Summary
Protocoles pour la stadification des périodes nymphales et mesure de la pigmentation de la voilure de Drosophila guttifera sont décrits. Mise en scène et la quantification de la pigmentation fournissent une base solide pour l’étude des mécanismes de développement des traits adultes et permettent la comparaison interspécifique de développement de caractère.
Abstract
Diversifié d’espèces de drosophile (mouche) offrent des possibilités d’étudier les mécanismes du développement et des modifications génétiques responsables des changements évolutifs. En particulier, le stade adulte est une source riche des traits morphologiques pour comparaison interspécifique, y compris la comparaison de pigmentation aile. Afin d’étudier les différences de développement entre les espèces, observation détaillée et mise en scène appropriée sont nécessaires pour comparaison précise. Nous décrivons ici les protocoles de mise en scène des périodes nymphales et quantification de la pigmentation chez un pois drosophile, Drosophila guttiferaaile. Tout d’abord, nous décrivons la méthode d’observation morphologique détaillée et définition des stades nymphales issu des morphologies. Cette méthode comprend une technique pour enlever le puparium, qui est le cas de chitineux externe de la chrysalide, pour permettre l’observation détaillée des morphologies pupes. En second lieu, nous décrivons la méthode pour mesurer la durée des stades nymphales définis. Enfin, nous décrivons la méthode pour la quantification de la pigmentation Escadre basée sur l’analyse d’images à l’aide d’images numériques et logiciels ImageJ. Avec ces méthodes, nous pouvons établir une base solide pour la comparaison des processus de développement des traits adultes stades nymphales.
Introduction
Certains des traits morphologiques de la drosophile sont diversifié en fonction des espèces1,2,3,4,5. Nous pouvons aborder la question de la diversité morphologique comment se pose en comparant les mécanismes de génération de ces morphologies. Trichomes larvaires, peignes de sexe adulte, appareil génital externe, pigmentation cutanée abdominale et aile pigmentation6,7,8,9, sont des exemples de ces morphologies 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. afin d’étudier les différences morphologiques entre les adultes, observation et analyse des stades nymphales sont importantes, car le sort des traits adultes est déterminé dans les derniers stades larvaires et morphogenèse ultérieure procède au cours de la période nymphale.
Dans des études de biologie du développement de Drosophila melanogaster, « heures CSA » (heures après la formation de la pupe) est la méthode couramment utilisée pour indiquer une chrysalide16. Ce système emploie temps absolu après formation de la pupe et est très pratique pour des expériences courantes. Cependant, vitesse du développement peut-être différer chez les nymphes et peut être affectée par légères différences génétiques, épigénétiques ou micro-environnementales, et par conséquent avoir le même temps absolu après formation de la pupe ne garantit pas que les nymphes sont dans le même stade de développement. Dans de nombreux cas, les étapes définies par les caractéristiques morphologiques sont préférables pour comparer plusieurs personnes. En particulier, une comparaison entre les espèces nécessite mise en scène précise et comparaison entre les étapes (homologues) correspondantes.
Bainbridge et Bownes17 reconnu 20 stades nymphales (P1 à P15(ii)) basé sur des caractéristiques morphologiques des pupes de Drosophila melanogaster . Cette mise en scène est le plus largement utilisé de la mise en scène du développement morphologique18. Dans une étude précédente, nous avons effectué pupal mise en scène de Drosophila guttifera pour établir une base pour aile pigmentation études19. D. guttifera a pois noir sur ses ailes et est l’un de l’espèce modèle pour aile pigmentation formation20. Bien que nous avons évoqué les critères morphologiques décrits dans le Bainbridge et 'Bownes recherche17, nous avons mesuré directement durées étape par observations série19, au lieu d’utiliser Bainbridge et Bownes' estimation de la durée de l’étape de la fréquence observée. Nous décrivons ici la méthode de mise en scène pupe et de mesure des durées des stades nymphales de Drosophila utilisé dans Fukutomi et al.,19.
Pour étudier le mécanisme du développement de la pigmentation de l’aile, nous avons besoin de savoir quand les stades nymphales ou adultes la pigmentation se produit. Fukutomi et al. 19 quantifiée des densités optiques (ODs) de pigmentation stades nymphal et adulte par analyse d’image des images de l’aile. La pigmentation des ailes de la drosophile est pensée pour être causée par une accumulation de mélanine noire21. Pour la quantification de ces substances, échelle de gris des images et ImageJ logiciel (https://imagej.nih.gov/ij/)22 ont été utilisés. Pour reconnaître et quantifier la pigmentation spot spécifique (ΔOD), nous soustrayons l’OD en dehors d’une place de la Division d’opposition à l’intérieur d’un spot. Pour rendre cette méthode objective et reproductible, les lieux de mesure OD doivent être déterminées en utilisant des veines de l’aile comme points de repère. Dans cet article, nous décrivons en détail cette méthode de dosage de la pigmentation de la voilure dans drosophile guttifera.
