Summary
Protokoller for iscenesættelse puppe perioder og måling af wing pigmentering af Drosophila guttifera er beskrevet. Iscenesættelse og kvantificering af pigmentering giver et solidt grundlag for at studere udviklingsmæssige mekanismer af voksne træk og aktiverer artskrydsede sammenligning af trait udvikling.
Abstract
Diversificeret arter af Drosophila (bananfluen) giver mulighed for at studere mekanismer bag udvikling og genetiske ændringer ansvarlig for evolutionære forandringer. Især er den voksne fase en rig kilde af morfologiske træk for artskrydsede sammenligning, herunder wing pigmentering sammenligning. For at studere udviklingsmæssige forskelle mellem arterne, er detaljeret observation og passende iscenesættelse påkrævet til nøje sammenligning. Her beskriver vi protokoller for iscenesættelse af puppe perioder og kvantificering af wing pigmentering i en polka-prikket frugtflue, Drosophila guttifera. Først, vi beskrive metoden til detaljeret morfologiske observation og definition af puppe faser baseret på morfologier. Denne metode omfatter en teknik til at fjerne puparium, som er den ydre chitinous tilfælde af puppe, aktivere detaljeret observation af puppe morfologier. Andet, vi beskrive metoden til at måle varigheden af definerede puppe faser. Endelig vil beskrive vi metode til kvantificering af wing pigmentering baseret på billedanalyse ved hjælp af digitale billeder og ImageJ software. Med disse metoder, kan vi etablere et solidt grundlag for at sammenligne udviklingsprocesser af voksne træk puppe gennemførelsesstadier.
Introduction
Nogle af de morfologiske træk af Drosophila er diversificeret blandt arter1,2,3,4,5. Vi kan nærme sig spørgsmålet om hvordan morfologiske diversitet opstår ved at sammenligne mekanismerne af generation af disse morfologier. Eksempler på sådanne morfologier er larver trichomes, adult sex kamme, ydre kønsorganer apparater, abdominal pigmentering og fløj pigmentering6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. for at studere morfologiske forskelle blandt voksne, observation og analyse af de puppe stadier er vigtige, fordi voksne træk skæbne bestemmes i de sene larve stadier og efterfølgende morfogenese provenuet puppe i perioden.
Udviklingsmæssige biologi studier af Drosophila melanogaster, "timer APF" (timer efter puppe dannelsen) er den fælles metode til at angive en puppe stadie16. Dette system beskæftiger absolutte tid efter puppe dannelse og er meget bekvemt for rutinemæssig eksperimenter. Men udviklingsmæssige hastighed kan variere blandt pupper, og kan blive påvirket af små genetiske, epigenetiske eller microenvironmental forskelle, og derfor har den samme absolutte tid efter puppe dannelse garanterer ikke at pupper er på samme udviklingsstadiet. I mange tilfælde er stadier defineret af morfologiske træk at foretrække frem for at sammenligne flere individer. Især, kræver en sammenligning mellem arter præcise iscenesættelse og sammenligning mellem tilsvarende (homolog) faser.
Bainbridge og Bownes17 anerkendt 20 puppe etaper (P1 til P15(ii)) baseret på morfologiske egenskaber i Drosophila melanogaster pupper. Denne iscenesættelse er det mest udbredte system af morfologiske udviklingsmæssige midlertidige18. I en tidligere undersøgelse udført vi puppe iscenesættelse af Drosophila guttifera for at skabe et grundlag for wing pigmentering undersøgelser19. D. guttifera har en sort prikkede mønster på sine vinger og er en af model arter for wing pigmentering dannelse20. Selv om vi omtales de morfologiske kriterier, der er beskrevet i Bainbridge og Bownes' forskning17, vi målte direkte fase varigheder af serie observationer19, istedet for benytter Bainbridge og Bownes' skøn over scenen varigheder fra observerede frekvens. Her beskriver vi metode til puppe iscenesættelse og måling af varigheder af puppe faser i Drosophila bruges i Fukutomi mfl19.
For at undersøge den udviklingsmæssige mekanisme af wing pigmentering, vi har brug at kende når i puppe eller voksen etaper pigmentering opstår. Fukutomi mfl. 19 kvantificeret optisk tætheder (ODs) af pigmentering i puppe og voksen faser ved billedanalyse af wing billeder. Pigmentering af Drosophila vinger menes at være forårsaget af ophobning af sort melanin21. Til kvantificering af ODs, blev grå-skala billeder og ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/)22 brugt. For at genkende og kvantificere spot-specifikke pigmentering (ΔOD), trække vi OD uden for en plet fra OD inde i en spot. For at gøre denne metode reproducerbare og objektive, skal steder af OD måling bestemmes ved hjælp af wing vener som vartegn. I denne artikel beskriver vi i detaljer denne metode til kvantificering af wing pigmentering i Drosophila guttifera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. flyve lager
- Bruge Drosophila guttifera for alle de følgende protokoller.
