Summary
Описываются протоколы постановка куколки периодов и измерение крыла пигментации Drosophila guttifera . Постановка и количественной оценки пигментации обеспечивают прочную основу для изучения развития механизмов взрослых черты и включить межвидовые сравнения черта развития.
Abstract
Разнообразные виды дрозофилы (плодовая муха) предоставляют возможности для изучения механизмов развития и генетические изменения, ответственных за эволюционных изменений. В частности взрослой стадии является богатым источником морфологических признаков для межвидовые сравнения, включая крыло пигментации сравнения. Для изучения развития различия среди видов, для точного сравнения необходимы подробные наблюдения и соответствующие промежуточные. Здесь мы описываем протоколы для промежуточной куколки периодов и количественной оценки крыла пигментации в полька пунктирной плодовой мушки, дрозофила guttifera. Во-первых мы описываем метод для подробного морфологических наблюдения и определения стадий куколки, основанный на морфологии. Этот метод включает метод для удаления puparium, который внешние хитиновый случае куколки, чтобы включить подробные наблюдения куколки морфологии. Во-вторых мы описываем метод для измерения длительности определенных этапов куколки. Наконец мы описываем метод количественной оценки крыла пигментации на основе анализа изображения с помощью цифровых изображений и ImageJ программного обеспечения. С помощью этих методов мы можем создать прочную основу для сравнения процессов развития взрослых черты куколки этапах.
Introduction
Некоторые из морфологических признаков дрозофилы диверсифицированы среди видов1,2,3,4,5. Мы можем подойти к вопросу как морфологического разнообразия возникает, сравнивая механизмы генерации этих морфологии. Примерами таких морфологии являются личиночной трихом, секс Расчески, внешних половых аппарат, брюшной пигментации и крыло пигментации6,,78,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. изучить морфологические различия среди взрослых, наблюдение и анализ стадии куколки важны, потому что в конце личиночной стадии определяется судьба взрослых черты и последующие морфогенеза продолжается период куколки.
В биологии развития исследований Drosophila melanogaster«часов НФА» (часов после куколки формирования) является распространенным методом для обозначения стадия куколки16. Эта система использует абсолютное время после формирования куколки и очень удобно для обычных экспериментов. Однако развития скорость может отличаться среди куколок и могут быть затронуты незначительные различия генетических, эпигенетических или microenvironmental, и поэтому имеющие то же абсолютное время после куколки образования не гарантирует что куколки в то же стадии развития. Во многих случаях этапов определяется морфологические особенности являются предпочтительными для сравнения нескольких лиц. Особенно Сравнение видов требует точной постановки и сравнение среди соответствующих этапов (гомологичных).
Байнбридж и Bownes17 признал 20 куколки этапов (P1 для P15(ii)) на основе морфологических особенностей Drosophila melanogaster куколок. Эта постановка является наиболее широко используемой системой морфологического развития промежуточной18. В предыдущем исследовании мы провели, куколки постановка Drosophila guttifera создать основу для крыла пигментации исследования19. D. guttifera имеет черный горошек узор на свои крылья и является одним из видов модели для формирования пигментации крыла20. Хотя мы ссылались на морфологические критерии, описанные в17исследования Байнбридж и Bownes', мы непосредственно измеряется стадии длительностей последовательных наблюдений19, вместо Байнбридж и Bownes оценки длительности этапа от наблюдаемой частоты. Здесь мы описываем метод куколки промежуточной и измерение длительности куколки этапов дрозофилы , используемых в Фукутоми et al19.
Для изучения развития механизма пигментации крыла, нам необходимо знать, когда в стадии куколки или взрослых происходит пигментация. Фукутоми и др. 19 количественно оптических плотностей (СОД) пигментации стадии куколки и взрослых путем анализа изображений крыла изображений. Считается, что пигментации дрозофилы крыльев быть вызваны накоплением меланина черный21. Для количественной оценки ОРВ были использованы серого изображения и ImageJ программного обеспечения (https://imagej.nih.gov/ij/)22 . Признать и определить место конкретных пигментации (ΔOD), мы вычитаем ОД вне пятно от ОД внутри пятно. Чтобы сделать этот метод воспроизводимость и объективной, должна определяться места измерения ОД, с использованием крыло вен как ориентиры. В этой статье мы подробно описать этот метод количественной оценки крыла пигментации в Drosophila guttifera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fly фондовой
- Используйте дрозофилы guttifera для всех следующих протоколов.
