다는 음식 섭취를 평가 합니다. 또한, 유전자 형17,17, 성별 등 여러 내부 및 외부 요인 상태17, 밀도30,32circadian 리듬31,및 식품 품질3 양육 성관계 , 8 , 16, 영향 음식 섭취 량입니다. 따라서, 먹이 기간 특정 실험 조건에 따라 조정 해야 합니다. 음식 섭취 량의 정량화를 촉진, 외 식품 식품 선택2,,1927, 평가 하 고 시각화 카페 분석 결과12에 microcapillary에서 초승달 모양에도 사용 됩니다.
여기, 염료 라벨 방식으로 신경 활동의 결합 프로토콜 조작을 소개합니다. 이 전략 성인 과일 파리24제어를 먹이 기에 우리의 neurogenetic 연구에 유용한 입증 되었습니다. 식품 소비;의 빠른 평가 위한 시각적 득점 메서드 사용 따라서, 시기에 종자의 큰 숫자를 통해 심사에 대 한 유용합니다. 화면에서 후보자는 다음 자세히 객관적이 고 정확한 정량화 추가 연구를 제공 하는 색도계 방법을 사용 하 여 분석 됩니다.
먹이 분석 실험, 게다가 우리는 또한 thermogenetic27,33,34,35 및 optogenetic36 의 메서드 강제로 대상 초파리에서 신경 세포를 활성화 설명 합니다. Thermogenetic 신경 활성화 작업이 간단 하 고 편리한 초파리 와 일시적 수용 체 잠재적인 Ankyrin 1 (dTRPA1)는 신경 흥분을 증가 온도 및 전압 문을 단 양이온 채널 때 주위 온도 23 ° C33,37; 올라가면 그러나, 높은 온도에서 동물 테스트 동작에 악영향을 생성할 수 있습니다. 또 다른 효과적인 방법은 초파리 에서 신경 세포를 활성화 하는 사용 optogenetics CsChrimson36, 빛에 노출 되 면 신경 세포의 흥분 성 증가 channelrhodopsin의 빨간색 이동 변종입니다. Optogenetics 더 높은 시간 해상도 thermogenetics 보다 덜 방해 동작을 제공합니다. 신경 활동의 조작으로 음식 섭취 량의 정량적 측정을 결합 하 여 먹이의 신경 메커니즘을 공부에 대 한 효과적인 접근 방식을 나타냅니다.
우리가 먹이 챔버와 파리의 준비 테스트를 자세히 설명 합니다. 본뜬 Gal4 파리를 사용 하 여 모델24, thermogenetics 및 optogenetics에 의해 활성화 신경 설명 합니다. 염료-표시 된 식품 식품 소비의 정량화의 2 개의 분석 실험 또한 프로토콜에서 설명 합니다.
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Protocol
1. 먹이 챔버 준비
참고: 먹이 챔버 염료 라벨 먹이 분석 결과 대 한 두 부분으로 구성: (표지)로 외부 컨테이너와 내부 (식량)와 컨테이너.
- 수정 (31.8 m m 내부 직경)와 80 m m의 높이 초파리 배양에 대 한 유리 병에서 외부 컨테이너 (그림 1A, 1 C). 1 %agarose 제대로 먹이 설치 계속 (5 mL)의 층으로 컨테이너의 하단 습도 및 (그림 1B)를 따라 걸을 파리에 대 한 부드러운 기판으로 커버. 컨테이너는 그로 인하여 최소한의 스트레스와 파리에 소동 들고 제어 하지만 자연 분위기를 제공 합니다.
- 외부 컨테이너를 준비 합니다. 두 배 증류수, 자주 교 반, 열 50 ml에서 agarose의 0.5 g을 일시 중단 하 고 자력 열 플레이트에 완전히 분해 비등.
- 때 약 60 ℃, 1 %agarose 냉각 컨테이너 (그림 1B), 외부 빈에 1 %agarose 5 mL을 전송 하 고 컨테이너는 agarose 패드를 실내 온도에 냉각 될 때까지 열려 있어.
- 염료-표시 된 음식을 준비 합니다. 염료-표시 된 식품의 구성 다른 실험적인 목적에 따라 다릅니다. 여기만 자당 포함 된 염료 표시 된 음식 준비의 예가입니다.