- Bruge plastik hætteglas (diameter 25 mm x højde 96 mm) og cellulose stik (diameter 23 mm x højde 26 mm) for stock vedligeholdelse. Brug en standard cornmeal/sukker/gær/agar mad og følge en publikation beskrives tre andre alternative opskrifter for denne art2.
Bemærk: D. guttifera (stock antallet 15130-1971.10) er fastsat af Drosophila arter Stock Center på University of California, San Diego. Selvom D. guttifera hører til immigrans-tripunctata stråling, som er fjernt beslægtet med D. melanogaster inden for slægten23, har det mange biologiske egenskaber til fælles med D. melanogaster . Derfor kan denne protokol anvendes til mange Drosophila arter, selv om nogle arter kræver specifikke fødevarer og/eller tekniske tips til at opretholde dem2.
2. observation af puppe og definition af puppe faser
Bemærk: Pupa for observation er taget fra den flyve materiel vedligeholdes med en 12:12 h lys/mørke cyklus på 25 ° C. Bainbridge og Bownes17 beskrevet en lav risiko for at flytte D. melanogaster pupper fra det oprindelige sted af pupation på et stykke af fugtede silkepapir (97% overlevelse af 946 flyttede pupper). D. guttifera pupper kan tilberede stort set den samme metode.
- Placer raske voksne af Drosophila på friske fødevarer (standard cornmeal/sukker/gær/agar fødevarer) i en plastik hætteglas (diameter 25 mm x højde 96 mm) og lade dem lægge æg. Vente 7 dage til at få slutningen 3rd instars.
- Sted 1 mL af standard cornmeal/sukker/gær/agar mad ind hver 1,5 mL microtube. Lave 3 porer med 2 mm afstand i lågene af microtubes af gennemtrængende med en opslagsnål tillade vejrtrækning.
- Centrifugeres microtubes med mad til 7 s i en mini microcentrifuge (860 x g).
- Vend og hætteglas for at fjerne alle voksne fra hætteglasset.
- Hæld 5-10 mL af Hedeselskabet2O (eller omvendt osmosevand) ind i hætteglasset.
- Udøse larver med vand i en plastik petriskål (diameter 90 mm x højde 15 mm). Identificere sent 3rd instars ved deres store kropsstørrelse (3-4 mm i længden).
- Forsigtigt flytte sent 3rd instar larver med pincet i microtubes med mad (10 larver / microtube). Inkuber dem natten over ved 25 ° C.
- Flytte nydannede pupper på et stykke af silkepapir, der er fugtet med ddH2O og placeret i en plastik petriskål (diameter 35 mm x højde 10 mm).
- Placere en petriskål i et fugtigt kammer (som indeholder 10 mL af Hedeselskabet2O i bunden), og vent indtil pupper udvikle til det ønskede tidspunkt.
- Flytte pupper ind på en fugtet stykke silkepapir i en plastik petriskål (diameter 60 mm x højde 15 mm).
Bemærk: Definition af faser kan hovedsagelig være foretaget på grundlag af faser af D. melanogaster17. Typisk, den puppe periode af Drosophila kan kategoriseres i P1 - P15(ii), selv om nogle ændringer af fase definition ville være påkrævet afhængigt af de arter, der anvendes. Hvis det er muligt muliggør at fjerne puparium præcis og detaljeret observation. Se detaljer nedenfor (trin 3). - Observere pupper under et stereo mikroskop. Tage billeder med et digital kamera knyttet til stereo-mikroskop.
3. fjernelse af puparium
Bemærk: Pupper af Drosophila er omfattet af en struktur, der kaldes puparium. Insekt af Muscomorpha (fluer) kaste ikke sine larver neglebånd på pupation; i stedet, det hærder kutikula efter apolysis, og bruger det som et beskyttende dække af puppe, puparium24. En puppe opholder sig inde i en puparium har en ægte puppe kutikula, som er meget bløde og skrøbelige. Før apolysis finder sted omkring P4(ii), epitheler og puparium knyttes sammen, og derfor fjerne puparium uden skader er meget vanskeligt. Efter P5 er at fjerne puparium besværlig, men nyttig for morfologiske observation og definition af puppe faser. Processen udføres som følger.
- Anbringe et stykke dobbeltsidet tape på et stykke køkkenrulle.
- Placer en puppe dobbeltklæbende tape ventrale side op (figur 1A).
- Find plads mellem den forreste side af puparium og den interne puppe. Forstå og fjerne puparium omkring dette hul, bruge pincet, og afsløre den forreste side af lederen af puppe.
