Summary
Protocollen voor tijdelijke pop perioden en meting van vleugel pigmentatie van Drosophila guttifera worden beschreven. Fasering en kwantificering van pigmentatie vormen een solide basis voor de studie van ontwikkelingsstoornissen mechanismen voor volwassen traits en inschakelen van interspecifieke vergelijking van trait ontwikkeling.
Abstract
Gediversifieerde soorten Drosophila (fruitvlieg) bieden mogelijkheden om te studeren van mechanismen van ontwikkeling en genetische veranderingen die verantwoordelijk zijn voor de evolutionaire veranderingen. In het bijzonder is het volwassen stadium een rijke bron van morfologische eigenschappen voor interspecifieke vergelijking, met inbegrip van vleugel pigmentatie vergelijking. Studeren developmental verschillen tussen de soorten, zijn gedetailleerde observatie en passende enscenering nodig voor nauwkeurige vergelijking. We beschrijven hier protocollen voor de enscenering van pop perioden en kwantificering van vleugel pigmentatie in een polka-dotted fruitvlieg, Drosophila guttifera. Eerst beschrijven we de methode voor gedetailleerde morfologische waarneming en definitie van pop fasen op basis van morphologies. Deze methode omvat een techniek voor het verwijderen van de puparium, die de buitenste chitinous voor de verpopping geldt, om gedetailleerde observatie van pop morphologies. Ten tweede, beschrijven we de methode voor het meten van de duur van de omschreven pop stappen. Ten slotte, beschrijven we de methode voor de kwantificering van de vleugel pigmentatie op basis van de analyse van de afbeelding met behulp van digitale beelden en ImageJ software. Met deze methoden kunnen we een solide basis voor het vergelijken van de ontwikkelings processen voor volwassen traits tijdens pop stadia vaststellen.
Introduction
Sommige van de morfologische eigenschappen van Drosophila zijn gediversifieerd onder soorten1,2,3,4,5. Wij kunnen benaderen de kwestie van hoe morfologische diversiteit ontstaat door het vergelijken van de mechanismen van de generatie van deze morphologies. Voorbeelden van dergelijke morphologies zijn larvale schubben, erotische sex kammen, externe genitale toestellen, abdominale pigmentatie en vleugel pigmentatie6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. studeren morfologische verschillen tussen volwassenen, waarneming en analyse van de pop stadia zijn belangrijk, omdat het lot van volwassen eigenschappen wordt bepaald in de late larvale stadia en latere morfogenese gedurende de pop opbrengsten.
In studies van de ontwikkelingsbiologie van Drosophila melanogaster, "uren APF" (uur na pop vorming) is de gemeenschappelijke methode om aan te geven een popstadium16. Dit systeem maakt gebruik van absolute tijd na pop vorming en is erg handig voor routinematige experimenten. Echter, developmental snelheid kan verschillen van poppen, en kan worden beïnvloed door lichte microenvironmental, genetische en epigenetische verschillen, en dus met dezelfde absolute tijd na pop vorming garandeert niet dat de poppen tegelijkertijd zijn ontwikkelingsstadium. In veel gevallen zijn de fasen die zijn gedefinieerd door morfologische kenmerken voorkeur voor het vergelijken van meerdere personen. Met name vereist een vergelijking tussen soorten nauwkeurige enscenering en vergelijking tussen overeenkomstige (homologe) fasen.
Bainbridge en Bownes17 erkend 20 pop stadia (P1 P15(ii)) gebaseerd op morfologische kenmerken van Drosophila melanogaster poppen. Deze enscenering is het meest gebruikte systeem van morfologische developmental tijdelijke18. In een eerdere studie uitgevoerd we pop opvoering van Drosophila guttifera om vast te stellen van een basis voor studies19van de pigmentatie van de vleugel. D. guttifera heeft een zwarte polka-dot-patroon op haar vleugels en behoort tot de soort model voor vleugel pigment vorming20. Hoewel we verwezen naar de morfologische criteria beschreven de Bainbridge en Bownes onderzoek17, we rechtstreeks gemeten fase duur door seriële observaties19, in plaats van met behulp van Bainbridge en Bownes raming van de duur van de fase van waargenomen frequentie. Hier beschrijven we de methode van pop enscenering en meting van de totale duur van pop stadia van Drosophila gebruikt in Fukutomi et al.19.
Om te studeren het ontwikkelings mechanisme van vleugel pigmentatie, die we willen weten wanneer in pop of volwassen stadia de pigmentatie optreedt. Fukutomi et al. 19 gekwantificeerd optische dichtheid (ODs) van pigmentatie tijdens pop en volwassen stadia door beeldanalyse van beelden van de vleugel. De pigmentatie van Drosophila vleugels wordt gedacht te worden veroorzaakt door de opeenhoping van zwarte melanine21. Voor de kwantificering van ODs, werden grijs-schaal afbeeldingen en ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/)22 gebruikt. We aftrekken om te erkennen en kwantificeren van de plek-specifieke pigment (ΔOD), de OD buiten een plek van de OD binnenkant van een plek. Om deze methode reproduceerbaar en objectieve, moeten de plaatsen van OD meting worden bepaald met behulp van vleugel aderen als monumenten. In dit artikel beschrijven we in detail deze methode voor de kwantificering van de vleugel pigmentatie in Drosophila guttifera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vliegen voorraad
- Drosophila guttifera voor alle van de volgende protocollen gebruiken.
