Summary
Pupa dönemi ve kanat pigmentasyon Drosophila guttifera ölçümü evreleme için protokol açıklanmıştır. Evreleme ve pigmentasyon miktar yetişkin özellikleri ile gelişimsel mekanizmaları eğitim için sağlam bir temel sağlamak ve özellik geliştirme interspecific karşılaştırma etkinleştirin.
Abstract
Drosophila (meyve sineği) çeşitli türlerin gelişim ve genetik değişiklikler için evrimsel değişiklikler sorumlu mekanizmaları incelemek için fırsatlar sağlar. Özellikle, Yetişkin sahne Morfolojik özellikleri kanat pigmentasyon karşılaştırma da dahil olmak üzere interspecific karşılaştırma için zengin bir kaynağıdır. Türler arasında gelişimsel farklılıkları eğitim için detaylı gözlem ve uygun evreleme kesin karşılaştırma için gereklidir. Burada evreleme pupa dönemi ve bir polka noktalı meyve sineği Drosophila guttiferakanat pigmentasyon miktar için iletişim kuralları açıklar. İlk olarak, ayrıntılı morfolojik gözlem ve pupa aşamaları türleri üzerinde Morfoloji temel tanımını için yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem pupa türleri Morfoloji detaylı gözlem etkinleştirmek için pupa, dış chitinous durumda puparium kaldırmak için bir yöntem içerir. İkinci olarak, tanımlanmış pupa aşamaları süresi ölçme yöntemi açıklanmaktadır. Son olarak, dijital görüntü ve ImageJ yazılım kullanarak görüntü analizi dayalı kanat pigmentasyon miktar için yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntemler ile yetişkin özellikleri ile gelişimsel süreçleri pupa evrelerinde karşılaştırmak için sağlam bir temel oluşturabilir.
Introduction
Drosophila morfolojik özelliklerin bazıları tür1,2,3,4,5arasında çeşitlendirilmiş. Soru yaklaşım olabilir bu türleri Morfoloji nesil mekanizmaları karşılaştırarak nasıl morfolojik çeşitlilik ortaya çıkar. Böyle türleri Morfoloji larva trichomes, yetişkin sex taraklar, dış genital aparatı, karın pigmentasyon ve kanat pigmentasyon6,7,8,9, örnekler 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. yetişkinler arasında morfolojik farklılıklar çalışmaya, gözlem ve analiz pupa etap yetişkin özellikleri kaderi geç larva aşamalı olarak belirlenir ve sonraki morfogenez pupa döneminde gelirleri için önemlidir.
Drosophila melanogaster, gelişim biyolojisi çalışmalarında "saat APF" (pupa kuruluşundan sonra saat) bir pupa sahne16belirtmek için yaygın bir yöntemdir. Bu sistem ve pupa kuruluşundan sonra mutlak zaman istihdam rutin deneyler için çok uygundur. Ancak, gelişimsel hız pupa arasında farklı olabilir ve küçük genetik, epigenetik veya microenvironmental farkları tarafından etkilenebilir ve bu nedenle aynı sahip mutlak zaman pupa kuruluşundan sonra pupa aynı anda olduğunu garanti etmez gelişimsel sahne. Birçok durumda, Morfolojik özellikleri tarafından tanımlanan aşamaları birden çok kişiye karşılaştırmak için tercih edilir. Özellikle, türler arasında bir karşılaştırma kesin evreleme ve karşılık gelen (homolog) aşamaları arasında karşılaştırma gerektirir.
Bainbridge ve Bownes17 tanınan 20 pupa etap (P1 P15(ii)) için Drosophila melanogaster pupa morfolojik özelliklerini temel alarak. Bu evreleme morfolojik gelişim hazırlama18en çok kullanılan sistemdir. Bir önceki çalışmada, Pupa Drosophila guttifera kanat pigmentasyon çalışmalar19için bir temel oluşturmak üzere evreleme yapılır. D. guttifera kanat üzerinde siyah puanlı desene sahip ve kanat pigmentasyon oluşumu20modeli türlerinden biridir. Her ne kadar biz açıklanan morfolojik ölçütlere anılacaktır Bainbridge ve Bownes'17araştırma, doğrudan seri gözlemler19sahne süreleri Bainbridge ve Bownes tahmini kullanmak yerine tarafından sahne süreleri ölçülen gözlenen frekansı. Burada pupa hazırlama yöntemi ve Fukutomi ve ark19' kullanılan Drosophila pupa aşaması süreleri ölçümü açıklayın.
Kanat pigmentasyon gelişimsel mekanizması çalışmaya, Pupa veya yetişkin aşamasında pigmentasyon ortaya çıktığında bilmemiz gereken. Fukutomi ve ark. 19 kanat görüntüleri görüntü analizi tarafından pigmentasyon pupa ve yetişkin aşamaları sırasında optik yoğunlukları (ODs) sayılabilir. Drosophila kanatları pigmentasyon siyah melanin21birikimi tarafından neden olduğu düşünülmektedir. ODs miktar için gri tonlama görüntüler ve ImageJ yazılım (https://imagej.nih.gov/ij/)22 kullanılmıştır. Tanımak ve nokta özel pigmentasyon (ΔOD) ölçmek için biz bir noktadan OD içinde bir nokta dışında OD çıkarın. Tekrarlanabilir ve objektif bu yöntemi kullanabilmek için aşırı doz ölçüm yerlerin kanat damarlar yerler kullanarak tespit edilmelidir. Bu makalede, biz bu yöntemi miktar Drosophila guttiferakanat pigmentasyon, ayrıntılı olarak tarif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. stok fly
- Drosophila guttifera tüm aşağıdaki iletişim kuralları için kullanın.