- Используйте Пластиковые флаконы (диаметр 25 мм x Высота 96 мм) и целлюлозы вилки (диаметр 23 мм x высота 26 мм) для фондовых обслуживания. Использовать стандартное питание кукурузной муки/сахар/дрожжи/агар и последующей публикации описаны три другие альтернативные рецепты для этого вида2.
Примечание: д guttifera (Инвентарный номер 15130-1971.10) обеспечивается дрозофилы видов фондового центра в университете Калифорнии, Сан-Диего. Хотя д guttifera принадлежит к immigrans-tripunctata излучение, которое отдаленно связаны с D. melanogaster в род23, она имеет много биологических свойств общего D. melanogaster . Таким образом этот протокол может применяться для многих видов дрозофилы , хотя некоторые виды требуют конкретных продуктов питания и/или технические советы для поддержания их2.
2. наблюдение и определение стадии куколки куколки
Примечание: Куколки для наблюдения берется из летать акций с 12:12 h свет/темно цикла при 25 ° C. Байнбридж и Bownes17 описал низкий риск перемещения D. melanogaster куколки от первоначального места Окукливание на кусок бумаги смоченной ткани (97% выживания 946 переехал куколки). D. guttifera куколки можно приготовить по существу таким же методом.
- Место здоровых взрослых дрозофилы на свежие продукты питания (стандартное питание кукурузной муки/сахар/дрожжи/агар) в пластиковом флаконе (диаметр 25 мм x Высота 96 мм) и пусть они откладывают яйца. Ждать 7 дней, чтобы получить конце 3 стадий.
- Место 1 мл стандартного кукурузной муки/сахар/дрожжи/агар пищи в каждом 1,5 мл микропробирок. Сделать 3 отверстий с шагом 2 мм в крышки пробирки, проникая с канцелярской позволять дышать.
- Центрифуга для пробирок с пищей для 7 s в мини microcentrifuge (860 x g).
- Инвертировать и коснитесь флаконы для удаления всех взрослых из флакона.
- Залить 5-10 мл ddH2O (или обратного осмоса вода) в пробирку.
- Вылейте личинки с водой в пластиковой чашке Петри (диаметр 90 мм x высота 15 мм). Идентифицировать конце 3 стадий их размер большого тела (3-4 мм в длину).
- Аккуратно переместите конце 3 instar личинки с щипцами в пробирок с пищей (10 личинок / Микропробирка). Инкубировать их на ночь при 25 ° C.
- Переместить новообразованной куколок на кусок оберточной бумаги, смоченной ddH2O и помещены в пластиковый Петри (диаметр 35 мм x высота 10 мм).
- Поместите Петри блюдо во влажной камере (содержащие 10 мл ddH2O в нижней части) и подождите, пока куколки разработки до стадии желаемого.
- Переместить куколок на смоченный кусок оберточной бумаги в пластиковой чашке Петри (диаметр 60 мм x высота 15 мм).
Примечание: Определение этапов главным образом производится на основе на этапах D. melanogaster17. Как правило куколки период дрозофилы можно подразделить на P1 - P15(ii), хотя некоторые изменения определения стадии потребуются в зависимости от видов, используемых. Если возможно удаление puparium позволяет точные и подробные наблюдения. Смотрите подробности ниже (шаг 3). - Соблюдайте куколок под микроскопом стерео. Возьмите фотографии с помощью цифровой камеры, прикрепленной к стерео Микроскоп.
3. Удаление puparium
Примечание: Куколки дрозофилы покрыты структура под названием puparium. Насекомое Muscomorpha (мухи) не сбрасывают свои личиночные кутикулы в Окукливание; Вместо этого он твердеет кутикулы после apolysis и использует его как защитная крышка куколки, puparium24. Куколки, находящихся внутри puparium имеет истинное куколки кутикулы, который является очень мягкий и хрупкий. Прежде чем apolysis происходит вокруг P4(ii), эпителия и puparium крепятся вместе, и поэтому удаление puparium без повреждения очень трудно. После P5 удаление puparium является трудоемким, но полезно для морфологического наблюдения и определения стадии куколки. Этот процесс осуществляется следующим образом.
- Аффикс кусок двухсторонний скотч на кусок бумаги полотенце.
- Место куколка на двухсторонний скотч вентральной стороне вверх (рис. 1A).
- Найти расстояние между передней стороне puparium и внутренней куколки. Возьмите и удалить puparium вокруг этого разрыва, с помощью щипцов и разоблачить передней стороне головы куколки.