- Gebruik van plastic flesjes (diameter 25 mm x hoogte 96 mm) en cellulose pluggen (doorsnede 23 mm x hoogte 26 mm) voor voorraadbeheer. Gebruik een standaard maïsmeel/suiker/gist/agar voedsel en volgen een publicatie beschreven drie andere alternatieve recepten voor deze soorten2.
Opmerking: D. guttifera (voorraadnummer 15130-1971.10) is verstrekt door de Drosophila soorten voorraad Center aan de University of California, San Diego. Hoewel D. guttifera tot de immigrans-tripunctata straling, die ver verwant aan D. melanogaster binnen het geslacht23 behoort is, heeft het vele biologische eigenschappen gemeen met D. melanogaster . Dienovereenkomstig, dit protocol kan worden toegepast voor vele soorten van de Drosophila , hoewel sommige soorten vereisen specifieke levensmiddelen en/of technische tips om ze te bewaren2.
2. waarneming van de verpopping en definitie van pop podia
Opmerking: De verpopping voor observatie is genomen uit de vliegen voorraad onderhouden met een 12:12 h licht/donker cyclus bij 25 ° C. Bainbridge en Bownes17 beschreven een laag risico van bewegende D. melanogaster poppen van de oorspronkelijke plaats van verpopt op een bevochtigde tissue papier (97% overleving van 946 verplaatste poppen). D. guttifera poppen kunnen bereid worden door in wezen dezelfde methode.
- Gezonde volwassenen van Drosophila plaats op vers voedsel (standaard maïsmeel/suiker/gist/agar voedsel) in een plastic flesje (diameter 25 mm x hoogte 96 mm) en laat ze leggen eieren. 7 dagen wachten te verkrijgen late 3de stadia.
- 1 mL van de standaard maïsmeel/suiker/gist/agar voedsel in elke 1,5 mL microtube plaatsen. Maak 3 gaatjes met 2 mm afstand in de deksels van de slangen door indringend met een push-pins toe ademhaling.
- Centrifugeer de slangen met voedsel voor 7 s in een mini microcentrifuge (860 x g).
- Omkeren en tik op flesjes als wilt verwijderen van alle volwassenen uit het flesje.
- 5-10 mL ddH2O pour (of reverse-osmose-water) in de flacon.
- Uitstorten larven met water in een plastic petrischaal (diameter 90 mm x hoogte 15 mm). Identificeren eind 3e stadia door hun grote lichaamsgrootte (3-4 mm in lengte).
- Zachtjes gaan eind 3e instar-larven met een tang de slangen met voedsel (10 larven / microtube). Na een hen nacht bebroeden bij 25 ° C.
- Verplaatsen van de nieuw gevormde poppen op een stuk van de papieren zakdoekje dat is bevochtigd door ddH2O en geplaatst in een plastic petrischaal (diameter 35 mm x hoogte 10 mm).
- Plaats de petrischaal in een vochtige kamer (met 10 mL van ddH2O in de bodem), en wacht totdat de poppen naar het gewenste werkgebied ontwikkelen.
- Verplaatsen van poppen op een bevochtigde weefsel papier in een plastic petrischaal (diameter 60 mm x hoogte 15 mm).
Nota: Dedefinitievan stadia kan meestal worden gemaakt gebaseerd op de podia van D. melanogaster17. Meestal is dat de pop periode van Drosophila kan worden onderverdeeld in P1 - P15(ii), hoewel enkele wijzigingen van fase definitie zou nodig zijn afhankelijk van de soort gebruikt. Indien mogelijk, kan het verwijderen van de puparium nauwkeurige en gedetailleerde observatie. Zie details hieronder (stap 3). - Acht poppen onder een stereomicroscoop. Fotograferen met een digitale camera die is aangesloten op de stereo microscoop.
3. opheffing van bepaalde puparium
Opmerking: Poppen van Drosophila zijn gedekt door een structuur genaamd de puparium. Een insect van Verpopping (vliegen) doet niet vergoten het larvale cuticula op verpopt; in plaats daarvan het verhardt de cuticle na apolysis, en gebruikt het als een beschermende dekking van de verpopping, de puparium24. Een Verpopping woonachtig binnen een puparium heeft een echte pop cuticle, die zeer zacht en kwetsbaar is. Voordat apolysis plaats rond P4(ii) vindt, epitheel en puparium met elkaar zijn verbonden, en daarom het verwijderen van de puparium zonder schade is heel moeilijk. Na P5 is het verwijderen van de puparium moeizaam, maar nuttig voor morfologische waarneming en definitie van pop stadia. Het proces is als volgt uitgevoerd.
- Brengt een stuk dubbelzijdige tape op een stuk papier handdoek.
- Plaats een Verpopping op de ventrale zijde van de dubbelzijdige tape omhoog (figuur 1A).
- Zoek de ruimte tussen de voorste zijde van de puparium en de interne Verpopping. Begrijpen en verwijderen van de puparium rond deze kloof met behulp van Tang, en bloot de voorste zijde van het hoofd van de verpopping.