- Plastik şişeleri kullanın (çapı 25 mm yükseklik x 96 mm) ve selüloz prizler (çapı 23 mm yükseklik x 26 mm) hisse senedi bakım için. Bu tür2diğer üç alternatif tariflerini takip bir yayın açıklanan ve standart bir Mısır unu/şeker/Maya/agar gıda kullanın.
Not: D. guttifera (stok numarası 15130-1971.10) Drosophila tür stok merkezi San Diego Kaliforniya Üniversitesi tarafından sağlanır. Her ne kadar immigransiçin - uzaktan D. melanogaster için içinde cins23ilgilidir,tripunctata radyasyon D. guttifera ait ö melanogaster ile ortak birçok biyolojik özelliği vardır . Buna göre gerektirse de bazı türler özel gıda ve/veya teknik ipuçları2onları korumak için bu protokolü Drosophila türlerin için uygulanabilir.
2. pupa ve pupa aşamaları tanımını gözlem
Not: Pupa gözlem için bir 12:12 s açık/koyu döngüsü 25 ° C'de tutulan sinek hisse senedi alınır Bainbridge ve Bownes17 pupation üzerine ıslatılmış doku kağıt (946 taşınan pupa sağkalım % 97) orijinal yerine D. melanogaster pupa Taşınılan düşük riski nitelendirdi. D. guttifera pupa temelde aynı yöntemle hazırlanabilir.
- Drosophila sağlıklı yetişkin taze gıda (Standart Mısır unu/şeker/Maya/agar Gıda) bir plastik şişe yerleştirin (çapı 25 mm yükseklik x 96 mm) ve onları yumurtlamak. 7 gün geç 3rd instars elde etmek için bekleyin.
- 1 mL standart Mısır unu/şeker/Maya/agar gıda her 1.5 mL microtube yerleştirin. 2 mm aralığı ile 3 iğne delikleri mikrotüpler kapaklar, bir itme-nefes izin vermek için iğne ile Penetran olun.
- Mikrotüpler gıda için 7 ile santrifüj kapasitesi mini microcentrifuge (860 x g) s.
- Ters çevir ve şişeleri tüm yetişkin şişe kaldırmak için dokunun.
- GKD2O 5-10 mL dökün (veya ters ozmoz su) şişe içine.
- Larvaları ile plastik bir Petri kabına suya dökmek (çapı 90 mm yükseklik x 15 mm). Büyük beden büyüklükleri (3-4 mm uzunluğunda) tarafından geç 3rd instars tanımlayın.
- Yavaşça geç 3rd INSTAR larva Forseps ile gıda ile mikrotüpler taşıyın (10 larva / microtube). Onları gecede 25 ° C'de kuluçkaya
- Yeni kurulan pupa GKD2tarafından O nemlendirilmiş ve bir plastik Petri kabına yerleştirilir doku kağıt parçası üzerine hareket (çapı 35 mm x Yükseklik 10 mm).
- Nemli bir odası (GKD2O içinde belgili tanımlık dip 10 mL içeren) Petri kabına yerleştirin ve pupa istenen Sahne Alanı'na geliştirmek kadar bekleyin.
- Pupa ıslatılmış bir doku kağıt parçası üzerine bir plastik Petri kabına hareket (çapı 60 mm yükseklik x 15 mm).
Not: Aşamaları tanımını çoğunlukla D. melanogaster17Etaplar temel alınarak yapılabilir. Genellikle, her ne kadar bazı değişiklikler sahne tanımının kullanılan türler bağlı olarak gerekli olacaktır Drosophila pupa dönemi P1 - P15(ii), sınıflandırılabilir. Mümkünse, puparium kaldırma kesin ve ayrıntılı gözlem sağlar. (Adım 3) aşağıda ayrıntıları bakın. - Stereo mikroskop altında pupa gözlemlemek. Stereo mikroskop bağlı bir dijital kamera ile fotoğraf çekmek.
3. puparium kaldırma
Not: Pupa Drosophila puparium denilen bir yapı tarafından karşılanmaktadır. Muscomorpha (uçar) bir böcek, larva kütikül pupation, döken değil; Bunun yerine, manikür apolysis sonra sertleşir ve pupa puparium24bir koruyucu kapak kullanır. Bir puparium içinde ikamet eden bir pupa çok yumuşak ve kırılgan bir doğru pupa kütikül vardır. Apolysis P4(ii) etrafında gerçekleşmesidir önce epiteli ve puparium birlikte eklenir ve bu nedenle zarar vermeden puparium kaldırma çok zordur. P5 sonra puparium zahmetli ama morfolojik gözlem ve pupa aşamaları tanımını için yararlı olabilir. İşlem aşağıdaki gibi yapılır.
