Summary
Protokolle für die Inszenierung pupal Perioden und Messung der Flügel Pigmentierung der Drosophila Guttifera werden beschrieben. Inszenierung und Quantifizierung der Pigmentierung bieten eine solide Grundlage für das Studium Entwicklungsmechanismen von Erwachsenen Züge und interspezifischen Vergleich der Eigenschaft Entwicklung ermöglichen.
Abstract
Vielfältige Arten von Drosophila (Fruchtfliege) bieten Möglichkeiten, die Mechanismen der Entwicklung und genetische Veränderungen für evolutionäre Veränderungen verantwortlich zu studieren. Insbesondere ist die adult-Stadium eine reiche Quelle von morphologischen Merkmalen auf interspezifischen Abgleich, einschließlich Flügel Pigmentierung Vergleich. Um Entwicklungsstörungen Unterschiede zwischen den Arten zu studieren, sind detaillierte Beobachtung und entsprechende Inszenierung für präzisen Vergleich erforderlich. Hier beschreiben wir Protokolle für die Inszenierung von pupal Perioden und Quantifizierung der Flügel Pigmentierung eine gepunktete Fruchtfliege Drosophila Guttifera. Zunächst beschreiben wir die Methode für die genaue morphologische Beobachtung und Definition von pupal Stadien basierend auf Morphologien. Diese Methode beinhaltet eine Technik zur Entfernung der Puppenkammer, ist die Radula Außenhülle der Puppe, um detaillierte Beobachtung der pupal Morphologien zu ermöglichen. Zweitens, beschreiben wir die Methode zur Messung der Dauer der definierte pupal Stadien. Schließlich beschreiben wir die Methode zur Quantifizierung der Flügel Pigmentierung basierend auf Bildanalyse mit digitalen Bildern und ImageJ-Software. Mit diesen Methoden können wir eine solide Basis für den Vergleich von Entwicklungsprozessen von Erwachsenen Züge während pupal Stadien feststellen.
Introduction
Einige der morphologischen Merkmale von Drosophila sind unter Arten1,2,3,4,5breit gefächert. Nähern wir uns der Frage wie morphologische Vielfalt entsteht durch den Vergleich der Mechanismen der Generation diese Morphologien. Beispiele für solche Morphologien sind Larven Trichome, adult Sex Kämme, externe Geschlechtsapparat, Abdominal-Pigmentierung und Flügel Pigmentierung6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. um morphologische Unterschiede zwischen Erwachsenen zu studieren, Beobachtung und Analyse der pupal Stadien sind wichtig, weil das Schicksal der Erwachsenen Züge sich in der späten Larvenstadien richtet und anschließende Morphogenese den pupal Zeitraum geht.
In Studien der Entwicklungsbiologie von Drosophila Melanogaster"Stunden APF" (Stunden nach pupal Bildung) ist die übliche Methode um ein Puppenstadium16anzugeben. Dieses System absoluten Zeit nach pupal Bildung beschäftigt und ist sehr praktisch für routinemäßige Experimente. Allerdings Entwicklungs-Geschwindigkeit abweichen unter Puppen und durch leichte microenvironmental, genetische und epigenetische Unterschiede betroffen sein könnten, und daher mit den gleichen absoluter Zeit nach pupal Bildung garantiert nicht, dass Puppen gleichzeitig sind Entwicklungsstadium. In vielen Fällen sind die Phasen definiert durch morphologische Merkmale für den Vergleich von mehreren Personen vorzuziehen. Vor allem, erfordert ein Vergleich zwischen den Arten präzise Inszenierung und Vergleich unter entsprechenden (homologe) Stufen.
Bainbridge und Bownes17 erkannt 20 pupal Stadien (P1 bis P15(ii)) basierend auf morphologische Merkmale von Drosophila Melanogaster Puppen. Diese Inszenierung ist die am weitesten verbreitete System der morphologischen Entwicklungs-staging-18. In einer früheren Studie führten wir pupal Inszenierung von Drosophila Guttifera , um eine Grundlage für Flügel Pigmentierung Studien19zu schaffen. D. Guttifera hat eine schwarze Polka-Dot Muster auf den Flügeln und gehört der Gattung Modell für Flügel Pigmentierung Bildung20. Obwohl wir den morphologischen Kriterien beschrieben bezeichnet die Bainbridge und Bownes Forschung17, wir direkt gemessen Bühne Dauer durch serielle Beobachtungen19, anstatt Bainbridge und Bownes Schätzung der Bühne Dauer von der beobachteten Frequenz. Hier beschreiben wir die Methode der pupal Inszenierung und Messung der Dauer von pupal Stadien der Drosophila in Fukutomi Et Al19verwendet.
Um den Entwicklungsstörungen Mechanismus der Flügel Pigmentierung zu untersuchen, müssen wir wissen, tritt im pupal oder adulten Stadien die Pigmentierung. Fukutomi Et Al. 19 quantifiziert optische dichten (ODs) der Pigmentierung während pupal und adulten Stadien durch die Bildanalyse Flügel Bilder. Die Pigmentierung von Drosophila Flügel wird gedacht, um durch Ansammlung von schwarzen Melanin21verursacht werden. Für die Quantifizierung der ODs dienten Graustufenbilder und ImageJ Software (https://imagej.nih.gov/ij/)22 . Zu erkennen und quantifizieren die Spot-spezifische Pigmentierung (ΔOD), subtrahieren wir die OD außerhalb ein Spot aus der OD innerhalb einer Stelle. Um diese Methode reproduzierbar und objektiver zu gestalten, sollten die Orte der OD-Messung über Flügel Venen als Wahrzeichen ermittelt werden. In diesem Artikel beschreiben wir ausführlich diese Methode zur Quantifizierung der Flügel Pigmentierung in Drosophila Guttifera.