- Breng de tip van een verlostang doordat het parallel aan de anterior-posterior-as wordt verplaatst. Til de tip van de verlostang om lokaal de puparium breken. Herhaal deze actie totdat de breuk het posterieure deel van de puparium bereikt. Zorgen dat een kloof wordt ook gevormd tussen de puparium en de benen van de pop, en de ventrale zijde van de puparium breken en minimaliseren van de schade aan de interne Verpopping (figuur 1B).
- Na het breken van de puparium zo veel mogelijk, nemen de verpopping met behulp van een fijn penseel (#5/0) (Figuur 1 c).
- De verpopping plaats op een stuk weefsel papier die is bevochtigd met ddH2O en geplaatst in een plastic petrischaal (diameter 60 mm x hoogte 15 mm). Fotograferen zo spoedig mogelijk omdat de blootgestelde Verpopping kwetsbaar is en gemakkelijk droog.
Opmerking: Poppen zonder een puparium zijn niet geschikt voor het meten van de totale duur van pop perioden (stap 4), omdat stress (zoals uitdroging) en fysieke schade kunnen interfereren met de normale ontwikkeling.
4. meting van de totale duur van pop podia
- Poppen voor te bereiden voor het meten van de totale duur van pop stadia zoals beschreven in stap 2. Poppen van 1-2, 2-3, en 3-4 dagen na pop vorming (elk 20 poppen) verzamelen. Individuele identificatienummers (1-60) geven door poppen voor identificatie. Blijven verzamelen nieuw poppen gevormd tijdens de volgende stappen te verkrijgen 20 meer jonge poppen. Individuele identificatienummers (61-80) geven de nieuwgevormde poppen. Plaats een Verpopping op een stuk van ddH2O-bevochtigd zijdepapier in een put (3.9 cm2) van een 12-well cel cultuur plaat (1 Verpopping per putje, 12 poppen/plaat). Vul de Inter goed ruimte voor platen met ddH2O te behouden van vochtigheid, de deksels in te zetten, en de platen in 25 ° C, constante licht (24:0 h licht/donker).
Opmerking: Poppen zonder een puparium zijn niet geschikt voor het meten van de totale duur van pop perioden. Verwijder alstublieft niet de puparium. - Morfologische kenmerken, met inbegrip van het lichaam kleur, borstels, Malpighian tubuli en geel lichaam van alle poppen zodra elke 30 min en record stadia waargenomen (P1 - P15(ii), gebaseerd op de referenties17,19) in een blad tally observeren.
- Blijven opnemen van meer dan vier rechte dagen (96 h) door een roterende verschuiving van drie (of meer) personen.
- Tellen aantal records van elke bijzondere fase en gemiddelde hen (gemiddelde aantal waarnemingen / poppen). Vervolgens vermenigvuldigt u hen met 0,5 (h), resulterend in de geschatte lengte van fasen (h).
5. meting van de intensiteit van de zwarte vlekken op een vleugel
Opmerking: De intensiteit van de zwarte vlekken op een pop of volwassen vleugel kan worden gekwantificeerd door het meten van de optische dichtheid (OD). Een glas-filter met bekende ODs (stapte-opaciteitsfilter) wordt gebruikt voor kalibratie25, zodat men de OD van een bepaald gebied van een digitale afbeelding van een vleugel berekenen kan. De OD op een plek en de OD buiten de plek worden gemeten, en de laatste wordt afgetrokken van de voormalige te verkrijgen van de intensiteit van de spot (ΔOD). Hier beschrijven we de methode van de dissectie, meting en berekening van ΔOD. Deze procedure kan worden gedaan na stap 2, onafhankelijk van stap 3 en stap 4. Zodra een stap 2 heeft uitgevoerd en alle pop stadia begrijpt, kan direct beginnen of herhaalt u stap 5.
- Voorbereiding van de afbeelding
- Bereid een nieuwe Verpopping een focale fase zoals beschreven in stap 2. Verwijder het voorste deel van een puparium met een tang. Neem de verpopping met pincet en leg deze in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, tabel 2) in een plastic petrischaal (diameter 35 mm x hoogte 10 mm).
- Snijd het basaal gewricht van een vleugel (basaal gewricht is het smalle proximale deel van de vleugel). Als de vleugel is gevouwen, plaatst u deze in een plastic petrischaal (diameter 35 mm x hoogte 10 mm) gevuld met ddH2O uit te breiden door osmotische druk (de vleugel ontvouwt zich vanzelf).
- Verzamelen nieuw eclosed volwassenen om de 10 min van een voorraad flacon. Anesthetize een vlieg met CO2 met behulp van een anesthetizing pad van CO2 , afstomping bevestigen door immobiliteit en snijd het basaal gewricht van een vleugel.
- Plaats 10 µL van PBS op een glasplaatje, daar plaatsen van de vleugel, en bedek met een dekking slip (18 mm x 18 mm).
- Schakel in het licht van de stereomicroscoop. Het licht op maximale niveau ingesteld. Het objectief 11,5 X instellen Stel het diafragma om de meest open staat. Zet de camera. Instellen van de camera te zijn (ISO: 100, modus SHQ 3136 x 2352 pixels, sluitertijd: 1/20 s). Focus op het monster door het verplaatsen van de focus knop van de Microscoop.