- Вставьте наконечник щипцов, перемещая его параллельно передней задней оси. Поднимите кончик щипцы сломать puparium локально. Повторите это действие до тех пор, пока поломки достигает задней частью puparium. Убедитесь, что разрыв между puparium и куколки ноги, также формируется и разорвать вентральной стороне puparium и свести к минимуму ущерб внутренней куколки (рис. 1B).
- После ломать puparium насколько это возможно, вынимают куколки с помощью тонкой кистью (#5/0) (рис. 1 c).
- Место куколка на кусок оберточной бумаги, смоченной ddH2O и помещены в пластиковый Петри (диаметр 60 мм x высота 15 мм). Возьмите фотографии как можно скорее, потому что подвергаются куколки уязвим и легко становится сухой.
Примечание: Куколки без puparium не подходят для измерения длительности периодов куколки (шаг 4), потому что стресс (например, сушка) и физический ущерб может мешать нормальному развитию.
4. измерение длительности куколки этапов
- Подготовьте куколок для измерения длительности куколки этапов, как описано в шаге 2. Собирайте куколок 1-2, 2-3 и 3-4 дней после формирования куколки (по 20 куколки). Дать куколок для идентификации индивидуальных идентификационных номеров (1-60). Продолжайте сбор вновь образующихся следующие шаги, чтобы получить 20 более молодые куколки куколки. Дать индивидуальные идентификационные номера (61-80) для вновь образованной куколок. Место куколка на кусок ddH2O, смоченным папиросной бумаги в колодец (3,9 см2) плиты культуры 12-ну клеток (1 куколки/Ну, 12 куколок/плиты). Заполните пространство между хорошо пластин с ddH2O для поддержания влажности, наденьте крышки и поместите пластины в 25 ° C, постоянный свет (24:0 h свет/темно) условий.
Примечание: Куколки без puparium не подходят для измерения длительности куколки периодов. Пожалуйста, не удаляйте puparium. - Соблюдайте морфологические особенности, включая цвет кузова, щетина, Malpighian трубочки и желтого тела всех куколок, один раз каждые 30 мин и запись наблюдается этапов (P1 - P15(ii), основанный на ссылки17,19) в лист учёта.
- Продолжить запись более четырех дней подряд (96 ч), вращающийся переход три (или более) человек.
- Подсчет количества записей каждого конкретного этапа и в среднем их (среднее количество наблюдений / куколок). Затем умножьте их на 0,5 (h), что приводит к оценкам длин этапов (h).
5. измерение интенсивности черных пятен на крыле
Примечание: Интенсивность черные пятна на крыло куколки или взрослый может быть квантифицировано путем измерения оптической плотности (OD). Стеклянный фильтр с известными ОРВ (ступенчатые плотности фильтра) используется для калибровки25, так что можно вычислить ОД конкретной области от цифрового изображения крыла. ОД в месте и ОД вне месте измеряются, и последний вычитается из бывшей получить интенсивность месте (ΔOD). Здесь мы описываем метод вскрытия, измерение и расчет ΔOD. Эта процедура может быть сделано после шага 2, независимо от шаг 3 и шаг 4. После того, как один выступал шаг 2 и понимает все стадии куколки, можно непосредственно начать или повторите шаг 5.
- Подготовка образа
- Подготовьте новые куколки фокуса этапа, как описано в шаге 2. Удаление передней частью puparium пинцетом. Взять из куколки с помощью щипцов и поместить его в фосфатный буфер (PBS, Таблица 2) в пластиковой чашке Петри (диаметр 35 мм x высота 10 мм).
- Вырезать базальной совместной крыла (базальный сустава является узким проксимальной частью крыла). Как крыло складывается, поместите его в пластиковый Петри (диаметр 35 мм x высота 10 мм) заполнены с ddH2O продлить его на осмотического давления (крыло разворачивается сама по себе).
- Соберите недавно eclosed взрослых один раз каждые 10 мин от запасов во флаконе. Анестезировать Муха с CO2 использование CO2 обезболивающим pad, подтвердите анестезии, неподвижность и вырезать базальной совместной крыла.
- Место 10 мкл PBS на слайде стекла, там место крыла и накрыть крышкой скольжения (18 x 18 мм).
- Включите свет стерео Микроскоп. Установите свет, чтобы быть на максимальном уровне. Установка объектива 11.5 X. Установка диафрагмы быть наиболее открытое состояние. Включите камеру. Установите камеру, чтобы быть (ISO: 100, режим SHQ 3136 x 2352 pixels, скорость затвора: 1/20 s). Фокус на образце, перемещая фокус ручка Микроскоп.
