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Biology

ुपाल समय और Drosophila guttifera के पंख रंजकता की माप मचान के लिए तरीके

Published: January 24, 2018 doi: 10.3791/56935
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,3,4
1Graduate School of Science, Kyoto University, 2Graduate School of Science, Osaka City University, 3The Hakubi Center for Advanced Research, Kyoto University, 4Graduate School of Environmental Science, Hokkaido University

Summary

ुपाल समय और Drosophila guttifera की विंग रंजकता की माप मचान के लिए प्रोटोकॉल वर्णित हैं । स्टैगिंग और रंजकता के ठहराव वयस्क लक्षण के विकासात्मक तंत्र का अध्ययन करने और विशेषता के विकास के एक विशिष्ट तुलना सक्षम करने के लिए एक ठोस आधार प्रदान करते हैं ।

Abstract

Drosophila की विविध प्रजातियों (फल मक्खी) विकास के तंत्र और आनुवंशिक परिवर्तन के लिए जिंमेदार बदलाव के अध्ययन के लिए अवसर प्रदान करते हैं । विशेष रूप से, वयस्क मंच एक विशिष्ट तुलना के लिए रूपात्मक लक्षण का एक समृद्ध स्रोत है, पंख रंजकता तुलना सहित । प्रजातियों के बीच विकासात्मक मतभेदों का अध्ययन करने के लिए, विस्तृत अवलोकन और उचित मचान सटीक तुलना के लिए आवश्यक हैं । यहाँ हम ुपाल समय और एक पोल्का-बिंदीदार फल मक्खी में विंग रंजकता के ठहराव के मचान के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन, Drosophila guttifera. सबसे पहले, हम विस्तृत रूपात्मक अवलोकन और morphologies के आधार पर ुपाल चरणों की परिभाषा के लिए विधि का वर्णन । इस विधि में puparium को हटाने के लिए एक तकनीक शामिल है, जो pupa का बाहरी chitinous मामला है, ुपाल morphologies का विस्तृत अवलोकन करने में सक्षम है । दूसरा, हम परिभाषित ुपाल चरणों की अवधि को मापने के लिए विधि का वर्णन । अंत में, हम डिजिटल छवियों और ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि विश्लेषण के आधार पर विंग रंजकता के ठहराव के लिए विधि का वर्णन । इन तरीकों के साथ, हम ुपाल चरणों के दौरान वयस्क लक्षण के विकास की प्रक्रिया की तुलना के लिए एक ठोस आधार स्थापित कर सकते हैं ।

Introduction

Drosophila के रूपात्मक लक्षण के कुछ प्रजातियों के बीच विविध रहे है1,2,3,4,5। हम कैसे रूपात्मक विविधता इन morphologies की पीढ़ी के तंत्र की तुलना से उठता है के सवाल का दृष्टिकोण कर सकते हैं । इस तरह के morphologies के उदाहरण हैं लार्वा trichomes, वयस्क सेक्स कंघी, बाहरी जननांग तंत्र, उदर रंजकता, और पंख रंजकता6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. वयस्कों के बीच रूपात्मक मतभेदों का अध्ययन करने के लिए, अवलोकन और ुपाल चरणों का विश्लेषण महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि वयस्क लक्षण के भाग्य देर लार्वा चरणों में निर्धारित किया जाता है और ुपाल अवधि के दौरान बाद morphogenesis आय.

विकासात्मक जीवविज्ञान अध्ययन में Drosophila melanogaster, "घंटे APF" (ुपाल गठन के बाद घंटे) आम तरीका है एक ुपाल मंच16से संकेत मिलता है । यह प्रणाली ुपाल गठन के बाद निरपेक्ष समय कार्यरत है और दिनचर्या के प्रयोगों के लिए बहुत सुविधाजनक है । हालांकि, विकास की गति कोषस्थों के बीच अलग हो सकता है, और मामूली आनुवंशिक, epigenetic या microenvironmental मतभेदों से प्रभावित हो सकता है, और इसलिए ुपाल गठन के बाद एक ही निरपेक्ष समय होने की गारंटी नहीं है कि कोषस्थों एक ही हैं विकासात्मक अवस्था । कई मामलों में, रूपात्मक सुविधाओं द्वारा परिभाषित चरणों कई व्यक्तियों की तुलना के लिए बेहतर कर रहे हैं । विशेष रूप से, प्रजातियों के बीच एक तुलना सटीक मचान और इसी (मुताबिक़) चरणों के बीच तुलना की आवश्यकता है ।

Bainbridge और Bownes17 मान्यता प्राप्त 20 ुपाल चरणों (P1 to P15 (ii)) के आधार पर रूपात्मक Drosophila melanogaster की कोषस्थों सुविधाओं पर आधारित है । इस मचान रूपात्मक विकास मचान के सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रणाली है18। पिछले एक अध्ययन में, हम विंग रंजकता अध्ययन19के लिए एक आधार स्थापित करने के लिए Drosophila guttifera के ुपाल मचान प्रदर्शन किया । D. guttifera अपने पंखों पर एक काले पोल्का डॉट पैटर्न है और विंग रंजकता गठन20के लिए मॉडल प्रजातियों में से एक है । हालांकि हम रूपात्मक Bainbridge और ' Bownes अनुसंधान17में वर्णित मानदंडों को भेजा, हम सीधे धारावाहिक प्रेक्षणों19, के बजाय Bainbridge और मंच अवधि के Bownes ' आकलन का उपयोग कर के स्तर की अवधि मापा से मनाया आवृत्ति । यहां हम ुपाल मचान और Fukutomi एट अल19में प्रयुक्त Drosophila के ुपाल चरणों की अवधि के माप की विधि का वर्णन ।

विंग रंजकता के विकास तंत्र का अध्ययन करने के लिए, हमें पता है जब ुपाल या वयस्क चरणों में रंजकता होता है की जरूरत है । Fukutomi एट अल. विंग छवियों की छवि विश्लेषण द्वारा ुपाल और वयस्क चरणों के दौरान रंजकता की 19 मात्रा ऑप्टिकल घनत्व (ODs) । Drosophila पंखों की रंजकता काले मेलेनिन21के संचय के कारण होने लगा है । ODs, ग्रे-स्केल इमेजेस और ImageJ सॉफ्टवेयर (https://imagej.nih.gov/ij/) के ठहराव के लिए22 का इस्तेमाल किया गया । पहचान और स्पॉट विशिष्ट रंजकता (ΔOD) यों तो, हम एक स्थान के अंदर आयुध डिपो से एक स्थान के बाहर आयुध डिपो घटाना । इस विधि को प्रतिलिपि और उद्देश्य बनाने के लिए, आयुध डिपो की माप के स्थान को पंख की नसों के रूप में उपयोग करके निर्धारित किया जाना चाहिए । इस आलेख में, हम विस्तार में Drosophila guttiferaमें विंग रंजकता के ठहराव की इस विधि का वर्णन ।

