Summary
Protokoller for staging pupal perioder og måling av vingen pigmentering i Drosophila guttifera er beskrevet. Regi og kvantifisering av pigmentering danner et solid grunnlag for å studere utviklingsmessige mekanismer av voksen trekk og aktiverer interspesifikk sammenligning av trekk utvikling.
Abstract
Diversifisert arter av Drosophila (frukt fly) gir muligheter for å studere mekanismer for utvikling og genetiske endringer ansvarlig for utviklingsendringene. Spesielt er det voksne stadiet en rik kilde til morfologiske egenskaper for interspesifikk sammenligning, inkludert fløyen pigmentering sammenligning. For å studere utviklingsmessige forskjeller arter, er detaljert observasjon og riktig oppsetning nødvendig for nøyaktig sammenligning. Her beskriver vi protokoller for oppsamling av pupal perioder og kvantifisering av vingen pigmentering i en polka-prikkete frukt fly, Drosophila guttifera. Først beskriver vi metoden for detaljert morfologiske observasjon og definisjon av pupal stadier basert på morphologies. Denne metoden inneholder en teknikk for å fjerne de blodsugende, som er den ytre chitinous saken av puppe, aktivere detaljert observasjon av pupal morphologies. Andre beskriver vi metoden for å måle varigheten av definerte pupal stadier. Til slutt, vi beskriver metoden for kvantifisering av vingen pigmentering basert på bildeanalyser med digitale bilder og ImageJ programvare. Disse metodene, kan vi opprette et solid grunnlag for sammenligning utviklingsprosesser av voksen trekk under pupal stadier.
Introduction
Noen av de morfologiske egenskapene av Drosophila er diversifisert blant arter,1,,2,,3,,4,,5. Vi kan nærme spørsmålet hvordan morfologiske mangfold oppstår ved å sammenligne mekanismer for generering av disse morphologies. Eksempler på slike morphologies er larver trichomes, voksen sex kammer, ytre genital apparat, abdominal pigmentering og vinge pigmentering6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. for å studere morfologiske forskjeller blant voksne, observasjon og analyse av pupal stadier er viktig, fordi skjebnen til voksen trekk bestemmes på slutten larver stadier og påfølgende morphogenesis fortsetter i pupal perioden.
I utviklingsbiologi studier av Drosophila melanogaster, "timer APF" (timer etter pupal formasjon) er den vanligste metoden å angi en pupal scenen16. Dette systemet har absolutt tid etter pupal formasjon og er veldig praktisk for rutinemessig eksperimenter. Imidlertid utviklingsmessige hastigheten kan variere mellom pupae, og kan påvirkes av små genetisk, epigenetic eller microenvironmental forskjeller, og derfor har samme absolutte tidspunkt etter pupal formasjon garanterer ikke at pupae er på samme utviklingsstadiet. I mange tilfeller er stadier definert av morfologiske funksjoner å foretrekke for sammenligning av flere personer. Spesielt krever en sammenligning mellom artene presis regi og sammenligning mellom tilsvarende (homologe) stadier.
Bainbridge og Bownes17 anerkjent 20 pupal stadier (P1 til P15(ii)) basert på morfologiske funksjoner i Drosophila melanogaster pupae. Denne oppsetningen er det mest brukte systemet morfologiske utviklingsmessige oppsetning18. I en tidligere studie utført vi pupal oppsetning av Drosophila guttifera å etablere et grunnlag for vinge pigmentering studier19. D. guttifera har en sort polka-dot mønster på sine vinger og er en av modell arter for vinge pigmentering formasjon20. Selv om vi omtalt morfologiske vilkårene beskrevet i Bainbridge og Bownes' forskning17, målte vi direkte scenen varighet av føljetong observasjoner19, istedet for benytter Bainbridge og Bownes' estimering av scenen varigheter fra observert frekvens. Her beskriver vi metoden pupal regi og måling av varighet for pupal stadier av Drosophila brukes i Fukutomi et al19.