- Indsæt spidsen af en pincet ved at flytte det parallelt med anterior-posterior akse. Løfte spidsen af pincet til lokalt bryde puparium. Gentag denne handling, indtil knækker når den bageste del af puparium. Sikre, at et hul dannes også mellem puparium og puppe ben, og bryde den ventrale side af puparium og minimere skaderne på den interne puppe (figur 1B).
- Efter at bryde puparium så meget som muligt, tage ud puppe ved hjælp af en fin pensel (#5/0) (figur 1 c).
- Læg puppe på et stykke silkepapir, der er fugtet med ddH2O og placeret i en plastik petriskål (diameter 60 mm x højde 15 mm). Tage fotografier hurtigst muligt, fordi den udsatte puppe er sårbare og let bliver tør.
Bemærk: Pupper uden en puparium er ikke egnede til måling af varigheder af puppe perioder (trin 4), fordi stress (såsom udtørring) og fysiske skader kan forstyrre den normale udvikling.
4. måling varigheder af puppe faser
- Forberede pupper måling varigheder af puppe faser som beskrevet i trin 2. Indsamle pupper af 1-2, 2-3, og 3-4 dage efter puppe dannelse (20 pupper hver). Give individuelle identifikationsnumre (1-60) til pupper til identifikation. Fortsat indsamle nyligt dannede pupper under følgende trin, for at opnå 20 flere unge pupper. Give de nydannede pupper individuelle identifikationsnumre (61-80). Læg en puppe på et stykke af Hedeselskabet2O-fugtet silkepapir i en brønd (3,9 cm2) af en 12-godt celle kultur plade (1 puppe/brønd, 12 pupper/plade). Udfylde den indbyrdes godt plads af plader med ddH2O vedligeholde fugtighed, sætte låg på og læg pladerne i 25 ° C, konstant lys (24:0 h lys/mørk) betingelser.
Bemærk: Pupper uden en puparium er ikke egnede til måling af varigheder af puppe perioder. Fjern ikke puparium. - Observere morfologiske funktioner herunder kropsfarve, børster, Malpighian tubuli og gule krop af alle pupper når først al mulig 30 min, og post observerede faser (P1 - P15(ii), baseret på referencer17,19) i en stemmeoversigten.
- Fortsætte optagelsen over fire straight dage (96 timer) af et roterende skift af tre (eller flere) personer.
- Tælle antallet af poster i hver især fase, og den gennemsnitlige dem (gennemsnitligt antal observationer / pupper). Multiplicer dem med 0,5 (h), hvilket resulterer i de anslåede længder af stadier (h).
5. måling af intensiteten af sorte pletter på en vinge
Bemærk: Intensiteten af sorte pletter på en puppe eller voksen fløj kan kvantificeres ved at måle optisk densitet (OD). Et glas filter med kendte ODs (stepped tæthed filter) anvendes til kalibrering25, således at man kan beregne OD af et bestemt område fra et digitalt billede af en vinge. OD i en spot og OD uden for stedet måles, og sidstnævnte er trukket fra den tidligere at få intensiteten af stedet (ΔOD). Her, beskrive vi metoden af dissektion, måling og beregning af ΔOD. Denne procedure kan gøres efter trin 2, uafhængige fra trin 3 og trin 4. Når man har udført trin 2 og forstår alle puppe faser, kan en direkte start eller gentage trin 5.
- Billede forberedelse
- Forberede en ny puppe af en fokal stadium, som beskrevet i trin 2. Fjern den forreste del af en puparium med pincet. Tegne en puppe med pincet og læg det i fosfatbufferet saltopløsning (PBS, tabel 2) i en plast petriskål (diameter 35 mm x højde 10 mm).
- Skære rodled af en vinge (rodled er den smalle proksimale del af vingen). Da fløjen er foldet, læg det i en plastik petriskål (diameter 35 mm x højde 10 mm) fyldt med ddH2O til at udvide det osmotiske tryk (fløjen udfolder sig selv).
- Indsamle nyligt eclosed voksne en gang hver 10 min fra et lager hætteglas. Bedøver en flue med CO2 ved hjælp af et CO2 bedøve pad, Bekræft anesthetization ved stilstand og skære rodled af en vinge.
- Sted 10 µL af PBS på et glas dias, placere fløjen der, og dække med et cover slip (18 mm x 18 mm).
- Tænde lys af stereo-mikroskop. Indstille lyset til at være på maksimalt niveau. Sæt mål linse 11,5 X. Indstille membran til at være det mest åbne land. Tænd kameraet. Indstille kameraet til at være (ISO: 100, mode SHQ 3136 x 2352 pixels, Lukkerhastighed: 1/20 s). Fokusere på prøve ved at flytte fokus knop af mikroskopet.