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Protocol

1. फ्लाई स्टॉक

  1. सभी निंन प्रोटोकॉल के लिए Drosophila guttifera का उपयोग करें ।
  2. प्लास्टिक शीशियों का उपयोग करें (व्यास 25 मिमी x ऊंचाई ९६ मिमी) और फाइबर प्लग (व्यास 23 मिमी x ऊंचाई 26 मिमी) स्टॉक रखरखाव के लिए. एक मानक cornmeal/चीनी/खमीर/आगर भोजन का उपयोग करें और एक प्रकाशन का पालन करें इस प्रजाति के लिए तीन अंय वैकल्पिक व्यंजनों2।
    नोट: D. guttifera (स्टॉक संख्या 15130-1971.10) कैलिफोर्निया, सैन डिएगो के विश्वविद्यालय में Drosophila प्रजातियों के शेयर केंद्र द्वारा प्रदान की जाती है । हालांकि d. guttifera immigrans-tripunctata विकिरण है, जो दूर से जीनस23के भीतर डी. melanogaster से संबंधित है के अंतर्गत आता है, यह आम में कई जैविक गुण है डी melanogaster के साथ . तदनुसार, इस प्रोटोकॉल कई Drosophila प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है, हालांकि कुछ प्रजातियों के विशिष्ट भोजन और/

2. pupa और ुपाल चरणों की परिभाषा का अवलोकन

नोट: अवलोकन के लिए pupa मक्खी स्टॉक से लिया जाता है 25 डिग्री सेल्सियस पर एक 12:12 ज प्रकाश/अंधेरे चक्र के साथ बनाए रखा । Bainbridge और Bownes17 डी. melanogaster कोषस्थों के मूल स्थान से कोषस्थ के एक टुकड़े पर भिगोया ऊतक कागज (९४६ के ९७% अस्तित्व कोषस्थों चले गए) पर ले जाने के एक कम जोखिम का वर्णन किया । D. guttifera कोषस्थों को मूलतः इसी विधि द्वारा तैयार किया जा सकता है ।

  1. एक प्लास्टिक की शीशी (व्यास 25 मिमी x ऊंचाई ९६ मिमी) में ताजा भोजन (मानक cornmeal/चीनी/खमीर/आगर भोजन) पर Drosophila के स्वस्थ वयस्कों प्लेस और उंहें अंडे देना । देर से 3 सितारों को प्राप्त करने के लिए 7 दिन रुको ।
  2. प्रत्येक १.५ मिलीलीटर microtube में मानक cornmeal/चीनी/खमीर/आगर भोजन के 1 मिलीलीटर रखें । सांस लेने की अनुमति देने के लिए एक पुश-पिन के साथ मर्मज्ञ द्वारा microtubes के ढक्कन में 2 मिमी रिक्ति के साथ 3 pinholes बनाओ ।
  3. एक मिनी microcentrifuge में 7 एस के लिए भोजन के साथ microtubes केंद्रापसारक (८६० x जी) ।
  4. शीशी से सभी वयस्कों को दूर करने के लिए पलटना और नल शीशियों ।
  5. शीशी में ddH2ओ (या रिवर्स असमस पानी) के 5-10 मिलीलीटर डालो ।
  6. एक प्लास्टिक पेट्री डिश में पानी के साथ लार्वा बाहर डालो (व्यास ९० मिमी x ऊंचाई 15 मिमी) । उनके बड़े शरीर का आकार (लंबाई में 3-4 mm) द्वारा देर से 3 सितारों की पहचान करें ।
  7. धीरे संदंश के साथ देर से 3 instar लार्वा भोजन के साथ microtubes में ले जाएं (10 लार्वा/microtube) । उंहें 25 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की मशीन ।
  8. ऊतक कागज है कि ddH द्वारा गीला किया गया है के एक टुकड़े पर नव गठित कोषस्थों हटो2हे और एक प्लास्टिक पेट्री डिश (व्यास ३५ mm x ऊंचाई 10 मिमी) में रखा गया है ।
  9. एक नम कक्ष में पेट्री डिश प्लेस (ddH के 10 मिलीलीटर के नीचे में2) युक्त), और जब तक कोषस्थों वांछित चरण के लिए विकसित रुको ।
  10. एक प्लास्टिक पेट्री डिश में टिशू पेपर का एक गीला टुकड़ा पर कोषस्थों हटो (व्यास ६० मिमी x ऊंचाई 15 मिमी) ।
    नोट: चरणों की परिभाषा ज्यादातर D. melanogasterके चरणों के आधार पर किया जा सकता है17. आमतौर पर, ुपाल अवधि के Drosophila P1-P15 (ii) में वर्गीकृत किया जा सकता है, हालांकि मंच परिभाषा के कुछ संशोधनों का इस्तेमाल प्रजातियों के आधार पर आवश्यक होगा । यदि संभव हो, puparium को हटाने सटीक और विस्तृत अवलोकन सक्षम बनाता है । नीचे विवरण देखें (चरण 3) ।
  11. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत कोषस्थों निरीक्षण । एक डिजिटल स्टीरियो माइक्रोस्कोप से जुड़ी कैमरे का उपयोग तस्वीरें ले लो ।

3. puparium निकालना

नोट: Drosophila का कोषस्थों puparium नामक संरचना द्वारा कवर किया जाता है । Muscomorpha (मक्खियों) का एक कीट कोषस्थ पर अपने लार्वा छल्ली शेड नहीं है; इसके बजाय, यह apolysis के बाद छल्ली को मज़बूत करता है, और यह pupa, puparium24के सुरक्षात्मक आवरण के रूप में उपयोग करती है । एक puparium अंदर रहने वाले एक pupa एक सच्चे ुपाल छल्ली है, जो बहुत नरम और नाजुक है । इससे पहले apolysis पी 4 के आसपास जगह लेता है (द्वितीय), epithelia और puparium एक साथ संलग्न हैं, और इसलिए क्षति के बिना puparium को हटाने बहुत मुश्किल है । P5 के बाद, puparium को हटाने श्रमसाध्य है, लेकिन रूपात्मक अवलोकन और ुपाल चरणों की परिभाषा के लिए उपयोगी है । इस प्रक्रिया को निम्नानुसार किया जाता है ।