For å studere utviklingsmessige mekanisme fløyen pigmentering, trenger vi å vite når pupal eller voksen stadier pigmentering oppstår. Fukutomi et al. 19 kvantifisert optisk tettheter (ODs) av pigmentering under pupal og voksen stadier av bildeanalyse fløyen bilder. Pigmentering i Drosophila vinger antas å skyldes opphopning av svart melanin21. For kvantifisering av ODs, ble gråtonebilder og ImageJ programvare (https://imagej.nih.gov/ij/)22 brukt. Å gjenkjenne og kvantifisere spot-spesifikke pigmentering (ΔOD), trekker vi OD utenfor et sted fra OD i et sted. For å gjøre denne metoden reproduserbare og objektiv, bør steder av OD måling fastsettes ved hjelp av vingen årer som landemerker. I denne artikkelen beskrive vi i detalj denne metoden for kvantifisering av vingen pigmentering i Drosophila guttifera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fly lager
- Bruk Drosophila guttifera for alle følgende protokoller.
- Bruke plast ampuller (diameter 25 mm x høyde 96 mm) og cellulose plugger (diameter 23 mm x høyde 26 mm) lager vedlikehold. Bruk standard cornmeal/sukker/gjær/agar mat og følger en publikasjon beskrevet tre andre alternative oppskrifter for denne arten2.
Merk: D. guttifera (lager nummer 15130-1971.10) er gitt av Drosophila arter lager Center ved University of California, San Diego. Selv om D. guttifera tilhører den immigrans-tripunctata stråling, som er fjernt beslektet til D. melanogaster i slekt23, har mange biologiske egenskaper til felles med D. melanogaster . Derfor kan denne protokollen brukes for mange Drosophila arter, selv om noen arter krever bestemt mat og/eller tekniske tips beholde dem2.
2. observasjon av puppe og definisjon av pupal stadier
Merk: Puppe for observasjon er Hentet fra fly lager opprettholdt med en 12:12 h lys/mørke syklus på 25 ° C. Bainbridge og Bownes17 beskrevet en lav risiko for flytte D. melanogaster pupae fra det opprinnelige stedet av pupation på et stykke fuktet papir (97% overlevelse av 946 flyttet pupae). D. guttifera pupae kan tilberedes i hovedsak på samme måte.
- Plasser friske voksne i Drosophila på fersk mat (standard cornmeal/sukker/gjær/agar mat) i en plast hetteglass (diameter 25 mm x høyde 96 mm) og la dem legge egg. Vent 7 dager å få sent 3 instars.
- Plass 1 mL av standard cornmeal/sukker/gjær/agar mat i hver 1,5 mL microtube. Lage 3 knappenålshull med 2 mm avstand i lokkene på microtubes ved penetrerende med en tegnestift tillate puste.
- Sentrifuge microtubes med mat for 7 s i en mini microcentrifuge (860 x g).
- Inverter og trykk hetteglass for å fjerne alle voksne fra ampullen.
- Hell 5-10 mL ddH2O (eller omvendt osmose vann) i ampullen.
- Utøse Larvene med vann i en plast Petriskål (diameter 90 mm x høyde 15 mm). Identifisere sent 3 instars ved sin store størrelse (3-4 mm i lengde).
- Forsiktig flytte sent 3 skikkelsen Larvene med tang i microtubes med mat (10 Larvene / microtube). Inkuber dem over natten på 25 ° C.
- Flytte nyopprettede pupae på et stykke papir som er fuktet med ddH2O og plassert i en plast Petriskål (diameter 35 mm x høyde 10 mm).
- Plasser Petriskål i et fuktig kammer (som inneholder 10 mL av ddH2O nederst), og vente til pupae utvikle til ønsket scenen.
- Flytte pupae på en fuktet stykke papir i en plast Petriskål (diameter 60 mm x høyde 15 mm).
Merk: Definisjonen av stadier hovedsakelig gjøres basert på de D. melanogaster17. Vanligvis kan pupal perioden Drosophila kategoriseres i P1 - P15(ii), selv om noen endringer av scenen definisjon ville være nødvendig avhengig av arten brukes. Hvis mulig, gjør fjerne blodsugende nøyaktig og detaljert observasjon. Se detaljer nedenfor (trinn 3). - Observere pupae under stereo mikroskop. Ta bilder med et digitalt kamera koblet til stereo mikroskopet.
3. fjerne blodsugende
Merk: Pupae i Drosophila er dekket av en struktur som kalles blodsugende. Et insekt Muscomorpha (fluer) kaster ikke sin larver cuticle på pupation; i stedet, det beskytter hårstråene etter apolysis, og bruker det som et beskyttende deksel av puppe, de blodsugende24. August bosatt innenfor blodsugende har en ekte pupal cuticle, som er veldig myk og skjør. Før apolysis foregår rundt P4(ii), epithelia og blodsugende er knyttet sammen, og derfor fjerne blodsugende uten skader er svært vanskelig. Etter P5 er fjerne blodsugende arbeidskrevende, men nyttig for morfologiske observasjon og definisjon av pupal stadier. Prosessen er gjennomført som følger.