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Protocol
1. Lager fliegen
- Verwenden Sie Drosophila Guttifera für alle der folgenden Protokolle.
- Kunststoff-Fläschchen verwendet werden (Durchmesser 25 mm x Höhe 96 mm) und Zellulose-Stecker (Durchmesser 23 mm x Höhe 26 mm) für die Bestandspflege. Verwenden Sie ein standard Maismehl, Zucker, Hefe, Agar Essen und folgen einer Publikation beschrieben drei andere alternative Rezepte für diese Arten2.
Hinweis: D. Guttifera (Lagernummer 15130-1971.10) bietet der Drosophila-Arten Stock Center an der University of California, San Diego. Obwohl D. Guttifera zu den Immigrans-Tripunctata Strahlung innerhalb der Gattung23entfernt, D. Melanogaster verwandt ist gehört, hat es viele biologische Eigenschaften gemein D. melanogaster . Dementsprechend kann dieses Protokoll für viele Arten von Drosophila , angewendet werden, obwohl einige Arten erfordern bestimmte Lebensmittel oder technische Tipps zu2gewährleisten.
(2) die Beobachtung der Puppe und Definition von pupal Stadien
Hinweis: Die Puppe für die Beobachtung stammt aus der Fliege bestand gepflegt mit einem 12:12 h hell/dunkel-Zyklus bei 25 ° C. Bainbridge und Bownes17 beschrieben ein geringes Risiko der Bewegung D. Melanogaster Puppen vom ursprünglichen Ort der Verpuppung auf ein Stück feuchtes Seidenpapier (97 % Überleben von 946 zog Puppen). D. Guttifera Puppen können durch im Wesentlichen die gleiche Methode hergestellt werden.
- Legen Sie gesunde Erwachsene von Drosophila auf frische Nahrung (standard Maismehl, Zucker, Hefe, Agar) in einer Durchstechflasche aus Kunststoff (Durchmesser 25 mm x Höhe 96 mm) und lassen sie die Eier. Warten Sie 7 Tage, um späten 3. Larvenstadien zu erhalten.
- Setzen Sie 1 mL der standard Maismehl, Zucker, Hefe, Agar Essen in jeder 1,5 mL Reaktionscup. Machen Sie 3 Löcher mit 2 mm Abstand in den Deckeln von Mikroröhrchen dringt mit einer Push-Pin um Atmung zu ermöglichen.
- Zentrifugieren der Mikroröhrchen mit Essen für 7 s in einem Mini Microcentrifuge (860 X g).
- Umkehren Sie, und tippen Sie auf Fläschchen um alle Erwachsenen aus der Durchstechflasche zu entfernen.
- Gießen Sie 5-10 mL DdH2O (oder reverse Osmose-Wasser) in die Flasche.
- Gießen Sie Larven mit Wasser in einem Kunststoff Petrischale (Durchmesser 90 mm x Höhe 15 mm). Ende 3. Larvenstadien durch ihre große Körpergröße (ca. 3-4 mm in der Länge) identifizieren.
- Sanft bewegen späten 3. Instar Larven mit der Pinzette in die Mikroröhrchen mit Lebensmitteln (10 Larven / Reaktionscup). Brüten sie über Nacht bei 25 ° C.
- Verschieben der neugeformte Puppen auf ein Stück Seidenpapier, die durch DdH2O befeuchtet und in einem Kunststoff Petrischale gelegt wurde (Durchmesser 35 mm x Höhe 10 mm).
- Platzieren Sie der Petrischale in eine feuchte Kammer (mit 10 mL DdH2O unten), und warten Sie, bis die Puppen auf die gewünschte Stufe zu entwickeln.
- Puppen auf ein feuchtes Stück Seidenpapier in einem Kunststoff-Petrischale zu bewegen (Durchmesser 60 mm x Höhe 15 mm).
Hinweis: Die Definition der Phasen kann meist basierend auf den Bühnen von D. Melanogaster17erfolgen. In der Regel kann die pupal Zeitraum von Drosophila in P1 - P15(ii), eingeteilt werden, wenngleich einige Änderungen der Bühne Definition abhängig von der Sorte verwendet werden würde. Wenn möglich, ermöglicht entfernen der Puppenkammer präzise und detaillierte Beobachtung. Details siehe unten (Schritt 3). - Puppen unter dem Stereo-Mikroskop zu beobachten. Fotografieren Sie mit einer digitalen Kamera angeschlossen an das Stereo-Mikroskop.
3. entfernen Puppenkammer
Hinweis: Puppen von Drosophila sind durch eine Struktur namens der Puppenkammer abgedeckt. Ein Insekt von Muscomorpha (fliegen) HAART nicht seine Larven Kutikula zur Verpuppung; Stattdessen, es härtet die Nagelhaut nach Apolysis und verwendet es als eine Schutzhülle für die Puppe, die Puppenkammer24. Eine Puppe, die ihren Wohnsitz in einer Puppenkammer hat eine wahre pupal Kutikula, die sehr weich und zerbrechlich ist. Bevor Apolysis um P4(ii) stattfindet, Epithelien und Puppenkammer hängen zusammen, und daher entfernen der Puppenkammer ohne Beschädigung ist sehr schwierig. Nach P5 ist das Entfernen der Puppenkammer mühsam, aber nützlich für die morphologische Beobachtung und Definition von pupal Stadien. Der Prozess wird wie folgt durchgeführt.