  1. प्रत्यय कागज तौलिया के एक टुकड़े पर डबल पक्षीय टेप का एक टुकड़ा ।
  2. डबल-पक्षीय टेप पर एक pupa रखें ventral साइड अप (चित्र 1a) ।
  3. puparium के पूर्वकाल की ओर और आंतरिक pupa के बीच रिक्ति का पता लगाएँ । समझ और संदंश का उपयोग कर इस अंतर के आसपास puparium निकालें, और pupa के सिर के पूर्वकाल की ओर बेनकाब ।
  4. यह पूर्वकाल-पीछे अक्ष के समानांतर ले जाकर एक संदंश की नोक डालें । स्थानीय रूप से puparium को तोड़ने के लिए संदंश की नोक उठाएं । इस क्रिया को तब तक दोहराएं जब तक टूटना puparium के पीछे के भाग तक नहीं पहुंच जाता । सुनिश्चित करें कि एक अंतर भी puparium और ुपाल पैर के बीच का गठन किया है, और puparium के ventral पक्ष को तोड़ने और आंतरिक pupa (आंकड़ा 1b) को नुकसान को कम करने के लिए ।
  5. puparium तोड़ने के बाद जितना संभव हो सके, ठीक तूलिका का प्रयोग कर pupa को बाहर निकाले (#5 0) (चित्रा 1C) ।
  6. टिशू पेपर है कि ddH के साथ गीला कर दिया गया है के एक टुकड़े पर pupa प्लेस2हे और एक प्लास्टिक पेट्री डिश (व्यास ६० mm x ऊंचाई 15 मिमी) में रखा । जितनी जल्दी हो सके फोटोग्राफ ले लो क्योंकि उजागर pupa कमजोर है और आसानी से सूख जाता है ।
    नोट: एक puparium के बिना कोषस्थों (चरण 4) ुपाल अवधियों की अवधि को मापने के लिए उपयुक्त नहीं हैं, क्योंकि तनाव (जैसे सुखाना के रूप में) और शारीरिक क्षति सामांय विकास के साथ हस्तक्षेप हो सकता है ।

4. ुपाल चरणों की अवधि मापने

  1. चरण 2 में बताए अनुसार ुपाल चरणों की अवधि मापने के लिए कोषस्थों तैयार करें । ुपाल गठन (20 कोषस्थों प्रत्येक) के बाद 1-2, 2-3, और 3-4 दिन के कोषस्थों लीजिए । पहचान के लिए कोषस्थों के लिए अलग पहचान संख्या (1-60) दें । 20 और युवा कोषस्थों प्राप्त करने के लिए, निम्न चरणों के दौरान नवगठित कोषस्थों एकत्रित करना जारी रखें । नव गठित कोषस्थों को अलग पहचान संख्या (६१-८०) दें । ddH के एक टुकड़े पर एक pupa प्लेस2O-गीला ऊतक कागज एक अच्छी तरह से (३.९ cm2) में एक 12-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट (1 pupa/खैर, 12 कोषस्थों/ नमी बनाए रखने के लिए ddH2O के साथ प्लेटों के अंतर-अच्छी जगह भरें, पर ढक्कन लगा दें, और प्लेटों को 25 डिग्री सेल्सियस में रखें, लगातार हल्का (24:0 h light/
    नोट: एक puparium के बिना कोषस्थों ुपाल अवधि की अवधि को मापने के लिए उपयुक्त नहीं हैं । कृपया puparium को न निकालें ।
  2. एक बार हर 30 मिनट में शरीर का रंग, bristles, Malpighian नलिकाओं और सभी कोषस्थों के पीले शरीर सहित रूपात्मक सुविधाओं का निरीक्षण करें, और रिकॉर्ड चरणों (P1-P15 (द्वितीय), संदर्भ17,19) एक टैली शीट में पर आधारित है ।
  3. तीन (या अधिक) व्यक्तियों के एक घूर्णन बदलाव से चार सीधे दिन (९६ ज) पर रिकॉर्डिंग जारी रखें ।
  4. प्रत्येक विशेष चरण के अभिलेखों की संख्या की गणना, और उंहें औसत (अवलोकन/कोषस्थों की औसत गिनती) । फिर उंहें ०.५ (एच), चरणों के अनुमानित लंबाई (एच) में जिसके परिणामस्वरूप से गुणा ।

5. एक शाखा पर काले धब्बे की तीव्रता का मापन

नोट: ुपाल या एडल्ट विंग पर काले धब्बों की तीव्रता ऑप्टिकल डेंसिटी (OD) को मापने के द्वारा मात्रा की जा सकती है । ज्ञात ODs (कदम घनत्व फिल्टर) के साथ एक गिलास फिल्टर अंशांकन25के लिए प्रयोग किया जाता है, ताकि एक एक विंग की एक डिजिटल छवि से एक विशेष क्षेत्र के आयुध डिपो की गणना कर सकते हैं । एक स्थान में आयुध डिपो और घटनास्थल के बाहर आयुध डिपो मापा जाता है, और बाद के पूर्व से घटाई है मौके की तीव्रता (ΔOD) प्राप्त करने के लिए । यहाँ, हम ΔOD की विच्छेदन, माप और गणना की विधि का वर्णन करते हैं. यह कार्यविधि चरण 2, चरण 3 और चरण 4 से स्वतंत्र के बाद किया जा सकता है । एक बार एक कदम 2 प्रदर्शन किया है और सभी ुपाल चरणों समझता है, एक सीधे शुरू कर सकते है या 5 कदम दोहराएं ।