- Bir parça kağıt havlu üzerinde çift taraflı bant parçası yapıştırmayın.
- Bir pupa (şekil 1A) çift taraflı bant ventral tarafa yerleştirin.
- Puparium ön tarafında ve iç pupa arasında boşluk bulun. Kavramak ve forseps kullanarak bu boşluğu çevresinde puparium kaldırmak ve pupa başkanı ön tarafında karşı karşıya.
- Ön-arka eksenine paralel hareket ettirerek bir pens ucu yerleştirin. Yerel olarak puparium kırmaya pens ucunu kaldır. Kırılma puparium posterior parçası ulaşıncaya kadar bu eylemi yineleyin. Bir boşluk da puparium ve pupa bacaklar arasında oluşturulur emin olmak ve puparium ventral tarafında break ve iç pupa (şekil 1B) zarar en aza indirmek.
- Puparium mümkün olduğunca kırdıktan sonra ince fırça (#5/0) (şekil 1 c) kullanarak pupa al.
- Pupa GKD2ile O nemlendirilmiş ve bir plastik Petri kabına yerleştirilen doku kağıt yerleştirin (çapı 60 mm yükseklik x 15 mm). Çünkü maruz pupa savunmasız ve kolayca kuru olur en kısa zamanda fotoğraflarını.
Not: Pupa bir puparium olmadan çünkü pupa dönemi (Adım 4), sürelerini ölçmek için uygun değildir (kuruma gibi) stres ve fiziksel hasar ile normal gelişim engel.
4. pupa aşamaları sürelerini ölçmek
- Pupa 2. adımda açıklandığı gibi pupa aşamaları sürelerini ölçmek için hazırlayın. 1-2, 2-3, ve 3-4 gün sonra pupa oluşumu (20 her pupa) pupa toplamak. Bireysel kimlik numaraları (1-60) pupa için için kimlik vermek. Yeni toplama pupa 20 daha fazla genç pupa elde etmek için aşağıdaki adımları sırasında oluşan devam edin. Bireysel kimlik numaraları (61-80) yeni kurulan pupa ver. Bir pupa GKD2O nemlendirilmiş doku kağıt 12-şey hücre kültür plaka (1 pupa/iyi, 12 pupa/plaka) iyi (3,9 cm2) yerleştirin. Nem korumak, kapakları giy ve 25 ° C, sürekli ışık (24:0 h ışık/karanlık) koşulları Plakayı yerleştirmek için GKD2O ile plakaların arası iyi boşluğu doldurmak.
Not: Pupa bir puparium olmadan pupa dönemi sürelerini ölçmek için uygun değildir. Lütfen puparium kaldırmaz. - Morfolojik özellikleri bir kez her 30 dakika ve kayıt (P1 - P15(ii), başvurular17,19tarihinde dayalı) aşamaları taksitli sayfa gözlenen gövde rengi, kıllar, Malpighi tübüllerin ve tüm pupa sarı gövdesi gibi gözlemlemek.
- Dört düz günü (96 h) üç (veya daha fazla) kişi dönen bir kayma tarafından kayıt devam etmek.
- Belirli her sahne alanı'nın kayıt sayıları saymak ve onları ortalama (ortalama gözlem sayısı / pupa). O zaman onları aşamaları (h) tahmini uzunluklarda kaynaklanan 0.5 (s) tarafından çarpın.
5. siyah noktalar bir kanat yoğunluğu ölçümü
Not: Siyah noktalar bir pupa veya yetişkin kanat yoğunluğunu optik yoğunluk (OD) ölçerek sayısal. Bir cam filtre bilinen ODs (basamaklı yoğunluk filtresi) ile bir kanat dijital bir görüntüsünü belirli bir alandan OD hesaplayabilirsiniz kalibrasyon25için kullanılır. Bir noktada OD ve spot dışında OD ölçülür ve ikinci nokta (ΔOD) yoğunluğu elde etmek için eski çıkarılır. Burada, diseksiyon, ölçüm ve ΔOD hesaplanması yöntemi açıklanmaktadır. Bu yordamı, adım 2, adım 3 ve adım 4 bağımsız sonra yapılabilir. Bir kez bir adım 2 sahne aldı ve tüm pupa aşamaları anlar, bir doğrudan başlatabilir veya adım 5 tekrarlayın.
- Görüntü hazırlama
- Odak bir sahne alanı'nın yeni bir pupa 2. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın. Bir puparium ön kısmı Forseps ile kaldırın. Forseps kullanarak pupa alın ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS, Tablo 2) bir plastik Petri kabına yerleştirin (çapı 35 mm x Yükseklik 10 mm).
- Bir kanat Bazal eklem kesmek (Bazal eklem ise kanat dar proksimal parçası). Kanat katlanmış gibi o plastik bir Petri kabına yer (çapı 35 mm x Yükseklik 10 mm) ozmotik basınç (kanat izlerken kendiliğinden) tarafından genişletmek için GKD2O ile dolu.
- Yeni eclosed yetişkin bir kez her 10 min hisse senedi bir şişe toplamak. Bir sinek bir CO2 anesthetizing defterini kullanma CO2 ile anestezi, hareketsizlik tarafından anesthetization onaylamak ve bir kanat Bazal eklem kesti.