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Protocol
1. la mouche stock
- Utiliser Drosophila guttifera pour tous les protocoles suivants.
- Utiliser des flacons en plastique (diamètre 25 mm x hauteur 96 mm) et bouchons de cellulose (diamètre 23 mm x hauteur 26 mm) pour l’entretien de stocks. Utiliser un aliment standard de la semoule de maïs/sucre/levure/agar et suivre une publication décrit trois autres recettes alternatives pour cette espèce2.
Remarque : d. guttifera (numéro de nomenclature 15130-1971.10) est fourni par l’espèce Drosophila Stock Center à l’Université de Californie, San Diego. Bien que d. guttifera appartient à immigrans-tripunctata rayonnement, qui est lointainement lié à d. melanogaster dans le genre23, il possède de nombreuses propriétés biologiques en commun avec D. melanogaster . En conséquence, le présent protocole peut être appliqué à de nombreuses espèces de drosophile , bien que certaines espèces ont besoin d’aliments spécifiques et/ou des conseils techniques pour les entretenir2.
2. observation de chrysalide et de définition des étapes pupes
Remarque : La chrysalide pour observation est tirée de la mouche stock maintenu avec un 12:12 h de lumière/obscurité cycle à 25 ° C. Bainbridge et Bownes17 décrit un faible risque de passer des pupes de d. melanogaster de l’endroit original de la nymphose sur un morceau de papier de soie humide (97 % de survie des pupes déplacés 946). Guttifera d. nymphes peuvent être préparés par essentiellement la même méthode.
- Placer les adultes en bonne santé de la drosophile sur des aliments frais (norme alimentaire de semoule de maïs/sucre/levure/agar) dans un flacon en plastique (diamètre 25 mm x hauteur 96 mm) et qu’ils pondent des œufs. Attendre 7 jours pour obtenir la fin 3e stades.
- Placer 1 mL de nourriture de semoule de maïs/sucre/levure/gélose standard dans chaque microtubes de 1,5 mL. Faire 3 trous d’épingle avec espacement de 2 mm dans les couvercles des microtubes en pénétrant avec une punaise pour permettre la respiration.
- Centrifuger les microtubes avec de la nourriture pour 7 s dans une micro-centrifugeuse minie (860 x g).
- Inverser et tapoter les flacons pour supprimer tous les adultes de la fiole.
- Versez 5 à 10 mL de ddH2O (ou inverse eau osmosée) dans le flacon.
- Versez les larves avec de l’eau dans une boîte de Pétri de plastique (diamètre 90 mm x épaisseur 15 mm). Identifier les stades 3e fin par leur grande taille (3-4 mm de longueur).
- Déplacez doucement fin 3ème stade larvaire avec une pince dans les microtubes contenant alimentaire (10 larves / microtube). Les incuber pendant la nuit à 25 ° C.
- Déplacer des nymphes nouvellement formés sur un morceau de papier de soie qui a été mouillé par ddH2O et placé dans une boîte de Pétri de plastique (diamètre 35 mm x épaisseur 10 mm).
- Placez la boîte de Pétri dans une chambre humide (contenant 10 mL de ddH2O en bas) et attendez que la pupe se développer au stade désiré.
- Déplacer des pupes sur une pièce humide de papier de soie dans une boîte de Pétri de plastique (diamètre 60 mm x épaisseur 15 mm).
Remarque : La définition des étapes peut surtout être prise en fonction sur les scènes de d. melanogaster17. En règle générale, la période nymphale de Drosophila peut être classée en P1 - P15(ii), bien que quelques modifications de définition de la scène il faudrait selon l’espèce utilisée. Si possible, enlever le puparium permet l’observation précise et détaillée. Voir détails ci-dessous (étape 3). - Observer les nymphes sous un microscope stéréo. Prendre des photos à l’aide d’une caméra numérique attachée au microscope stéréo.
3. Enlever le puparium
NOTE : Les nymphes de drosophile sont couverts par une structure appelée le puparium. Un insecte du Muscomorpha (mouches) n’apporte pas sa cuticule larvaire à la nymphose ; au lieu de cela, il durcit la cuticule après apolyse et l’utilise comme un couvercle de protection de la chrysalide, le puparium24. Une nymphe qui résident à l’intérieur d’un puparium a une cuticule nymphale vraie, qui est très doux et fragile. Avant apolyse se déroule autour de P4(ii), épithéliums et puparium sont attachés ensemble, et donc enlever le puparium sans dommage est très difficile. Après P5, enlevant le puparium est laborieux, mais utile pour l’observation morphologique et définition des étapes pupes. Le processus est effectué comme suit.
- Apposer un morceau de ruban adhésif double-face sur un morceau de papier absorbant.
- Placez une nymphe sur la face ventrale du ruban adhésif double-face vers le haut (Figure 1 a).