  1. छवि तैयारी
    1. चरण 2 में वर्णित के रूप में एक फोकल चरण का एक नया pupa तैयार करें । संदंश के साथ एक puparium के पूर्वकाल भाग निकालें । संदंश का उपयोग कर pupa बाहर ले जाओ और यह फॉस्फेट में जगह (पंजाबियों, तालिका 2) एक प्लास्टिक पेट्री डिश में बफर (व्यास ३५ मिमी x ऊंचाई 10 मिमी) ।
    2. एक शाखा के बेसल संयुक्त कट (बेसल संयुक्त विंग के संकीर्ण समीपस्थ हिस्सा है) । के रूप में पंख जोड़ रहा है, यह एक प्लास्टिक पेट्री डिश में जगह (व्यास ३५ mm x ऊंचाई 10 मिमी) ddH से भरा यह परासरणी दबाव से विस्तार करने के लिए (पंख खुद से करेंगी) ।
    3. एक शेयर शीशी से हर 10 मिनट में एक बार नव eclosed वयस्कों लीजिए । Anesthetize2 एक सह2 anesthetizing पैड का उपयोग कर के साथ एक मक्खी, गतिहीनता से anesthetization की पुष्टि करें और एक शाखा के बेसल संयुक्त कटौती ।
    4. एक गिलास स्लाइड पर पंजाब के 10 µ एल प्लेस, विंग वहां जगह है, और एक कवर स्लिप (18 मिमी x 18 मिमी) के साथ कवर ।
    5. स्टीरियो माइक्रोस्कोप की लाइट चालू करें । प्रकाश अधिकतम स्तर पर होने के लिए सेट करें । उद्देश्य लेंस 11.5 x सेट करें । डायाफ्राम सबसे खुला राज्य होने के लिए सेट करें । कैमरा चालू करें । कैमरा (ISO: १००, मोड SHQ ३१३६ x २३५२ पिक्सेल, शटर गति: 1/20 s) करने के लिए सेट करें । माइक्रोस्कोप की फोकस घुंडी चलती द्वारा नमूना पर ध्यान केंद्रित.
    6. एक छवि लेने के लिए दूरदराज के नियंत्रण इकाई के शटर बटन पुश । विंग प्रति 3 छवियों को ले लो, जिनमें से प्रत्येक एक campaniform sensillum, अनुदैर्ध्य नस स्थान या पीछे crossvein पर केंद्रित किया जाना चाहिए, स्थिति बाईं ओर पंख के बाहर का हिस्सा है और ऊपरी तरफ पंख के पूर्वकाल हिस्सा ।
  2. अंशांकन
    1. विंग छवि प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल एक ही कैमरा सेटिंग्स का उपयोग कर एक कदम घनत्व फिल्टर के 9 भागों की छवियों को ले लो ।
    2. प्रारंभ ImageJ सॉफ्टवेयर (https://imagej.nih.gov/ij/)22।
    3. फ़ाइल क्लिक करें । खुला | और कदम रखा घनत्व फिल्टर की छवियों में से एक का चयन करें ।
    4. क्लिक करें छवि । प्रकार | 8-सा | छवि को एक 8-बिट छवि में कनवर्ट करने के लिए ।
    5. संपादित करें | चयन | निर्धार | और अंडाकार और केंद्रित स्तंभ की जांच करें । चौड़ाई स्तंभ में १०० (पिक्सेल) लिखें, ऊँचाई स्तंभ में १०० (पिक्सेल), X निर्देशांक स्तंभ में १५६८ और Y निर्देशांक स्तंभ में ११७६. ठीकक्लिक करें ।
    6. क्लिक करें विश्लेषण । उपाय | चयनित क्षेत्रों का "अर्थ धूसर मान" मापा जाता है ।
    7. दोहराएँ 5.2.3. ते 5.2.6. 8 शेष छवियों के लिए ।
    8. क्लिक करें विश्लेषण । जांच ना और Rodbard25 समारोह कॉलम में चयन और बीच में सही कॉलम में निंनलिखित संख्या लिखें (०.०४, ०.३३६, ०.६३२, ०.९२८, १.२२४, १.५२, १.८१६, २.११२, २.४०८; ये संख्या घनत्व पर निर्भर करती है । कदम रखा घनत्व फिल्टर) ।
    9. वैश्विक अंशांकन स्तंभ जांचें और ठीकक्लिक करें ।
      नोट: इस कार्यविधि का प्रदर्शन करके, "धूसर मान का अर्थ" Rodbard फ़ंक्शन का उपयोग करके "ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो)" में कनवर्ट किया जाता है । इस कदम के बाद, ऑप्टिकल घनत्व ImageJ सॉफ्टवेयर में एक विशेष रूप से चयनित क्षेत्र के लिए गणना की जा सकती है ।
  3. माप के क्षेत्र का चयन
    नोट: स्पॉट विशेष रूप से लैंडमार्क के साथ संबद्ध होते हैं, जैसे campaniform sensilla, अनुदैर्ध्य नस युक्तियाँ और crossveins. इन और एक शाखा पर अंय स्थलों के लिए माप के क्षेत्र का चयन किया जा सकता है । यहां, एक उदाहरण मेंD. guttifera(चित्रा 2) बताई गई है ।
    1. बिंदु एक की परिभाषा, campaniform sensillum स्पॉट ।
      1. एक छवि है जिसमें एक campaniform sensillum स्थान छवि के केंद्र में है खोलो । क्लिक करें छवि । प्रकार | 8-सा | छवि को एक 8-बिट छवि में कनवर्ट करने के लिए ।
      2. क्षेत्र चयन उपकरण में आयत क्लिक करें और एक आयत बनाएं । आयत के ऊपरी बाएं शीर्ष सेट इतना है कि यह तीसरी अनुदैर्ध्य नस और एक campaniform sensillum स्थान से बाहर के पीछे की रेखा से जुड़ा हुआ है । आयत के दाईं ओर सेट करें ताकि यह campaniform sensillum स्थान के दाईं तरफ स्थित है ।
      3. संपादित करें | चयन | प्रबंधक में जोड़ें। सभी दिखाएं स्तंभ की जांच करें ।
      4. पंक्ति चयन उपकरणमें कोण टूल क्लिक करें । तीसरे अनुदैर्ध्य नस के पीछे लाइन पर पहली पंक्ति ड्रा । चरण 1 में आरेखित आयत के शीर्ष पर पंक्ति का बायां अंतिमबिंदु सेट करें । आयत के ऊपरी ओर दूसरी पंक्ति आरेखित करना । इस चरण में आरेखित दो पंक्तियों के बीच के कोण को मापने के लिए "m" कुंजी दबाएं । कंप्यूटर की स्क्रीन पर छवि की विंडो क्लिक करें ।
      5. संपादित करें | चयन | प्रबंधक में जोड़ें।
      6. क्षेत्र चयन उपकरण में आयत क्लिक करें और लगभग 1/9 की छवि विंडो के आकार का एक आयत बनाएं । संपादित करें | चयन | घुमाएं । चरण 5.3.1.4 में मापा कोण के शूंय डिग्री लिखें । कोण स्तंभ में और इस चरण में आरेखित आयत को घुमाने के लिए ठीक क्लिक करें ।