- PBS yer 10 µL bir cam slayt üzerinde yer kanat var ve bir kapak notu (18 x 18 mm) ile kapağı.
- Stereo mikroskop ışıkları. Işık maksimum düzeyde olması için ayarlayın. 11,5 X objektif lens ayarlayın. En açık devlet olmak için diyafram ayarlayın. Kamerayı açın. Set kamera olmak (ISO: 100, modu SHQ 3136 x 2352 piksel, Obtüratör Hız: 1/20 s). Örnek üzerinde mikroskop odak düğme hareket ettirerek odaklan.
- Uzaktan kumanda birimi bir görüntü çekmek için Obtüratör butonuna bas. Kanat, her biri bir campaniform sensillum, sol kanatta distal parçası ve kanat üst tarafındaki ön parçası konumlandırma boyuna ven spot veya posterior crossvein merkezli gerekir başına 3 resim al.
- Kalibrasyon
- Kanat görüntü elde etmek için kullanılan aynı kamera ayarlarını kullanarak bir basamaklı yoğunluk filtresi 9 bölümlerinin görüntü alabilir.
- ImageJ yazılım (https://imagej.nih.gov/ij/)22başlatın.
- Dosyasını tıklatın | Açık | ve basamaklı yoğunluk filtresi resimlerden birini seçin.
- Resmi tıklayın | Türü | 8-bit | Resim 8-bit görüntüyü dönüştürmek için.
- Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Belirtmek | ve Oval ve merkezli sütununu kontrol edin. Sütun genişliği (piksel) 100, 100 (piksel) Yükseklik sütundaki, 1568 sütun X koordine ve 1176 Y Koordinat sütununda yazın. Tamam' ı tıklatın.
- Tıklayın analiz | Ölçü |. Seçili alanları "demek gri değeri" ölçülür.
- 5.2.3 yineleyin. 5.2.6 için. görüntüler kalan 8 için.
- Tıklayın analiz | Kalibre ve Rodbard25 işlev sütun seçin ve orta sağ sütunda aşağıdaki numarasını yazmak (0,04, 0,336, 0.632, 0,928, 1,224, 1.52, 1.816, 2,112, 2.408; bu numaraları bağlıdır yoğunlukları «««çıktı) yoğunluk filtresi.
- Küresel kalibrasyon sütununu kontrol edin ve Tamam' ı tıklatın.
Not: Bu yordamı gerçekleştirerek, "gri değeri demek" "Rodbard işlevini kullanarak optik yoğunluğu (OD)" dönüştürülür. Bu adımdan sonra optik yoğunluk için ImageJ yazılım belirli bir seçili alanında hesaplanır.
- Ölçümlerin alanı seçme
Not: Campaniform sensilla, boyuna ven ipuçları ve crossveins gibi simge yapılara ile genellikle ilişkili noktalardır. Bunlar ve diğer yerler bir kanat ölçüleri bölge seçmek için kullanılabilir. Burada, bir örnek olarakD. guttifera(Resim 2) açıklanmıştır.- A noktası, campaniform sensillum nokta tanımı.
- Bir campaniform sensillum nokta görüntünün merkezinde olduğu bir resim açın. Resmi tıklayın | Türü | 8-bit | Resim 8-bit görüntüyü dönüştürmek için.
- Alan seçim araçları Dikdörtgen ' i tıklatın ve bir dikdörtgen çizin. Bu bir campaniform sensillum nokta üçüncü boyuna ven arka hattına bağlı ve daha distal dikdörtgenin üst sol köşe olarak. Böylece campaniform sensillum spot sağında yer alan dikdörtgenin sağ tarafında ayarlayın.
- Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Yöneticisine Ekle |. Tümünü göster sütununu kontrol edin.
- Satır seçim araçları açı aracını tıklatın. İlk satır üçüncü boyuna ven arka çizgi üzerinde çizin. 1. adımda çizilen dikdörtgen izdüşümü satırının sol bitiş noktaları ayarlayın. İkinci satır dikdörtgenin üst tarafında çizin. Bu adımda çizilmiş iki satır arasındaki açı ölçmek için "m" tuşuna basın. Bilgisayarın ekrandaki görüntü penceresini tıklatın.
- Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Yöneticisine Ekle |.
- Alan seçim araçları Dikdörtgen ' i tıklatın ve yaklaşık 1/9 bir dikdörtgen çizin Görüntü penceresinin boyutu. Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Döndürme |. 5.3.1.4 adımda ölçülen açı eksi derecelerde yazmak. açı sütun ve bu adımda çizilen dikdörtgen döndürmek için Tamam düğmesini tıklatın.
- Adım 5.3.1.6 çizilmiş dikdörtgeni taşımak. ok tuşlarını kullanarak. Dikdörtgenin sol tarafında ve üçüncü boyuna ven arka satırına iliştirilmiş dikdörtgenin alt tarafında ikinci boyuna ven arka çizgisinin bitiş noktası ayarlayın. Bu yordamda üçüncü boyuna ven arka satýr ikinci boyuna ven bitiş noktası arasında dikey bir çizgi çizilir onaylayın. Dikey çizgi ayak (şekil 2A) A noktası tanımlayın.