- Localiser l’espace entre la paroi antérieure de la puparium et la nymphe interne. Saisir et retirer le puparium autour de cette lacune à l’aide de pinces et exposer la face antérieure de la tête de la nymphe.
- Insérez l’extrémité d’une pince en le déplaçant parallèlement à l’axe antéro-postérieur. Soulevez la pointe de la pince à rompre localement le puparium. Répétez l’opération jusqu'à ce que la rupture atteigne la partie postérieure de la puparium. Veiller à ce qu’un écart est également formé entre le puparium et jambes pupes et briser la face ventrale de la puparium et minimiser les dommages à la chrysalide interne (Figure 1 b).
- Après la rupture du puparium autant que possible, retirez la pupe à l’aide d’un pinceau fin (#5/0) (Figure 1).
- Placez la nymphe sur un morceau de papier de soie qui a été imbibé de ddH2O et placé dans une boîte de Pétri de plastique (diamètre 60 mm x épaisseur 15 mm). Prendre des photos dès que possible parce que la chrysalide exposée est vulnérable et devienne facilement sec.
NOTE : Nymphes sans un puparium ne conviennent pas pour mesurer les durées des périodes nymphales (étape 4), parce que stress (par exemple, la dessiccation) et les dommages physiques risquent d’interférer avec le développement normal.
4. mesure de la durée des stades nymphales
- Préparer les nymphes pour la mesure des durées des stades nymphales tel que décrit à l’étape 2. Recueillir les nymphes de 1-2 et 2-3, 3-4 jours après la formation de pupe (20 nymphes). Donner des numéros d’identification individuels (1-60) à nymphes pour identification. Poursuivre la collecte nouvellement formé des nymphes aux étapes suivantes, afin d’obtenir 20 nymphes jeunes plus. Donner les numéros d’identification individuels (61-80) pour les nymphes nouvellement formés. Placer une nymphe sur un morceau ddH2O imbibée de papier de soie dans un puits (3,9 cm2) d’une plaque de culture de cellules de 12 puits (1 chrysalide/puits, 12 chrysalides/plaque). Remplir l’espace entre bien des plaques avec les ddH2O à conserver l’humidité, mettre les couvercles et placer les plaques à 25 ° C, des conditions de luminosité constante (24:0 h lumière/obscurité).
Remarque : Les nymphes sans un puparium ne sont pas appropriés pour mesurer les durées des périodes nymphales. S’il vous plaît ne pas enlever le puparium. - Observez les traits morphologiques y compris couleur de la carrosserie, soies, tubes de Malpighi et corps jaune des chrysalides tous une fois chaque 30 min et consigner observée stades (P1 - P15(ii), basé sur les références17,19) dans une feuille de pointage.
- Continuer l’enregistrement pendant quatre jours consécutifs (96 h) par un déplacement rotatif de personnes trois (ou plus).
- Compter le nombre d’enregistrements de chaque étape particulière et leur moyenne (moyenne nombre d’observations / nymphes). Puis multiplier par 0,5 (h), ayant pour résultat la longueur estimée des stades (h).
5. mesure de l’intensité des taches noires sur une aile
Remarque : L’intensité des taches noires sur une aile de nymphe ou adulte peut être quantifiée en mesurant la densité optique (do). Un filtre en verre avec ODs connus (filtre à densité gradins) est utilisé pour l’étalonnage25, afin qu’on peut calculer le diamètre extérieur d’une zone particulière d’une image numérique d’une aile. On mesure le diamètre extérieur dans un endroit et la Division d’opposition en dehors de l’endroit, et cette dernière est soustraite de l’ancien pour obtenir l’intensité de la tache (ΔOD). Nous décrivons ici la méthode de dissection, de mesure et de calcul des ΔOD. Cette procédure peut être faite après l’étape 2, indépendante de l’étape 3 et l’étape 4. Une fois qu’on comprend tous les stades nymphales et a joué étape 2, on peut directement commencer ou répétez l’étape 5.
- Préparation de l’image
- Préparer une nouvelle nymphe d’une étape de liaison tel que décrit à l’étape 2. Enlever la partie antérieure d’un puparium avec une pince. Retirez la nymphe avec une pincette et placez-le dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, tableau 2) dans une boîte de Pétri de plastique (diamètre 35 mm x épaisseur 10 mm).
- Couper le joint basal d’une aile (articulation basale est la partie proximale étroite de l’aile). Comme l’aile est pliée, placez-le dans une boîte de Pétri de plastique (diamètre 35 mm x épaisseur 10 mm) rempli de ddH2O de la prolonger par la pression osmotique (l’aile se déploie en soi).
- Recueillir nouvellement éclos adultes une fois toutes les 10 min d’un flacon de stock. Anesthésier une mouche avec du CO2 à l’aide d’un tampon anesthésiant de CO2 , anesthetization pour confirmer l’immobilité et couper le joint basal d’une aile.