- 두 배 증류수, 자주 교 반, 열 50 ml agarose의 0.5 g을 추가 하 고 열 플레이트 자력에 완전히 분해 비등.
- 언제 위의 1 %agarose 약 60 ° C에 냉각, 100mm 자당을 얻기 위해 agarose를 자당의 1.71 g을 추가 합니다.
- 0.5% (w/v) 염료 라는 음식을 얻기 위해 agarose 솔루션에 파란색 염료 (erioglaucine disodium) 0.25 g을 추가 합니다.
- 내부 준비 컨테이너. 컨테이너 안에 빈 평면 수평 표면에 다음 추가 750 µ L 음식의 파란색 염료 표시 된 개별 음식 콘테이너, 적어도 5 분 동안 공고히 하자.
참고: 내부 컨테이너는 13.6 m m의 내부 직경 및 높이 7.5 m m (그림 1A 1 C) 작은 플라스틱 접시. 그것은 염료 라는 음식으로 가득 하 고 외부 컨테이너의 agarose 패드의 가운데에 배치 됩니다. - 준비 된 외부 컨테이너에 컨테이너 내부는 채워진 전송 및 agarose 패드의 중심에 위치. 먹이 챔버 외부 컨테이너의 벽은 응축의 무료 때까지 40 분 동안 실내 온도에 열려 있을 게.
참고: 벽은 물 하락에 연락 하 여 벽에 붙어 되 고에서 파리를 방지 해야 합니다. - 염료-무료 음식 먹이 챔버 준비 (동일한 구성 없이 하지만 염색) 배경 빼기.
2입니다. 파리의 준비
참고: 성인 여성의 5 ~ 10 일 후 일수로 분석 실험을 먹이 기를 위해 일반적으로 사용 됩니다 파리. 파리의 유전 컨트롤을 포함 하 여 다른 genotypes 준비 하 고 동시에 테스트 하는 것이 좋습니다. (한 먹이 챔버)에서 20 파리 한 데이터 포인트를 생성합니다.
- 성인 파리 양육 인구 밀도를 고려 하십시오. 일반적으로, 변종에 따라 부모의 파리의 개수와 문화 병의 크기를 변화 하 여 인구 밀도 제어 합니다. 예를 들어, 문화 병 (31.8 m m의 직경)와 80 m m의 높이에 15 남성 및 구획-S의 30 여성을 전송 하 고 1 일 후 제거 성인 파리 산란 암컷 하자.
- Thermogenetic 정품 인증에 대 한 파리를 준비 합니다.
- Gal4/UAS 시스템38 를 사용 하 여 UAS-dTrpA1 다른 GAL4 드라이버 라인 (그림 2B)와 파리 교차점에 의해 다양 한 뉴런에 dTRPA133 를 표현.
- 22 ° C, 상대 습도 60%, 그리고 12 h/12 h 빛 어두운 주기의 표준 음식에 성인 파리를 유지.
- 시험의 2 일 전에 먹이, 정렬 및 신선한 식품 유리병에 스테레오 현미경 CO2 플라이 패드에 파리를 수집 하 고 유리병 당 20 파리의 밀도 유지.
- Optogenetic 활성화를 위한 파리를 준비 합니다.
- Gal4/UAS 시스템38 를 사용 하 여 다른 뉴런에 CsChrimson36 다른 GAL4 드라이버 라인 건너 UAS-CsChrimson 파리에 의해 표현 하.
- Eclosed (24 시간) 이내 파리 새로 수집 하 고 표준 음식 400 µ M 모든-trans-망막을 포함 하는 유리병에 그들을 전송.
- 조기 활성화를 방지 하기 위해 포장 알루미늄 호 일 양육 튜브와 다음 원치 않는 가벼운 자극에서 파리를 보호 하기 위해 어두운 상자에 넣어. 25 ° C, 4-6 일 동안 어둠 속에서 60% 습도에서 파리를 유지.
- 2 일 전에 먹이 분석 결과 정렬 여성 CO2 플라이 패드 스테레오 현미경의 밑에 난다. 20 파리 한 음식 유리병으로 수집 하 고 먹이 테스트 전에 어둠 속에서 그들을 유지.