- Druk op de sluiterknop van de eenheid van de afstandsbediening om een opname te maken. Neem 3 beelden per vleugel, die elk op een campaniform sensillum, longitudinale ader steunkleuren of achterste crossvein, positionering van het distale deel van de vleugel aan de linkerzijde en het voorste deel van de vleugel aan de bovenzijde moet worden gecentreerd.
- Kalibratie
- Neem beelden van 9 delen van een getrapt dichtheid filter met dezelfde camera instellingen gebruikt om het beeld van de vleugel te krijgen.
- Initiëren ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/)22.
- Klik op bestand | Open | en selecteer een van de beelden van de getrapte-opaciteitsfilter.
- Klik op de afbeelding van de | Type | 8-bit | de installatiekopie converteren naar een 8-bits afbeelding.
- Klik op bewerken | Selectie | Opgeven | en controleer de kolom ovaal en gecentreerd . Schrijf 100 (pixels) in de kolom breedte , 100 (pixels) in hoogte kolom, 1568 in kolom X coördineren en 1176 in kolom Y coördineren . Klik op OK.
- Klik analyseren | Maatregel |. De "mean grijs waarde" van geselecteerde gebieden worden gemeten.
- Herhaal 5.2.3. naar 5.2.6. voor de 8 resterende afbeeldingen.
- Klik analyseren | Kalibreren Rodbard25 in functie kolom selecteren en het schrijven van het volgende nummer in de rechter kolom in het midden (0,04, 0,336, 0.632, 0.928, 1.224, 1,52, 1.816, 2.112, 2.408; deze cijfers is afhankelijk van de dichtheid van de stapte opaciteitsfilter).
- Controleer Global kalibratie kolom en klik op OK.
Opmerking: Door het uitvoeren van deze procedure, "verstaan grijs waarde" omgezet in "optische dichtheid (OD" met de Rodbard functie). Na deze stap, kan optische dichtheid worden berekend voor een specifieke geselecteerde gebied in ImageJ software.
- Gebied van metingen kiezen
Opmerking: Plekken zijn meestal geassocieerd met bezienswaardigheden, zoals campaniform sensilla, longitudinale ader tips en crossveins. Deze en andere bezienswaardigheden op een vleugel kunnen worden gebruikt om te kiezen van de regio van metingen. Hier een voorbeeld inD. guttifera(Figuur 2) wordt beschreven.- Definitie van punt A, campaniform sensillum plek.
- Open een afbeelding waarin een campaniform sensillum plek in het midden van de afbeelding is. Klik op de afbeelding van de | Type | 8-bit | de installatiekopie converteren naar een 8-bits afbeelding.
- Klik op rechthoek in Gereedschappen voor gebiedsselectie en teken een rechthoek. Het bovenste linker hoekpunt van de rechthoek zodanig instellen dat het is aangesloten op de achterste lijn van de derde longitudinale ader en meer distale uit een campaniform sensillum plek. De rechterkant van de rechthoek zodanig instellen dat het ligt aan de rechterkant van de campaniform sensillum ter plaatse.
- Klik op bewerken | Selectie | Toevoegen aan Manager |. Toon alle kolom raadplegen.
- Klik op de hoek hulpmiddel in Lijn selectie-gereedschappen. De eerste streep op de achterste lijn van derde longitudinale ader. Stel de linker eindpunten van de lijn op het hoekpunt van de rechthoek getekend in stap 1. Trek de tweede lijn op de bovenzijde van de rechthoek. Druk op de toets "m" voor het meten van de hoek tussen de twee lijnen getrokken in deze stap. Klik op het venster van het beeld op het scherm van de computer.
- Klik op bewerken | Selectie | Toevoegen aan Manager |.
- Klik op rechthoek in Gereedschappen voor gebiedsselectie en teken een rechthoek van ongeveer 1/9 de grootte van het afbeeldingsvenster. Klik op bewerken | Selectie | Draaien |. Schrijf de min graden van de hoek gemeten in stap 5.3.1.4. in de hoek kolom en klik op OK om te draaien de rechthoek getekend in deze stap.
- Verplaats de rechthoek getekend in stap 5.3.1.6. met behulp van de pijltoetsen. Het eindpunt van de achterste lijn van de tweede longitudinale ader aangezet op de linkerzijde van de rechthoek en de onderkant van de rechthoek op de achterste lijn van de derde longitudinale ader aangesloten. Bevestigen dat een lijn die loodrecht op vanaf het eindpunt van de tweede longitudinale ader aan de achterste lijn van de derde longitudinale ader wordt getekend met deze procedure. De voet van de lijn loodrecht op definiëren als punt A (figuur 2A).
- Opnemen van de x-coördinaat en de y-coördinaat van het punt A, aangegeven onder Gereedschappen voor gebiedsselectie bij het plaatsen van de cursor op het punt A.
- Definitie van punt B, longitudinale ader tip plek
- Open een afbeelding waarin een longitudinale ader tip plek in het midden van de afbeelding is. Klik op de afbeelding van de | Type | 8-bit | de installatiekopie converteren naar een 8-bits afbeelding.