- Befestigen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einem Stück Küchenpapier.
- Legen Sie eine Puppe auf der Doppel-Klebeband ventralen Seite nach oben (Abb. 1A).
- Suchen Sie den Abstand zwischen der vorderen Seite der Puppenkammer und die interne Puppe. Erfassen der Puppenkammer um diese Lücke mit Pinzette entfernen und Aussetzen der vorderen Seite des Leiters der Puppe.
- Stecken Sie die Spitze von einer Pinzette, indem Sie es parallel zu der anterior-posterioren Achse verschieben. Heben Sie die Spitze der Zange, die Puppenkammer lokal zu brechen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der Bruch den hinteren Teil der Puppenkammer erreicht. Stellen Sie sicher, dass eine Lücke zwischen der Puppenkammer und pupal Beine, auch gebildet wird und brechen der Bauchseite der Puppenkammer und minimieren die Schäden an den internen Puppe (Abbildung 1 b).
- Nehmen Sie nach dem Bruch der Puppenkammer so weit wie möglich die Puppe mit einem feinen Pinsel (#5/0) (Abbildung 1).
- Legen Sie die Puppe auf ein Stück Seidenpapier, die mit DdH2O angefeuchtet und in einem Kunststoff Petrischale gelegt wurde (Durchmesser 60 mm x Höhe 15 mm). Fotografieren Sie so bald wie möglich weil die exponierten Puppe anfällig ist und wird leicht trocken.
Hinweis: Puppen ohne eine Puppenkammer eignen sich nicht zur Messung der Dauer der pupal Perioden (Schritt 4), weil Stress (z. B. Austrocknung) und physischen Schaden könnte stören die normale Entwicklung.
4. Messung der Dauer von pupal Stadien
- Bereiten Sie Puppen zur Messung der Dauer von pupal Stadien wie in Schritt2 beschrieben. Sammeln Sie Puppen von 1-2, 2-3 und 3-4 Tage nach pupal Bildung (20 Puppen). Geben Sie einzelnen Identifikations-Nummern (1-60) Puppen zur Identifikation. Weiterhin neu sammeln Puppen während der folgenden Schritte aus, um 20 weitere junge Puppen zu erhalten gebildet. Die neu gebildeten Puppen individuellen Identifikationsnummern (61-80) verleihen. Legen Sie eine Puppe auf ein Stück von DdH2O angefeuchtet Tissue-Papier in einen Brunnen (3,9 cm2) von einer 12-Well Kultur Zellplatte (1 Puppe/Brunnen, 12 Puppen/Platte). Füllen Sie den Inter gut Raum der Platten mit DdH2O, Luftfeuchtigkeit zu erhalten, setzen Sie den Deckel auf und legen die Platten in 25 ° C, Dauerlicht (24:0 h hell/dunkel) Bedingungen.
Hinweis: Puppen ohne eine Puppenkammer eignen sich nicht zur Messung der Dauer der pupal Perioden. Bitte entfernen Sie nicht die Puppenkammer. - Morphologische Eigenschaften einschließlich Körperfarbe, Borsten, Malpighian Tubuli und Gelbkörper alle Puppen, sobald alle 30 min und Datensatz Phasen beobachtet (P1 - P15(ii), basierend auf der Referenzen-17,-19) in eine Strichliste zu beobachten.
- Weiter über vier Tage lang (96 h) durch eine rotierende Verschiebung von drei (oder mehr) Personen aufnehmen.
- Zählen der Anzahl von Datensätzen für jede einzelne Phase, und sie im Durchschnitt (durchschnittliche Anzahl von Beobachtungen / Puppen). Dann multiplizieren Sie sie mit 0,5 (h), wodurch die geschätzte Länge der Etappen (h).
5. Messung der Intensität der schwarzen Flecken auf einem Flügel
Hinweis: Die Intensität der schwarzen Flecken auf einem Flügel pupal oder Erwachsenen kann durch Messung der optischen Dichte (OD) quantifiziert werden. Ein Glasfilter mit bekannten ODs (gestufte Dichte Filter) dient zur Kalibrierung25, damit man die OD eines bestimmten Bereichs von einem digitalen Bild eines Flügels berechnen kann. OD in einem Ort und die OD außerhalb der Stelle gemessen, und letztere wird abgezogen, aus dem ehemaligen, die Intensität des Spots (ΔOD) zu erhalten. Hier beschreiben wir die Methode der Dissektion, Messung und Berechnung von ΔOD. Dieses Verfahren kann nach Schritt2, unabhängig von Schritt 3 und Schritt 4 durchgeführt werden. Sobald man Schritt2 ausgeführt hat und alle pupal Stadien versteht, können direkt starten oder wiederholen Sie Schritt 5.
- Bild-Vorbereitung
- Bereiten Sie eine neue Puppe eine fokale Phase, wie in Schritt2 beschrieben. Entfernen Sie den vorderen Teil einer Puppenkammer mit der Pinzette. Entnehmen Sie die Puppe mit Pinzette und legen es in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, Tabelle 2) in einem Kunststoff-Petrischale (Durchmesser 35 mm x Höhe 10 mm).
- Schneiden Sie das Grundgelenk eines Flügels (Grundgelenk ist der schmale proximalen Teil des Flügels). Wie die Flügel gefaltet ist, legen Sie sie in einem Kunststoff-Petrischale (Durchmesser 35 mm x Höhe 10 mm) gefüllt mit DdH2O, durch osmotischen Druck (die Flügel entfaltet sich von selbst) zu verlängern.