- Feste et stykke dobbeltsidig tape på et stykke papirhåndkle.
- Plass august på dobbeltsidig tape ventral side opp (figur 1A).
- Finn avstanden mellom den fremre siden av blodsugende og interne puppe. Forstå og fjerne blodsugende rundt dette gapet ved hjelp av pinsett, og utsette den fremre siden av hodet av puppen.
- Stikk en tang ved å flytte den parallelle anterior-posterior aksen. Løft spissen av Tang lokalt bryte blodsugende. Gjenta denne handlingen til brekkasje når den bakre delen av blodsugende. Sikre at et gap er også dannet mellom blodsugende og pupal Ben, og bryte den ventral siden av blodsugende og minimere skaden å intern puppe (figur 1B).
- Etter å ha brutt blodsugende som mulig, ta ut puppe med en fin pensel (#5/0) (figur 1 c).
- Plasser puppen på et stykke papir som er fuktet med ddH2O og plassert i en plast Petriskål (diameter 60 mm x høyde 15 mm). Ta bilder så snart som mulig fordi eksponert puppe sårbar og blir lett tørr.
Merk: Pupae uten blodsugende er ikke egnet for måling varighet for pupal perioder (trinn 4), fordi stress (for eksempel uttørking) og skader kan forstyrre normal utvikling.
4. måle varighet for pupal stadier
- Forberede pupae måler varigheten for pupal stadier som beskrevet i trinn 2. Samle pupae 1-2, 2-3, og 3-4 dager etter pupal formasjon (20 pupae hver). Gi personlige identifikasjonsnumre (1-60) til pupae for identifikasjon. Fortsett å samle nylig dannet pupae under trinnene, å få 20 flere unge pupae. Gi personlige identifikasjonsnumre (61-80) til de nyopprettede pupae. Plass august på ddH2O-fuktet vev papir i en godt (3,9 cm2) av en 12-vel celle kultur plate (1 puppe/godt, 12 pupae/plate). Tomrommet mellom godt av plater med ddH2O vedlikeholde fuktighet, sette lokkene og plassere platene i 25 ° C, konstant lys (24:0 h lys/mørke).
Merk: Pupae uten blodsugende er ikke egnet for måling varighet for pupal perioder. Ikke Fjern blodsugende. - Observere morfologiske funksjoner inkludert kroppen farge, bust, Malpighian tubuli og gul kropp av alle pupae når hver 30 min, og posten observert stadier (P1 - P15(ii), basert på referanser17,19) i en oversikt ark.
- Fortsette innspillingen over fire strake dager (96 h) av en roterende forskyvning av tre (eller flere) personer.
- Telle antall poster av hver bestemt scene, og gjennomsnittlig dem (gjennomsnittlig antall observasjoner / pupae). Deretter multiplisere dem ved 0,5 (h), som resulterer i beregnet lengdene av stadier (h).
5. måling av intensiteten av svarte flekker på en vinge
Merk: Intensiteten av svarte flekker på en pupal eller voksen vinge kan kvantifiseres ved å måle optisk tetthet (OD). Et glass filter med kjente ODs (trappet tetthet filter) brukes for kalibrering25, slik at man kan beregne OD i et bestemt område fra et digitalt bilde av en vinge. OD i et sted og OD utenfor stedet måles, og sistnevnte er trukket fra den tidligere å få intensiteten i stedet (ΔOD). Her beskriver vi disseksjon, måling og beregning av ΔOD. Denne fremgangsmåten kan gjøres etter trinn 2 uavhengige fra trinn 3 og trinn 4. Når man har utført trinn 2 og forstår alle pupal stadier, kan direkte starte eller gjenta trinn 5.
- Bildet forberedelse
- Forberede en ny puppe en fokal scene som beskrevet i trinn 2. Fjern den fremre delen av blodsugende med tang. Ta ut puppen ved hjelp av pinsett og plasser den i fosfat bufret saltvann (PBS, tabell 2) i en plast Petriskål (diameter 35 mm x høyde 10 mm).