- Herhaal dezelfde procedure in stap 5.3.1 beschreven. (Definitie van punt A, campaniform sensillum plek) te vinden van punt A in de afbeelding.
- Klik op bewerken | Selectie | Toevoegen aan Manager |.
- Klik op rechthoek in Gereedschappen voor gebiedsselectie en teken een rechthoek. Het bovenste linker hoekpunt van de rechthoek ingesteld op het eindpunt van de achterste lijn van de derde longitudinale ader.
- Klik op bewerken | Selectie | Toevoegen aan Manager |.
- Klik op de hoek hulpmiddel in Lijn selectie-gereedschappen. De eerste lijn tekenen om te verbinden van punt A en het eindpunt van de achterste lijn van de derde longitudinale ader. Deze regel definieert als lijn A. tekenen, wordt de tweede regel aan de bovenzijde van de rechthoek getekend in stap 5.3.2.4. Druk op "m" toets voor het meten van de hoek tussen de twee lijnen.
- Klik op bewerken | Selectie | Toevoegen aan Manager |.
- Klik op rechthoek in Gereedschappen voor gebiedsselectie en teken een rechthoek van ongeveer 1/9 de grootte van het afbeeldingsvenster. Klik op bewerken | Selectie | Draaien |. Schrijf de min graden van de hoek gemeten in stap 5.3.2.6. in de hoek kolom en klik op OK om te draaien de rechthoek getekend in deze stap. Verplaats de rechthoek met behulp van de pijltoetsen. De bovenzijde van de rechthoek zodanig instellen dat deze is aangesloten op de lijn A- en het eindpunt van de voorste lijn van de vierde longitudinale ader zodat er aan de linkerzijde van de rechthoek.
- Klik op bewerken | Selectie | Toevoegen aan Manager |.
- Klik op rechthoek in Gereedschappen voor gebiedsselectie en teken een rechthoek van ongeveer 1/9 de grootte van het afbeeldingsvenster. Klik op bewerken | Selectie | Draaien |. Schrijf de min graden van de hoek gemeten in stap 6 in hoek kolom en klik op OK om het draaien van de rechthoek getekend in deze stap. Verplaats de rechthoek met behulp van de pijltoetsen. Het lagere linker hoekpunt van de rechthoek ingesteld, zodat het op de bovenste links hoekpunt van de rechthoek getekend in stap 5.3.2.8., resulterend in het verkrijgen van de lijn loodrecht op vanaf het eindpunt van de voorste lijn van de vierde longitudinale ader lijn A. definiëren de snijpunt van de lijn loodrecht op en de achterste lijn van de derde longitudinale ader als punt B (figuur 2B).
- Opnemen van de x-coördinaat en de y-coördinaat van het punt B, onderstaande Gereedschappen voor gebiedsselectie bij het plaatsen van de cursor op het punt B.
- Definitie van punt C, posterior crossvein plek
- Open een afbeelding waarin een posterieure crossvein plek in het midden van de afbeelding is. Klik op de afbeelding van de | Type | 8-bit | de installatiekopie converteren naar een 8-bits afbeelding.
- Punt C definiëren als het punt van de posterior-de meeste van de voorste lijn van de vierde longitudinale ader op het gebied van de doorsnede van de achterste crossvein en de vierde longitudinale ader (figuur 2C).
- Opnemen van de x-coördinaat en de y-coördinaat van het punt C, onderstaande Gereedschappen voor gebiedsselectie bij het plaatsen van de cursor op het punt C.
- Definitie van punt D, regelzone
- Open een afbeelding waarin een campaniform sensillum plek in het midden van de afbeelding is. Klik op de afbeelding van de | Type | 8-bit | de installatiekopie converteren naar een 8-bits afbeelding.
- Klik op rechte in Lijn selectie-gereedschappen en tekent een lijn tussen het eindpunt van de voorste lijn van de tweede longitudinale ader en het eindpunt van de achterste lijn van de vierde longitudinale ader. Punt D definiëren als het snijpunt van deze lijn en de achterste lijn van de derde longitudinale ader (figuur 2D).
- Opnemen van de x-coördinaat en de y-coördinaat van het punt D, onderstaande Gereedschappen voor gebiedsselectie bij het plaatsen van de cursor op punt D.
- Definitie van punt A, campaniform sensillum plek.
- Metingen
- Open één van de beelden van vleugel vlekken (voor meting van punt A, open de afbeelding met punt A in het midden). Klik op de afbeelding van de | Type | 8-bit | de installatiekopie converteren naar een 8-bits afbeelding.
- Klik op rechthoek in Gereedschappen voor gebiedsselectie en teken een rechthoek van ongeveer 1/9 grootte van het afbeeldingsvenster.
- Klik op bewerken | Selectie | Opgeven |. Ovaal en gecentreerd kolom raadplegen. 100 (pixels) in breedte en hoogte kolommen schrijven, schrijf de x-coördinaten van punt A (of punt B of punt C) en D in kolom X coördineren en schrijven de y coördinaten van punt A (of punt B of punt C) en D in kolom Y coördineren . Klik op OK.
- Klik analyseren | Maatregel |. Als de kalibratie beschreven in punt 5.2 is al afgerond, zijn ODs aangegeven in kolom betekenen .
