Summary
Protokoll för mellanstationer Pupp perioder och mätning av wing pigmentering i Drosophila guttifera beskrivs. Mellanlagring och kvantifiering av pigmentering ger en solid grund för att studera utvecklingsmässiga mekanismer av vuxna drag och aktivera mellanartskonkurrens jämförelse av drag utveckling.
Abstract
Diversifierad arter av Drosophila (bananflugan) ger möjligheter att studera mekanismer för utveckling och genetiska förändringar ansvarig för evolutionära förändringar. I synnerhet är vuxen scenen en rik källa av morfologiska drag för mellanartskonkurrens jämförelse, inklusive wing pigmentering jämförelse. För att studera utvecklingsmässiga skillnaderna bland arter, krävs detaljerad observation och lämpliga iscensättning för exakt jämförelse. Här beskriver vi protokoll för iscensättning av Pupp perioder och kvantifiering av wing pigmentering i en polka-prickade bananflugan, Drosophila guttifera. Först beskriver vi metoden för detaljerad morfologiska observation och definition av Pupp stadier baserat på morfologier. Metoden innehåller en teknik för att ta bort den puparium, vilket är yttre kitina fallet av puppan, aktivera detaljerad observation av Pupp morfologier. Det andra beskriver vi metoden för att mäta längden på definierade Pupp etapper. Slutligen beskriver vi metoden för kvantifiering av wing pigmentering baserat på bildanalys med hjälp av digitala bilder och ImageJ programvara. Med dessa metoder, kan vi upprätta en solid grund för att jämföra utvecklingsprocesser av vuxna drag under Pupp stadier.
Introduction
Vissa morfologiska drag av Drosophila är diversifierade bland arter1,2,3,4,5. Man kan närma sig frågan hur morfologiska mångfald uppstår genom att jämföra mekanismerna av generation av dessa morfologier. Exempel på sådana morfologier är larval trichomes, vuxna kön kammar, externa genitala apparater, buken pigmentering och påskyndar pigmentering6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. för att studera morfologiska skillnader bland vuxna, observation och analys av Pupp arrangerar är viktiga, eftersom ödet för vuxna drag bestäms i sena larval stadier och efterföljande morfogenes fortsätter under perioden Pupp.
I utvecklingsbiologi studier av Drosophila melanogaster, ”timmar APF” (timmar efter Pupp bildandet) är den vanliga metoden att ange en Pupp etapp16. Detta system använder absolut tid efter Pupp bildandet och är mycket bekvämt för rutinmässig experiment. Dock utvecklingsmässiga hastighet kan variera bland puppor, och kan påverkas av genetiska och epigenetiska microenvironmental skillnader, och därför har samma absolut tid efter Pupp bildandet garanterar inte att puppor är på samma utvecklingsstadier. I många fall är arrangerar definieras av morfologiska egenskaper att föredra för att jämföra flera individer. Särskilt kräver en jämförelse mellan arter exakt iscensättning och jämförelse mellan motsvarande (homolog) stadier.
Bainbridge och Bownes17 erkänt 20 Pupp etapper (P1 till P15(ii)) baserat på morfologiska egenskaper av Drosophila melanogaster puppor. Denna iscensättning är det mest använda systemet morfologiska utvecklingsmässiga mellanlagringsplatsen18. I en tidigare studie har utfört vi Pupp iscensättning av Drosophila guttifera för att skapa en grund för wing pigmentering studier19. D. guttifera har ett svart polka-dot mönster på vingarna och är en modell art för wing pigmentering bildandet20. Även om vi hänvisat till de morfologiska kriterier som beskrivs i den Bainbridge och Bownes' forskning17, vi mätt direkt scenen varaktigheter med seriell observationer19, istället för att använda Bainbridge och Bownes' uppskattning av scenen varaktigheter från observerade frekvens. Här beskriver vi metoden för Pupp iscensättning och mätning av varaktigheter Pupp stadier av Drosophila används i Fukutomi et al19.
För att studera utvecklingsmässiga mekanismen av wing pigmentering, behöver vi veta när i Pupp eller vuxen steg pigmentering uppstår. Fukutomi et al. 19 kvantifieras optiska densitet (ODs) pigmentering under Pupp och vuxna stadier av bildanalys av wing bilder. Pigmenteringen Drosophila vingar tros orsakas av ansamling av svart melanin21. För kvantifiering av ODs användes gråskala bilder och ImageJ programvara (https://imagej.nih.gov/ij/)22 . För att identifiera och kvantifiera plats-specifika pigmentering (ΔOD), subtraherar vi OD utanför en plats från OD inuti en plats. För att göra denna metod reproducerbara och objektiva, bör förlägger av OD mätning bestämmas med wing vener som sevärdheter. I den här artikeln beskriver vi i detalj denna metod för kvantifiering av wing pigmentering i Drosophila guttifera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. flyga lager
- Använda Drosophila guttifera av följande protokoll.