- Kutte basale felles av en ving (basale felles er smale proksimale delen av vingen). Som vingen kastes, Legg den i en plast Petriskål (diameter 35 mm x høyde 10 mm) fylt med ddH2O å utvide det ved osmotisk trykk (vingen utfolder seg selv).
- Samle nylig eclosed voksne en gang hvert 10 min fra lager ampuller. Bedøve et fly med CO2 bruker en CO2 anesthetizing pad, bekrefte anesthetization ved ubevegelighet og kuttet basale felles av en vinge.
- Sted 10 µL av PBS på et glass lysbilde, plasserer vingen det og dekk med en cover slip (18 x 18 mm).
- Slå på lyset i stereo mikroskopet. Angi lyset på høyeste nivå. Angi linsen 11.5 X. Angi membranen til den mest åpne tilstand. Slå på kameraet. Stille inn kameraet skal (ISO: 100, modus SHQ 3136 x 2352 piksler, lukkertid: 1/20 s). Fokuser på prøven ved å flytte grovskruen av mikroskopet.
- Trykk på utløserknappen på fjernkontroll-enheten til å ta et bilde. Ta 3 bilder per vingen, hver må være sentrert på en campaniform sensillum, langsgående blodåre spot eller bakre crossvein, posisjonering den distale del av vingen på venstre side og den fremre delen av vingen på oversiden.
- Kalibrering
- Ta bilder av 9 deler av en trappet tetthet filter med samme kamerainnstillinger brukes til å innhente fløyen bildet.
- Starte ImageJ programvare (https://imagej.nih.gov/ij/)22.
- Klikk fil | Åpne | og velg ett av bildene trappet tetthet filter.
- Klikk bilde | Type | 8-biters | å konvertere bildet til en 8-biters avbildning.
- Klikk Rediger | Utvalg | Angi | og Oval og Midtstilt kolonne. Skrive 100 (piksler) i bredde kolonne, 100 (piksler) i høyde -kolonnen, 1568 i X koordinere kolonnen og 1176 i Y koordinere kolonnen. Klikk på OK.
- Klikk analysere | Mål |. Den "betyr grå verdien" av utvalgte områder måles.
- Gjenta 5.2.3. til 5.2.6. gjenværende bilder for 8.
- Klikk analysere | Kalibrere og velg Rodbard25 i funksjonen kolonne og skrive følgende nummer i høyre kolonne i midten (0.04, 0.336, 0.632, 0.928, 1.224, 1,52, 1.816, 2.112, 2.408, disse tallene, avhengig av tettheten av den trappet tetthet filter).
- Kontroller globale kalibrering kolonnen, og klikk OK.
Merk: Ved å utføre denne prosedyren, "mener grå verdi" konverteres til "optisk tetthet (OD)" ved hjelp av funksjonen Rodbard. Etter dette trinnet kan optisk densitet beregnes for en bestemt valgte området i ImageJ programvare.
- Velge området av målinger
Merk: Flekker er vanligvis knyttet til landemerker, som campaniform sensilla, langsgående blodåre tips og crossveins. Disse og andre landemerker på en vinge kan brukes å velge regionen målinger. Her et eksempel iD. guttifera(Figur 2) er beskrevet.- Definisjon av punkt A, campaniform sensillum stedet.
- Åpne et bilde som er en campaniform sensillum plass i midten av bildet. Klikk bilde | Type | 8-biters | å konvertere bildet til en 8-biters avbildning.
- Klikk rektangel i Området verktøy og tegne et rektangel. Angi øvre venstre toppunktet i rektangelet slik at det er knyttet til den bakre linjen i tredje langsgående venen og mer distale fra et campaniform sensillum sted. Angi høyre side av rektangelet slik at det ligger til høyre for campaniform sensillum stedet.
- Klikk Rediger | Utvalg | Legge til Manager |. Sjekk Vis alle kolonner.
- Klikk vinkel verktøyet i Linje markeringsverktøy. Tegn første linje på bakre linjen av tredje langsgående blodåre. Angi venstre endepunktene på linjen på toppunktet i rektangel tegnet i trinn 1. Trekke den andre linjen på oversiden av rektangelet. Trykk på "m" for å måle vinkelen mellom de to linjene i dette trinnet. Klikk vinduet av bildet på skjermen til datamaskinen.
- Klikk Rediger | Utvalg | Legge til Manager |.