- Нажмите кнопку затвора пульт взять изображение. Возьмите 3 изображения на крыло, каждая из которых должна быть сосредоточена на Сенсиллы sensillum, продольные Вены пятно или задняя crossvein, позиционирование дистальной частью крыла на левой стороне и передней частью крыла на верхней стороне.
- Калибровка
- Возьмите изображения 9 частей ступенчатыми плотности фильтра, используя те же параметры камеры используется для получения изображения крыло.
- Инициируйте ImageJ программного обеспечения (https://imagej.nih.gov/ij/)22.
- Щелкните файл | Открытых | и выберите один из образов ступенчатыми плотности фильтра.
- Нажмите на изображение, | Тип | 8-битный | чтобы преобразовать изображение в 8-битного изображения.
- Нажмите кнопку Изменить | Выбор | Укажите | и проверьте столбец овальные и по центру . Напишите 100 (пикселей) в ширину столбца, 100 (пикселей) в высоту столбца, 1568 в столбце Координата по оси X и 1176 в колонке Координата по оси Y . Нажмите кнопку ОК.
- Нажмите кнопку анализ | Мера |. «Среднее значение серого» отдельных областей измеряются.
- Повторите 5.2.3. для 5.2.6. 8 остальные изображения.
- Нажмите кнопку анализ | Калибровки выберите Rodbard25 в функции столбцов и написать следующее число в столбце справа в середине (0,04 0.336, 0,632, 0,928, 1,224, 1.52, 1.816, 2,112, 2.408, эти цифры зависят от плотности шагнуто плотности фильтра).
- Проверьте столбец глобальных калибровки и нажмите кнопку ОК.
Примечание: При выполнении этой процедуры, «означает серая значение» преобразуется в «оптической плотности (OD)», используя функцию Rodbard. После этого шага оптическая плотность вычисляется для конкретной выбранной области в ImageJ программного обеспечения.
- Выбор области измерений
Примечание: Пятна обычно связаны с достопримечательностями, например, Сенсиллы сенсилл, продольные Вены советы и crossveins. Эти и другие достопримечательности на крыло может использоваться для выбора региона измерений. Вот, например, вD. guttifera(Рисунок 2) описано.- Определение точки А, Сенсиллы sensillum пятно.
- Откройте изображение, в котором Сенсиллы sensillum пятно находится в центре изображения. Нажмите на изображение, | Тип | 8-битный | чтобы преобразовать изображение в 8-битного изображения.
- Щелкните прямоугольник в Область выделения инструментов и нарисуйте прямоугольник. Установите верхний левый вершин прямоугольника, так что это прилагается к задней линии третья продольные Вены и более дистальных от Сенсиллы sensillum пятно. Установка с правой стороны прямоугольника таким образом, что он расположен справа от Сенсиллы sensillum пятно.
- Нажмите кнопку Изменить | Выбор | Добавить в Диспетчер |. Проверьте Показать все колонки.
- Щелкните угол инструмент в Инструменты выделения строки. Нарисуйте линию первой на задней линии третья продольные Вены. Установите левую конечные точки линии вершин прямоугольника, обращается в шаге 1. Рисование второй линии в верхней части прямоугольника. Чтобы измерить угол между двумя линиями обращается в этот шаг, нажмите клавишу «m». Щелкните окно изображения на экране компьютера.
- Нажмите кнопку Изменить | Выбор | Добавить в Диспетчер |.
- Щелкните прямоугольник в Область выделения инструментов и нарисуйте прямоугольник примерно 1/9 размер окна изображения. Нажмите кнопку Изменить | Выбор | Вращать |. Напишите минус градусов угол, измеряемый в шаге 5.3.1.4. в угол и нажмите кнопку OK для поворота прямоугольника, обращается в этом шаге.
- Переместите прямоугольник в шаге 5.3.1.6. с помощью клавиш со стрелками. Укажите конечную точку по задней линии второго продольные Вены на левой стороне прямоугольника и нижней стороны прямоугольника, придает задней линии третья продольные Вены. Подтвердите, что перпендикулярная линия от конечной точки второй продольные Вены на задней линии третья продольные Вены рисуется в этой процедуре. Определение подножия перпендикулярной линии как точки А (рис. 2A).
- Записывать координаты x и y-координата точки А, указанных ниже Инструменты выделения области при размещении курсора на пункт а.
- Определение точки B, пятно наконечник продольной вен
- Откройте изображение, в котором пятно наконечник продольной Вены находится в центре изображения. Нажмите на изображение, | Тип | 8-битный | с конвертировать изображения в 8-битного изображения.