- Déposer 10 µL de PBS sur une lame de verre, y placer l’aile et recouvrir d’une lamelle couvre-objet (18 x 18 mm).
- Allumer la lampe du microscope stéréo. Placez la lampe au niveau maximum. Réglez le diaphragme de l’objectif 11,5 X. Régler le diaphragme à l’état plus ouvert. Mettez l’appareil photo. Régler l’appareil pour être (ISO : 100, mode SHQ 3136 x 2352 pixel, vitesse d’obturation : 1/20 s). Mettre l’accent sur l’échantillon en actionnant le bouton de mise au point du microscope.
- Poussez le bouton de l’obturateur de l’unité de contrôle à distance pour prendre une photo. Prendre 3 images par aile, chacun d'entre eux doit être centrée sur une sensille campaniforme, veine longitudinale spot ou postérieur crossvein, positionnement de la partie distale de l’aile sur le côté gauche et la partie antérieure de l’aile sur le dessus.
- Calibration
- Prendre des photos des 9 parties d’un filtre de densité escalier en utilisant les mêmes paramètres de la caméra utilisées pour obtenir l’image de l’aile.
- Initier ImageJ logiciel (https://imagej.nih.gov/ij/)22.
- Cliquez sur le fichier | Ouvert | puis sélectionnez une des images du filtre densité de gradins.
- Cliquez sur l’Image de | Type | 8-bit | pour convertir l’image en une image de 8 bits.
- Cliquez sur modifier | Sélection | Spécifiez | et vérifier la colonne ovale et centré . Dans la colonne Y coordonner , écrire 100 (pixels) dans la colonne de largeur , 100 (pixels) dans la colonne de hauteur , 1568 en colonne X coordonner et 1176. Cliquez sur OK.
- Cliquez analyser | Mesure |. La valeur de gris « signifie » de certaines zones est mesurés.
- 5.2.3 répéter. à 5.2.6. pour les 8 autres images.
- Cliquez analyser | Calibrer Rodbard25 en fonction de colonne et sélectionnez inscrire le numéro suivant dans la colonne de droite au milieu (0,04, 0.336, 0,632, 0.928, 1,224, 1.52, 1.816, 2.112, 2,408 ; ces chiffres dépendent de la densité de la a filtre à densité).
- Vérifier le calibrage Global colonne, puis cliquez sur OK.
Remarque : En effectuant cette procédure, « signifie la valeur de gris » est converti en « densité optique (do) » en utilisant la fonction Rodbard. Après cette étape, densité optique peut être calculée pour un domaine particulier sélectionné dans les logiciels ImageJ.
- Choisir la zone de mesure
NOTE : Les taches sont généralement associés à monuments, tels que des sensilles campaniformes, veine longitudinale trucs et crossveins. Ces et autres points de repère sur une aile peuvent servir à choisir la région de mesures. Ici, un exemple enD. guttifera(Figure 2) est décrite.- Définition du Point A, point sensille campaniforme.
- Ouvrez une image dans laquelle un spot de sensille campaniforme est au centre de l’image. Cliquez sur l’Image de | Type | 8-bit | pour convertir l’image en une image de 8 bits.
- Cliquez sur Rectangle dans la Zone sélection outils et dessinez un rectangle. Définissez le vertex supérieur gauche du rectangle afin qu’il est attaché à la ligne postérieure de la veine longitudinale troisième et plus distale d’une tache de sensille campaniforme. La valeur du côté droit du rectangle afin qu’il se trouve à droite de la sensille campaniforme spot.
- Cliquez sur modifier | Sélection | Ajoutez au gestionnaire |. Vérifier la colonne Afficher tout .
- Cliquez sur outil de l’Angle dans les Outils de sélection de ligne. Dessiner la première ligne sur la ligne postérieure du troisième veine longitudinale. Définissez les points de terminaison gauche de la ligne sur le sommet du rectangle dessiné à l’étape 1. Dessiner la deuxième ligne du côté supérieur du rectangle. Appuyez sur la touche « m » pour mesurer l’angle entre les deux lignes tracées dans cette étape. Cliquez sur la fenêtre de l’image sur l’écran de l’ordinateur.
- Cliquez sur modifier | Sélection | Ajoutez au gestionnaire |.
- Cliquez sur Rectangle dans la Zone sélection outils et dessinez un rectangle d’environ 1/9 la taille de la fenêtre d’image. Cliquez sur modifier | Sélection | Faire pivoter |. Écrire les moins degrés de l’angle mesuré à l’étape 5.3.1.4. Angle de colonne et cliquez sur OK pour faire pivoter le rectangle dessiné dans cette étape.
- Déplacez le rectangle dessiné à l’étape 5.3.1.6. en utilisant les touches fléchées. Définir le point de terminaison de la ligne postérieure de la deuxième veine longitudinale sur le côté gauche du rectangle et le côté inférieur du rectangle relié à la ligne postérieure de la veine longitudinale troisième. Confirmer qu’une ligne perpendiculaire à partir du point de terminaison de la deuxième veine longitudinale à la ligne postérieure de la veine longitudinale troisième est attirée dans cette procédure. Définir le pied de la ligne verticale sous le Point A (Figure 2 a).