- Klikk rektangel i Området verktøy og tegne en firkant på omtrent 1/9 størrelsen på bildevinduet. Klikk Rediger | Utvalg | Rotere |. Skrive minus grader av vinkelen måles i trinn 5.3.1.4. i vinkel -kolonnen og klikk OK for å rotere rektangel tegnet i dette trinnet.
- Flytte rektangelet i trinn 5.3.1.6. ved hjelp av piltastene. Angi sluttpunktet på bakre linjen av andre langsgående venen på venstre side av rektangelet og nedre side av rektangelet festet til den bakre linjen i tredje langsgående venen. Bekrefte at en vinkelrett linje fra endepunktet for andre langsgående fotsporene til bakre linjen i tredje langsgående venen er trukket i denne fremgangsmåten. Definere foten av den vinkelrette linjen som punkt A (figur 2A).
- X-koordinat og y-koordinaten for punkt A, vist nedenfor Området verktøy når du plasserer markøren på punkt A.
- Definisjon av punkt B, langsgående blodåre tips spot
- Åpne et bilde som en langsgående blodåre tips stedet er i midten av bildet. Klikk bilde | Type | 8-biters | å konvertere bildet til en 8-biters avbildning.
- Gjenta den samme fremgangsmåten som er beskrevet i trinn 5.3.1. (Definisjonen av punkt A, campaniform sensillum spot) å finne punkt A i bildet.
- Klikk Rediger | Utvalg | Legge til Manager |.
- Klikk rektangel i Området verktøy og tegne et rektangel. Angi øvre venstre toppunktet på rektanglet på endepunktet for den bakre linjen i tredje langsgående venen.
- Klikk Rediger | Utvalg | Legge til Manager |.
- Klikk vinkel verktøyet i Linje markeringsverktøy. Tegn første linje for å koble punkt A og endepunktet for den bakre linjen i tredje langsgående venen. Definere denne linjen som linjen A. trekk den andre linjen på oversiden av rektangel tegnet i trinn 5.3.2.4. Trykk "m" for å måle vinkelen mellom de to linjene.
- Klikk Rediger | Utvalg | Legge til Manager |.
- Klikk rektangel i Området verktøy og tegne en firkant på omtrent 1/9 størrelsen på bildevinduet. Klikk Rediger | Utvalg | Rotere |. Skrive minus grader av vinkelen måles i trinn 5.3.2.6. i vinkel -kolonnen og klikk OK for å rotere rektangel tegnet i dette trinnet. Flytte rektangelet ved hjelp av piltastene. Angi oversiden av rektangelet slik at den er koblet til linje A og endepunktet for den fremre linjen i fjerde langsgående venen slik at det er på venstre side av rektangelet.
- Klikk Rediger | Utvalg | Legge til Manager |.
- Klikk rektangel i Området verktøy og tegne en firkant på omtrent 1/9 størrelsen på bildevinduet. Klikk Rediger | Utvalg | Rotere |. Skrive minus grader av vinkelen måles i trinn 6 i vinkel -kolonnen, og klikk OK for å rotere rektangel tegnet i dette trinnet. Flytte rektangelet ved hjelp av piltastene. Angi nedre venstre toppunktet i rektangelet slik at det er på øvre venstre toppunktet i rektangel tegnet i trinn 5.3.2.8., resulterende å skaffe den vinkelrette linjen fra endepunktet for den fremre linjen i fjerde langsgående venen linje A. definere den skjæringspunktet poenget med den vinkelrette linjen og bakre linjen i tredje langsgående venen som punkt B (figur 2B).
- X-koordinat og y-koordinaten for punkt B, vist nedenfor Området verktøy når du plasserer markøren på Point B.
- Definisjon av punkt C, bakre crossvein sted
- Åpne et bilde som et bakre crossvein sted er i midten av bildet. Klikk bilde | Type | 8-biters | å konvertere bildet til en 8-biters avbildning.
- Definere punkt C som den bakre mest fremre linjen av fjerde langsgående venen innen krysset den bakre crossvein og fjerde langsgående venen (figur 2C).
- X-koordinat og y-koordinaten for punkt C, vist nedenfor Området verktøy når du plasserer markøren på punkt C.
- Definisjon av punkt D, kontroll-området
- Åpne et bilde som er en campaniform sensillum plass i midten av bildet. Klikk bilde | Type | 8-biters | å konvertere bildet til en 8-biters avbildning.