- Повторите ту же процедуру, описанной в шаге 5.3.1. (Определение точки A, Сенсиллы sensillum пятно), чтобы найти точки на изображении.
- Нажмите кнопку Изменить | Выбор | Добавить в Диспетчер |.
- Щелкните прямоугольник в Область выделения инструментов и нарисуйте прямоугольник. Установите верхний левый вершин прямоугольника в конечной точке линии задней третья продольные Вены.
- Нажмите кнопку Изменить | Выбор | Добавить в Диспетчер |.
- Щелкните угол инструмент в Инструменты выделения строки. Нарисуйте линию первой соединить точки А и конечную точку по задней линии, третья продольные Вены. Определите эту линию как рисовать линии A. второй линии в верхней части прямоугольника, обращается в шаге 5.3.2.4. Клавишу «m», чтобы измерить угол между двумя линиями.
- Нажмите кнопку Изменить | Выбор | Добавить в Диспетчер |.
- Щелкните прямоугольник в Область выделения инструментов и нарисуйте прямоугольник примерно 1/9 размер окна изображения. Нажмите кнопку Изменить | Выбор | Вращать |. Напишите минус градусов угол, измеряемый в шаге 5.3.2.6. в угол и нажмите кнопку OK для поворота прямоугольника, обращается в этом шаге. Переместите прямоугольник с помощью клавиш со стрелками. Таким образом, чтобы он прилагается к линии и конечную точку передней линии четвертой продольные Вены, так что это на левой стороне прямоугольника установите верхней стороны прямоугольника.
- Нажмите кнопку Изменить | Выбор | Добавить в Диспетчер |.
- Щелкните прямоугольник в Область выделения инструментов и нарисуйте прямоугольник примерно 1/9 размер окна изображения. Нажмите кнопку Изменить | Выбор | Вращать |. Написать минус градусов угол, измеряемый в шаге 6 в угол и нажмите кнопку OK для поворота прямоугольника, обращается в этом шаге. Переместите прямоугольник с помощью клавиш со стрелками. Установите нижний левый вершин прямоугольника, так что это в верхней левой вершин прямоугольника, обращается в шаге 5.3.2.8., в результате в получении перпендикулярной линии от конечной точки передней линии четвертой продольные Вены для определения линии A. точка пересечения перпендикулярной линии и линии задней третья продольные Вены как точка B (рис. 2B).
- Записывать координаты x и y точки B, указанные ниже Области инструменты выделения при размещении курсора на пункт б.
- Определение точки c, пятно заднего crossvein
- Откройте изображение, в котором пятно заднего crossvein находится в центре изображения. Нажмите на изображение, | Тип | 8-битный | с конвертировать изображения в 8-битного изображения.
- Определите точки C как задняя точка передней линии четвертой продольные Вены в районе пересечения заднего crossvein и четвертый продольные Вены (рис. 2 c).
- Записывать координаты x и y точки C, указанные ниже Инструменты выделения области , помещая курсор на точке C.
- Определение точки d, область управления
- Откройте изображение, в котором Сенсиллы sensillum пятно находится в центре изображения. Нажмите на изображение, | Тип | 8-битный | чтобы преобразовать изображение в 8-битного изображения.
- Щелкните прямо в Линию инструменты выделения и нарисуйте линия, соединяющая конечную точку передней линии второго продольные Вены и конечной точкой линии задней четвертой продольные Вены. Определите точки D как точки пересечения этой линии и линии задней третья продольные Вены (Рисунок 2D).
- Записывать координаты x и y-координата точки D, указанные ниже Области инструменты выделения при размещении курсора на точки D.
- Определение точки А, Сенсиллы sensillum пятно.
- Измерения
- Откройте один из образов крыла пятна (для измерения точки a, откройте изображение с точкой в центре). Нажмите на изображение, | Тип | 8-битный | чтобы преобразовать изображение в 8-битного изображения.
- Щелкните прямоугольник в Область выделения инструментов и нарисуйте прямоугольник размером приблизительно 1/9 окна изображения.
- Нажмите кнопку Изменить | Выбор | Укажите |. Проверьте столбец овальные и по центру . Написать 100 (пикселей) в высоту и ширину столбцов, напишите координаты x точки А (или точку B или C точки) и D в X координировать столбец и записи y координаты точки A (точка B или C точки) и D в колонке Координата по оси Y . Нажмите кнопку ОК.
- Нажмите кнопку анализ | Мера |. Если калибровка, описанных в пункте 5.2 уже завершена, в виду колонке указаны ОРВ.