- X ve y koordinatları nokta a, imleç noktası A. üzerinde yerleştirirken Alan seçim araçları belirtilen kayıt
- B noktasını, boyuna ven uç nokta tanımı
- Bir boyuna ven uç nokta görüntünün merkezinde olduğu bir resim açın. Resmi tıklayın | Türü | 8-bit | görüntü 8 bit görüntüyü dönüştürmek için.
- 5.3.1. adımda açıklanan aynı yordamı yineleyin. (A noktasının tanımı, campaniform sensillum nokta) noktasından bir görüntü bulmak için.
- Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Yöneticisine Ekle |.
- Alan seçim araçları Dikdörtgen ' i tıklatın ve bir dikdörtgen çizin. Dikdörtgenin üst sol köşe üçüncü boyuna ven arka çizgisinin bitiş noktası ayarlayın.
- Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Yöneticisine Ekle |.
- Satır seçim araçları açı aracını tıklatın. A noktası ve bitiş noktası üçüncü boyuna ven arka çizgisinin bağlanmak için ilk çizgi çizin. Bu satırı A. çizgi çizmek Adım 5.3.2.4 çizilen dikdörtgen üst tarafındaki ikinci satırı tanımlayın. İki çizgi arasındaki açı ölçmek için "m" tuşuna basın.
- Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Yöneticisine Ekle |.
- Alan seçim araçları Dikdörtgen ' i tıklatın ve yaklaşık 1/9 bir dikdörtgen çizin Görüntü penceresinin boyutu. Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Döndürme |. 5.3.2.6 adımda ölçülen açı eksi derecelerde yazmak. açı sütun ve bu adımda çizilen dikdörtgen döndürmek için Tamam düğmesini tıklatın. Dikdörtgenin ok tuşlarını kullanarak hareket. Böylece dikdörtgenin sol tarafta a hattı ve dördüncü boyuna ven ön çizgisinin bitiş noktası için bağlı olduğu dikdörtgenin üst tarafında ayarlayın.
- Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Yöneticisine Ekle |.
- Alan seçim araçları Dikdörtgen ' i tıklatın ve yaklaşık 1/9 bir dikdörtgen çizin Görüntü penceresinin boyutu. Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Döndürme |. 6. adımda ölçülen açı sütununda açısı eksi derecelerde yazmak ve bu adımda çizilen dikdörtgen döndürmek için Tamam ' ı tıklatın. Dikdörtgenin ok tuşlarını kullanarak hareket. Adım 5.3.2.8 çizilmiş dikdörtgenin üst sol köşe olduğunu dikdörtgenin alt sol köşe ayarlayın., A. satırı tanımlamak için dördüncü boyuna ven ön çizgisi bitiş noktasının dikey çizgi elde elde edilen dikey çizgi ve nokta B (şekil 2B) olarak üçüncü boyuna ven arka çizgi kesişme noktası.
- X ve y koordinatları nokta b, imleç noktası b yerleştirirken Alan seçim araçları belirtilen kayıt
- C noktası, posterior crossvein nokta tanımı
- Posterior crossvein nokta görüntünün merkezinde olduğu bir resim açın. Resmi tıklayın | Türü | 8-bit | görüntü 8 bit görüntüyü dönüştürmek için.
- C noktası dördüncü boyuna ven arka crossvein kesişme alanında ve dördüncü boyuna ven (şekil 2C) ön çizgi arka en noktası olarak tanımlayın.
- X ve y koordinatları nokta c, imleç noktası c üzerinde yerleştirirken Alan seçim araçları belirtilen kayıt
- Nokta D, denetim alanı tanımı
- Bir campaniform sensillum nokta görüntünün merkezinde olduğu bir resim açın. Resmi tıklayın | Türü | 8-bit | Resim 8-bit görüntüyü dönüştürmek için.
- Düz çizgi seçim araçları tıklatın ve ikinci boyuna ven ön hat ve dördüncü boyuna ven arka çizgisinin bitiş noktası bitiş noktası bağlayan bir çizgi çizin. Nokta D Bu satırı ve posterior üçüncü boyuna ven (şekil 2B) hattının geçiş noktası olarak tanımlayın.
- X ve y koordinatları nokta d, imleç noktası d yerleştirirken Alan seçim araçları belirtilen kayıt
- A noktası, campaniform sensillum nokta tanımı.
- Ölçümleri
- (Ölçüm noktası a, açmak için görüntünün merkezinde A noktası ile) kanat noktalar görüntülerden birini açın. Resmi tıklayın | Türü | 8-bit | Resim 8-bit görüntüyü dönüştürmek için.
- Alan seçim araçları Dikdörtgen ' i tıklatın ve boyutunun yaklaşık 1/9 görüntü penceresinde bir dikdörtgen çizin.
- Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Belirtmek |. Oval ve merkezli sütununu kontrol edin. 100 (piksel) genişlik ve Yükseklik sütunlar halinde yazmak, A noktası (veya noktası B veya C noktası) x koordinatlarını yazmak ve D X koordine sütun ve yazma y A noktasının koordinatları (veya noktası B veya C noktası) ve D Y Koordinat sütun. Tamam' ı tıklatın.
- Tıklayın analiz | Ölçü |. 5,2 açıklanan kalibrasyon zaten bitmiş, ODs demek sütununda belirtilir.