- 주변광에 의해 발생 하는 효과 피하기 위해 가능한 한 빨리 희미 한 빛 아래에서 모든 작업을 수행 합니다. 작업 영역에서 멀리 떨어져 배치 LED 램프를 사용 하 여, 작업 영역에서 강도 5 µW/c m2입니다.
참고: 굶 어 사용 구획-S 먹이 분석 결과 대 한 긍정적인 컨트롤로 파리. 식품의이 파리를 박탈 하 고 먹이 테스트 전에 24 h에 대 한 1 %agarose 유지 합니다. 이러한 파리의 식품 소비 수준을 하루 변동 평가 도움이 됩니다.
3. thermogenetic 활성화
- Circadian 리듬 때문에 변이 최소화 하기 위해 Zeitgeber 시간 4-631,32, 주위 하루 중 같은 시간에 모든 먹이 실험을 실시 합니다.
- 난방 환경으로 인큐베이터 (또는 온도 조절 히터와 작은 방)을 준비 합니다.
- 행동 실험 전에 준비 먹이 실 실험 온도 (30 ℃)에서 온도 먹이 챔버에 상대 유니폼을 보장 하기 위해 2 시간에 대 한 equilibrate.
- 먹이 프로세스를 시작 하려면 신중 하 게 전송 20 파리 그들의 가정 유리병에서 데워 먹이 챔버로 부드러운 드려서. 60 분 ( 그림 3A) . 30 ° C에서 먹이 프로세스 계속
참고: 잦은 실이 먹이 행동 저하 인큐베이터 문 개폐와 같은 따라서 한다 최소화. - 30 분 동안 먹이 실-80 ° C (-20 ° C)에서 동결 하 여 60 분에 수 유를 중단.
참고: 동시에 모든 실에 수 유를 중지를 동결 수 있습니다. 파리-80 ° C에서 냉동 두 가지 목적, euthanizing 파리 및 균질 최대 1 주일까지 저장을 위해 제공 합니다. - 온도 제어 그룹에 대 일 분 동안 22 ° C에서 먹이 과정을 시작 하려면 염료 색 음식 챔버를 먹이 실 온에 20 파리를 전송 합니다.
- 30 분 동안 실-80 ° C (-20 ° C)에서 동결 하 여 온도 제어 그룹의 먹이 중단.
4. Optogenetic 활성화
- Circadian 리듬 때문에 변이 최소화 하기 위해 Zeitgeber 시간 4-631,32, 주위 하루 중 같은 시간에 모든 먹이 실험을 실시 합니다.
- 신중 하 게 전송 20 파리 한 유리병에서 먹이 챔버로 부드러운 두 드려서, 그리고 옆으로 챔버 (그림 4A, 4B) 조명 설치에.
- Optogenetic 조작에 대 한 오렌지 LEDs의 배열을 사용 하 여 (607 nm) 빛 자극, 그리고 수정 먹이 지 원하는 Led 위에 수평 플 렉 시 유리 접시 조명 동안 챔버의 근원으로. (그림 4A, 4B) 습도 60%와 25 ° C에서 인큐베이터 설치를 하십시오.
- 자극 하는 동시에 유전자 제어 파리는 본뜬 > CsChrimson 파리, 하지만 다른 먹이 챔버.
- 오렌지 빛으로 다시 조명으로 60 분 동안 먹이 과정을 계속 합니다.
- Optogenetics에 대 한 최적의 조명 농도 실험적으로 결정36. 에 본뜬 > CsChrimson 파리, 2.2 mW/m m2 의 휘도 유도 마비 (운동의 정지) 및 자세 제어의 손실을 따라서, 0.1 mW/m m2 의 중간 강도 사용 하 여 본뜬 자극 > CsChrimson 먹이 테스트 기간 동안 파리.
- 30 분 동안 먹이 실-80 ° C (-20 ° C)에서 동결 하 여 수 유를 중단.
5. 식품 소비 시각적인 추정
참고: 시각적 득점 방법은 식품 소비량의 반 정량적 평가 제공합니다. 광학 방법으로 객관적 이더라도,이 방법은 그것을 만드는 첫번째 적합을 신속 하 게 추가 테스트에 대 한 후보 유전자 스크린의 라운드 시기 비행 긴장의 많은 수를 통해가 수 있습니다.