- Рассчитать ΔODs путем вычитания ОД точка D от ОРВ точек A, B и C.
Примечание: Точка D находится в прозрачной частью крыла и не включают пигментации и поэтому подходит для фона элемента управления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Куколки период D. guttifera состоит из 17 этапов (P1 - P15(ii); изображения три представителя приведены этапы (P1, P5 - 6, P10), что на рисунке 3и все 17 этапов проиллюстрированы на рис. 4). Хотя Байнбридж и Bownes17 признается 20 этапов в D. melanogaster, некоторые из этих этапов не может применяться к D. guttifera. Порядок двух развития событий, появление желтого тела (масса пролить клеток в пределах средняя26) и сроков Malpighian трубочки, переходя зеленый, не контролируются строго в D. guttifera, и поэтому мы не могли отделить P5 (i ), P5(ii) и P6. Кроме того в отличие от в D. melanogaster, сроков почернение грудной и брюшной щетинок был синхронизирован, и поэтому мы не могли отделить P11(i) и P11(ii)19.
Мы могли бы измерить длину куколки этапов D. guttifera (Фукутоми et al.19, таблица 3). Весь период куколки составляет приблизительно 20 ч больше, чем D. melanogaster при 25 ° C17. Мы подсчитали ΔODs районов вокруг Сенсиллы sensillum, наконечник продольной вен и задней crossvein. Здесь мы покажем ОРВ и ΔODs в взрослых в 7 дней после eclosion (Таблица 4). Сравнивая данные нескольких этапов, мы обнаружили, что этап P12(i) сроков начала пигментации, и что пигментации завершается через 24 ч после eclosion (рис. 5, от исходного измерения, используемые в Фукутоми и др. 19).
Рисунок 1. Иллюстрация удаления puparium. (A) место куколки вентральной стороне вверх на кусок двухсторонний скотч. Удаление передней частью puparium. (B) разорвать puparium пинцетом с брюшной стороны. (C) после разрыва puparium, выньте куколки, используя кисть. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Определение области для измерения пигментацию. (A) точка A на месте, связанные с Сенсиллы sensillum. (B) пункта B на месте, связанные с наконечником продольные Вены. (C) точка C на месте, связанные с задней crossvein. (D) точка D для управления области. Шкала индикатора указывают 250 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Примеры определенных этапов куколки. (A) pupa этапа P1, покрытые puparium. (B) pupa стадии P5 - 6. (C) Pupa стадии P10. Puparia будут удалены перед замечание в пункте (B) и (C). Шкала индикатора указывают 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Иллюстрации 17 куколки этапов, указанных в D. guttifera. (A) P1, puparium белый. (B) P2, цвет puparium светло-коричневый. (C) P3, пузырь наблюдается в боковой (черная стрелка). (D) P4(i), пузырь больше, чем в P3 (черная стрелка), и куколки плавучесть в PBS. (E) P4(ii), разрыв наблюдается в передней части (черная стрелка) и задняя часть (серые стрелки). (F) P5 - 6, Malpighian, трубочки мигрируют (трудно увидеть если охватываются puparium). Куколки форма формируется куколки эпителия и куколки кутикулы. (G) P7, желтое тело можно наблюдать на спинной стороне (черная стрелка). (H) P8, глаза желтые. (I) P9, радужина янтаря. (J) P10, глаза красные. (K) P11, орбитальных и ocellar щетинками (серые стрелки), вибриссов, грудной macrochaetae (черная стрелка) и преплюсневой щетина черный и видимым. (L) P12(i), кончики крыльев отображаются серым цветом. (M) P12(ii), все части крыльев, серый (черная стрелка). (N) P13, крылья полностью черный. (O) P14, голова и ноги полностью затемнены. (P) P15(i), мекония может наблюдаться на спинной части живота (черная стрелка). (Q) P15(ii), fly является eclosing. Детали этих этапов были описаны в Фукутоми и др. 19 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Развития пигментации вокруг companiform sensillum на крыле. Круги показывают отдельные ΔODs, и горизонтальные полоски указывают средние. P10: n = 10, P11: n = 10, 12(i): n = 10, P15(i): n = 11, 3 h: n = 8, 24 h: n = 7, 7 дней: n = 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Компонент | |
| Мягкий белый сахар | 51.6 g |
| Кукурузная мука | 172.4 g |
| Кукурузная крупа - C | 86,4 g |
| Сухие пивные дрожжи | 106 г |
| Агар порошок | 35.28 g |
| ddH2O | 4000 мл |
| Варить в течение 30 мин и оставить остывать до 70 ° C. | |
| Добавьте 4 g бутиловый p гидроксибензоата растворяют в 40 мл этанола. | |
| Хорошо перемешать и вылить 9 мл в пластиковых флаконах (диаметр 25 мм x Высота 96 мм). | |
Таблица 1. Состав стандартного кукурузной муки/сахар/дрожжи/агар пищи.