- ΔODs OD noktası D A, B ve c noktalarından ODs üzerinden çıkararak hesaplamak
Not: Nokta D kanat şeffaf bir parçası ve pigmentasyon içermez ve bu nedenle bir arka plan kontrol için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
D. guttifera pupa dönemine 17 aşamaları (P1 - P15(ii); görüntüler üç temsilcisi aşamaları (P1, P5 - 6, P10) şekil 3ve tüm 17 aşamaları şekil 4' te gösterilmiştir gösterilir) ayrılmıştır. Bainbridge ve Bownes17 20 D. melanogasteraşamalarında kabul rağmen bu aşamaların bazıları D. guttiferaiçin uygulanamadı. İki gelişimsel olayların sırası, sarı vücudun (kitle içindeki midgut26döken hücreleri) görünüm ve yeşil, dönüm Malpighi tübüllerin zamanlaması değil kesinlikle kontrol edilir D. guttiferave bu nedenle biz P5 değil ayrı (ı ), P5(ii) ve P6. Ayrıca, aksine D. melanogasteriçinde göğüs ve karın kıllar karalama zamanlaması eşitlendi ve bu nedenle biz P11(i) ve P11(ii)19değil ayırın.
D. guttifera (Tablo 3, Fukutomi vd.19) pupa aşaması uzunluğunu ölçmek. Tüm pupa yaklaşık 20 h 25 ° C17, D. melanogaster bundan uzun dönemdir. Biz bir campaniform sensillum, boyuna ven ipucu ve posterior crossvein çevresinde ΔODs hesaplanır. İşte, ODs ve ΔODs erişkinlerde 7 gün sonra eclosion (Tablo 4) göstermektedir. Birden çok aşamaları verileri karşılaştırarak, sahne P12(i) pigmentasyon başlangıcı zamanlaması, ve o pigmentasyon tarafından 24 saat eclosion sonra tamamlanır bulduk (şekil 5, Fukutomi ve arkiçinde kullanılan özgün ölçümleri. 19).
Şekil 1. Puparium kaldırma illüstrasyon. (A) bir pupa ventral yan çift taraflı bant bir parça üzerine yerleştirin. Puparium ön parçası kaldırmak. (B) puparium ventral taraftan Forseps ile bölünürler. (C) puparium kırma sonra bir fırça kullanarak pupa al. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Pigmentasyon ölçmek için alan tanımını. (A) noktasından bir campaniform sensillum ile ilişkili bir nokta için. (B) noktası B boyuna ven ucu ile ilişkili bir nokta için. (C) arka crossvein ile ilişkili bir nokta için C noktası. (D) noktası D denetim alanı için. Ölçek Çubuklarõn 250 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Örnek olarak tanımlanmış pupa aşamaları. (A) pupa Sahne Alanı'nın P1 puparium ile kaplı. (B) pupa sahne P5 - 6. (C) sahne P10 Pupa. Kozaları kaldırıldı önce gözlem (b) ve (C). Ölçek Çubuklarõn 500 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. D. guttiferaiçinde tanımlanan 17 pupa etap illüstrasyonlar. (A) P1, puparium beyazdır. (B) P2, puparium rengini hafif kahverengi. (C) P3, bir kabarcık yan yan (siyah ok ucu) görülmektedir. (D) P4(i), kabarcık P3 içinde daha büyük (siyah ok ucu), ve pupa PBS içinde batmaz. (E) P4(ii), bir boşluk (siyah ok ucu) ön bölümü ve arka bölümü (gri ok ucu) görülmektedir. (F) P5 - 6, Malpighi tübüllerin (zor puparium tarafından Eğer görmek için) göç. Pupa şekil pupa epitel ve pupa kütikül tarafından oluşturulur. (G) P7, sarı vücut dorsal tarafta (siyah ok ucu) görülebilir. (H) P8, gözleri sarıdır. (I) P9, amber gözleri vardır. (J) P10, gözleri kırmızıdır. (K) P11, yörünge ve ocellar kıllar (gri ok ucu), vibrissae, göğüs macrochaetae (siyah ok ucu) ve tarsal kıllar siyah ve görünür olacak. (L) P12(i), kanat uçları gridir. (M) P12(ii), gri (siyah ok ucu) tüm parçalar kanatları vardır. (N) P13, kanatlar tamamen siyahtır. (O) P14, baş ve ayaklar tamamen karanlık. (P) P15(i), Mekonyum sırt karın bölgesinde (siyah ok ucu) görülebilir. (Q) P15(ii), eclosing sinek var. Bu aşamalar ayrıntılarını Fukutomi ve arkiçinde tarif edildi. 19 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. Geliştirme pigmentasyon çevresinde bir kanat companiform sensillum. Daireler bireysel ΔODs gösterir ve yatay çubuklar Ortalamalar gösterir. P10: n = 10, P11: n = 10, 12(i): n = 10, P15(i): n = 11, 3 h n = 8, 24 h n = 7, 7 gün: n = 10. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Bileşen | |
| Beyaz yumuşak şeker | 51,6 g |
| Mısır unu | 172.4 g |
| Mısır ezmesi - C | 86.4 g |
| Kuru bira mayası | 106 g |
| Agar toz | 35.28 g |
| GKD2O | 4000 mL |
| 30 dk ve 70 ° c kadar soğumaya bırakın kaynatın | |
| 40 mL etanol butil p-hydroxybenzoate 4 g çözünmüş ekleyin. | |
| Mix iyi ve 9 mL plastik şişe dökün (çapı 25 mm yükseklik x 96 mm). | |
Tablo 1. Standart Mısır unu/şeker/Maya/agar gıda bileşimi.