- 수 유 후 anesthetize와 점수는 CO에 파리 스테레오 현미경2 플라이 패드. 볼륨 및 염료 색 음식의 복 부 (그림 2A)에서 강도에 따라 각 비행을 개별 점수를 제공 합니다.
참고: 기준 시각 추정에 대 한: 점수 시스템에 다른 볼륨 및 복 부에 색깔 음식의 농도 해당 하는 음식 섭취 량의 4 레벨.- 점수 0; 감지 염료 색 음식 없이 파리 그 희미 한 (거의 감지) 파란 염료 또는 염료 색 음식을 차지 하는 복 부의 볼륨의 1/3 미만 1의 점수를 제공 합니다.
- 점수 2의 점수 복 부의 절반을 차지 하는 강렬한 염료 색 식품으로 이동 합니다.
- 그 강렬한 염색 콘텐츠 점령 복 부의 절반 보다 큰 3 (그림 2A)의 점수를 점수.
- 각 실험 조건 (그림 2B)에 다른 점수와 함께 파리의 비율을 계산 합니다.
6. 색도계 정량화의 식품 소비
- 후의 수 유, 부 어는 먹이에서 모든 20 파리 종이, 무게의 조각에 챔버 다음 부드러운 브러쉬를 사용 하 여 1.5 mL 튜브에 그들을 전송 합니다.
참고: 감기 챔버에 물 응축 때문에 챔버 벽에 집착 하는 파리를 피하기 위해 같은 시간에-80 ° C 저장에서 챔버의 모든을 하지 마십시오. - 튜브에 PBST의 500 µ L을 추가 하 고 5에 대 한 60 Hz에서 분쇄 밀을 사용 하 여 파리를 균질 s.
- 본문 부분의 없습니다 감지 조각 있을 때 충분 한 균질 관찰 하 여 확인 합니다.
- 잔해를 13000 rpm에서 30 분 동안 homogenates 튜브를 회전 합니다.
- 원심, 후 상쾌한의 100 µ L 96 잘 접시의 전송.
- 모든 샘플을 로드 630에서 샘플의 흡 광도 측정 하는 플레이트 리더에 접시를 넣어 nm.
- 배경 흡 광도 제거, 파리에서 supernatants의 흡 광도를 상쾌한 블루 음식 먹이 파리에서의 흡 광도에서 염료 없이 음식을 먹이.
참고: 이 단계는 사용 하는 식품의 구성에 따라 선택 사항입니다. (염료) 없이 비행 음식 630에서 흡 광도 생성 하는 때 nm, 그것은 백그라운드를 제거 하려면이 단계를 수행 하는 데 필요한.
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Representative Results
Thermogenetic 스크린입니다.
식욕 비정상적으로 증가 하면 생리 적 요구에 높은 음식 섭취 량. 높은 처리량을 디자인 하는이 제도 활용 하는 우리 행동 신경 세포의 유전 핸들을 얻기 위해 기아와 관련 된 화면과 만족 상태 (그림 1). 화면 본뜬 Gal424나왔고. 본뜬 Gal4 뉴런은 강제로 30 ° C에 활성화 될 때는 본뜬 > TrpA1 컨트롤 (그림 2, 그림 3) 보다 식품의 대량 섭취 파리.
시각적으로 식품 소비 점수.
일부 신경 전달 물질 및 neuropeptides 먹이 행동의 규칙에 표시 되어 있기 때문에 우리는 NPF20, sNPF39, octopamine21, 도파민27, 를 포함 하 여 해당 GAL4 라인 테스트 40, 세로토닌41,42, 아 흐35, 그리고 Dilp27,,835. 척도 먹이 반응을, 우리는 시각적으로 검사 하 고 (그림 2A)에 다양 한 양의 감지 염료와 함께 파리를 득점. 본뜬 뉴런의 약 58%의 활성화 후 본뜬 > dTrpA1 파리 전시 강한 먹이 행동, 그리고 이러한 보였다 가벼운 먹이 행동 (그림 2B)의 23%. 반면, 한계 먹이 행동 다른 뉴런을 통해 활성화와 함께 파리에서 관찰 되었다 dTrpA1 (그림 2B).
음식 섭취 량의 색도계 정량화입니다.