- Skub udløserknappen på fjernbetjening til at tage et billede. Tage 3 billeder pr vinge, hvoraf hver skal være centreret om en campaniform sensillum, langsgående Åre spot eller bageste crossvein, placerer den distale del af vingen på venstre side og den forreste del af fløjen på oversiden.
- Kalibrering
- Tage billeder af 9 dele af en intensiveret tæthed filter ved hjælp af samme kameraindstillinger bruges til at få fløj billedet.
- Indlede ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/)22.
- Klik på fil | Åben | og vælg et af billederne af stepped tæthed filter.
- Klik på billedet for | Type | 8-bit | at konvertere billedet til et 8-bit billede.
- Klik på Rediger | Udvalg | Angive | og kontrollere Oval og centreret kolonne. Skriv 100 (pixel) i bredde kolonne, 100 (pixels) i højden kolonne, 1568 i X koordinere kolonne og 1176 Y koordinere kolonne. Klik på OK.
- Klik på analyser | Foranstaltning |. Den "mener grå værdi" af udvalgte områder er målt.
- Gentag 5.2.3. til 5.2.6. resterende billeder til 8.
- Klik på analyser | Kalibrere og vælg Rodbard25 i funktionen kolonne og skrive følgende nummer i den højre kolonne i midten (0,04, 0.336, 0.632, 0.928, 1.224, 1.52, 1.816, 2.112, 2.408; disse tal afhænger tætheder af de trådte tæthed filter).
- Kontrollere, globale kalibrering kolonne, og klik på OK.
Bemærk: Ved at udføre denne procedure, "mener grå værdi" omdannes til "optisk densitet (OD)" ved hjælp af funktionen Rodbard. Efter dette trin kan ekstinktionen beregnes for et markeret område i ImageJ software.
- At vælge område af målinger
Bemærk: Steder er typisk forbundet med campaniform sensilla, langsgående Åre tips og crossveins. Disse og andre seværdigheder på en vinge kan bruges til at vælge regionen af målinger. Her, et eksempel iD. guttifera(Figur 2) er beskrevet.- Definition af punkt A, campaniform sensillum stedet.
- Åbn et billede er som en campaniform sensillum plet i midten af billedet. Klik på billedet for | Type | 8-bit | at konvertere billedet til et 8-bit billede.
- Klik på rektangel i Området markeringsværktøjer og tegne et rektangel. Indstille øverste venstre toppunktet af rektanglet, så det er knyttet til den bageste linje af tredje langsgående venen og mere distale fra en campaniform sensillum stedet. Angive højre side af rektanglet, så det er placeret til højre for den campaniform sensillum spot.
- Klik på Rediger | Udvalg | Tilføje til Manager |. Kontrollere Vis alle kolonne.
- Klik på vinkel værktøj i Linje markeringsværktøjerne. Trække den første linje på den bageste linje af tredje langsgående vene. Sæt venstre slutpunkterne på linjen på toppunktet af rektanglet trukket i trin 1. Trække den anden linje på den øvre side af rektanglet. Tryk på "m"-tasten til at måle vinklen mellem de to streger i dette trin. Klik i vinduet af billedet på skærmen på computeren.
- Klik på Rediger | Udvalg | Tilføje til Manager |.
- Klik på rektangel i Området markeringsværktøjer og tegne et rektangel med ca 1/9 størrelse i billedvinduet. Klik på Rediger | Udvalg | Rotere |. Skriv vinklen målt i trin 5.3.1.4 minus grader. i vinkel kolonne, og klik på OK for at rotere det rektangel, der er tegnet i dette trin.
- Flyt rektanglet trukket i trin 5.3.1.6. ved hjælp af piletasterne. Indstille slutpunktet for den bageste linje af den anden langsgående vene på venstre side af rektanglet og den nedre side af rektanglet er knyttet til den bageste linje af den tredje langsgående vene. Bekræfte, at en vinkelret linje fra slutpunktet for den anden langsgående vene til den bageste linje af den tredje langsgående vene er trukket i denne procedure. Definere foden af den vinkelrette linje som punkt A (figur 2A).
- Optage x-koordinaten og y-koordinaten for punkt A, anført nedenfor Område markeringsværktøjer , når du placerer markøren på punkt A.
- Definition af punkt B, langsgående Åre tip spot
- Åbn et billede, hvor en langsgående Åre tip spot er i midten af billedet. Klik på billedet for | Type | 8-bit | til at konvertere billedet til et 8-bit billede.
- Gentag den samme procedure beskrevet taktfast 5.3.1. (Definition af litra A, campaniform sensillum spot) at finde punkt A i billedet.