- Använda plast injektionsflaskor (diameter 25 mm x höjd 96 mm) och cellulosa pluggar (diameter 23 mm x höjd 26 mm) för lager underhåll. Använd en standard majsmjöl/socker/jäst/agar-mat och följa en publikation beskrivs tre andra alternativa recept för denna art2.
Obs: D. guttifera (lager nummer 15130-1971.10) tillhandahålls av Drosophila arter lager Center vid University of California, San Diego. Även om D. guttifera tillhör den immigrans-tripunctata strålning, som är avlägset besläktade D. melanogaster inom släktet23, har det många biologiska egenskaper gemensamt med D. melanogaster . Detta protokoll kan således tillämpas för många Drosophila arter, även om vissa arter kräver viss mat och/eller tekniska tips att upprätthålla dem2.
2. observation av puppa och definition av Pupp stadier
Obs: Puppan för observation tas från flyga lager underhålls med en 12:12 h ljus/mörk cykel vid 25 ° C. Bainbridge och Bownes17 beskrivs låg risk flytta D. melanogaster puppor från den ursprungliga platsen för förpuppningen på en fuktad vävnad papper (97% överlevnad av 946 flyttade puppor). D. guttifera puppor kan framställas genom i huvudsak samma metod.
- Placera friska vuxna av Drosophila på färska livsmedel (standard majsmjöl/socker/jäst/agar mat) i en plast injektionsflaska (diameter 25 mm x höjd 96 mm) och låt dem lägga ägg. Vänta 7 dagar att få sent 3rd stadier.
- Placera 1 mL standard majsmjöl/socker/jäst/agar mat i varje 1,5 mL mikrorör. Gör 3 hål med 2 mm mellanrum i locken på mikrorör av genomträngande med push-pin att tillåta andning.
- Centrifugera i mikrorör med mat för 7 s i en mini mikrocentrifug (860 x g).
- Vänd och injektionsflaskor för att ta bort alla vuxna från injektionsflaskan.
- Häll 5-10 mL ddH2O (eller omvänd osmos vatten) in i injektionsflaskan.
- Häll ut larver med vatten till en plast petriskål (diameter 90 mm x höjd 15 mm). Identifiera slutet 3rd stadier av deras stora kroppsstorlek (3-4 mm i längd).
- Flytta försiktigt sen 3rd instar larver med pincett in mikrorör med mat (10 larver / mikrorör). Inkubera dem över natten vid 25 ° C.
- Flytta nybildade puppor på en bit silkespapper som har fuktats av ddH2O och placeras i en plast petriskål (diameter 35 mm x höjd 10 mm).
- Placera petriskål i en fuktig kammare (innehållande 10 mL ddH2O i botten) och vänta tills puppor utvecklas till ett önskat Stadium.
- Flytta puppor på en fuktad vävnad papper i en plast petriskål (diameter 60 mm x höjd 15 mm).
Obs: Definitionen av stadier kan oftast göras baserat på arrangerar av D. melanogaster17. Drosophila Pupp perioden kan vanligtvis delas in P1 - P15(ii), även om vissa ändringar av scenen definition skulle krävas beroende på vilken art som används. Om möjligt, möjliggör ta bort puparium exakt och detaljerad observation. Se detaljer nedan (steg 3). - Iaktta puppor i stereo Mikroskop. Fotografera med en digitalkamera ansluten till stereomikroskopet.
3. ta bort puparium
Obs: Puppor av Drosophila omfattas av en struktur som kallas puparium. En insekt av Muscomorpha (flyger) inte skjul dess larver nagelbanden vid förpuppningen; istället, det härdar nagelbanden efter apolysis, och använder det som ett skyddande lock av puppan, puparium24. En puppa som bor inuti en puparium har en sann Pupp nagelband, som är mycket mjuk och skör. Innan apolysis sker runt P4(ii), epitel och puparium bifogas tillsammans och ta därför bort puparium utan skador är mycket svårt. Efter P5 är ta bort puparium mödosam, men användbar för morfologiska observation och definition av Pupp stadier. Processen utförs enligt följande.
- Anbringa en bit dubbelhäftande tejp på en bit hushållspapper.
- Placera en puppa på dubbelhäftande tejp ventrala sida upp (figur 1A).
- Leta upp utrymmet mellan den främre sidan av puparium och interna puppa. Ta tag och ta bort puparium runt denna lucka med pincett och exponera den främre sidan av huvudet av puppan.