- Sammeln Sie neu geschlüpften Erwachsene einmal alle 10 Minuten von einem Lager Fläschchen. Betäuben Sie eine Fliege mit CO2 mit einem CO2 betäubende Pad zu, bestätigen Sie Anesthetization durch Immobilität und schneiden Sie das Grundgelenk eines Flügels.
- Platz 10 µL PBS auf einen Glasobjektträger legen die Flügel gibt, und mit einem Deckglas (18 x 18 mm).
- Schalten Sie das Licht des Stereomikroskops. Legen Sie das Licht bei maximalem Niveau sein. Setzen Sie das Objektiv 11,5 X. Legen Sie die Membran der offenste Staat. Schalten Sie die Kamera ein. Stellen Sie die Kamera sein (ISO: 100, Modus SHQ 3136 x 2352 Pixel, Verschlusszeit: 1/20 s). Konzentrieren Sie sich auf die Probe durch verschieben den Fokusknopf des Mikroskops.
- Drücken Sie den Auslöser an der Fernbedienung, um das Bild aufzunehmen. Nehmen Sie 3 Bilder pro Flügel, von denen jeder eine Campaniform Sensillum, längs-Ader vor Ort oder posterior Crossvein, Positionierung der distale Teil des Flügels auf der linken Seite und den vorderen Teil des Flügels auf der oberen Seite zentriert werden muss.
- Kalibrierung
- Nehmen Sie Bilder von 9 Teile eines abgestuften Dichte-Filters mit der gleichen Kameraeinstellungen verwendet, um die Flügel-Bild zu erhalten.
- ImageJ Software (https://imagej.nih.gov/ij/)22zu initiieren.
- Klicken Sie -Datei | Offenen | und wählen Sie eines der Bilder der abgestuften Dichte Filter.
- Klicken Sie auf Bild | Typ | 8-Bit | um das Bild in einem 8-Bit-Bild umzuwandeln.
- Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Geben Sie | und Oval und zentriert Spalte zu überprüfen. Schreiben Sie 100 (Pixel) in Breite Spalte, 100 (Pixel) in Höhe Spalte, 1568 in Spalte X koordinieren und 1176 in Spalte Y zu koordinieren . Klicken Sie auf "OK".
- Klicken Sie auf analysieren | Maßnahme |. Die "mittlere Grauwert" ausgewählte Bereiche werden gemessen.
- Wiederholen Sie 5.2.3. auf 5.2.6. für die 8 verbleibenden Bilder.
- Klicken Sie auf analysieren | Kalibrieren Rodbard25 in Funktion Spalte auswählen und schreiben Sie die folgende Nummer in der rechten Spalte in der Mitte (0,04, 0.336, 0.632, 0.928, 1.224, 1.52, 1.816, 2.112, 2.408; diese Zahlen hängen die Dichte der trat Dichte Filter).
- Überprüfen Sie globale Kalibrierung Spalte, und klicken Sie auf "OK".
Hinweis: Durch dieses Verfahren durchführen, "meint Grauwert" werden in "optische Dichte (OD)" mit der Rodbard Funktion konvertiert. Nach diesem Schritt kann die optische Dichte für einen bestimmten ausgewählten Bereich in ImageJ-Software berechnet werden.
- Wahl der Messungen
Hinweis: Flecken sind in der Regel verbunden mit Sehenswürdigkeiten wie dem Campaniform Sensillen, längs-Ader Tipps und Crossveins. Diese und andere Sehenswürdigkeiten auf einem Flügel lässt sich die Region von Messungen auswählen. Hier ein Beispiel inD. guttifera(Abbildung 2) wird beschrieben.- Definition von Punkt A, Campaniform Sensillum Ort.
- Öffnen Sie ein Bild, in dem ein Campaniform Sensillum Fleck in der Mitte des Bildes ist. Klicken Sie auf Bild | Typ | 8-Bit | um das Bild in einem 8-Bit-Bild umzuwandeln.
- Klicken Sie auf Rechteck im Bereich Auswahlwerkzeuge und zeichnen Sie ein Rechteck. Stellen Sie den oberen linken Eckpunkt des Rechtecks so ein, dass es von einem Campaniform Sensillum Fleck an der hinteren Linie der dritte längs-Ader und mehr distalen ist. Stellen Sie der rechten Seite des Rechtecks so ein, dass es sich auf der rechten Seite der Campaniform Sensillum vor Ort befindet.
- Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Manager hinzufügen |. Überprüfen Sie Alle anzeigen -Spalte.
- Klicken Sie auf Winkel Werkzeug in Linie Auswahlwerkzeuge. Zeichnen Sie die erste Zeile auf der hinteren Linie der dritte längs-Ader. Legen Sie den linken Endpunkte der Linie auf den Scheitelpunkt des Rechtecks in Schritt 1 erstellt. Zeichnen Sie die zweite Linie, auf der oberen Seite des Rechtecks. Taste "m" drücken, um den Winkel zwischen zwei Linien, die in diesem Schritt messen. Klicken Sie auf das Fenster des Bildes auf dem Bildschirm des Computers.
- Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Manager hinzufügen |.
- Klicken Sie auf Rechteck im Bereich Auswahlwerkzeuge und zeichnen Sie ein Rechteck von etwa 1/9 die Größe des Bildfensters. Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Drehen |. Schreiben Sie die Minusgrade des Winkels in Schritt 5.3.1.4 gemessen. im Winkel Spalte und klicken Sie auf "OK" , um das Rechteck gezeichnet in diesem Schritt drehen.