음식 섭취 량 높은 정밀도 및 객관성, 계량 음식2,,2728추가 염료에 비행 추출 특정 파장에서의 흡 광도 측정 했습니다. 음식 섭취 량의 볼륨으로 흡 광도 값을 연결할 표준 곡선 샘플 솔루션 (파리, PBST 조직에 대 한 동일한 버퍼)의 흡 광도 측정 하 여 얻은 다른 양의 염료와 혼합). 우리의 결과 보여줍니다, 급성 활성화 본뜬 GAL4 뉴런 TRPA1 극적으로 증가 음식 섭취 같은 테스트 기간 (그림 3B), 유전자 제어 및 온도 제어와 비교 하는 제안으로 본뜬 GAL4 레이블된 신경 성인 초파리의 음식 섭취 량의 조절에 참여.
초파리에서 음식 섭취 량을 홍보 Optogenetic 활성화.
우리는 오렌지 빛36 (그림 4A, 4B)와 조명에 의해 본뜬 뉴런을 활성화 하 UAS-CsChrimson 를 사용. 때 본뜬 > CsChrimson 파리 607에서 LED 조명에 의해 자극 되었다 nm, 그들은 컨트롤 (그림 4C) 보다 훨씬 더 많은 음식을 섭취. 또한, 섭취 한 음식의 양을 자극 빛 (그림 4D)의 농도와 잘 상관 된다. 따라서, dTrpA1와 thermogenetics, 게다가 본뜬 신경에 있는 CsChrimson와 optogenetic 활성화 만족된 파리에서 먹이 동기 또한 촉진합니다.
그림 1 . 성인 파리에서 식욕을 분석 하기 위한 먹이 패러다임. (A) 먹이 챔버 포함 내부 컨테이너 가득 염료 색 음식과 외부 컨테이너 1 %agarose 채워집니다. 왼쪽에서 오른쪽, 내부 컨테이너, 외부 컨테이너, 그리고 완전 한 먹이 챔버. (B) 내부 컨테이너 외부 컨테이너의 하단에 agarose 패드 위에 앉아 있다. (C) 먹이 챔버의 최고 볼 수 있습니다. (D) A 도식 "식욕 화면" 실험을 보여주는 일반 만족된 파리 거의 먹은 음식 (왼쪽된 유리병), 강제로 활성화 하는 동안 먹이 특정 제어 신경 발생 따라서 복 부 (오른쪽 유리병)에 염료 색 음식 전시, 추가 음식 섭취에 만족된 파리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 음식 섭취의 시각적 추정. 복 부에 음식 콘텐츠 점수 기준 표시 (A) 표본 이미지. (B) 30 ° c.에 dTrpA1에 의해 활성화 되 고 표시 된 신경을 가진 파리에 점수를 먹이 기의 분포 아니-Gal4: UAS-dTrpA1 (유전자 제어); NPF GAL4: neuropeptide F 긍정적인 뉴런; sNPF GAL4: 짧은 neuropeptide F 긍정적인 뉴런; TDC1-GAL4 및 TDC2 GAL4: octopamine 신경; TH-GAL4: 도파민 뉴런; 5-HT: 세로토닌 뉴런; 아 흐: adipokinetic 호르몬 긍정적인 뉴런; dip2: 인슐린 같은 펩 티 드 2 긍정적인 뉴런; 龍-GAL4: 본뜬 GAL4 레이블 뉴런 (n = 조건 당 120 파리). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . Thermogenetic의 활성화 본뜬 신경 성인 파리에서 식품 소비 증가. (A) 이미지 thermogenetic 활성화 실험의 설정을 보여 줍니다. 30 ° c.에 인큐베이터에서 먹이 테스트 수행 (B) 식품 소비 만족된 파리 색도계 정량화 하 여 30 ° C 또는 1 h. 에 대 한 22 ° C에서 테스트 하나의 비행의 식품 소비에의 한 먹이 챔버에 20 파리의 계산 했다 (n = 6). n.s. 나타냅니다 중요 하지 (p > 0.05); p < 0.001. Tukey의 임시 게시물 테스트 뒤 일방통행 ANOVA는 다중 비교 분석에 사용 되었다. 오차 막대 표시 평균 ± SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . Optogenetic-활성화 본뜬 뉴런의 강도-종속 방식으로 음식 섭취의 양을 증가. (A, B) Optogenetic 정품 인증에 대 한 설치 프로그램의 2 개의 전망입니다. 