- Sätt spetsen på en peang genom att flytta den parallellt med främre-bakre axeln. Lyft spetsen på tången lokalt bryta puparium. Upprepa åtgärden tills brott når den bakre delen av puparium. Se till att en klyfta bildas också mellan puparium och Pupp ben, och bryta den ventrala sidan av puparium och minimera skador på den interna puppan (figur 1B).
- Efter att bryta puparium så mycket som möjligt, ta ut puppan med hjälp av en fin pensel (nr 5/0) (figur 1 c).
- Placera puppan på en bit vävnad papper som har fuktats med ddH2O och placeras i en plast petriskål (diameter 60 mm x höjd 15 mm). Ta fotografier så snart som möjligt eftersom den exponerade puppan är sårbara och lätt blir torr.
Obs: Puppor utan en puparium är inte lämplig för att mäta varaktigheter Pupp perioder (Steg4), eftersom stress (t.ex. torkning) och fysiska skador kan störa den normala utvecklingen.
4. mäta varaktigheter Pupp stadier
- Förbereda puppor för att mäta varaktigheter Pupp steg som beskrivs i steg 2. Samla puppor av 1-2, 2-3, och 3-4 dagar efter Pupp bildandet (20 puppor varje). Ge individuella ID-nummer (1-60) till puppor för identifiering. Fortsätt samla nyligen bildade puppor under följande steg, för att få 20 fler unga puppor. Ge de individuella identifieringsnumren (61-80) till de nybildade puppor. Placera en puppa på en papperslapp ddH2O-fuktad vävnad i en brunn (3,9 cm2) 12-väl cell kultur platta (1 puppa per brunn, 12 puppor/platta). Fyll mellan väl loppet av plattor med ddH2O att bibehålla fuktigheten, sätta lock på och placera plåtarna i 25 ° C, konstant ljus (24:0 h ljus/mörk).
Obs: Puppor utan en puparium är inte lämplig för att mäta varaktigheter Pupp perioder. Ta inte bort puparium. - Iaktta morfologiska egenskaper inklusive kroppen färg, borst, Malpighian tubuli och gula kroppen av alla puppor en gång varje 30 min, och posten observerade stadier (P1 - P15(ii), baserad på de referenser17,19) i ett tally blad.
- Fortsätta spela in över fyra raka dagar (96 h) av en roterande förskjutning av tre (eller fler) personer.
- Räkna antalet poster i varje enskilt skede, och i genomsnitt dem (genomsnittligt antal observationer / puppor). Sedan multiplicera dem med 0,5 (h), vilket resulterar i de uppskattade längderna av stadier (h).
5. mätning av intensiteten av svarta fläckar på en vinge
Obs: Intensiteten av svarta fläckar på en Pupp eller vuxen vinge kan kvantifieras genom mätning av optiska densitet (OD). Ett glas filter med kända ODs (klev densitet filter) används för kalibrering25, så att man kan beräkna OD av ett visst område från en digital bild av en vinge. OD på en plats och OD utanför plats mäts, och den senare subtraheras från den förstnämnda att erhålla intensiteten av plats (ΔOD). Här beskriver vi metoden av dissektion, mätning och beräkning av ΔOD. Denna procedur kan göras efter steg 2, fristående från steg 3 och Steg4. När man har utfört steg 2 och förstår alla Pupp stadier, kan man direkt starta eller upprepa steg 5.
- Bild förberedelse
- Förbered en ny puppa av en fokal steg som beskrivs i steg 2. Ta bort den främre delen av en puparium med pincett. Ta ut puppan med pincett och placera det i fosfatbuffrad saltlösning (PBS, tabell 2) i en plast petriskål (diameter 35 mm x höjd 10 mm).
- Skär basalled av en vinge (basalled är den smala proximala delen av vingen). Som vingen är vikt, placera det i en plast petriskål (diameter 35 mm x höjd 10 mm) fylld med ddH2O att utvidga det av osmotiskt tryck (vingen utspelar sig själv).
- Samla nya eclosed vuxna en gång var 10: e minut från en injektionsflaska av lager. Söva en fluga med CO2 använder en CO2 anesthetizing pad, bekräfta anesthetization av orörlighet och skär basalled av en vinge.
- Plats 10 µL av PBS på en glasskiva, placera vingen där, och täck med ett täckglas (18 x 18 mm).
- Slå på ljuset av stereomikroskopet. Ställ ljuset vara på maximal nivå. Ställa in målet linsen 11,5 X. Ställ in membranet att vara den mest öppna. Slå på kameran. Ange att kameran ska vara (ISO: 100, läge SHQ 3136 x 2352 pixlar, slutartid: 1/20 s). Fokusera på prov genom att flytta fokus ratten av mikroskopet.