      7. चरण 5.3.1.6 में आरेखित आयत को ले जाएं । तीर कुंजियों का उपयोग करके । आयत और तीसरी अनुदैर्ध्य नस के पीछे की रेखा से जुड़ी आयत के निचले हिस्से के बाईं ओर दूसरी अनुदैर्ध्य नस के पीछे लाइन का समापन बिंदु सेट करें । पुष्टि करें कि तीसरे अनुदैर्ध्य नस के पीछे लाइन के लिए दूसरा अनुदैर्ध्य नस के अंत बिंदु से एक सीधा लाइन इस प्रक्रिया में तैयार की है । एक बिंदु (चित्र 2a) के रूप में सीधा रेखा के पैर को परिभाषित करें ।
      8. रिकॉर्ड x समंवय और y बिंदु एक के समंवय, क्षेत्र चयन उपकरण जब बिंदु पर कर्सर रखने के नीचे संकेत दिया ।
    2. बिंदु B की परिभाषा, अनुदैर्ध्य नस टिप रपोट
      1. एक छवि है जिसमें एक अनुदैर्ध्य नस टिप स्पॉट छवि के केंद्र में है खोलो । क्लिक करें छवि । प्रकार | 8-bit | छवि को एक 8-बिट छवि में कनवर्ट करने के लिए ।
      2. चरण 5.3.1 में वर्णित समान कार्यविधि दोहराएं । (बिंदु की परिभाषा एक, campaniform sensillum स्पॉट) के लिए छवि में एक बिंदु खोजने के लिए ।
      3. संपादित करें | चयन | प्रबंधक में जोड़ें।
      4. क्षेत्र चयन उपकरण में आयत क्लिक करें और एक आयत बनाएं । तीसरे अनुदैर्ध्य नस के पीछे की रेखा के अंत बिंदु पर आयत के ऊपरी बाएं शिखर सेट करें ।
      5. संपादित करें | चयन | प्रबंधक में जोड़ें।
      6. पंक्ति चयन उपकरणमें कोण टूल क्लिक करें । पहली पंक्ति ड्रा बिंदु एक और तीसरे अनुदैर्ध्य नस के पीछे की रेखा के अंत बिंदु से कनेक्ट करने के लिए । इस पंक्ति को पंक्ति A के रूप में निर्धारित करें । चरण 5.3.2.4 में आरेखित आयत के ऊपरी ओर दूसरी पंक्ति आरेखित करें । दो पंक्तियों के बीच कोण को मापने के लिए "m" कुंजी दबाएं ।
      7. संपादित करें | चयन | प्रबंधक में जोड़ें।
      8. क्षेत्र चयन उपकरण में आयत क्लिक करें और लगभग 1/9 की छवि विंडो के आकार का एक आयत बनाएं । संपादित करें | चयन | घुमाएं । चरण 5.3.2.6 में मापा कोण के शूंय डिग्री लिखें । कोण स्तंभ में और इस चरण में आरेखित आयत को घुमाने के लिए ठीक क्लिक करें । तीर कुंजियों का उपयोग करके आयत ले जाएं । आयत के ऊपरी हिस्से को सेट करें ताकि यह रेखा से जुड़ी हो और चौथी अनुदैर्ध्य शिरा की पूर्वकाल रेखा के अंत बिंदु को ताकि वह आयत के बायीं ओर हो ।
      9. संपादित करें | चयन | प्रबंधक में जोड़ें।
      10. क्षेत्र चयन उपकरण में आयत क्लिक करें और लगभग 1/9 की छवि विंडो के आकार का एक आयत बनाएं । संपादित करें | चयन | घुमाएं । कोण स्तंभ में चरण 6 में मापा गया कोण का ऋण अंश लिखें और इस चरण में आरेखित आयत को घुमाने के लिए ठीक क्लिक करें । तीर कुंजियों का उपयोग करके आयत ले जाएं । आयत के निचले बाएं शीर्ष सेट इतना है कि यह चरण 5.3.2.8. में खींचा आयत के ऊपरी बाएं शिखर पर है, चौथे अनुदैर्ध्य नस की पूर्वकाल रेखा के अंत बिंदु से लाइन को प्राप्त करने में जिसके परिणामस्वरूप एक. परिभाषित करें सीधा लाइन और बिंदु बी के रूप में तीसरे अनुदैर्ध्य नस के पीछे लाइन के प्रतिच्छेदन बिंदु (चित्र बी) ।
      11. रिकॉर्ड x निर्देशांक और y बिंदु b का समंवय, क्षेत्र चयन उपकरण जब बिंदु b पर कर्सर रखने के नीचे संकेत दिया
    3. बिंदु सी की परिभाषा, पीछे crossvein स्पॉट
      1. एक छवि है जिसमें एक पीछे crossvein जगह छवि के केंद्र में है खोलो । क्लिक करें छवि । प्रकार | 8-bit | छवि को एक 8-बिट छवि में कनवर्ट करने के लिए ।
      2. पीछे के रूप में बिंदु सी परिभाषित-पीछे crossvein और चौथे अनुदैर्ध्य नस (चित्रा 2c) के प्रतिच्छेदन क्षेत्र में चौथे अनुदैर्ध्य नस के पूर्वकाल रेखा के सबसे बिंदु ।
      3. रिकॉर्ड x समंवय और y बिंदु c के समंवय, क्षेत्र चयन उपकरण जब बिंदु सी पर कर्सर रखने के नीचे संकेत दिया ।
    4. पॉइंट डी, कंट्रोल एरिया की परिभाषा
      1. एक छवि है जिसमें एक campaniform sensillum स्थान छवि के केंद्र में है खोलो । क्लिक करें छवि । प्रकार | 8-सा | छवि को एक 8-बिट छवि में कनवर्ट करने के लिए ।
      2. लाइन चयन उपकरण में सीधे क्लिक करें और दूसरी अनुदैर्ध्य नस और चौथे अनुदैर्ध्य नस के पीछे लाइन के अंत बिंदु के पूर्वकाल रेखा के अंत बिंदु को जोड़ने लाइन आकर्षित । इस लाइन के पार बिंदु और तीसरे अनुदैर्ध्य नस (चित्रा 2d) के पीछे की रेखा के रूप में बिंदु डी परिभाषित करें ।
      3. रिकॉर्ड x समंवय और y बिंदु डी के समंवय, क्षेत्र चयन उपकरण जब बिंदु डी पर कर्सर रखने के नीचे संकेत दिया
  4. माप
    1. विंग स्पॉट की छवियों में से एक खोलें (बिंदु के माप के लिए एक, केंद्र में एक बिंदु के साथ छवि खुला). क्लिक करें छवि । प्रकार | 8-सा | छवि को एक 8-बिट छवि में कनवर्ट करने के लिए ।
    2. क्षेत्र चयन उपकरण में आयत क्लिक करें और छवि विंडो के लगभग 1/9 आकार का एक आयत बनाएं ।
    3. संपादित करें | चयन | निर्दिष्ट करें। अंडाकार और केंद्रित स्तंभ की जाँच करें. चौड़ाई और ऊंचाई स्तंभों में १०० (पिक्सेल) लिखें, x बिंदु के निर्देशांक एक (या बिंदु b या point c) और d में x समन्वय स्तंभ लिखें और y बिंदु का निर्देशांक एक (या बिंदु b या point c) और d में y समन्वय स्तंभ लिखें । ठीकक्लिक करें ।
    4. क्लिक करें विश्लेषण । उपाय | ५.२ में वर्णित अंशांकन पहले से ही समाप्त हो गया है, तो ODs माध्य स्तंभ में इंगित कर रहे हैं ।
    5. अंक A, B, और C के ODs से पॉइंट डी के ओडी को घटाकर ΔODs की गणना करें ।
      नोट: बिंदु डी विंग के एक पारदर्शी हिस्से में है और रंजकता शामिल नहीं है, और इसलिए एक पृष्ठभूमि नियंत्रण के लिए उपयुक्त है ।