- Enregistrer la coordonnée x et la coordonnée y du Point A, ci-dessous les Outils de sélection de zone lorsque vous placez le curseur sur le Point A.
- Définition du Point B, veine longitudinale Astuce tache
- Ouvrez une image dans laquelle une veine longitudinale Astuce tache est au centre de l’image. Cliquez sur l’Image de | Type | 8-bit | pour convertir l’image en une image de 8 bits.
- Répéter la procédure décrite à l’étape 5.3.1. (Définition de A, campaniformes sensille spot) pour trouver un Point de l’image.
- Cliquez sur modifier | Sélection | Ajoutez au gestionnaire |.
- Cliquez sur Rectangle dans la Zone sélection outils et dessinez un rectangle. Définissez le vertex supérieur gauche du rectangle à la fin de la ligne postérieure de la veine longitudinale troisième.
- Cliquez sur modifier | Sélection | Ajoutez au gestionnaire |.
- Cliquez sur outil de l’Angle dans les Outils de sélection de ligne. Dessiner la première ligne pour relier le Point A et le point final de la ligne postérieure de la veine longitudinale troisième. Définir cette ligne comme la ligne A. dessiner la deuxième ligne du côté supérieur du rectangle dessiné à l’étape 5.3.2.4. Appuyez sur la touche « m » pour mesurer l’angle entre les deux lignes.
- Cliquez sur modifier | Sélection | Ajoutez au gestionnaire |.
- Cliquez sur Rectangle dans la Zone sélection outils et dessinez un rectangle d’environ 1/9 la taille de la fenêtre d’image. Cliquez sur modifier | Sélection | Faire pivoter |. Écrire les moins degrés de l’angle mesuré à l’étape 5.3.2.6. Angle de colonne et cliquez sur OK pour faire pivoter le rectangle dessiné dans cette étape. Déplacer le rectangle en utilisant les touches fléchées. Définir le côté supérieur du rectangle afin qu’il est attaché à la ligne A et le point final de la ligne antérieure de la quatrième veine longitudinale afin qu’il soit sur le côté gauche du rectangle.
- Cliquez sur modifier | Sélection | Ajoutez au gestionnaire |.
- Cliquez sur Rectangle dans la Zone sélection outils et dessinez un rectangle d’environ 1/9 la taille de la fenêtre d’image. Cliquez sur modifier | Sélection | Faire pivoter |. Écrire les moins degrés de l’angle mesuré à l’étape 6 en Angle de colonne, puis cliquez sur OK pour faire pivoter le rectangle dessiné dans cette étape. Déplacer le rectangle en utilisant les touches fléchées. Définissez le sommet inférieur gauche du rectangle afin qu’il soit au sommet supérieur gauche du rectangle dessiné à l’étape 5.3.2.8. qui aboutiront à l’obtention de la ligne verticale partir du point de terminaison de la ligne antérieure de la veine longitudinale quatrième ligne A. définir la point d’intersection de la ligne verticale et la ligne postérieure de la veine longitudinale troisième Point b (Figure 2 b).
- Enregistrer la coordonnée x et la coordonnée y du Point B, a indiqué ci-dessous les Outils de sélection de zone lorsque vous placez le curseur sur le Point B.
- Définition du Point C, tache postérieure crossvein
- Ouvrez une image dans laquelle une tache postérieure crossvein est au centre de l’image. Cliquez sur l’Image de | Type | 8-bit | pour convertir l’image en une image de 8 bits.
- Définir le Point C comme le point le plus postérieur de la ligne antérieure de la quatrième veine longitudinale dans la zone d’intersection de la crossvein postérieure et la quatrième veine longitudinale (Figure 2).
- Enregistrer la coordonnée x et la coordonnée y du Point C, ci-dessous les Outils de sélection de zone lorsque vous placez le curseur sur le Point C.
- Définition de Point D, zone de contrôle
- Ouvrez une image dans laquelle un spot de sensille campaniforme est au centre de l’image. Cliquez sur l’Image de | Type | 8-bit | pour convertir l’image en une image de 8 bits.
- Cliquez à droite dans les Outils de sélection de ligne et tracer une ligne reliant le point de fin de la ligne antérieure de la deuxième veine longitudinale et l’extrémité de la ligne postérieure de la quatrième veine longitudinale. Define Point D comme le point de passage de cette ligne et la ligne postérieure de la troisième veine longitudinale (Figure 2D).
- Enregistrer la coordonnée x et la coordonnée y du Point D, ci-dessous les Outils de sélection de zone lorsque vous placez le curseur sur le Point D.
- Définition du Point A, point sensille campaniforme.