| Компонент | Сумма |
| NaCl | 80 g |
| KCl | 0% |
| Na2HPO4·12H2O | 29 g |
| KH2PO4 | 0% |
| ddH2O | до 10 Л |
| значение рН 7,4 |
Таблица 2. Состав PBS (1 X).
| Этап | Значит, продолжительности (h) | с.д. | n |
| P1 - 2 | 1.7 | 0,65 | 16 |
| P3 | 2.1 | 0,65 | 16 |
| P4(i) | 2.1 | 1.69 | 19 |
| P4(II) | 0,3 | 0.28 | 29 |
| P5 - 6 | 5.0 | 3.07 | 30 |
| P7 | 31,9 | 7.22 | 46 |
| P8 | 9.6 | 2.81 | 57 |
| P9 | 10.9 | 2.66 | 55 |
| P10 | 11.7 | 2.96 | 39 |
| P11 | 4.4 | 2.81 | 44 |
| P12(i) | 1.1 | 0,76 | 44 |
| P12(II) | 2,0 | 0,70 | 43 |
| P13 | 2.2 | 0,68 | 10 |
| P14 - 15(i) | 28.6 | 2,75 | 10 |
| P15(II) | 1.4 | 0.87 | 10 |
| Итого | 121,7 |
В таблице 3. Измерения длительности куколки стадий д guttifera.
| OD | ΔOD | |||||||
| Сенсиллы sensilum | Продольные Вены наконечник | Задняя crossvein | Управления | Сенсиллы sensilum | Продольные Вены наконечник | Задняя crossvein | ||
| Индивидуальные | (Точка А) | (Точка B) | (Точка С) | (Точка D) | (Точка A - точка D) | (Точка B - точка D) | (Точка C - точка D) | |
| 1 | 0.549 | 0.484 | 0.515 | 0,256 | 0,293 | 0.228 | 0,259 | |
| 2 | 0.529 | 0.489 | 0.516 | 0.254 | 0.275 | 0.235 | 0.262 | |
| 3 | 0,546 | 0.48 | 0.533 | 0,255 | 0.291 | 0,225 | 0,278 | |
| 4 | 0.583 | 0.496 | 0.566 | 0,255 | 0.328 | 0.241 | 0,311 | |
| 5 | 0.523 | 0.479 | 0.528 | 0.235 | 0,288 | 0.244 | 0,293 | |
| 6 | 0.572 | 0.509 | 0,546 | 0,265 | 0,307 | 0.244 | 0.281 | |
| 7 | 0.568 | 0,511 | 0.56 | 0,256 | 0.312 | 0,255 | 0.304 | |
| 8 | 0.56 | 0.507 | 0.562 | 0,27 | 0.29 | 0.237 | 0,292 | |
| 9 | 0.551 | 0,485 | 0.569 | 0,259 | 0,292 | 0.226 | 0.31 |
Таблица 4 . Измеряется ОРВ и ΔODs из д guttifera взрослых через 7 дней после eclosion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем протоколы для определения стадии куколки, удаление puparium подробные наблюдения, измерения длительности куколки этапов и измерение интенсивности черные пятна на крыло в д guttifera. Эти протоколы могут быть применены для многих дрозофилы и связанных летать видов, особенно видов с крыла пигментации.
Углубленное наблюдение и описание более подробное развития событий позволило бы дальнейшее подразделение этапов. Во многих случаях развития событий, требующих рассечение или секционирование куколки не подходит для определения стадии, потому что надо убить куколки для постановки и дальнейшего использования этого человека трудно. Для использования новых видов дрозофилы один следует использовать развития событий отличается от за пределами puparium как первый шаг. В зависимости от цели исследования один можно затем дробить этапов, основанные на конкретных органогенеза или других развития событий.
Для межвидовые сравнения нескольких этапов потенциальную трудность является инверсии ордена развития событий среди видов (27Гетерохрония). Например в D. melanogaster, Malpighian трубочка становится зеленым, и затем желтое тело становится видимым, тогда как этот порядок может быть обращено в некоторых куколок D. guttifera19. В таком случае строгое сравнение между гомологичных стадиях трудно. В зависимости от этого явления интерес может понадобиться повторно определить или подразделяют конкретной стадии на основе развития событий. Например мы можем примерно выбрать куколок P5 - 6 и межвидовые сравнения выражения гена в куколки крылья, с помощью крыло морфология как показатель развития времени14.