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Representative Results

D. guttifera की ुपाल अवधि को 17 चरणों (p1-P15 (ii) में विभाजित कर दिया गया है; तीन प्रतिनिधि चरणों (p1, P5-6, P10) की छवियां चित्रा 3दर्शाई गई हैं, और सभी 17 अवस्थाएं चित्रा 4में सचित्र हैं) । हालाँकि Bainbridge और Bownes१७ ने डी. melanogasterमें २० चरणों में मान्यता प्राप्त की, इनमें से कुछ चरणों को डी. guttiferaपर लागू नहीं किया जा सका. दो विकासात्मक घटनाओं के क्रम, पीत-पिण्ड की उपस्थिति (midgut26के भीतर शेड कोशिकाओं के द्रव्यमान) और Malpighian नलिकाओं के समय हरे रंग की मोड़, सख्ती से डी. guttiferaमें नियंत्रित नहीं कर रहे हैं, और इसलिए हम अलग नहीं कर सका P5 (मैं ), P5 (ii) व P6. इसके अलावा, D. melanogasterके विपरीत, वक्ष और उदर bristles के काला के समय को सिंक्रनाइज़ किया गया था, और इसलिए हम P11 (i) और P11 (ii)19को अलग नहीं कर सके ।

हम guttifera (तालिका 3, Fukutomi एट अल.19से) के ुपाल चरणों की लंबाई मापने सकता है । पूरे ुपाल अवधि लगभग 20 ज है कि D. melanogaster की तुलना में 25 डिग्री सेल्सियस17पर । हम एक campaniform sensillum, अनुदैर्ध्य नस टिप और पीछे crossvein आसपास के क्षेत्रों की ΔODs की गणना । यहां, हम eclosion (तालिका 4) के 7 दिनों बाद ODs और ΔODs को वयस्कों में दिखाते हैं । कई चरणों के डेटा की तुलना करके, हमने पाया है कि चरण P12 (i) रंजकता की शुरुआत के समय है, और कि रंजकता 24 eclosion के बाद एच द्वारा पूरा हो गया है (चित्रा 5, Fukutomi एट अलमें इस्तेमाल मूल माप से. 19).

Figure 1
चित्र 1. puparium को हटाने का चित्रण. (क) डबल पक्षीय टेप के एक टुकड़े पर एक pupa ventral पक्ष जगह है । puparium के पूर्वकालिक भाग को हटा दें । (ख) ventral की ओर से संदंश के साथ puparium को तोड़ना. (ग) puparium तोड़ने के बाद, तूलिका का प्रयोग कर pupa को बाहर निकाल लें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. रंजकता मापने के लिए क्षेत्र की परिभाषा । (क) एक campaniform sensillum के साथ जुड़े एक स्थान के लिए एक बिंदु । (ख) एक अनुदैर्ध्य नस टिप के साथ जुड़े एक स्थान के लिए प्वाइंट बी । (ग) एक जगह एक पीछे crossvein के साथ जुड़े के लिए प्वाइंट सी । (घ) एक नियंत्रण क्षेत्र के लिए प्वाइंट डी । स्केल बार्स संकेत २५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. परिभाषित ुपाल चरणों के उदाहरण । (क) puparium के साथ कवर किया गया स्टेज P1 का Pupa । (ख) स्टेज P5 की Pupa-6. (ग) स्टेज P10 की Pupa । (ख) और (ग) में अवलोकन से पहले puparia हटा दिए जाते हैं. स्केल बार्स संकेत ५०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. D. guttiferaमें पहचाने गए 17 ुपाल चरणों के रेखांकन । (क) P1, puparium सफेद है । (ख) P2, puparium का रंग हल्का भूरा है । (ग) p, एक बुलबुला पार्श्व पक्ष में मनाया जाता है (black ऐरोहेड). (घ) पी 4 (i), बुलबुला (काले ऐरोहेड) p में से बड़ा है, और pupa पंजाब में बोया है । (ङ) पी 4 (द्वितीय), एक अंतर पूर्वकाल भाग में मनाया जाता है (काले ऐरोहेड) और पीछे भाग (ग्रे ऐरोहेड) । (च) P5-6, Malpighian नलिकाओं माइग्रेट (यदि puparium द्वारा कवर किया गया देखने के लिए मुश्किल) । ुपाल आकार ुपाल उपकला और ुपाल छल्ली द्वारा बनाई गई है । (छ) P7, पीत-पिण्ड को पृष्ठीय पक्ष (black ऐरोहेड) में देखा जा सकता है । (ज) P8, आँखें पीली पड़ जाती हैं । (I) P9, आंखें एंबर हैं । (ञ) P10, आँखें लाल हो जाती हैं । (K) P11, कक्षीय और ocellar bristles (धूसर ऐरोहेड), vibrissae, वक्ष macrochaetae (काली ऐरोहेड), और तरसल bristles काले और दृश्यमान हैं. (ठ) P12 (i), पंखों के नुस्खे धूसर हैं. (म) P12 (ii), पंखों के सभी भाग धूसर (black ऐरोहेड) होते हैं । (N) P13, पंख पूरी तरह काले हैं । (हे) P14, सिर और पैर पूरी तरह से काला हो गया है । (प) P15 (i), जातविष्ठा पृष्ठीय उदर (black ऐरोहेड) पर मनाया जा सकता है. (Q) P15 (ii), मक्खी eclosing है । इन चरणों का विवरण Fukutomi एट अलमें वर्णित किया गया था । 19 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5. एक शाखा पर एक companiform sensillum चारों ओर रंजकता का विकास । वृत्त व्यक्तिगत ΔODs इंगित करते हैं, और क्षैतिज पट्टियां औसत दर्शाती हैं । P10: n = 10, P11: n = 10, 12 (i): n = 10, P15 (i): n = 11, 3 h: n = 8, 24 h: n = 7, 7 दिन: n = 10. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