- Mesures
- Ouvrez une des images des spots d’aile (pour mesure du Point A, ouvrez l’image avec un Point au centre). Cliquez sur l’Image de | Type | 8-bit | pour convertir l’image en une image de 8 bits.
- Cliquez sur Rectangle dans la Zone sélection outils et dessinez un rectangle d’environ 1/9 taille de la fenêtre d’image.
- Cliquez sur modifier | Sélection | Spécifiez |. Vérifier la colonne ovale et centré . 100 (pixels) dans les colonnes de largeur et de hauteur , écrire les coordonnées en x du Point A (ou B Point ou Point C) et D dans la colonne X coordonner et écrire l’y coordonnées du Point A (Point B ou Point C) et D dans la colonne Y coordonner . Cliquez sur OK.
- Cliquez analyser | Mesure |. Si l’étalonnage mentionné au point 5.2 est déjà terminée, ODs sont indiqués dans la colonne moyenne .
- Calculer ΔODs en soustrayant OD du Point D de ODs des Points A, B et C.
NOTE : Point D se trouve dans une partie transparente de l’aile et n’inclut pas de pigmentation et par conséquent est approprié pour un contrôle de fond.
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Representative Results
La période de pupe de d. guttifera est divisée en 17 étapes (P1 - P15(ii) ; images représentant trois stades (P1, P5 - 6, P10) sont indiquées Figure 3et 17 toutes les étapes sont illustrées à la Figure 4). Que Bainbridge et Bownes17 reconnu 20 étapes chez d. melanogaster, certaines de ces étapes ne pourraient pas s’appliquer aux d. guttifera. L’ordre des deux événements développementaux, l’apparence du corps jaune (masse de cellules hangar au sein de l' intestin moyen26) et le moment de Malpighi devenant verte, ne sont pas strictement contrôlés dans d. guttifera, et donc nous ne pourrions pas séparer P5 (i ), P5(ii) et P6. Aussi, contrairement à chez d. melanogaster, le timing du noircissement des soies thoraciques et abdominales était synchronisé et donc nous ne pourrions pas séparer P11(i) et P11(ii)19.
Nous pourrions mesurer la longueur des étapes pupes de d. guttifera (tableau 3, al. Fukutomi19). L’ensemble de la période nymphale est plus longue que celle de d. melanogaster à 25 ° C17environ 20 h. Nous avons calculé les ΔODs des environs d’une sensille campaniforme, la pointe de la veine longitudinale et la crossvein postérieure. Ici, nous montrons l’ODs et ΔODs chez l’adulte 7 jours après l’éclosion (tableau 4). En comparant les données de multiples étapes, nous avons constaté que le stade P12(i) est le moment d’apparition de la pigmentation, et cette pigmentation est complétée par 24 h après l’éclosion (Figure 5, des mesures originales utilisées dans Fukutomi et coll.. 19).
Figure 1. Illustration de la suppression puparium. (A) placer une face ventrale de la chrysalide vers le haut sur un morceau de ruban adhésif double-face. Enlever la partie antérieure de la puparium. (B) briser le puparium avec une pince du côté ventral. (C) après la rupture du puparium, sortez la pupe à l’aide d’un pinceau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Définition de zone pour mesurer la pigmentation. (A) A point pour une place, associée à une sensille campaniforme. (B) le point B pour une place, associée à un bout de veine longitudinale. (C) le point C pour un spot associé à une crossvein postérieure. (D) le point D pour une zone de contrôle. Barres d’échelle indiquent 250 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Exemples des stades nymphales définis. (A) nymphe du stade que P1 recouvert puparium. (B) nymphe du stade P5 - 6. (C) nymphe du stade P10. Le puparia sont supprimés avant l’observation en (B) et (C). Barres d’échelle indiquent 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 4. Illustrations de 17 étapes pupes déterminées dans d. guttifera. (A) P1, le puparium est blanc. (B) P2, la couleur de la puparium est brun clair. (C) P3, une bulle est observée dans le côté latéral (flèche noire). (D) P4(i), la bulle est plus grande que celle de P3 (flèche noire), et la nymphe est flottante dans du PBS. (E) P4(ii), une lacune est observée dans la partie antérieure (flèche noire) et la partie postérieure (pointe de flèche grise). (F) P5 - 6, Malpighi tubules migrent (difficile de voir si couvert par puparium). La forme nymphale est formée par l’épithélium nymphal et cuticule nymphale. (G) P7, le corps jaune peut être observé dans la face dorsale (flèche noire). (H) P8, les yeux sont de couleur jaunes. (I) P9, les yeux sont orange. (J) P10, les yeux sont rouges. (K) P11, soies orbitales et ocellaires (pointe de flèche grise), vibrisses, macrochaetae thoracique (flèche noire) et soies du tarse sont noirs et visible. (L) P12(i), les extrémités des ailes sont gris. (M) P12(ii), toutes les parties des ailes sont gris (flèche noire). (N) P13, les ailes sont complètement noirs. (O) P14, la tête et les jambes sont complètement obscurcis. (P) P15(i), le méconium peut être observé sur l’abdomen dorsal (flèche noire). (Q) P15(ii), la mouche est éclosion. Détails de ces étapes sont décrites dans Fukutomi et al. 19 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5. Développement de pigmentation autour une sensille companiform sur une aile. Cercles indiquent ΔODs individuels, et les barres horizontales indiquent moyennes. P10 : n = 10, P11 : n = 10, 12i : n = 10, P15(i) : n = 11, 3 h : n = 8, 24 h : n = 7, 7 jours : n = 10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Composant | |
| Sucre mou blanc | 51,6 g |
| Farine de maïs | 172,4 g |
| Gruau de maïs - C | 86,6 % |
| Levure de bière sèche | 106 g |
| Poudre d’agar | 35,28 g |
| ddH2O | 4000 mL |
| Faire bouillir pendant 30 min et laisser refroidir jusqu'à 70 ° C. | |
| Ajouter 4 g de p-hydroxybenzoate de butyle dissous dans 40 mL d’éthanol. | |
| Bien mélanger et verser 9 mL chacun dans des flacons en plastique (diamètre 25 mm x hauteur 96 mm). | |
Le tableau 1. La composition des aliments de semoule de maïs/sucre/levure/gélose standard.