- Tryck på avtryckaren på fjärrkontrollen enheten för att ta en bild. Ta 3 bilder per vinge, som alla måste vara centrerad på en campaniform sensillum, längsgående ven plats eller bakre crossvein, positionering den distala delen av vingen på vänster sida och den främre delen av vingen på ovansidan.
- Kalibrering
- Ta bilder av 9 delar av en stegvis densitet filter med samma kamerainställningar används för att uppnå wing bild.
- Initiera ImageJ programvara (https://imagej.nih.gov/ij/)22.
- Klicka på Arkiv | Öppna | och välj en av bilderna av filtret klev densitet.
- Klicka på bilden för | Typ | 8-bitars | konvertera bilden till en 8-bitars bild.
- Klicka på Redigera | Urval | Ange | och kontrollera Oval och centrerad kolumn. Skriv 100 (bildpunkter) i Bredd kolumnen, 100 (bildpunkter) i höjd kolumn, 1568 i X samordna kolumn och 1176 i Y samordna kolumn. Klicka på OK.
- Klicka på analysera | Åtgärden |. Den ”betyder grå värde” av valda områden mäts.
- Upprepa 5.2.3. till 5.2.6. för 8 återstående bilder.
- Klicka på analysera | Kalibrera Välj Rodbard25 i funktionen kolumn och skriv följande nummer i kolumnen till höger i mitten (0,04, 0.336, 0.632, 0.928, 1.224, 1.52, 1.816, 2.112, 2.408; dessa siffror beror på täthet av den (klev densitet filter).
- Kontrollera Global kalibrering kolumn och klicka på OK.
Obs: Genom att utföra proceduren, ”menar grå värde” konverteras till ”optisk täthet (OD)” med funktionen Rodbard. Efter detta steg, kan optisk densitet beräknas för ett särskilt markerat område i ImageJ programvara.
- Du väljer område av mätningar
Obs: Fläckar är vanligtvis förknippas med sevärdheter, till exempel campaniform sensilla, längsgående ven tips och crossveins. Dessa och andra sevärdheter på en vinge kan användas för att välja regionen i mätningar. Här, ett exempel iD. guttifera(Figur 2) beskrivs.- Definitionen i punkt A, campaniform sensillum spot.
- Öppna en bild där en campaniform sensillum plats är i mitten av bilden. Klicka på bilden för | Typ | 8-bitars | konvertera bilden till en 8-bitars bild.
- Klicka på rektangel i Området markeringsverktygen och rita en rektangel. Ange den övre vänstra vertex av rektangeln så att den är fäst vid den bakre raden av tredje längsgående ven och mer distala från en campaniform sensillum spot. Ange höger sida av rektangeln så att den ligger till höger om den campaniform sensillum spot.
- Klicka på Redigera | Urval | Lägg till Manager |. Markera Visa alla kolumn.
- Klicka vinkel verktyg i Raden av markeringsverktygen. Rita den första raden på bakre raden av tredje längsgående ven. Ange raden vänster ändpunkter på hjässan av rektangeln ritas i steg 1. Rita den andra raden på den övre sidan av rektangeln. Tryck på ”m” för att mäta vinkeln mellan de två linjerna dras i detta steg. Klicka på fönstret på bilden på skärmen på datorn.
- Klicka på Redigera | Urval | Lägg till Manager |.
- Klicka på rektangel i Området markeringsverktygen och rita en rektangel i cirka 1/9 storleken på bildfönstret. Klicka på Redigera | Urval | Rotera |. Skriva minus grader av vinkeln mäts i steg 5.3.1.4. i vinkel kolumn och klicka på OK om du vill rotera rektangeln ritas i det här steget.
- Flytta rektangeln ritas i steg 5.3.1.6. med hjälp av piltangenterna. Ange slutpunkten av den bakre raden i den andra längsgående ven på vänster sida av rektangeln och den nedre sidan av rektangeln kopplad till bakre raden av tredje längsgående ven. Bekräfta att en vinkelrät linje från slutpunkten för den andra längsgående ven till den bakre raden i tredje längsgående venen dras i detta förfarande. Definiera foten av den vinkelräta linjen som punkt A (figur 2A).
- Spela in x-koordinaten och y-koordinaten i punkt A, anges nedan Området urval verktyg när du placerar markören på punkt A.
- Definition av punkt B, längsgående ven tip plats
- Öppna en bild där en längsgående ven tip plats är i mitten av bilden. Klicka på bilden för | Typ | 8-bitars | att konvertera bilden till en 8-bitars bild.
- Upprepa samma procedur som beskrivs i steg 5.3.1. (Definition av punkt A, campaniform sensillum plats) att hitta punkt A i bilden.