| Bileşen | Tutar |
| NaCl | 80 g |
| KCl | 2 g |
| Na2HPO4·12H2O | 29 g |
| KH2PO4 | 2 g |
| GKD2O | ilâ 10 L |
| pH 7.4 ayarla |
Tablo 2. PBS (1 X) bileşimi.
| Sahne | Süresi (h) demek | s.d. | n |
| P1 - 2 | 1.7 | 0.65 | 16 |
| P3 | 2.1 | 0.65 | 16 |
| P4(i) | 2.1 | 1,69 | 19 |
| P4(ii) | 0,3 | 0,28 | 29 |
| P5 - 6 | 5.0 | 3,07 | 30 |
| P7 | 31.9 | 7.22 | 46 |
| P8 | 9.6 | 2,81 | 57 |
| P9 | 10,9 | 2,66 | 55 |
| P10 | 11,7 | 2.96 | 39 |
| P11 | 4.4 | 2,81 | 44 |
| P12(i) | 1.1 | 0,76 | 44 |
| P12(ii) | 2.0 | 0.70 | 43 |
| P13 | 2.2 | 0,68 | 10 |
| P14 - 15(i) | 28,6 | 2,75 | 10 |
| P15(ii) | 1.4 | 0,87 | 10 |
| Toplam | 121.7 |
Tablo 3. Ölçülen süreleri pupa aşaması D. guttifera.
| OD | ΔOD | |||||||
| Campaniform sensilum | Boyuna ven ipucu | Arka crossvein | Denetim | Campaniform sensilum | Boyuna ven ipucu | Arka crossvein | ||
| Birey | (A noktası) | (Noktası B) | (C noktası) | (Nokta D) | (Nokta A - nokta D) | (Point B - nokta D) | (Nokta C - nokta D) | |
| 1 | 0,549 | 0.484 | 0.515 | 0.256 | 0.293 | 0,228 | 0.259 | |
| 2 | 0.529 | 0.489 | 0.516 | 0.254 | 0.275 | 0.235 | 0.262 | |
| 3 | 0.546 | 0.48 | 0.533 | 0,255 | 0.291 | 0.225 | 0.278 | |
| 4 | 0.583 | 0.496 | 0.566 | 0,255 | 0,328 | 0.241 | 0.311 | |
| 5 | 0.523 | 0.479 | 0.528 | 0.235 | 0.288 | 0,244 | 0.293 | |
| 6 | 0.572 | 0.509 | 0.546 | 0.265 | 0.307 | 0,244 | 0,281 | |
| 7 | 0.568 | 0.511 | 0.56 | 0.256 | 0,312 | 0,255 | 0.304 | |
| 8 | 0.56 | 0.507 | 0.562 | 0,27 | 0,29 | 0.237 | 0.292 | |
| 9 | 0.551 | 0,485 | 0.569 | 0.259 | 0.292 | 0.226 | 0.31 |
Tablo 4. ODs ölçülen ve ΔODs, D. guttifera Yetişkin 7 gün sonra eclosion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada pupa aşamaları, tanımını protokollerde pupa aşamaları sürelerini ve siyah noktalar üzerinde D. guttiferakanadında yoğunluğu ölçümü ölçme detaylı gözlem için puparium kaldırma açıklar. Bu protokoller için birçok Drosophila uygulanabilir ve sinek türleri, özellikle türler kanat pigmentasyon ile ilgili.
Daha da derinlemesine gözlem ve gelişimsel olaylarını daha ayrıntılı açıklamasını alt aşamaları sağlayacak. Birçok durumda, diseksiyon gerektiren veya bir pupa kesit gelişimsel bir olay sahne alanı tanımı için uygun değil, tek tek zor çünkü bir evreleme için bir pupa öldürüp daha fazla kullanımı vardır. Yeni bir Drosophila tür kullanım için bir ilk adım olarak gelişim olayları ayırt puparium dışında gelen istihdam. Çalışma amacına bağlı bir sonra daha da belirli organogenesis veya diğer gelişim etkinlikleri temel aşamaları alt bölümlere.
Birden çok aşamaları interspecific karşılaştırma için potansiyel bir zorluk bir inversiyon türler (heterochrony27) arasında gelişimsel olaylar sipariş olduğunu. Örneğin, D. melanogasteriçinde Malpighi tübül yeşil olur ve bu sırada D. guttifera19bazı pupa içinde ters ise sarı vücut görünür olur. Böyle bir durumda, homolog aşamaları arasında sıkı karşılaştırma zordur. Faiz olgusu bağlı olarak, bir yeniden tanımlamak veya bir gelişimsel olay tabanlı belirli bir sahne daha alt bölümlere ayırma gerekebilir. Örneğin, biz kabaca pupa P5 - 6 seçin ve pupa kanat kanat Morfoloji gelişimsel zamanlama14bir göstergesi olarak kullanarak gen ifadelerin interspecific karşılaştırma yapmak.