घटक
सफेद नरम चीनी ५१.६ छ
मकई का आटा १७२.४ छ
मकई जई-सी ८६.४ छ
सूखी बियर खमीर १०६ छ
आगर पाउडर ३५.२८ छ
ddH२हे ४००० एमएल
30 मिनट के लिए फोड़ा और ७० डिग्री सेल्सियस के लिए नीचे शांत करने के लिए छोड़ दें ।
इथेनॉल के ४० मिलीलीटर में भंग butyl पी के 4 जी-hydroxybenzoate जोड़ें ।
अच्छी तरह से मिलाएं और 9 मिलीलीटर प्लास्टिक शीशियों में प्रत्येक डालना (व्यास 25 मिमी x ऊंचाई ९६ mm) ।

तालिका 1. मानक cornmeal/चीनी/खमीर/आगर भोजन की संरचना ।

घटक राशि
nacl ८० छ
kcl 2 जी
ना२HPO४· 12घं२हे 29 ग्राम
KH2पो4 2 जी
ddH२हे 10 L तक
सेट नं० ७.४

तालिका 2. पंजाबियों की संरचना (1x) ।

मंच meaning of duration (h) s.d. एन
P1-2 १.७ ०.६५ 16
p3 २.१ ०.६५ 16
पी 4 (आई) २.१ १.६९ 19
पी 4 (द्वितीय) ०.३ ०.२८ 29
P5-6 ५.० ३.०७ 30
p7 ३१.९ ७.२२ ४६
p8 ९.६ २.८१ ५७
p9 १०.९ २.६६ ५५
p10 ११.७ २.९६ ३९
p11 ४.४ २.८१ ४४
P12 (सातारा) १.१ ०.७६ ४४
P12 (ii) २.० ०.७० ४३
P13 २.२ ०.६८ 10
P14-15 (आई) २८.६ २.७५ 10
P15 (ii) १.४ ०.८७ 10
कुल १२१.७

तालिका 3. guttifera के ुपाल चरणों की मापा अवधि यां ।

od ΔOD
Campaniform sensilum अनुदैर्ध्य नस टिप पीछे crossvein नियंत्रण Campaniform sensilum अनुदैर्ध्य नस टिप पीछे crossvein
अलग (Point A) (Point B) (Point C) (Point D) (बिंदु A-point D) (बिंदु B-point D) (बिंदु C-point D)
1 ०.५४९ ०.४८४ ०.५१५ ०.२५६ ०.२९३ ०.२२८ ०.२५९
2 ०.५२९ ०.४८९ ०.५१६ ०.२५४ ०.२७५ ०.२३५ ०.२६२
3 ०.५४६ ०.४८ ०.५३३ ०.२५५ ०.२९१ ०.२२५ ०.२७८
4 ०.५८३ ०.४९६ ०.५६६ ०.२५५ ०.३२८ ०.२४१ ०.३११
5 ०.५२३ ०.४७९ ०.५२८ ०.२३५ ०.२८८ ०.२४४ ०.२९३
6 ०.५७२ ०.५०९ ०.५४६ ०.२६५ ०.३०७ ०.२४४ ०.२८१
7 ०.५६८ ०.५११ ०.५६ ०.२५६ ०.३१२ ०.२५५ ०.३०४
8 ०.५६ ०.५०७ ०.५६२ ०.२७ ०.२९ ०.२३७ ०.२९२
9 ०.५५१ ०.४८५ ०.५६९ ०.२५९ ०.२९२ ०.२२६ ०.३१

तालिका 4. 7 दिन eclosion के बाद guttifera वयस्कों के ODs और ΔODs मापा ।

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Discussion

हम यहां ुपाल चरणों की परिभाषा के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन, विस्तृत अवलोकन के लिए puparium को हटाने, ुपाल चरणों की अवधि को मापने, और D. guttiferaमें एक शाखा पर काले धब्बे की तीव्रता का माप । इन प्रोटोकॉल कई Drosophila और संबंधित मक्खी प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है, विंग रंजकता के साथ विशेष रूप से प्रजातियों ।

गहराई से अवलोकन और अधिक विस्तृत विकासात्मक घटनाओं का वर्णन चरणों के आगे उपखंड सक्षम होगा । कई मामलों में, एक विकास घटना विच्छेदन या एक pupa के अनुभाग की आवश्यकता होती है मंच परिभाषा के लिए उपयुक्त नहीं है, क्योंकि एक मचान के लिए एक pupa को मारने के लिए है, और उस व्यक्ति के आगे का उपयोग मुश्किल है । एक नई Drosophila प्रजातियों के उपयोग के लिए, एक विकासात्मक puparium के बाहर से पहले कदम के रूप में अलग घटनाओं को रोजगार चाहिए । अध्ययन के उद्देश्य के आधार पर, एक तो और विशेष organogenesis या अंय विकासात्मक घटनाओं के आधार पर चरणों में प्रतिभाग कर सकते हैं ।

कई चरणों की एक विशिष्ट तुलना के लिए, एक संभावित कठिनाई प्रजातियों के बीच विकासात्मक घटनाओं के क्रम का एक उलटा है (heterochrony27) । उदाहरण के लिए, d. melanogasterमें, Malpighian tubule हरा हो जाता है और फिर पीला शरीर दिखाई देता है, जबकि यह क्रम डी. guttiferaके कुछ कोषस्थों में पलटने वाला हो सकता है । ऐसी स्थिति में, मुताबिक़ चरणों के बीच सख्त तुलना मुश्किल है । ब्याज की घटना पर निर्भर करता है, एक को फिर से परिभाषित करने या एक विकासात्मक घटना के आधार पर एक विशेष मंच में प्रतिभाग करने की आवश्यकता हो सकती है । उदाहरण के लिए, हम मोटे तौर पर P5 के कोषस्थों का चयन कर सकते है-6 और ुपाल पंख में जीन के भाव के तुलनात्मक तुलना करना विकासात्मक समय के एक संकेतक के रूप में विंग आकृति विज्ञान का उपयोग कर14।

सामान्यतया, यह puparium को निकालने के लिए 10-30 मिनट लेता है । यदि कोई एक छोटी अवस्था का निरीक्षण करना चाहता है, कोषस्थों खाते में समय है कि puparium हटाने के दौरान गुजरता लेने के लिए तैयार किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, यदि कोई P12 का निरीक्षण करना चाहता है (i) के D. guttifera, जो केवल १.१ ज अवधि है, P11 पर कोषस्थों तैयारी एक अच्छा परिणाम देना होगा ।

हमारे प्रोटोकॉल में, गीला टिशू पेपर ुपाल छवियों की पृष्ठभूमि के लिए प्रयोग किया जाता है । अवलोकन और संरचनाओं के मंच पर निर्भर करता है एक आंकड़ा में दिखाना चाहता है, एक सफेद या काले टिशू पेपर का उपयोग कर सकते हैं । पी 4 के लिए p (द्वितीय) संक्रमण, pupa में बुलबुले की स्थिति अलग चरणों के लिए महत्वपूर्ण है, और काले ऊतक कागज बुलबुला की स्थिति का पालन करने में मदद करता है । P5 के बाद चरणों के लिए, सफेद ऊतक कागज बेहतर है क्योंकि यह पीत-पिण्ड, आंखों का रंग, bristles, और शरीर के रंग का पालन करने में मदद करता है ।