- Berekenen van ΔODs door af te trekken OD van punt D van ODs van punten A, B en C.
Opmerking: Punt D is in een transparante deel van de vleugel en bevat geen pigment en is daarom geschikt voor een achtergrond controle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De pop periode van D. guttifera is onderverdeeld in 17 stadia (P1 - P15(ii); afbeeldingen van drie vertegenwoordiger stadia (P1, P5 - 6, P10) worden weergegeven Figuur 3, en alle 17 stadia worden geïllustreerd in afbeelding 4). Hoewel Bainbridge en Bownes17 erkend 20 etappes in D. melanogaster, kan sommige van deze fasen niet worden toegepast op D. guttifera. De volgorde van twee ontwikkelingsstoornissen gebeurtenissen, het uiterlijk van het gele lichaam (massa van schuur cellen binnen de middendarm26) en de timing van Malpighian tubuli draaien groen, niet strikt worden gecontroleerd in D. guttiferaen vandaar kunnen wij niet scheiden P5 (i ), P5(ii) en P6. Ook, in tegenstelling tot bij D. melanogaster, de timing van Blacker van borst- en buikholte varkenshaar werd gesynchroniseerd, en dus we kunnen niet van elkaar scheiden P11(i) en P11(ii)19.
We konden meet de lengte van de pop stadia van D. guttifera (tabel 3, van Fukutomi et al.,19). De gehele periode van de pop is ongeveer 20 h langer dan die van D. melanogaster bij 25 ° C-17. We berekend ΔODs van gebieden rond een campaniform sensillum, de longitudinale ader uiteinde en de achterste crossvein. Hier, laten we de ODs en ΔODs bij volwassenen 7 dagen na eclosion (tabel 4). Door het vergelijken van de gegevens van meerdere stadia, vonden we dat stadium P12(i) de timing verschijnselen van pigmentatie is en dat pigmentatie is voltooid door 24 h na eclosion (Figuur 5, van de oorspronkelijke metingen gebruikt in Fukutomi et al.. 19).
Figuur 1. Illustratie van het verwijderen van puparium. (A) plaats een Verpopping ventrale zijde omhoog op een stukje dubbelzijdig tape. Verwijder het voorste deel van de puparium. (B) het breken van de puparium met een tang uit de ventrale zijde. (C) na het breken van de puparium, nemen de verpopping met behulp van een penseel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Definitie van ruimte voor het meten van pigmentatie. A punt A voor een plek die is gekoppeld aan een campaniform sensillum. B punt B voor een plek die is gekoppeld aan een longitudinale ader tip. (C) in punt C voor een plek die is gekoppeld aan een posterieure crossvein. D punt D voor een meetgebied. Schaal staven geven 250 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Voorbeelden van omschreven pop stappen. (A) de verpopping van etappe P1 bedekt met puparium. (B) Verpopping van etappe P5 - 6. (C) Verpopping van etappe P10. De puparia zijn verwijderd voordat observatie in (B) en (C). Schaal staven geven 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Illustraties van 17 pop stadia geïdentificeerd in D. guttifera. (A) P1, de puparium is wit. (B) P2, de kleur van de puparium is licht bruin. (C) P3, een zeepbel is waargenomen in de laterale zijde (zwarte pijlpunt). (D) P4(i), de zeepbel is groter dan dat in P3 (zwarte pijlpunt), en de verpopping is drijven in PBS. (E) P4(ii), een kloof wordt waargenomen in het voorste deel (zwarte pijlpunt) en het achterste gedeelte (grijze pijlpunt). (F) P5 - 6, Malpighian tubuli (moeilijk migreren te zien of vallende puparium). De pop vorm wordt gevormd door pop epitheel en pop cuticula. (G) P7, het gele lichaam kan worden waargenomen in de dorsale zijde (zwarte pijlpunt). (H) P8, de ogen zijn geel. (I) P9, de ogen zijn amber. (J) P10, de ogen zijn rood. (K) P11, Orbital en ocellar borstels (grijze pijlpunt) snorharen, thoracale macrochaetae (zwarte pijlpunt) en tarsale borstels zijn zwart en zichtbaar. (L) P12(i), de toppen van de vleugels zijn grijs. (M) P12(ii), alle delen van de vleugels zijn grijs (zwarte pijlpunt). (N) P13, de vleugels zijn volledig zwart. (O) P14, het hoofd en de benen zijn volledig verduisterd. (P) P15(i), het meconium kan worden waargenomen op de dorsale buik (zwarte pijlpunt). (Q) P15(ii), de vlieg is eclosing. Details van deze etappes werden beschreven in Fukutomi et al. 19 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Ontwikkeling van pigmentatie rond een companiform sensillum op een vleugel. Cirkels geven individuele ΔODs en horizontale balken geven gemiddelden. P10: n = 10, P11: n = 10, 12(i): n = 10, P15(i): n = 11, 3 h: n = 8 wordt 24 h: n = 7, 7 dagen: n = 10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Component | |
| Witte basterdsuiker | 51.6 g |
| Maïsmeel | 172,4 g |
| Maïs grutten - C | 86.4 g |
| Droge bier gist | 106 g |
| Agar poeder | 35.28 g |
| ddH2O | 4000 mL |
| Koken voor 30 min en laat afkoelen tot 70 ° C. | |
| Voeg 4 g butyl-p-hydroxybenzoaat ontbonden in 40 mL ethanol. | |
| Meng goed en giet elk 9 mL in plastic flesjes (diameter 25 mm x hoogte 96 mm). | |
Tabel 1. De samenstelling van standaard maïsmeel/suiker/gist/agar voedsel.