- Klik på Rediger | Udvalg | Tilføje til Manager |.
- Klik på rektangel i Området markeringsværktøjer og tegne et rektangel. Sæt øverste venstre toppunktet af rektanglet på slutpunktet for den bageste linje af den tredje langsgående vene.
- Klik på Rediger | Udvalg | Tilføje til Manager |.
- Klik på vinkel værktøj i Linje markeringsværktøjerne. Trække den første linje til at forbinde punkt A og slutpunktet for den bageste linje af den tredje langsgående vene. Definere denne linje som linje A. tegne den anden linje på den øvre side af rektanglet trukket i trin 5.3.2.4. Tryk på "m" for at måle vinklen mellem de to linjer.
- Klik på Rediger | Udvalg | Tilføje til Manager |.
- Klik på rektangel i Området markeringsværktøjer og tegne et rektangel med ca 1/9 størrelse i billedvinduet. Klik på Rediger | Udvalg | Rotere |. Skrive de minus grader af vinklen målt i trin 5.3.2.6. i vinkel kolonne, og klik på OK for at rotere det rektangel, der er tegnet i dette trin. Flyt rektanglet ved hjælp af piletasterne. Angiv den øvre side af rektanglet, så det er knyttet til linje A og slutpunktet for den forreste linje af den fjerde langsgående Åre, så det er på venstre side af rektanglet.
- Klik på Rediger | Udvalg | Tilføje til Manager |.
- Klik på rektangel i Området markeringsværktøjer og tegne et rektangel med ca 1/9 størrelse i billedvinduet. Klik på Rediger | Udvalg | Rotere |. Skrive de minus grader af vinklen målt i trin 6 i vinkel kolonne, og klik på OK for at rotere det rektangel, der er tegnet i dette trin. Flyt rektanglet ved hjælp af piletasterne. Angive det nederste venstre toppunktet af rektanglet, så det er på den øverste venstre vertex rektanglets trukket i trin 5.3.2.8., resulterende i at opnå den vinkelrette linje fra slutpunktet for den forreste linje af den fjerde langsgående vene linje A. definere den skæringspunktet for den vinkelrette linje og den bageste linje af den tredje langsgående retning som punkt B (figur 2B).
- Optage x-koordinaten og y-koordinaten for punkt B, anført nedenfor Område markeringsværktøjer , når du placerer markøren på punkt B.
- Definition af punkt C, bageste crossvein spot
- Åbn et billede er hvor en posterior crossvein plet i midten af billedet. Klik på billedet for | Type | 8-bit | til at konvertere billedet til et 8-bit billede.
- Definere punkt C som posterior-mest punkt af den forreste linje af den fjerde langsgående Åre i området krydset af de bageste crossvein og den fjerde langsgående vene (figur 2 c).
- Optage x-koordinaten og y-koordinaten for punkt C, anført nedenfor Område markeringsværktøjer , når du placerer markøren på punkt C.
- Definition af punkt D, kontrolområdet
- Åbn et billede er som en campaniform sensillum plet i midten af billedet. Klik på billedet for | Type | 8-bit | at konvertere billedet til et 8-bit billede.
- Klik på lige linje udvælgelse værktøjer og tegne en linje, der forbinder slutpunktet for den forreste linje af den anden langsgående Åre og slutpunktet for den bageste linje af den fjerde langsgående vene. Definere punkt D som overgangsstedet af denne og den bageste linje af den tredje langsgående vene (figur 2D).
- Optage x-koordinaten og y-koordinaten for punkt D, angivet nedenfor Område markeringsværktøjer , når du placerer markøren på punkt D.
- Definition af punkt A, campaniform sensillum stedet.
- Målinger
- Åbn et af billederne af wing steder (for måling af punkt A, åbne billedet med punkt A i midten). Klik på billedet for | Type | 8-bit | at konvertere billedet til et 8-bit billede.
- Klik på rektangel i Området markeringsværktøjer og tegne et rektangel med ca 1/9 størrelse i billedvinduet.
- Klik på Rediger | Udvalg | Angive |. Kontrollere Oval og centreret kolonne. Skrive 100 (pixel) i bredden og højden kolonner, Skriv x-koordinaterne af punkt A (eller punkt B eller litra C) og D i X koordinere kolonne og skrive y koordinater af Point A (eller punkt B eller litra C) og D Y koordinere kolonne. Klik på OK.
- Klik på analyser | Foranstaltning |. Hvis kalibreringen beskrevet i 5.2 er allerede blevet færdig, angives ODs i betyde kolonne.
- Beregne ΔODs ved at fratrække OD af punkt D fra ODs af A, B og C.