Как правило занимает 10-30 мин для удаления puparium. Если один хочет, чтобы наблюдать за короткий этап, должны быть готовы куколок, принимая во внимание время, которое проходит во время удаления puparium. Например если один хочет, чтобы наблюдать P12(i) D. guttifera, который имеет только 1.1 h длительность, подготовка куколок на P11 даст хороший результат.
В наш протокол смоченной папиросной бумаги используется для фона куколки изображений. В зависимости от стадии наблюдения и структур, что один хочет, чтобы показать на рисунке можно использовать белый или черный папиросной бумаги. Для P3 для P4(ii) перехода позиция пузырь в куколки важно для разграничения стадий, и черный папиросной бумаги помогает соблюдать положение пузырь. На этапах после P5 белая бумага лучше, потому что он помогает соблюдать желтого тела, цвет глаз, щетина и цвет кузова.
Байнбридж и Bownes17 Ориентировочная продолжительность куколки этапов от их частоты появления. Промежуточная таблица является наиболее широко используемым для D. melanogaster18. Для их метода они подготовили четыре бутылки пищи, содержащий пять взрослых самцов и пять самок и держали их в темноте, и затем куколки были случайным образом вывезены из одной бутылки на 11, 12, 13 и 14 дней после начала откладки. Они подсчитано количество куколок в частности этапов и рассчитываются средние. Длина каждого стадия куколки можно оценить на основе данных общая продолжительность периода куколки и эти частоты данных. Одна проблема с этим методом является, что он не может использоваться для оценки точной длительности куколки этапов, если сроки развития стремится быть синхронизированы среди куколок.
В самом деле мы пытались Байнбридж и Bownes в метод в D. guttifera, и мы получили предвзятым данных из-за синхронизации среди куколок. Мы не могли определить причину этого явления, но некоторые возможности 1) куколок сохранил Циркадный ритм от стадии их молодых и/или 2) они отреагировали на воздействия света, что произошло на наблюдения. Поэтому мы решили измерить продолжительность фактического этапе путем прямого наблюдения. Это минимизирует предвзятости, вызванной суточный ритм.
Метод, описанный здесь метод количественной оценки дополнительных накопления меланина в точках, по сравнению с их окрестностях управления (ΔOD), путем вычитания ОД области управления от ОД площади пятна. Этот метод был вдохновлен метод количественной оценки ядерной ДНК содержание Feulgen окрашивание и изображения анализа (денситометрия28,,29). Как один из потенциальных проблем для применения этого метода на крыло пигментации ΔOD может быть отрицательное значение, особенно когда куколка очень молод и имеет почти не пигментацию. В более поздних этапах могут быть некоторые пигментацию в области управления. Использование простых ОД самого района, место может быть целесообразным вместо ΔOD в зависимости от цели исследования. В случае D. guttifera, использование простой ОД вместо ΔOD не изменилась тенденция данных или выводы исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Шон Кэрролл B. и Томас Вернер за предоставление покупать акции, Наоюки предохранитель для оборудования, Джин Сеок Byung за его помощь в съемках, Агата Киоказу для наставничества и Элизабет Накадзима для английского редактирования. Эта работа была поддержана KAKENHI 17K 19427 и Такэда научный фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits - C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits - C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 - 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
- Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. Hecht, M. K., Steere, W. C. , Springer (Meredith Corporation). New York. 437-543 (1970).
- Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: a guide to species identification and use. , Academic Press. New York. (2006).
- Patterson, J. T. The Drosophilidae of the southwest. 4313, University of Texas Publication. 7-216 (1943).
- Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
- Werner, T., Jaenike, J. Drosophilids of the Midwest and Northeast. , River Campus Libraries, University of Rochester. Rochester. (2017).
- Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
- Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136 (2015).
- Gompel, N., Prud'homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
- Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
- Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
- Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
- McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
- Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
- Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
- Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).
- Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
- Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. Sekimura, T., Nijhout, H. F. , Springer. New York. in press (2017).
- True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051 (2016).
- Resh, V. H., Cardé, R. T. Encyclopedia of Insects. , 2nd ed, Academic Press. Burlington. (2009).
- DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
- McKinney, M. L., McNamara, K. Heterochrony: the evolution of ontogeny. , Plenum Press. New York. (1991).
- Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners' guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
- Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).