Genellikle, puparium kaldırmak için 10-30 dakika sürer. Bir kısa bir sahne gözlemlemek istiyorsa, Pupa puparium kaldırma sırasında geçen süre dikkate alınarak hazırlanmalıdır. Örneğin, bir tek 1.1 h süresi olan D. guttifera, P12(i) gözlemlemek istiyorsa iyi bir sonuç pupa P11, hazırlama verirdim.
Bizim iletişim kuralında, nemli kağıt mendil pupa görüntüleri arka plan için kullanılır. Gözlem ve biri bir şekilde göstermek istiyor yapıları aşamada bağlı olarak, bir beyaz ya da siyah kağıt mendil kullanabilirsiniz. P3 P4(ii) geçiş için kabarcık bulunduğu pupa aşamaları ayırt için önemlidir ve siyah kağıt mendil kabarcık konumunu gözlemlemek için yardımcı olur. Çünkü o sarı vücut, göz rengi, kıllar ve gövde rengi gözlemlemek için yardım etmek için aşamalarını P5 sonra beyaz kağıt mendil daha iyidir.
Bainbridge ve Bownes17 onların frekans görünüm pupa aşamaları süre tahmin. Onların hazırlama tablo D. melanogaster18için en çok kullanılan olanıdır. Onların yöntemi için beş yetişkin kadın ve beş yetişkin erkekler içeren dört gıda şişelerde hazırlanan ve onları karanlıkta ve sonra pupa rastgele bir şişe her 11, 12, 13 ve 14 gün sonra yumurta atma başlangıcı adlı alınmıştır. Belirli aşamalarında sayılan pupa sayısı ve ortalamalar hesaplanır. Pupa her aşamasında uzunluğu pupa dönemi toplam süresi veri ve bu frekans verilerine göre tahmini. Bu yöntem ile bir sorun bu gelişimsel zamanlama pupa arasında eşitlenmesi eğilimi pupa aşamaları kesin süresini tahmin etmek için kullanılabileceğini değil olmasıdır.
Aslında, D. guttiferaBainbridge ve Bownes'ın yönteminde denedik ve pupa arasında eşitleme nedeniyle önyargılı veri aldı. Biz bu olayın nedenini değil, ama bazı olanaklar 1) pupa sirkadiyen ritim onların genç aşamasından muhafaza ve/veya 2) onlar Etkilenmeler gözlem oluştu ışığa tepki vardır. Bu nedenle, gerçek sahne süresi tarafından doğrudan gözlem ölçmek karar verdi. Bu önyargı sirkadiyen ritim tarafından kaynaklanan en aza indirir.
Burada açıklanan yöntemi denetim alanının dışında yer alan OD OD çıkararak ilave onların çevre denetim alanına (ΔOD), karşılaştırıldığında sıralarda melanin birikimi ölçmek için bir yöntem var. Bu yöntem nükleer DNA içeriği Feulgen boyama ve görüntü analizi tarafından (Dansitometresi28,29) miktarının bir yöntem esinlenilmiştir. Özellikle bir pupa çok genç ve hemen hemen hiç pigmentasyon olduğunda kanat pigmentasyon için bu yöntemi uygulamak için olası sorunlardan biri, negatif bir değer ΔOD olabilir. Daha sonraki aşamada, bazı pigmentasyon denetimi alanındaki olabilir. Basit OD spot alanının kullanımı yerine ΔOD çalışma amacına bağlı olarak uygun olabilir. D. guttifera, söz konusu olduğunda veri eğilim veya çalışmanın kullanımı basit OD ΔOD yerine değişmedi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Biz Sean B. Carroll ve Thomas Werner sinek hisse senetleri, Naoyuki sigorta donanımları için Byung Seok Jin filme, Kiyokazu rehberlik için Agata ve Elizabeth İngilizce düzenleme Nakajima'onun yardım sağlamak için teşekkür ederiz. Bu eser KAKENHI tarafından desteklenen 17K 19427 ve Takeda Bilim Vakfı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits - C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits - C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 - 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
- Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. Hecht, M. K., Steere, W. C. , Springer (Meredith Corporation). New York. 437-543 (1970).
- Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: a guide to species identification and use. , Academic Press. New York. (2006).
- Patterson, J. T. The Drosophilidae of the southwest. 4313, University of Texas Publication. 7-216 (1943).
- Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
- Werner, T., Jaenike, J. Drosophilids of the Midwest and Northeast. , River Campus Libraries, University of Rochester. Rochester. (2017).
- Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
- Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136 (2015).
- Gompel, N., Prud'homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
- Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
- Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
- Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
- McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
- Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
- Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
- Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).
- Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
- Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. Sekimura, T., Nijhout, H. F. , Springer. New York. in press (2017).
- True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051 (2016).
- Resh, V. H., Cardé, R. T. Encyclopedia of Insects. , 2nd ed, Academic Press. Burlington. (2009).
- DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
- McKinney, M. L., McNamara, K. Heterochrony: the evolution of ontogeny. , Plenum Press. New York. (1991).
- Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners' guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
- Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).