Bemærk: Punkt D er i en gennemsigtig del af vingen og omfatter ikke pigmentering, og er derfor velegnet til en baggrund kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den puppe periode af D. guttifera er inddelt i 17 faser (P1 - P15(ii), billeder af tre repræsentant faser (P1, P5 - 6, P10) er vist figur 3, og alle 17 trin er illustreret i figur 4). Selvom Bainbridge og Bownes17 anerkendt 20 etaper i D. melanogaster, kunne nogle af disse faser ikke anvendes til D. guttifera. Rækkefølgen af to udviklingsmæssige begivenheder, udseendet af det gule legeme (masse skur celler inden for midgut26) og timing af Malpighian tubuli dreje grønne, er ikke strengt kontrolleret i D. guttifera, og derfor kan vi ikke adskille P5 (jeg ), P5(ii) og P6. Også, i modsætning til i D. melanogaster, timingen af sværtning af thorax og abdominale børster var synkroniseret, og derfor kan vi ikke adskille P11(i) og P11(ii)19.
Vi kunne måle længden af puppe stadier af D. guttifera (tabel 3, fra Fukutomi et al.19). Hele puppe perioden er ca. 20 h længere end D. melanogaster på 25 ° C17. Vi beregnede ΔODs af områder omkring en campaniform sensillum, langsgående Åre tip og bageste crossvein. Her, viser vi ODs og ΔODs i voksne 7 dage efter eclosion (tabel 4). Ved at sammenligne data i flere etaper, vi fandt, at fase P12(i) er tidspunktet for indtræden af pigmentering, og at pigmentering er afsluttet af 24 timer efter eclosion (figur 5, fra de oprindelige målinger bruges i Fukutomi mfl. 19).
Figur 1. Illustration af at fjerne puparium. (A) Placer en puppe ventrale side op på et stykke dobbeltsidet tape. Fjern den forreste del af puparium. (B) bryde puparium med pincet fra den ventrale side. C efter at bryde puparium, tegne en puppe ved hjælp af et paintbrush. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Definition af område til måling af pigmentering. A punkt A til et sted, der er forbundet med en campaniform sensillum. B punkt B til et sted, der er forbundet med langsgående Åre spids. C litra C for en plet, der er tilknyttet en bageste crossvein. (D) punkt D til et kontrolområde. Skalaen angiver 250 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Eksempler på definerede puppe stadier. (A) puppe af fase P1 dækket med puparium. B puppe af fase P5 - 6. C puppe af fase P10. Puparia er fjernet før observation i (B) og (C). Skalaen angiver 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Illustrationer af 17 puppe faser identificeres i D. guttifera. (A) P1, puparium er hvide. (B) P2, farven på puparium er lys brun. (C) P3, en boble er observeret i den lateral side (sort pilespids). (D) P4(i), boblen er større end i P3 (sort pilespids), og puppe er blomstrende i PBS. (E) P4(ii), et hul er observeret i den forreste del (sort pilespids) og den bageste del (grå pilespids). (F) P5 - 6, Malpighian tubuli migrere (svært at se hvis er omfattet af puparium). Den puppe figur er dannet af puppe epitel og puppe neglebånd. (G) P7, det gule legeme kan iagttages i den dorsale side (sort pilespids). (H) P8, øjnene er gule. (I) P9, øjnene er amber. (J) P10, øjnene er røde. (K) P11, Orbital og ocellar børster (grå pilespids), vibrissae, thorax macrochaetae (sort pilespids) og tarsal børster er sort og synlige. (L) P12(i), spidsen af vingerne er grå. (M) P12(ii), alle dele af vingerne er grå (sort pilespids). (N) P13, vingerne er helt sort. (O) P14, hovedet og benene er helt formørket. (P) P15(i), mekonium kan observeres på den dorsale del af maven (sort pilespids). Q P15(ii), fluen er eclosing. Nærmere oplysninger om disse faser blev beskrevet i Fukutomi mfl. 19 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Udvikling af pigmentering omkring en companiform sensillum på en vinge. Cirkler angive individuelle ΔODs, og vandrette søjler indikerer gennemsnittene. P10: n = 10, P11: n = 10, 12(i): n = 10, P15(i): n = 11, 3 h: n = 8, 24 h: n = 7, 7 dage: n = 10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Komponent | |
| Hvid blød sukker | 51.6 g |
| Majsmel | 172.4 g |
| Majs gryn - C | 86,4 g |
| Tørre øl gær | 106 g |
| Agar pulver | 35.28 g |
| Hedeselskabet2O | 4000 mL |
| Kog i 30 min. og lad det køle ned til 70 ° C. | |
| Tilføje 4 g af butyl-p-hydroxybenzoat opløses i 40 mL ethanol. | |
| Bland godt og hæld 9 mL i plastik hætteglas (diameter 25 mm x højde 96 mm). | |
Tabel 1. Sammensætningen af standard cornmeal/sukker/gær/agar fødevarer.