- Klicka på Redigera | Urval | Lägg till Manager |.
- Klicka på rektangel i Området markeringsverktygen och rita en rektangel. Ange den övre vänstra vertex av rektangeln vid slutpunkten av bakre raden av tredje längsgående venen.
- Klicka på Redigera | Urval | Lägg till Manager |.
- Klicka vinkel verktyg i Raden av markeringsverktygen. Rita den första raden för att ansluta punkt A och slutpunkten för den bakre raden i tredje längsgående venen. Definiera den här raden som linje A. Rita den andra raden på den övre sidan av rektangeln ritas i steg 5.3.2.4. Tryck ”m” för att mäta vinkeln mellan de två linjerna.
- Klicka på Redigera | Urval | Lägg till Manager |.
- Klicka på rektangel i Området markeringsverktygen och rita en rektangel i cirka 1/9 storleken på bildfönstret. Klicka på Redigera | Urval | Rotera |. Skriva minus grader av vinkeln mäts i steg 5.3.2.6. i vinkel kolumn och klicka på OK om du vill rotera rektangeln ritas i det här steget. Flytta rektangeln med hjälp av piltangenterna. Ange den övre sidan av rektangeln så att den är kopplad till linje A och slutpunkten för den främre raden av fjärde längsgående ven så att det är på vänster sida av rektangeln.
- Klicka på Redigera | Urval | Lägg till Manager |.
- Klicka på rektangel i Området markeringsverktygen och rita en rektangel i cirka 1/9 storleken på bildfönstret. Klicka på Redigera | Urval | Rotera |. Skriva minus grader av vinkeln mäts i steg 6 i vinkel kolumn och klicka på OK om du vill rotera rektangeln ritas i det här steget. Flytta rektangeln med hjälp av piltangenterna. Ange nedre vänstra vertex av rektangeln så att den är i den övre vänstra hörn av rektangeln ritas i steg 5.3.2.8., vilket resulterar i att erhålla den vinkelräta linjen från slutpunkten för den främre raden av fjärde längsgående ven linje A. definiera den skärningspunkten för den vinkelräta linjen och den bakre raden av tredje längsgående ven som punkt B (figur 2B).
- Spela in x-koordinaten och y-koordinaten för punkt B, nedan angivna Området urval verktyg när du placerar markören på punkt B.
- Definitionen i punkt C, bakre crossvein plats
- Öppna en bild där en bakre crossvein plats är i mitten av bilden. Klicka på bilden för | Typ | 8-bitars | att konvertera bilden till en 8-bitars bild.
- Definiera punkt C som syftet posterior-mest på den främre raden i den fjärde längsgående ven i området korsningen i den bakre crossvein och den fjärde längsgående ven (figur 2 c).
- Spela in x-koordinaten och y-koordinaten i punkt C, anges nedan Området urval verktyg när du placerar markören på punkten C.
- Definition av punkt D, kontrollområde
- Öppna en bild där en campaniform sensillum plats är i mitten av bilden. Klicka på bilden för | Typ | 8-bitars | konvertera bilden till en 8-bitars bild.
- Klicka på rak Linje markeringsverktygen och rita en linje som förbinder slutpunkten för den främre raden i den andra längsgående ven och slutpunkten för den bakre raden av fjärde längsgående venen. Definiera punkt D som gränsövergången på denna linje och den bakre raden av tredje längsgående ven (figur 2D).
- Spela in x-koordinaten och y-koordinaten för punkt D, anges nedan Området urval verktyg när du placerar markören på punkt D.
- Definitionen i punkt A, campaniform sensillum spot.
- Mätningar
- Öppna en av bilderna av wing ställen (för mätning av punkt A, öppna bilden med punkt A i mitten). Klicka på bilden för | Typ | 8-bitars | konvertera bilden till en 8-bitars bild.
- Klicka på rektangel i Området markeringsverktygen och rita en rektangel ungefär 1/9 storlek i bildfönstret.
- Klicka på Redigera | Urval | Ange |. Kontrollera Oval och centrerad kolumn. Skriva 100 (bildpunkter) i Bredd och höjd kolumner, skriva x koordinaterna för punkt A (eller punkt B eller punkt C) och D i X samordna kolumn och skriva y koordinaterna för punkt A (punkt B eller punkt C) och D i Y samordna kolumn. Klicka på OK.
- Klicka på analysera | Åtgärden |. Om den kalibrering som beskrivs i 5.2 har redan avslutats, indikeras ODs i menar kolumn.
- Beräkna ΔODs genom att subtrahera OD av punkt D från ODs punkter A, B och C.