| Component | Bedrag |
| NaCl | 80 g |
| KCl | 0% |
| NB2HPO4·12H2O | 29 g |
| KH2PO4 | 0% |
| ddH2O | tot 10 liter |
| pH 7.4 instellen |
Tabel 2. De samenstelling van PBS (1 X).
| Stadium | Gemiddelde van duur (h) | s.d. | n |
| P1 - 2 | 1.7 | 0.65 | 16 |
| P3 | 2.1 | 0.65 | 16 |
| P4(i) | 2.1 | 1.69 | 19 |
| P4(II) | 0.3 | 0.28 | 29 |
| P5 - 6 | 5.0 | 3.07 | 30 |
| P7 | 31,9 | 7.22 | 46 |
| P8 | 9.6 | 2.81 | 57 |
| P9 | 10.9 | 2,66 | 55 |
| P10 | 11.7 | 2.96 | 39 |
| P11 | 4.4 | 2.81 | 44 |
| P12(i) | 1.1 | 0.76 | 44 |
| P12(II) | 2.0 | 0.70 | 43 |
| P13 | 2.2 | 0.68 | 10 |
| P14 - 15(i) | 28.6 | 2,75 | 10 |
| P15(II) | 1.4 | 0,87 | 10 |
| Totaal | 121.7 |
Tabel 3. Duur van pop stadia van gemeten D. guttifera.
| OD | ΔOD | |||||||
| Campaniform sensilum | Longitudinale ader tip | Achterste crossvein | Controle | Campaniform sensilum | Longitudinale ader tip | Achterste crossvein | ||
| Individu | (Punt A) | (Punt B) | (Punt C) | (Punt D) | (Punt A - punt D) | (Punt B - punt D) | (Punt C - punt D) | |
| 1 | 0.549 | 0,484 | 0.515 | 0.256 | 0,293 | 0.228 | 0.259 | |
| 2 | 0.529 | 0.489 | 0.516 | 0.254 | 0.275 | 0.235 | 0.262 | |
| 3 | 0.546 | 0,48 | 0.533 | 0.255 | 0.291 | 0,225 | 0.278 | |
| 4 | 0.583 | 0.496 | 0.566 | 0.255 | 0.328 | 0.241 | 0.311 | |
| 5 | 0.523 | 0.479 | 0.528 | 0.235 | 0.288 | 0.244 | 0,293 | |
| 6 | 0.572 | 0.509 | 0.546 | 0.265 | 0.307 | 0.244 | 0.281 | |
| 7 | 0.568 | 0.511 | 0,56 | 0.256 | 0.312 | 0.255 | 0.304 | |
| 8 | 0,56 | 0.507 | 0.562 | 0.27 | 0,29 | 0.237 | 0.292 | |
| 9 | 0.551 | 0.485 | 0.569 | 0.259 | 0.292 | 0.226 | 0.31 |
Tabel 4. ODs gemeten en ΔODs van D. guttifera volwassenen 7 dagen na eclosion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven hier de protocollen voor definitie pop fasen, verwijderen van de puparium voor gedetailleerde observatie, meting van de duur van pop stadia, en meting van de intensiteit van de zwarte vlekken op een vleugel in D. guttifera. Deze protocollen kunnen worden toegepast voor vele Drosophila en gerelateerde vliegen soorten, vooral soorten met vleugel pigmentatie.
Diepgaande waarneming en beschrijving van meer gedetailleerde developmental gebeurtenissen zouden verdere onderverdeling van stadia. In veel gevallen een ontwikkelingstoxiciteit gebeurtenis verplicht stellen van de dissectie of segmenteren van een verpopping is niet geschikt voor fase definitie, omdat men een Verpopping voor staging te doden, en verder gebruik van dat individu is moeilijk. Voor gebruik van een nieuwe soort van de Drosophila , moet een ontwikkelingstoxiciteit gebeurtenissen te onderscheiden van buiten de puparium dienst als een eerste stap. Afhankelijk van het doel van de studie, kan een fasen op basis van bepaalde organogenese of andere ontwikkelingsstoornissen evenementen vervolgens verder onderverdelen.
Voor interspecifieke vergelijking van meerdere stadia is een potentieel probleem een omkering van de orde van ontwikkelingsstoornissen gebeurtenissen tussen soorten (heterochrony27). Bijvoorbeeld, in D. melanogaster, de Malpighian zaadvormende wordt groen en het gele lichaam wordt dan zichtbaar, overwegende dat deze volgorde kan worden omgekeerd in sommige poppen van D. guttifera19. In een dergelijk geval is strikte vergelijking tussen homologe stadia moeilijk. Afhankelijk van het fenomeen van belang wellicht een opnieuw te definiëren of een bepaalde fase op basis van een ontwikkelingstoxiciteit gebeurtenis onderverdelen. Wij kunnen bijvoorbeeld ongeveer Selecteer poppen van P5 - 6 en doen van interspecifieke vergelijking van gene expressies in pop vleugels met vleugel morfologie als indicator van ontwikkelingsstoornissen timing14.