| Komponent | Beløb |
| NaCl | 80 g |
| KCl | 2 g |
| Na2HPO4·12H2O | 29 g |
| KH2PO4 | 2 g |
| Hedeselskabet2O | op til 10 L |
| Indstil pH 7,4 |
Tabel 2. Sammensætningen af PBS (1 X).
| Fase | Mener af varighed (h) | s.d. | n |
| P1 - 2 | 1.7 | 0,65 | 16 |
| P3 | 2.1 | 0,65 | 16 |
| P4(i) | 2.1 | 1.69 | 19 |
| P4(II) | 0,3 | 0,28 | 29 |
| P5 - 6 | 5.0 | 3,07 | 30 |
| P7 | 31,9 | 7.22 | 46 |
| P8 | 9.6 | 2,81 | 57 |
| P9 | 10.9 | 2.66 | 55 |
| P10 | 11.7 | 2.96 | 39 |
| P11 | 4.4 | 2,81 | 44 |
| P12(i) | 1.1 | 0,76 | 44 |
| P12(II) | 2.0 | 0.70 | 43 |
| P13 | 2.2 | 0,68 | 10 |
| P14 - 15(i) | 28,6 | 2,75 | 10 |
| P15(II) | 1.4 | 0.87 | 10 |
| I alt | 121.7 |
Tabel 3. Målt varigheder af puppe faser af D. guttifera.
| OD | ΔOD | |||||||
| Campaniform sensilum | Langsgående Åre tip | Bageste crossvein | Kontrol | Campaniform sensilum | Langsgående Åre tip | Bageste crossvein | ||
| Enkelte | (Punkt A) | (Punkt B) | (Punkt C) | (Punkt D) | (Punkt A - punkt D) | (Punkt B - punkt D) | (Punkt C - punkt D) | |
| 1 | 0.549 | 0.484 | 0.515 | 0.256 | 0.293 | 0.228 | 0.259 | |
| 2 | 0.529 | 0.489 | 0.516 | 0.254 | 0,275 | 0.235 | 0.262 | |
| 3 | 0.546 | 0,48 | 0.533 | 0.255 | 0.291 | 0,225 | 0.278 | |
| 4 | 0,583 | 0.496 | 0.566 | 0.255 | 0.328 | 0.241 | 0,311 | |
| 5 | 0.523 | 0.479 | 0.528 | 0.235 | 0.288 | 0.244 | 0.293 | |
| 6 | 0.572 | 0.509 | 0.546 | 0,265 | 0.307 | 0.244 | 0,281 | |
| 7 | 0.568 | 0,511 | 0,56 | 0.256 | 0.312 | 0.255 | 0.304 | |
| 8 | 0,56 | 0.507 | 0.562 | 0,27 | 0,29 | 0.237 | 0.292 | |
| 9 | 0.551 | 0,485 | 0.569 | 0.259 | 0.292 | 0.226 | 0.31 |
Tabel 4. Målt ODs og ΔODs af D. guttifera voksne 7 dage efter eclosion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her protokoller til definition af puppe stadier, at fjerne puparium for detaljeret observation, måling varigheder af puppe faser, og måling af intensiteten af sorte pletter på wing i D. guttifera. Disse protokoller kan anvendes til mange Drosophila og relaterede flyve arter, navnlig arter med wing pigmentering.
Grundig observation og beskrivelse af mere detaljerede udviklingsmæssige begivenheder ville give yderligere underopdeling af faser. I mange tilfælde en udviklingsmæssig begivenhed kræver dissektion eller skæring af en puppe er ikke egnet til fase definition, fordi man skal dræbe en puppe for iscenesættelse, og yderligere brug af pågældende er vanskeligt. For brug af en ny Drosophila art, bør man ansætte udviklingsmæssige begivenheder kan skelnes fra uden for puparium som det første skridt. Afhængigt af formålet med undersøgelsen, kan en derefter yderligere Underinddel faser baseret på særlige organogenesis eller andre udviklingsmæssige begivenheder.
For artskrydsede sammenligning af flere faser er en potentielle vanskeligheder en omvending af udviklingsmæssige begivenheder blandt arter (heterochrony27). For eksempel, i D. melanogaster, Malpighian tubulus bliver grønne og så det gule legeme bliver synlige, der henviser til, at denne ordre kan inverteres i nogle pupper D. guttifera19. I dette tilfælde er strenge sammenligning mellem homologt faser vanskeligt. Afhængigt af fænomenet med interesse, man kan være nødvendigt at re-definere eller underopdele en bestemt fase baseret på en udviklingsmæssig begivenhed. For eksempel kan vi nogenlunde Vælg pupper af P5 - 6 og gøre artskrydsede sammenligning af genet udtryk i puppe vinger med wing morfologi som en indikator for udviklingsmæssige timing14.