Obs: Punkt D är i en öppen del av vingen och inkluderar inte pigmentering, och därför är lämplig för en bakgrund kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pupp perioden av D. guttifera är uppdelad i 17 etapper (P1 - P15(ii); bilder av tre representativa stadier (P1, P5 - 6, P10) visas figur 3, och alla 17 arrangerar illustreras i figur 4). Bainbridge och Bownes17 erkänner 20 etapper i D. melanogaster, kan några av dessa stadier inte tillämpas på D. guttifera. Två utvecklingsmässiga händelseordningen, uppkomsten av gula kroppen (massa skjul celler inom den midgut26) och tidpunkten för Malpighian tubuli turning green, kontrolleras inte strikt i D. guttifera, och därför kunde vi inte skilja P5 (jag ), P5(ii) och P6. Också, till skillnad från i D. melanogaster, tidpunkten för svärtning av bröst- och bukhåla borst synkroniserades, och därför kunde vi inte skilja P11(i) och P11(ii)19.
Vi kunde mäta längden på Pupp stadier av D. guttifera (tabell 3, från Fukutomi et al.19). Hela Pupp perioden är cirka 20 timmar längre än för D. melanogaster vid 25 ° C17. Vi beräknade ΔODs områden runt en campaniform sensillum, längsgående ven spets och bakre crossvein. Här, visar vi ODs och ΔODs hos vuxna 7 dagar efter eclosion (tabell 4). Genom att jämföra uppgifterna i flera etapper, Vi hittade att scenen P12(i) är tidpunkten för uppkomsten av pigmentering, och denna pigmentering kompletteras av 24 h efter eclosion (figur 5, från de ursprungliga mätningar som används i Fukutomi et al. 19).
Figur 1. Illustration av flyttande puparium. (A) placera en puppa ventrala sida upp på en bit dubbelhäftande tejp. Ta bort den främre delen av puparium. (B) bryta puparium med pincett från ventrala sida. (C) efter att ha brutit puparium, ta ut puppan med hjälp av en pensel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Definition av området för att mäta pigmentering. (A) punkt A för en plats som är associerad med en campaniform sensillum. (B) punkt B för en plats som är associerad med längsgående ven spets. (C) punkt C för en plats som är associerad med en bakre crossvein. (D) punkt D för ett kontrollområde. Skala staplarna anger 250 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3. Exempel på definierade Pupp etapper. (A) pupa etappen P1 täckt med puparium. (B) pupa etappen P5 - 6. (C) Pupa etappen P10. Puparia avlägsnas innan observation i (B) och (C). Skala staplarna visar 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4. Illustrationer av 17 Pupp arrangerar identifieras i D. guttifera. (A) P1, puparium är vit. (B) P2, färgen på puparium är ljusbrun. (C) P3, en bubbla observeras i den laterala sidan (svart pil). (D) P4(i), bubblan är större än i P3 (svart pil) och puppan är flytande i PBS. (E) P4(ii), en lucka observeras i den främre delen (svart pil) och den bakre delen (grå pilspets). (F) P5 - 6, Malpighian tubuli migrera (svårt att se om omfattas av puparium). Pupp formen bildas av Pupp epitel och Pupp nagelband. (G) P7, gula kroppen kan observeras i ryggsidan (svart pil). (H) P8, ögon är gula. (I) P9, ögonen är amber. (J) P10, ögonen är röda. (K) P11, Orbital och ocellar borst (grå pilspets), vibrissae, bröstkorgens macrochaetae (svart pil) och böjd borst är svart och synliga. (L) P12(i), tips på vingarna är grå. (M) P12(ii), alla delar av vingarna är grå (svart pil). (N) P13, vingarna är helt svart. (O) P14, huvudet och benen är helt mörklagt. (P) P15(i), Mekonium kan observeras på dorsala buken (svart pil). (Q) P15(ii), flugan är eclosing. Detaljer av dessa steg beskrivs i Fukutomi et al. 19 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Utveckling av pigmentering runt en companiform sensillum på en vinge. Cirklar anger individuella ΔODs och horisontella staplar anger medelvärden. P10: n = 10, P11: n = 10, 12(i): n = 10, P15(i): n = 11, 3 h: n = 8, 24 h: n = 7, 7 dagar: n = 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Komponent | |
| Vitt mjukt socker | 51,6 g |
| Majsmjöl | 172,4 g |
| Havre gryn - C | 86,4 g |
| Torra öl jäst | 106 g |
| Agar pulver | 35.28 g |
| ddH2O | 4000 mL |
| Koka i 30 min och låt svalna ner till 70 ° C. | |
| Lägga till 4 g av butyl p-hydroxibensoat löses i 40 mL etanol. | |
| Blanda väl och häll 9 mL varje i plast injektionsflaskor (diameter 25 mm x höjd 96 mm). | |
Tabell 1. Sammansättningen av standard majsmjöl/socker/jäst/agar mat.