먹이 챔버 오렌지 LEDs의 배열을 지원 접시에 옆으로 아래쪽에서 조명 배치 했다. 조명 상자 전면 내부를 보여 제거 되었다 Led. 행동 실험은 25 ° C, 60 %RH 인큐베이터 안에 수행 했다. (C) 표시 genotypes optogenetic 조명 아래 또는 1 시간에 대 한 어둠 속에서 테스트 했을 때의 만족의 음식 소비 (n = 6). (D) 식품 섭취로 만족 본뜬 > CsChrimson 파리 조명 강도 연관 되었다 (n = 6). n.s. 나타냅니다 중요 하지 (p > 0.05); p < 0.001, 일방통행 ANOVA Tukey의 임시 게시물 테스트에 따라 여러 비교, 학생의 t을 분석 하기 위해 사용 되었다-두 그룹 비교 테스트. 오차 막대 표시 평균 ± SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 보고서는 thermogenetic의 맥락에서 소비 식품의 염료 라벨 먹이 분석의 기술 과정에 초점을 맞추고 먹이 제어 하는 optogenetic 활성화 뉴런을 조작 하 고. 이 간단 하 고 신뢰할 수 있는 프로토콜 제어, 파리의 음식 선호도 측정 하 고 먹이 기반 유전 스크린24통해 먹이 제어 회로에 새로운 플레이어를 식별 하 먹이에 후보 뉴런의 기능을 명료 하 게 하는 데 도움이 됩니다.
염료 라벨 전략은 단기 먹이 행동 조사에서 가능 합니다. 염료, erioglaucine disodium에 녹이 고, 음식 섭취 식품 소비의 중요 한 지표 이다. Deshpande 외. 시연 파란색 염료 자체 카페 분석 결과와 음식 섭취 량 분석 결과17라벨 방사성 측정 때 먹이에 아무런 영향을 보여주었다. 마찬가지로, 우리의 당 결과 (염료 표시 또는 염료 무료 100 m m 자당 솔루션 파리의 다리 자극) 표시는 파리 전시 염료 표시 또는 염료 무료 음식으로 그들의 반응에 큰 차이. 그러나, 염료 초파리에 맛도 인지에 관한 명확한 데이터 여전히 있다.
게다가 중요 한 단계에에서 표시 된 프로토콜을 일반에 특정 주의 테스트할 파리의 상태. 양육 되 고 비과 밀 밀도 유지, 외 파리, 부드럽게 처리 되어야 하 고 먹이 일관 된 결과 생성 하기 위하여 불필요 한 충격 또는 스트레스, 피할.
여기에 제시 된 먹이 패러다임에는 특정 제한이 있습니다. 첫째, 우리의 방법을 계량 음식 소비를 60 분 동안. 같은 날, 오랜 동안 음식 섭취를 평가 하 카페, 같은 다른 메서드는 필요할. 둘째, radioisotopes를 사용 하 여 정량화 방법에 비해, 색도계 방법 이며 덜 민감한 식품 소비 금액은 낮은 때 차이 해결 하기 어렵다. 셋째, 일부 파리 먹이의 시작 후 15 분으로 초기 방전을 시작 하는 것을 고려,이 프로토콜은 실제로 음식 섭취와 배설 인구17의 결과 측정 합니다. 넷째, 여기에 설명 된 음식 섭취 량의 색도계 정량화가 했다 비행 그룹, 하나의 비행의 음식 섭취의 방사성 동위 원소 라벨 등 다른 먹이 분석 실험, MAFE 분석 결과, 또는 FlyPAD에 따라 달라 집니다. 그럼에도 불구 하 고, 간단한, 안정, 표시, 및 높은 처리량 방법 등의 음식 섭취 량의 색도계 정량화의 이점이 선택을 그것 주요 긴장, 다 수의 정량화를 위한 특히 먹이 기반 유전자 화면 및 후속 연구
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품 국가 기본 연구 프로그램의 중국 (2012CB825504), 국립 자연 과학 재단의 중국 (91232720 및 9163210042), 중국 아카데미의 과학 (CAS) (GJHZ201302 및 QYZDY-남동-SMC015)에 의해 부분적으로 지원 되었다 빌과 멜 린다 게이츠 Y. zhu CAS의 기초 (OPP1119434), 및 100-재능 프로그램.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
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