Bainbridge और Bownes17 उनके प्रकटन की आवृत्ति से ुपाल चरणों की अवधि का अनुमान । उनकी मचान तालिका डी. melanogaster18के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल एक है । अपनी विधि के लिए, वे चार भोजन पांच वयस्क महिलाओं और पांच वयस्क पुरुषों युक्त बोतलों तैयार किया और उंहें अंधेरे में रखा है, और फिर कोषस्थों बेतरतीब ढंग से एक बोतल से बाहर ले जाया गया प्रत्येक 11, 12, 13, और 14 दिनों के बाद अंडे बिछाने की शुरुआत । वे विशेष चरणों में कोषस्थों की संख्या गिना, और औसत की गणना । प्रत्येक ुपाल चरण की लंबाई ुपाल अवधि और इन आवृत्ति डेटा की कुल अवधि के डेटा के आधार पर अनुमान लगाया जा सकता है । इस विधि के साथ एक समस्या यह है कि यह ुपाल चरणों की सटीक अवधि का अनुमान नहीं किया जा सकता है अगर विकास के समय कोषस्थों के बीच सिंक्रनाइज़ किया जाता है ।

वास्तव में, हमने D. guttiferaमें Bainbridge और Bownes की विधि की कोशिश की थी, और हमने कोषस्थों के बीच सिंक्रनाइज़ेशन के कारण पक्षपातपूर्ण डेटा प्राप्त किया । हम इस घटना के कारण की पहचान नहीं सकता है, लेकिन कुछ संभावनाएं है 1) कोषस्थों अपने युवा मंच और/या 2 से circadian लय बनाए रखा है) वे प्रकाश है कि प्रेक्षण में हुई के लिए जोखिम पर प्रतिक्रिया व्यक्त की । इसलिए, हम प्रत्यक्ष अवलोकन द्वारा वास्तविक स्तर की अवधि को मापने का फैसला किया । यह circadian लय की वजह से पूर्वाग्रह को कम करता है ।

विधि यहां वर्णित एक तरीका है अपने आसपास के नियंत्रण क्षेत्र (ΔOD), स्पॉट क्षेत्र के आयुध डिपो से नियंत्रण क्षेत्र के आयुध डिपो की तुलना में धब्बे में मेलेनिन के अतिरिक्त संचय यों तो । इस विधि Feulgen धुंधला और छवि विश्लेषण (densitometry28,29) द्वारा परमाणु डीएनए सामग्री को बढ़ाता है के लिए एक विधि से प्रेरित था । विंग रंजकता के लिए इस पद्धति को लागू करने के लिए संभावित समस्याओं में से एक के रूप में, ΔOD एक नकारात्मक मूल्य हो सकता है, विशेष रूप से जब एक pupa बहुत युवा है और लगभग कोई रंजकता है । बाद के चरणों में, नियंत्रण क्षेत्र में कुछ रंजकता हो सकता है । स्पॉट क्षेत्र के सरल आयुध डिपो के उपयोग के बजाय ΔOD के अध्ययन के उद्देश्य के आधार पर उपयुक्त हो सकता है । D. guttifera के मामले में, ΔOD के बजाय साधारण ओडी के प्रयोग से आंकड़ों की प्रवृत्ति या अध्ययन के निष्कर्ष में परिवर्तन नहीं हुआ ।

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई विरोध नहीं है.

Acknowledgments

हम शॉन बी कैरोल और थॉमस वर्नर धंयवाद फ्लाई स्टॉक प्रदान करने के लिए, उपकरण के लिए Naoyuki फ्यूज, Byung Seok जिन फिल्माने में उनकी सहायता के लिए, Kiyokazu Agata सलाह के लिए और एलिजाबेथ Nakajima अंग्रेजी संपादन के लिए । इस काम को KAKENHI 17K19427 और टाकेडा साइंस फाउंडेशन ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila guttifera The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego 15130-1971.10 Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article
Plastic vial Hightech MKC-30 Plastic vial, for fly stock maintenance
Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials Fisher Scientific AS-271 Cellulose plug, for fly stock maintenance
White soft sugar Mitsui Sugar J-500g White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Corn flour Nippon Flour Mills F Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Corn grits - C Nippon Flour Mills GC Corn grits - C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Agar powder Matsuki Kanten Sangyo No.602 Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Dry beer yeast Asahi Food & Healthcare Y2A Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Butyl p-hydroxybenzoate Nacalai Tesque 06327-02 Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Ethanol Wako 057-00456 Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food
Flat bottom microtube Ina Optica CF-0150 1.5 mL microtube, for collecting pupae
CAPSULEFUGE Tomy PMC-060 Mini microcentrifuge, for collecting pupae
Sterilized Schale NB Sansei Medical 01-013 Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm)
Serum tube rack Iwaki 9796-050 Used as a moist chamber, for observation of pupa
Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish Corning 353001 Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm)
Falcon standard tissue culture dish Corning 353002 Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm)
Push-pin Kokuyo 51233709 Push-pin, for making pinholes on the microtube lid
Stereomicroscope Olympus SZX16 Stereomicroscope, for morphological observation
Digital camera Olympus DSE-330-A Digital camera, for imaging
NICETACK double sided tape Nichiban NW-15SF Double sided tape, for removing puparium
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-20 Forceps, for removing puparium
Van Gogh VISUAL Paint brush Talens Japan GWVR-#5/0 Paint brush, for removing puparium
Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate Merck 665-180 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods
NaCl Wako 191-01665 NaCl, for PBS
KCl Nacalai Tesque 285-14 KCl, for PBS
Na2HPO4·12H2O Wako 196-02835 Na2HPO4·12H2O, for PBS
KH2PO4 Nacalai Tesque 28721-55 KH2PO4, for PBS
Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 - 3.0 Edmund Optics 64-384 Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement
ImageJ software NIH 1.8.0-101 ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov)
FINE FROST glass slide Matsunami Glass Ind FF-001 Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing
Square microscope cover glass 18 x 18 Matsunami Glass Ind C018181 Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक १३१ Drosophila guttifera विकास मचान pupa पंख रंजकता विकास evo-देवो ठहराव माप ऑप्टिकल घनत्व कायापलट
ुपाल समय और <em>Drosophila guttifera</em> के पंख रंजकता की माप मचान के लिए तरीके
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Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera. J. Vis. Exp. (131), e56935, doi:10.3791/56935 (2018).

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