| Komponent | Belopp |
| NaCl | 80 g |
| KCl | 2 g |
| Na2HPO4·12H2O | 29 g |
| KH2PO4 | 2 g |
| ddH2O | upp till 10 L |
| Ställ pH 7,4 |
Tabell 2. Sammansättningen av PBS (1 X).
| Skede | Menar med varaktighet (h) | s.d. | n |
| P1 - 2 | 1.7 | 0,65 | 16 |
| P3 | 2.1 | 0,65 | 16 |
| P4(i) | 2.1 | 1,69 | 19 |
| P4(II) | 0,3 | 0,28 | 29 |
| P5 - 6 | 5.0 | 3,07 | 30 |
| P7 | 31,9 | 7.22 | 46 |
| P8 | 9,6 | 2,81 | 57 |
| P9 | 10,9 | 2,66 | 55 |
| P10 | 11,7 | 2,96 | 39 |
| P11 | 4.4 | 2,81 | 44 |
| P12(i) | 1.1 | 0,76 | 44 |
| P12(II) | 2.0 | 0,70 | 43 |
| P13 | 2.2 | 0,68 | 10 |
| P14 - 15(i) | 28,6 | 2,75 | 10 |
| P15(II) | 1.4 | 0,87 | 10 |
| Totalt | 121,7 |
Tabell 3. Mätt varaktigheter Pupp stadier av D. guttifera.
| OD | ΔOD | |||||||
| Campaniform sensilum | Längsgående ven spets | Bakre crossvein | Kontroll | Campaniform sensilum | Längsgående ven spets | Bakre crossvein | ||
| Enskilda | (Punkt A) | (Punkt B) | (Punkt C) | (Punkt D) | (Punkt A - punkt D) | (Punkt B - punkt D) | (Punkt C - punkt D) | |
| 1 | 0.549 | 0,484 | 0.515 | 0.256 | 0.293 | 0.228 | 0,259 | |
| 2 | 0.529 | 0.489 | 0.516 | 0.254 | 0.275 | 0,235 | 0.262 | |
| 3 | 0.546 | 0,48 | 0.533 | 0,255 | 0,291 | 0,225 | 0,278 | |
| 4 | 0,583 | 0.496 | 0.566 | 0,255 | 0.328 | 0.241 | 0,311 | |
| 5 | 0.523 | 0,479 | 0.528 | 0,235 | 0,288 | 0.244 | 0.293 | |
| 6 | 0.572 | 0.509 | 0.546 | 0,265 | 0,307 | 0.244 | 0.281 | |
| 7 | 0.568 | 0.511 | 0,56 | 0.256 | 0,312 | 0,255 | 0.304 | |
| 8 | 0,56 | 0,507 | 0.562 | 0,27 | 0,29 | 0.237 | 0,292 | |
| 9 | 0.551 | 0,485 | 0.569 | 0,259 | 0,292 | 0,226 | 0,31 |
Tabell 4. Mätt ODs och ΔODs av D. guttifera vuxna 7 dagar efter eclosion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver här protokollen för definition av Pupp stadier, ta bort puparium för detaljerad observation, mätning varaktigheterna Pupp stadier och mätning av intensiteten av svarta fläckar på en flygel i D. guttifera. Dessa protokoll kan tillämpas för många Drosophila och relaterade flyga arter, särskilt med wing pigmentering.
Djupgående observation och beskrivning av mer detaljerade utvecklande händelser skulle möjliggöra ytterligare underindelning av skeden. I många fall en utvecklande händelse kräver dissektion eller snittning av en puppa är inte lämpar sig för etappen definition, eftersom man måste döda en puppa för mellanlagring, och vidare användning av att enskilda är svårt. För användning av en ny Drosophila -art, bör en anställa utvecklande händelser kan särskiljas från utanför puparium som ett första steg. Beroende på syftet med studien, en kan sedan dela upp ytterligare stadier baserat på viss organogenesen eller andra utvecklingsmässiga händelser.
För mellanartskonkurrens jämförelse av flera etapper är en potentiell svårighet en inversion storleksordningen utvecklande händelser bland arter (heterochrony27). Till exempel i D. melanogaster, den Malpighian tubuli blir gröna och gula kroppen blir då synligt, medan denna ordning kan inverteras i vissa puppor av D. guttifera19. I sådant fall är strikt jämförelse mellan homologa stadier svårt. Beroende på fenomenet av intresse, kan man behöver omdefiniera eller dela upp en viss fas baserat på en utvecklande händelse. Vi kan till exempel ungefär Välj puppor av P5 - 6 och göra mellanartskonkurrens jämförelse av genuttryck i Pupp vingar med wing morfologi som indikator av utvecklingstoxicitet timing14.