Det tager typisk 10-30 min til at fjerne puparium. Hvis man ønsker at observere en kort fase, bør pupper udarbejdes under hensyntagen til den tid, der går under puparium fjernelse. For eksempel, hvis man ønsker at observere P12(i) af D. guttifera, som har kun 1,1 h varighed, kan forberede pupper på P11 ville give et godt resultat.
I vores protokol anvendes fugtede silkepapir som baggrund for puppe billeder. Afhængigt af fase af observation og strukturer man ønsker at vise i en figur, kan man bruge hvid eller sort silkepapir. For P3 P4(ii) overgangen, placeringen af boblen i puppe er vigtigt for at adskille faser og sort silkepapir hjælper med at observere placeringen af boblen. For etaper efter P5 er hvidt silkepapir bedre, fordi det bidrager til at observere gule krop, øjenfarve, børster og kropsfarve.
Bainbridge og Bownes17 anslået varighed af puppe stadier fra deres hyppighed af udseende. Deres midlertidige tabel er den mest udbredte til D. melanogaster18. For deres metode, de udarbejdet fire mad flasker der indeholder fem voksne hunner og fem voksne mænd og holdt dem i mørke, og derefter pupper blev tilfældigt taget fra en flaske på 11, 12, 13 og 14 dage efter symptomdebut æglægning. De tælles antallet af pupper i særlige stadier, og beregnet gennemsnit. Længden af hver puppe stadie kan anslås baseret på data om den samlede varighed af den periode, puppe og disse frekvens. Et problem med denne metode er, at det ikke kan bruges til at vurdere den præcise varighed af puppe faser hvis udviklingsmæssige timing tendens til at blive synkroniseret blandt pupper.
I virkeligheden, vi prøvede Bainbridge og Bowness metode i D. guttifera, og vi fik tendentiøse data på grund af synkronisering mellem pupper. Vi kunne ikke identificere årsagen til dette fænomen, men nogle muligheder er 1) pupper beholdes døgnrytme fra deres unge scenen og/eller 2) de reagerede udsættelse for lys, der fandt sted på observation. Derfor besluttede vi at måle faktiske fase varighed af direkte observation. Dette minimerer bias forårsaget af døgnrytme.
Metoden beskrevet her er en metode til at kvantificere ekstra ophobning af melanin i steder i forhold til deres omkringliggende kontrolområdet (ΔOD), ved at fratrække OD af kontrolområdet fra OD af spot-området. Denne metode var inspireret af en metode til kvantificering af nukleare DNA indhold af Feulgen farvning og billede analyse (densitometri28,29). Som en af de potentielle problemer for at anvende denne metode på wing pigmentering, kan ΔOD være en negativ værdi, især når en puppe er meget ung og har næsten ingen pigmentering. I senere faser, kunne der være nogle pigmentering i kontrolområdet. Brugen af den simple OD af selve stedet området kan være passende i stedet for ΔOD afhængigt af formålet med undersøgelsen. Ved D. guttifera, ændre brugen af simple OD i stedet for ΔOD ikke tendensen til dataene eller konklusionerne af undersøgelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Sean B. Carroll og Thomas Werner for at levere flyve bestande, Naoyuki Fuse til udstyr, Byung Seok Jin for hans hjælp til at filme, Kiyokazu Agata til mentorordninger og Elizabeth Nakajima for Dansk redigering. Dette arbejde blev støttet af KAKENHI 17K 19427 og Takeda Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits - C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits - C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 - 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
- Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. Hecht, M. K., Steere, W. C. , Springer (Meredith Corporation). New York. 437-543 (1970).
- Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: a guide to species identification and use. , Academic Press. New York. (2006).
- Patterson, J. T. The Drosophilidae of the southwest. 4313, University of Texas Publication. 7-216 (1943).
- Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
- Werner, T., Jaenike, J. Drosophilids of the Midwest and Northeast. , River Campus Libraries, University of Rochester. Rochester. (2017).
- Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
- Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136 (2015).
- Gompel, N., Prud'homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
- Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
- Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
- Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
- McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
- Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
- Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
- Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).
- Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
- Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. Sekimura, T., Nijhout, H. F. , Springer. New York. in press (2017).
- True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051 (2016).
- Resh, V. H., Cardé, R. T. Encyclopedia of Insects. , 2nd ed, Academic Press. Burlington. (2009).
- DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
- McKinney, M. L., McNamara, K. Heterochrony: the evolution of ontogeny. , Plenum Press. New York. (1991).
- Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners' guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
- Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).