- Bewegen Sie das Rechteck in Schritt 5.3.1.6 gezeichnet. mit Hilfe der Pfeiltasten. Legen Sie den Endpunkt der hinteren Linie der zweiten längs-Ader auf der linken Seite des Rechtecks und die untere Seite des Rechtecks an der hinteren Linie der dritte längs-Ader angeschlossen. Bestätigen Sie, dass eine senkrechte Linie vom Endpunkt der zweiten längs-Ader an der hinteren Linie der dritte längs-Ader in diesem Verfahren erstellt wird. Definieren Sie den Fuß der senkrechten Linie als Punkt A (Abbildung 2A).
- Notieren Sie die X-Koordinate und die y-Koordinate von Punkt A, unten Bereich Auswahlwerkzeuge angegeben, bei der Platzierung des Cursors auf Punkt A.
- Definition von Punkt B, längs-Ader Tipp vor Ort
- Öffnen Sie ein Bild, in dem eine längs-Ader Spitze Spot in der Mitte des Bildes ist. Klicken Sie auf Bild | Typ | 8-Bit | , das Bild in einem 8-Bit-Bild umzuwandeln.
- Wiederholen Sie den Vorgang im Schritt 5.3.1 beschrieben. (Definition von Punkt A, Campaniform Sensillum vor Ort), Punkt A im Bild zu finden.
- Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Manager hinzufügen |.
- Klicken Sie auf Rechteck im Bereich Auswahlwerkzeuge und zeichnen Sie ein Rechteck. Legen Sie den oberen linken Eckpunkt des Rechtecks am Endpunkt der hinteren Linie der dritte längs-Ader.
- Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Manager hinzufügen |.
- Klicken Sie auf Winkel Werkzeug in Linie Auswahlwerkzeuge. Zeichnen Sie die erste Linie um Punkt A und den Endpunkt der hinteren Linie der dritte längs-Ader zu verbinden. Definieren Sie diese Linie als Linie A. zeichnen die zweite Zeile auf der oberen Seite des Rechtecks in Schritt 5.3.2.4 gezeichnet. Taste "m" drücken, um den Winkel zwischen den beiden Linien zu messen.
- Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Manager hinzufügen |.
- Klicken Sie auf Rechteck im Bereich Auswahlwerkzeuge und zeichnen Sie ein Rechteck von etwa 1/9 die Größe des Bildfensters. Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Drehen |. Schreiben Sie die Minusgrade des Winkels in Schritt 5.3.2.6 gemessen. im Winkel Spalte und klicken Sie auf "OK" , um das Rechteck gezeichnet in diesem Schritt drehen. Bewegen Sie das Rechteck mit den Pfeiltasten. Stellen Sie die obere Seite des Rechtecks so ein, dass er mit Linie A und der Endpunkt der vorderen Linie der vierten längs-Ader verbunden ist, so dass es auf der linken Seite des Rechtecks.
- Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Manager hinzufügen |.
- Klicken Sie auf Rechteck im Bereich Auswahlwerkzeuge und zeichnen Sie ein Rechteck von etwa 1/9 die Größe des Bildfensters. Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Drehen |. Schreiben Sie die Minusgrade des Winkels gemessen in Schritt 6 in Winkel Spalte und klicken Sie auf "OK" um das Rechteck gezeichnet in diesem Schritt zu drehen. Bewegen Sie das Rechteck mit den Pfeiltasten. Die unteren linken Eckpunkt des Rechtecks so einstellen, dass es am oberen linken Eckpunkt des Rechtecks in Schritt 5.3.2.8 gezeichnet ist., was bei der Beschaffung der senkrechten Linie vom Endpunkt der vorderen Linie der vierten längs-Ader Linie A. definieren die Schnittpunkt der senkrechten Linie und der hinteren Linie der dritte längs-Ader als Punkt B (Abb. 2 b).
- Notieren Sie die X-Koordinate und die y-Koordinate von Punkt B, unten Bereich Auswahlwerkzeuge angegeben, bei der Platzierung des Cursors auf Punkt B.
- Definition der Punkt C, hintere Crossvein vor Ort
- Öffnen Sie ein Bild, in dem eine posteriore Crossvein Fleck in der Mitte des Bildes ist. Klicken Sie auf Bild | Typ | 8-Bit | , das Bild in einem 8-Bit-Bild umzuwandeln.
- Definieren Sie Punkt C als der hinteren Punkt der vorderen Linie von der vierten längs-Ader im Knotenpunktbereich der hinteren Crossvein und die vierte längs-Ader (Abbildung 2).
- Notieren Sie die X-Koordinate und die y-Koordinate der Punkt C, unten Bereich Auswahlwerkzeuge angegeben, bei der Platzierung des Cursors auf Punkt C.
- Definition von Punkt D, Regelzone
- Öffnen Sie ein Bild, in dem ein Campaniform Sensillum Fleck in der Mitte des Bildes ist. Klicken Sie auf Bild | Typ | 8-Bit | um das Bild in einem 8-Bit-Bild umzuwandeln.
- Klicken Sie auf gerade Linie Auswahlwerkzeuge und zeichnen Sie eine Linie verbindet den Endpunkt der vorderen Linie der zweiten längs-Ader und den Endpunkt der hinteren Linie der vierten längs-Ader. Definieren Sie Punkt D als Kreuzungspunkt von dieser Linie und der hinteren Linie der dritte längs-Ader (Abb. 2D).
- Notieren Sie die X-Koordinate und die y-Koordinate der Punkt D, unten Bereich Auswahlwerkzeuge angegeben, bei der Platzierung des Cursors auf Punkt D.
- Definition von Punkt A, Campaniform Sensillum Ort.