Typiskt, det tar 10-30 min att ta bort puparium. Om man vill följa ett kort skede, bör puppor utarbetas med hänsyn till den tid som förflyter under puparium borttagning. Exempelvis om man vill följa P12(i) av D. guttifera, som har endast 1.1 h varaktighet, skulle förbereda puppor på P11 ge ett bra resultat.
I våra protokoll används fuktade vävnad papper för bakgrunden av Pupp bilder. Beroende på stadium av observation och strukturer som man vill visa i ett diagram, kan man använda vit eller svart silkespapper. För P3 P4(ii) övergång, positionen för bubblan i puppa är viktig för att skilja stadier och svart silkespapper hjälper för att Observera placeringen av bubblan. Arrangerar efter P5 är vitt silkespapper bättre eftersom det hjälper för att observera den gula kroppen, ögonfärg, borst och kroppen färg.
Bainbridge och Bownes17 Beräknad varaktighet Pupp stadier från deras frekvens av utseende. Deras mellanlagringsregister är den mest använda för D. melanogaster18. För deras metod, de förberedde fyra mat flaskor som innehåller fem vuxna tikar och fem vuxna hannar och höll dem i mörkret, och sedan puppor togs slumpmässigt ut från en flaska varje 11, 12, 13 och 14 dagar efter debuten av äggläggning. De räknade antalet puppor i synnerhet etapper och beräknas medelvärdena. Längden på varje Pupp etapp kunde uppskattas utifrån data för den totala längden på perioden Pupp och uppgifterna frekvens. Ett problem med denna metod är att det inte kan användas för att beräkna den exakta varaktigheten av Pupp stadier om utvecklingstoxicitet timing tenderar att vara synkroniserade bland puppor.
I själva verket vi försökt Bainbridge och Bowness metod i D. guttifera, och vi fick partisk data på grund av synkronisering bland puppor. Vi kunde inte identifiera orsaken till detta fenomen, men vissa möjligheter är 1) puppor behållas dygnsrytmen från deras unga scenen eller (2) de reagerat på exponeringar mot ljus som inträffade vid observationen. Därför beslutade vi att mäta faktiska scenen varaktighet genom direkt observation. Detta minimerar bias orsakad av dygnsrytmen.
Den metod som beskrivs här är en metod för att kvantifiera extra ackumulering av melanin i ställen jämfört med deras kontroll omgivningen (ΔOD), genom att subtrahera OD av området från OD i området plats. Denna metod var inspirerad av en metod för att kvantifiera nuclear DNA-innehåll av Feulgen färgning och bild analys (densitometry28,29). Som en av de potentiella problemen för att tillämpa denna metod på wing pigmentering, kan ΔOD vara ett negativt värde, särskilt när en puppa är mycket ung och har nästan ingen pigmentering. I senare stadier kan det finnas vissa pigmentering i området. Användning av enkla OD av spot området i sig kan vara lämplig i stället för ΔOD beroende på syftet med studien. När det gäller D. guttifera, ändra användning av enkla OD i stället för ΔOD inte tendensen av data eller slutsatserna av studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar Sean B. Carroll och Thomas Werner för att tillhandahålla flyga bestånd, Naoyuki säkring för utrustning, Byung Seok Jin för hans hjälp med filmning, Kiyokazu Agata för mentorskap och Elizabeth Nakajima för engelska redigering. Detta arbete stöds av KAKENHI 17K 19427 och Takeda Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits - C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits - C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 - 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
- Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. Hecht, M. K., Steere, W. C. , Springer (Meredith Corporation). New York. 437-543 (1970).
- Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: a guide to species identification and use. , Academic Press. New York. (2006).
- Patterson, J. T. The Drosophilidae of the southwest. 4313, University of Texas Publication. 7-216 (1943).
- Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
- Werner, T., Jaenike, J. Drosophilids of the Midwest and Northeast. , River Campus Libraries, University of Rochester. Rochester. (2017).
- Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
- Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136 (2015).
- Gompel, N., Prud'homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
- Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
- Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
- Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
- McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
- Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
- Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
- Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).
- Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
- Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. Sekimura, T., Nijhout, H. F. , Springer. New York. in press (2017).
- True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051 (2016).
- Resh, V. H., Cardé, R. T. Encyclopedia of Insects. , 2nd ed, Academic Press. Burlington. (2009).
- DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
- McKinney, M. L., McNamara, K. Heterochrony: the evolution of ontogeny. , Plenum Press. New York. (1991).
- Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners' guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
- Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).