Meestal duurt het 10 tot 30 min voor het verwijderen van de puparium. Als men wil observeren een korte etappe, moeten poppen bereid zijn rekening houdend met de tijd die tijdens het verwijderen van de puparium verstrijkt. Bijvoorbeeld, als men wil observeren P12(i) van D. guttifera, die heeft enige 1.1 h duur, zou voorbereiding van poppen op P11 geven een goed resultaat.
In ons protocol, wordt bevochtigde tissue papier gebruikt voor de achtergrond van pop beelden. Afhankelijk van het stadium van de observatie en structuren die men wil weergeven in een afbeelding, kan men witte of zwarte tissue papier gebruiken. De positie van de zeepbel in de verpopping is belangrijk voor de onderscheiden fasen in de P3 te P4(ii) overgang, en zwarte papieren zakdoekje helpt bij het observeren van de positie van de zeepbel. Voor de fasen na P5 is wit zijdepapier beter omdat het helpt om het observeren van het gele lichaam, oogkleur, borstels en lichaam kleur.
Bainbridge en Bownes17 geschat de duur van de pop stadia van hun frequentie van verschijning. Hun staging-tabel is de wijdst gebruikte voor D. melanogaster18. Voor hun werkwijze, ze bereid vier voedsel flessen met vijf volwassen vrouwtjes en vijf volwassen mannetjes en ze in het donker bewaard, en vervolgens poppen willekeurig wordt genomen uit een fles iedere op 11, 12, 13 en 14 dagen na het begin van het leggen van eieren. Zij telde het aantal van poppen in bepaalde stadia, en de gemiddelden berekend. De lengte van elke popstadium kon worden geschat op basis van de gegevens van de totale duur van de pop en deze frequentie. Een probleem met deze methode is dat het niet kan worden gebruikt om te schatten van de precieze duur van pop podia als ontwikkelings timing neiging om te worden gesynchroniseerd tussen poppen.
In feite, we probeerde Bainbridge en Bownes de methode in D. guttifera, en wij bevooroordeeld gegevens verkregen vanwege synchronisatie tussen poppen. We kunnen niet identificeren van de oorzaak van dit verschijnsel, maar sommige mogelijkheden zijn 1) poppen behouden circadiane ritme van hun jonge stadium en/of 2) ze heeft gereageerd op de vorderingen aan het licht die plaatsvond bij waarneming. Daarom besloten we voor het meten van feitelijke fase duur door directe observatie. Dit minimaliseert bias veroorzaakt door circadiane ritme.
De hier beschreven methode is een methode om het kwantificeren van extra accumulatie van melanine in vlekken in vergelijking met hun controle omgeving (ΔOD), door af te trekken van de OD van de regelzone van de OD van de vlek gebied. Deze methode werd geïnspireerd door een methode voor het kwantificeren van de nucleaire inhoud van DNA door Feulgen kleuring en beeld analyse (densitometrie28,29). Als een van de potentiële problemen voor het toepassen van deze methode op vleugel pigmentatie, kunnen ΔOD een negatieve waarde, vooral wanneer een Verpopping zeer jong is en bijna geen pigmentatie heeft. In latere stadia, kunnen er sommige pigmentatie in de regelzone. Het gebruik van de eenvoudige OD van de spot gebied zelf thuishoren in plaats van ΔOD afhankelijk van het doel van de studie. In het geval van D. guttifera, veranderde gebruik van de eenvoudige OD in plaats van ΔOD niet de neiging van de gegevens of de conclusies van de studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflict van belang.
Acknowledgments
Wij danken Sean B. Carroll en Thomas Werner voor het verstrekken van vliegen voorraden, Naoyuki Fuse voor apparatuur, Byung-Seok Jin voor zijn hulp bij het filmen, Kiyokazu Agata voor begeleiding en Elizabeth Nakajima voor het bewerken van de Engelse. Dit werk werd gesteund door KAKENHI 17K 19427 en Takeda Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits - C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits - C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 - 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
- Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. Hecht, M. K., Steere, W. C. , Springer (Meredith Corporation). New York. 437-543 (1970).
- Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: a guide to species identification and use. , Academic Press. New York. (2006).
- Patterson, J. T. The Drosophilidae of the southwest. 4313, University of Texas Publication. 7-216 (1943).
- Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
- Werner, T., Jaenike, J. Drosophilids of the Midwest and Northeast. , River Campus Libraries, University of Rochester. Rochester. (2017).
- Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
- Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136 (2015).
- Gompel, N., Prud'homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
- Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
- Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
- Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
- McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
- Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
- Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
- Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).
- Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
- Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. Sekimura, T., Nijhout, H. F. , Springer. New York. in press (2017).
- True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051 (2016).
- Resh, V. H., Cardé, R. T. Encyclopedia of Insects. , 2nd ed, Academic Press. Burlington. (2009).
- DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
- McKinney, M. L., McNamara, K. Heterochrony: the evolution of ontogeny. , Plenum Press. New York. (1991).
- Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners' guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
- Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).