- Messungen
- Öffnen Sie eines der Bilder der Flügel-Spots (für Messung von Punkt A, öffnen Sie das Bild mit Punkt A in der Mitte). Klicken Sie auf Bild | Typ | 8-Bit | um das Bild in einem 8-Bit-Bild umzuwandeln.
- Klicken Sie auf Rechteck im Bereich Auswahlwerkzeuge und zeichnen Sie ein Rechteck von etwa 1/9 Größe des Bildfensters.
- Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Geben Sie |. Oval und zentriert Spalte zu überprüfen. 100 (Pixel) in Höhe und Breite Spalten zu schreiben, schreiben Sie die X-Koordinaten von Punkt A (oder Buchstabe B oder Buchstabe C) und in Spalte X koordinieren und schreiben die y Koordinaten von Punkt A (oder Punkt B oder Buchstabe C) und D in Spalte Y zu koordinieren . Klicken Sie auf "OK".
- Klicken Sie auf analysieren | Maßnahme |. Wenn die Kalibrierung in 5.2 beschrieben bereits abgeschlossen hat, sind ODs in Meine Spalte angegeben.
- ΔODs durch Subtrahieren OD von Punkt D von ODs der Punkte A, B und c berechnen
Hinweis: Punkt D befindet sich in einer durchsichtigen Teil des Flügels und beinhaltet keine Pigmentierung und eignet sich somit für ein Hintergrund-Steuerelement.
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Representative Results
Die pupal Zeitraum von D. Guttifera gliedert sich in 17 Stufen (P1 - P15(ii), Bilder von drei Vertreter, die Phasen (P1, P5 - 6, P10) gezeigt werden, Abbildung 3und alle 17 Stufen sind in Abbildung 4dargestellt). Obwohl Bainbridge und Bownes17 20 Etappen in D. Melanogastererkannt, könnten einige dieser Phasen nicht auf D. Guttiferaangewendet werden. Die Reihenfolge der beiden entwicklungspolitischen Veranstaltungen, das Aussehen des Gelbkörpers (Masse von Schuppen Zellen in den Mitteldarm26) und das Timing der Malpighian Tubuli grünte, nicht streng in D. Guttiferakontrolliert, und daher konnten wir nicht trennen P5 (i ), P5(ii) und P6. Auch, anders als in D. Melanogaster, das Timing der Schwärzung des thorakalen und abdominalen Borsten wurde synchronisiert, und daher konnten wir nicht trennen, P11(i) und P11(ii)19.
Wir konnten die Länge des pupal Stadien D. Guttifera (Tabelle 3, von Fukutomi Et Al.19) messen. Die gesamte pupal beträgt ca. 20 h länger als die von D. Melanogaster bei 25 ° C-17. ΔODs der Umgebung ein Campaniform Sensillum, längs-Ader Tipp und posterior Crossvein berechnet. Hier zeigen wir die ODs und ΔODs bei Erwachsenen 7 Tage nach Bewegungsapparate (Tabelle 4). Vergleicht man die Daten auf mehreren Etappen, wir fanden, dass die Bühne P12(i) ist der Zeitpunkt des Auftretens der Pigmentierung und die Pigmentierung erfolgt durch 24 h nach Bewegungsapparate (Abbildung 5, aus der ursprünglichen Messungen in Fukutomi Et Al. 19).
Abbildung 1: Abbildung des Entfernens Puppenkammer. (A) stellen Sie eine Puppe ventralen Seite nach oben auf ein Stück doppelseitiges Klebeband. Entfernen Sie den vorderen Teil der Puppenkammer. (B) Bruch der Puppenkammer mit der Pinzette von der Bauchseite. (C) nach dem Bruch der Puppenkammer, nehmen Sie die Puppe mit einem Pinsel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Abgrenzung des Gebiets für die Messung von Pigmentierung. (A) Punkt A um einen Platz mit einem Campaniform Sensillum verbunden. (B) Punkt B nach einem Ort, verbunden mit einer längs-Ader-Spitze. (C) Punkt C um einen Platz mit einem hinteren Crossvein verbunden. (D) Punkt D für eine Regelzone. Maßstabsleisten zeigen 250 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Beispiele für definierte pupal Stadien. (A) Puppe Stufe P1 mit Puppenkammer bedeckt. (B) Puppe der Bühne P5 - 6. (C) Puppe der Bühne P10. Die Puparia werden entfernt, vor der Beobachtung in (B) und (C). Maßstabsleisten geben 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Illustrationen von 17 pupal Stadien identifiziert in D. Guttifera. (A) P1, der Puppenkammer ist weiß. (B) P2, die Farbe der Puppenkammer ist hellbraun. (C) P3, wird eine Blase in der lateralen Seite (schwarze Pfeilspitze) beobachtet. (D) P4(i), die Blase ist größer als die in P3 (schwarze Pfeilspitze), und die Puppe ist lebhaft mit PBS-Puffer. (E) P4(ii), wird eine Lücke in den vorderen Teil (schwarze Pfeilspitze) und den hinteren Teil (graue Pfeilspitze) beobachtet. (F) P5 - 6, Malpighian Tubuli (schwer zu sehen, ob Puppenkammer abgedeckt) migrieren. Die pupal Form bildet pupal Epithel und pupal Nagelhaut. (G) P7, kann der Gelbkörper in der dorsalen Seite (schwarze Pfeilspitze) beobachtet werden. (H) P8, die Augen sind gelb. (I) P9, die Augen sind gelb. (J) P10, die Augen sind rot. (K) P11, Orbital und ocellar Borsten (graue Pfeilspitze), Tasthaare, thorakale Macrochaetae (schwarze Pfeilspitze) und tarsal Borsten sind schwarz und sichtbar. (L) P12(i), die Spitzen der Flügel sind grau. (M) P12(ii), alle Teile der Flügel sind grau (schwarze Pfeilspitze). (N) P13, sind die Flügel ganz schwarz. (O) P14, der Kopf und die Beine sind komplett verdunkelt. (P) P15(i), kann das Mekonium auf der dorsalen Bauch (schwarze Pfeilspitze) beobachtet werden. (Q) P15(ii), ist die Fliege umhüllenden. Details zu diesen Phasen wurden in Fukutomi Et al.beschrieben. 19 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Entwicklung der Pigmentierung um ein Companiform Sensillum auf einem Flügel. Kreise zeigen individuelle ΔODs und horizontalen Balken zeigen Durchschnittswerte. P10: n = 10, P11: n = 10, 12(i): n = 10, P15(i): n = 11, 3 h: n = 8, 24 h: n = 7, 7 Tage: n = 10. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Komponente | |
| Weiche Weißzucker | 51,6 g |
| Maismehl | 172,4 g |
| Maiskörner - C | 86,4 g |
| Trockene Bierhefe | 106 g |
| Agar Pulver | 35,28 g |
| DdH2O | 4000 mL |
| Kochen Sie für 30 min und bis zu 70 ° c abkühlen lassen | |
| Fügen Sie 4 g Butyl-p-Hydroxybenzoat in 40 mL Ethanol gelöst. | |
| Gut mischen und gießen Sie 9 mL in Kunststoff-Flaschen (Durchmesser 25 mm x Höhe 96 mm). | |
Tabelle 1. Die Zusammensetzung der standard Maismehl, Zucker, Hefe, Agar Essen.