| Composant | Montant |
| NaCl | 80 g |
| JCM | 2 g |
| Na2HPO4·12H2O | 29 g |
| KH2PO4 | 2 g |
| ddH2O | jusqu'à 10 L |
| la valeur de pH 7,4 |
Le tableau 2. La composition de PBS (1 X).
| Stade | Moyenne de durée (h) | s.d. | n |
| P1 - 2 | 1.7 | 0,65 | 16 |
| P3 | 2.1 | 0,65 | 16 |
| P4(i) | 2.1 | 1.69 | 19 |
| P4(II) | 0,3 | 0,28 | 29 |
| P5 - 6 | 5.0 | 3.07 | 30 |
| P7 | 31.9 | 7.22 | 46 |
| P8 | 9.6 | 2,81 | 57 |
| P9 | 10,9 | 2.66 | 55 |
| P10 | 11,7 | 2,96 | 39 |
| P11 | 4.4 | 2,81 | 44 |
| P12(i) | 1.1 | 0,76 | 44 |
| P12(II) | 2.0 | 0,70 | 43 |
| P13 | 2.2 | 0,68 | 10 |
| P14 - 15 (i) | 28,6 | 2,75 | 10 |
| P15(II) | 1.4 | 0,87 | 10 |
| Total | 121,7 |
Tableau 3. Mesurer les durées des stades nymphales de guttifera d..
| OD | ΔOD | |||||||
| Campaniformes sensilum | Astuce de veine longitudinale | Crossvein postérieur | Contrôle | Campaniformes sensilum | Astuce de veine longitudinale | Crossvein postérieur | ||
| Individu | (Point A) | (Point B) | (Point C) | (Point D) | (Point A Point D) | (Point B - Point D) | (Point C - Point D) | |
| 1 | 0,549 | 0,484 | 0,515 | 0,256 | 0,293 | 0,228 | 0,259 | |
| 2 | 0,529 | 0,489 | 0,516 | 0,254 | 0,275 | 0,235 | 0,262 | |
| 3 | 0.546 | 0,48 | 0,533 | 0,255 | 0,291 | 0,225 | 0,278 | |
| 4 | 0,583 | 0,496 | 0.566 | 0,255 | 0,328 | 0,241 | 0.311 | |
| 5 | 0,523 | 0,479 | 0.528 | 0,235 | 0,288 | 0,244 | 0,293 | |
| 6 | 0,572 | 0,509 | 0.546 | 0,265 | 0,307 | 0,244 | 0,281 | |
| 7 | 0,568 | 0.511 | 0,56 | 0,256 | 0,312 | 0,255 | 0,304 | |
| 8 | 0,56 | 0,507 | 0,562 | 0,27 | 0,29 | 0,237 | 0,292 | |
| 9 | 0.551 | 0,485 | 0.569 | 0,259 | 0,292 | 0,226 | 0,31 |
Tableau 4. Mesuré l’ODs et ΔODs de guttifera d. adultes 7 jours après l’éclosion.
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Discussion
Nous décrivons ici les protocoles pour la définition des étapes pupes, enlevant le puparium pour l’observation détaillée, mesure des durées des stades nymphales et mesure de l’intensité des taches noires sur une aile dans d. guttifera. Ces protocoles peuvent être appliquées pour les nombreux Drosophila et des espèces, en particulier les espèces avec la pigmentation de l’aile.