| Komponente | Betrag |
| NaCl | 80 g |
| KCl | 2 g |
| Na2HPO4·12H2O | 29 g |
| KH2PO4 | 2 g |
| DdH2O | bis zu 10 L |
| eingestellte pH-Wert 7,4 |
Tabelle 2. Die Zusammensetzung der PBS (1 X).
| Bühne | Mittelwert der Dauer (h) | s.d. | n |
| P1 - 2 | 1.7 | 0,65 | 16 |
| P3 | 2.1 | 0,65 | 16 |
| P4(i) | 2.1 | 1,69 | 19 |
| P4(II) | 0,3 | 0,28 | 29 |
| P5 - 6 | 5.0 | 3.07 | 30 |
| P7 | 31,9 | 7.22 | 46 |
| P8 | 9.6 | 2,81 | 57 |
| P9 | 10.9 | 2.66 | 55 |
| P10 | 11.7 | 2.96 | 39 |
| P11 | 4.4 | 2,81 | 44 |
| P12(i) | 1.1 | 0,76 | 44 |
| P12(II) | 2.0 | 0.70 | 43 |
| P13 | 2.2 | 0,68 | 10 |
| P14 - 15(i) | 28,6 | 2.75 | 10 |
| P15(II) | 1.4 | 0,87 | 10 |
| Insgesamt | 121,7 |
Tabelle 3. Gemessenen Laufzeiten pupal Stadien der D. Guttifera.
| OD | ΔOD | |||||||
| Campaniform sensilum | Längs-Ader Tipp | Hintere crossvein | Kontrolle | Campaniform sensilum | Längs-Ader Tipp | Hintere crossvein | ||
| Einzelnen | (Punkt A) | (Punkt B) | (Punkt C) | (Punkt D) | (Punkt A - Punkt D) | (Punkt B - Punkt D) | (Punkt C - Punkt D) | |
| 1 | 0.549 | 0.484 | 0.515 | 0.256 | 0.293 | 0.228 | 0.259 | |
| 2 | 0.529 | 0.489 | 0.516 | 0,254 | 0.275 | 0,235 | 0.262 | |
| 3 | 0.546 | 0,48 | 0.533 | 0.255 | 0,291 | 0.225 | 0.278 | |
| 4 | 0.583 | 0.496 | 0.566 | 0.255 | 0.328 | 0.241 | 0.311 | |
| 5 | 0.523 | 0.479 | 0.528 | 0,235 | 0.288 | 0.244 | 0.293 | |
| 6 | 0.572 | 0.509 | 0.546 | 0.265 | 0.307 | 0.244 | 0.281 | |
| 7 | 0.568 | 0.511 | 0,56 | 0.256 | 0.312 | 0.255 | 0.304 | |
| 8 | 0,56 | 0.507 | 0.562 | 0,27 | 0.29 | 0,237 | 0.292 | |
| 9 | 0.551 | 0.485 | 0.569 | 0.259 | 0.292 | 0.226 | 0,31 |
Tabelle 4. ODs gemessen und ΔODs von D. Guttifera Erwachsene 7 Tage nach Bewegungsapparate.
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Discussion
Wir beschreiben hier die Protokolle für die Definition von pupal Stadien entfernen der Puppenkammer für detaillierte Beobachtung, Messung der Dauer von pupal Stadien und Messung der Intensität der schwarzen Flecken auf einem Flügel in D. Guttifera. Diese Protokolle können viele Drosophila beantragt werden und im Zusammenhang mit Fliege Arten, vor allem mit Flügel Pigmentierung.
Eingehende Beobachtung und Beschreibung der detailliertere entwicklungspolitische Veranstaltungen könnten weitere Unterteilung der Stufen. In vielen Fällen eine Entwicklungsstörung Veranstaltung erfordern Dissektion oder eine Puppe-Schnitt eignet sich nicht für die Bühne Definition, da muss man eine Puppe für Inszenierung zu töten, und die weitere Nutzung dieser Person ist schwierig. Für den Einsatz einer neuen Art von Drosophila sollte eine entwicklungspolitische Veranstaltungen außerhalb der Puppenkammer unterscheidbar als ersten Schritt einsetzen. Je nach Zweck der Studie kann eine Phasen basierend auf bestimmten Organogenese oder andere entwicklungspolitischen Veranstaltungen dann weiter unterteilen.
Für interspezifische Vergleich der mehrstufig ist eine mögliche Schwierigkeit eine Umkehrung des Ordens entwicklungspolitische Veranstaltungen zwischen den Arten (Heterochrony27). Zum Beispiel in D. Melanogaster, Malpighian Röhrchen wird grün und der Gelbkörper wird dann sichtbar, während diese Ordnung in einige Puppen von D. Guttifera19invertiert werden kann. In einem solchen Fall ist strenger Vergleich zwischen homologen Stufen schwierig. Je nach dem Phänomen von Interesse müssen einer neu zu definieren oder ein bestimmtes Stadium, basierend auf einem entwicklungspolitischen Ereignis zu unterteilen. Zum Beispiel können wir etwa wählen Sie Puppen von P5 - 6 und interspezifischen Vergleichs zwischen gen ausdrücken im pupal Flügel mit Flügel Morphologie als Indikator für Entwicklungsstörungen Timing14tun.
In der Regel dauert es 10-30 min um die Puppenkammer zu entfernen. Wenn man eine kurze Etappe beobachten will, sollte unter Berücksichtigung der Zeit, die während der Puppenkammer Entfernung Puppen vorbereitet werden. Zum Beispiel will man P12(i) von D. Guttifera, zu beobachten, die nur 1,1 h Dauer hat, würde das Puppen auf P11 Vorbereitung ein gutes Ergebnis geben.
In unserem Protokoll wird angefeuchtet Tissue-Papier für den Hintergrund des pupal Bilder verwendet. Abhängig von der Phase der Beobachtung und Strukturen, die man in einem Bild zeigen will, kann man weiße oder schwarze Tissue-Papier verwenden. Für die P3 P4(ii) Übergang die Position der Blase in Puppe ist wichtig für die Unterscheidung von Stufen und schwarzes Seidenpapier hilft, um die Position der Blase zu beobachten. Für die Stufen nach P5 ist weißes Seidenpapier besser, weil es hilft, den Gelbkörper, Augenfarbe, Borsten und Körperfarbe beobachten.
Bainbridge und Bownes17 schätzt die Dauer der pupal Stadien von der Häufigkeit ihrer Erscheinung. Ihre Stagingtabelle ist das am weitesten verbreitete für D. Melanogaster18. Für ihre Methode sie vier Essen Flaschen mit fünf Erwachsenen Weibchen und 5 Männchen vorbereitet und im Dunkeln aufbewahrt und dann Puppen wurden nach dem Zufallsprinzip herausgenommen aus einer Flasche 11, 12, 13 und 14 Tage nach Beginn der Eiablage. Sie zählte die Anzahl der Puppen in bestimmten Stadien und die Mittelwerte berechnet. Die Länge der einzelnen Puppenstadium konnte anhand der Daten der Gesamtdauer der pupal Periode und die Frequenzdaten geschätzt werden. Ein Problem mit dieser Methode ist, dass es nicht verwendet werden, um die genaue Dauer des pupal Stadien zu schätzen, wenn Entwicklungsstörungen Timing tendenziell unter Puppen synchronisiert werden.
In der Tat, wir versucht Bainbridge und Bownes Methode in D. Guttifera, und wir erhalten verzerrte Daten wegen der Synchronisation unter Puppen. Wir können die Ursache für dieses Phänomen nicht identifizieren, aber einige Möglichkeiten sind (1) Puppen behalten zirkadianen Rhythmus von ihren jungen Bühne und/oder (2) sie reagierte auf die Forderungen an Licht, das auf Beobachtung aufgetreten ist. Daher beschlossen wir, die Dauer der eigentlichen Bühne durch direkte Beobachtung zu messen. Dies minimiert Verzerrungen verursacht durch zirkadianen Rhythmus.
Die hier beschriebene Methode ist eine Methode, um zusätzliche Ansammlung von Melanin an Stellen im Vergleich zu ihrer Umgebung Kontrolle (ΔOD), quantifizieren durch Subtraktion der OD der Regelzone von OD des Gebiets vor Ort. Diese Methode ist eine Methode zur Quantifizierung der nuklearen DNA-Gehalt von Feulgen Färbung und Bildanalyse (Densitometrie28,29) inspiriert. Als eines der möglichen Probleme für die Anwendung dieser Methode auf Flügel Pigmentierung kann ΔOD ein negativer Wert sein, besonders wenn eine Puppe sehr jung ist und fast keine Pigmentierung hat. In späteren Stadien gäbe es einige Pigmentierung in der Regelzone. Die Verwendung der einfachen OD des Gebiets vor Ort selbst möglicherweise anstelle von ΔOD abhängig vom Zweck der Studie geeignet. Im Falle von D. Guttifera, änderte Verwendung der einfachen OD statt ΔOD nicht die Tendenz der Daten oder die Schlussfolgerungen der Studie.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Wir danken Sean B. Carroll und Thomas Werner für die Bereitstellung von fliegen Bestände, Naoyuki Sicherung für Ausrüstung, Byung Seok Jin für seine Hilfe bei Dreharbeiten, Kiyokazu Agata für mentoring und Elizabeth Nakajima zur englischen Bearbeitung. Diese Arbeit wurde durch KAKENHI unterstützt 17K 19427 und Takeda Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits - C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits - C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 - 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
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