Observation approfondie et une description plus détaillées des événements du développement permettrait à la subdivision des étapes plus loin. Dans de nombreux cas, un événement du développement nécessitant une dissection ou sectionnement d’une nymphe n’est pas approprié pour la définition de la scène, qu’il est difficile, car il faut tuer une nymphe pour la mise en scène et l’utilisation subséquente de cette personne. Pour l’utilisation d’une nouvelle espèce de drosophile , on devrait employer événements développementaux distingués en dehors du puparium comme la première étape. Selon le but de l’étude, un peut subdiviser davantage puis étapes basés sur l’organogenèse particulier ou autres événements développementaux.
Pour la comparaison interspécifique des étapes multiples, une difficulté potentielle est une inversion de l’ordre des événements développementaux chez les espèces (hétérochronie27). Par exemple, chez d. melanogaster, les tubules Malpighian devient vert et le corps jaune devient alors visible, alors que cet ordre peut être inversé dans certains pupes de d. guttifera19. Dans un tel cas, une comparaison stricte entre les stades homologues est difficile. Selon le phénomène d’intérêt, on peut avoir besoin de re-définir ou subdiviser un stade particulier basé sur un événement du développement. Par exemple, nous pouvons à peu près sélectionnez les nymphes de P5 - 6 et faire comparaison interspécifique des expressions génétiques dans les ailes pupes utilisant la morphologie alaire comme indicateur de chronométrage du développement14.
En règle générale, il faut 10-30 min pour enlever le puparium. Si l'on veut observer une courte étape, nymphes doivent être préparés en tenant compte du temps qui passe au moment du retrait du puparium. Par exemple, si l'on veut observer P12(i) de d. guttifera, qui a seulement 1,1 h durée, préparation des nymphes à P11 donnerait un bon résultat.
Dans notre protocole, papier de soie humide est utilisée pour l’arrière-plan d’images pupes. Selon le stade d’observation et de structures, on veut montrer une figure, on peut utiliser le papier de soie blanc ou noir. Pour le P3 pour la transition P4(ii), la position de la bulle en pupe est importante pour distinguer les étapes, et papier de soie noir aide à respecter la position de la bulle. Pour les étapes après P5, papier de soie blanc est préférable car elle permet d’observer le corps jaune, couleur des yeux, poils et couleur de la carrosserie.
Bainbridge et Bownes17 estiment la durée des stades nymphales de leur fréquence d’apparition. Leur table intermédiaire est le plus largement utilisé pour d. melanogaster18. Pour leur méthode, ils ont préparé quatre bouteilles de nourriture contenant cinq femelles et cinq mâles adultes et eux tenus dans l’ignorance, et puis nymphes ont été prélevés au hasard d’une bouteille de chaque à 11, 12, 13 et 14 jours après le début de la ponte. Ils ont compté le nombre de nymphes dans certaines étapes et calculé les moyennes. La longueur de chaque stade pupal pourrait être estimée selon les données de la durée totale de la période nymphale et ces données sur la fréquence. Un problème avec cette méthode, c’est qu’il ne peut pas être utilisé pour estimer la durée exacte des stades nymphales si le calendrier du développement tend à être synchronisées entre les nymphes.
En fait, nous avons essayé la méthode Bainbridge et de Bownes dans d. guttifera, et nous avons obtenu des données biaisées en raison de la synchronisation entre les nymphes. Nous ne pourrions pas identifier la cause de ce phénomène, mais certaines possibilités sont des nymphes 1) conservé le rythme circadien dès leur jeune et/ou 2) ils ont réagi à l’exposition à la lumière qui a eu lieu à observation. Par conséquent, nous avons décidé de mesurer la durée du stade actuel par l’observation directe. Cela minimise la polarisation provoquée par le rythme circadien.
La méthode décrite ici est une méthode pour quantifier l’accumulation supplémentaire de la mélanine dans les taches par rapport à leurs environs de contrôle (ΔOD), en soustrayant le diamètre extérieur de la zone de contrôle de la Division d’opposition de la région de spot. Cette méthode s’inspire d’une méthode pour quantifier la teneur en ADN nucléaire de Feulgen coloration et analyse d’images (densitométrie28,,29). L’un des problèmes potentiels pour l’application de cette méthode de pigmentation de l’aile, ΔOD peut être une valeur négative, surtout quand une nymphe est très jeune et n’a presque aucune pigmentation. Aux stades plus avancés, il pourrait y avoir une pigmentation dans la zone de contrôle. L’utilisation de l’OD simple de la région comptant elle-même pourrait être appropriée au lieu de ΔOD selon le but de l’étude. Dans le cas de d. guttifera, utilisation de l’OD simple au lieu de ΔOD n’a pas changé la tendance des données ou les conclusions de l’étude.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions Sean B. Carroll et Thomas Werner pour fournir des stocks de mouche, Naoyuki fusible pour l’équipement, Byung Seok Jin pour son aide dans le tournage, Kiyokazu Agata de mentorat et Elizabeth Nakajima pour l’édition anglaise. Ce travail a été soutenu par KAKENHI 17K 19427 et Takeda (FNS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits - C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits - C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 - 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
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