- Klikk rett i Linje verktøy og tegne en linje som forbinder endepunktet for den fremre linjen i andre langsgående venen og endepunktet for den bakre linjen i fjerde langsgående venen. Definere punktet D som krysset poenget med denne og den bakre linjen i tredje langsgående venen (figur 2D).
- X-koordinat og y-koordinaten for punkt D, angitt under Området verktøy når du plasserer markøren på punkt D.
- Definisjon av punkt A, campaniform sensillum stedet.
- Målinger
- Åpne ett av bildene av vingen (for måling av punkt A, åpne bildet med punkt i midten). Klikk bilde | Type | 8-biters | å konvertere bildet til en 8-biters avbildning.
- Klikk rektangel i Området verktøy og tegne et rektangel i ca 1/9 størrelser av biletvindauget.
- Klikk Rediger | Utvalg | Angi |. Sjekk Oval og Midtstilt kolonne. Skrive 100 (piksler) i bredde og høyde kolonner, skrive x koordinatene til punkt A (eller punkt B eller punkt C) og D i X koordinere kolonne og skrive y koordinatene for punkt A (punkt B eller punkt C) og D i Y koordinere kolonnen. Klikk på OK.
- Klikk analysere | Mål |. Hvis kalibreringen beskrevet i 5.2 allerede er ferdig, angis ODs i mener kolonnen.
- Beregne ΔODs ved å trekke OD av punkt D fra ODs poeng A, B og C.
Merk: Punktet D i en gjennomsiktig del av vingen og inkluderer ikke pigmentering, og er derfor egnet for en bakgrunn kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
D. guttifera pupal perioden er inndelt i 17 etapper (P1 - P15(ii), bilder av tre representant stadier (P1, P5 - 6, P10) vises Figur 3og alle 17 etapper er illustrert i Figur 4). Selv om Bainbridge og Bownes17 anerkjent 20 etapper i D. melanogaster, kan noen av disse trinnene ikke brukes til D. guttifera. Hendelsesrekkefølgen to utviklingsmessige, utseendet på den gul kroppen (masse skur celler innenfor midttarmen26) og tidspunktet for Malpighian tubuli å snu grønt, er ikke strengt kontrollert i D. guttifera, og derfor kan vi ikke skille P5 (jeg ), P5(ii) og P6. Også i motsetning til i D. melanogaster, tidspunktet for sverting av thoracic og abdominal bust ble synkronisert, og derfor kan vi ikke skille P11(i) og P11(ii)19.
Vi kan måle lengden av pupal stadier av D. guttifera (tabell 3, Fukutomi et al.19). Hele er pupal ca 20 timer lengre enn D. melanogaster 25 ° C-17. Vi beregnet ΔODs av områdene rundt en campaniform sensillum, langsgående blodåre tips og bakre crossvein. Her viser vi ODs og ΔODs hos voksne 7 dager etter eclosion (Tabell 4). Ved å sammenligne dataene i flere faser, fant vi at scenen P12(i) er tidspunktet for utbruddet av pigmentering, og at pigmentering fullføres av 24 timer etter eclosion (figur 5, fra de opprinnelige målingene brukt i Fukutomi et al. 19).
Figur 1. Illustrasjon av fjerne blodsugende. (A) plass en puppe ventral side opp på et stykke dobbeltsidig tape. Fjern den fremre delen av blodsugende. (B) bryte blodsugende med tang fra ventral side. (C) etter bryte blodsugende, ta ut puppe ved hjelp av en pensel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Definisjon av området for å måle pigmentering. (A) punkt A for en flekk forbundet med en campaniform sensillum. (B) punkt B for en flekk forbundet med langsgående blodåre tips. (C) punkt C for en flekk tilknyttet en bakre crossvein. (D) punkt D for en kontroll-området. Skala stolper angir 250 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Eksempler på definerte pupal stadier. (A) puppe scenen P1 dekket med blodsugende. (B) puppe scenen P5 - 6. (C) puppe scenen P10. Puparia fjernes før observasjon i (B) og (C). Skala stolper angir 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Illustrasjoner av 17 pupal etapper i D. guttifera. (A) P1, blodsugende er hvit. (B) P2, fargen på blodsugende er lys brun. (C) P3 en boble er observert i den laterale siden (svart pilspiss). (D) P4(i), boblen er større enn i P3 (svart pilspiss), og puppen er oppe i PBS. (E) P4(ii), et gap er observert i den fremre delen (svart pilspiss) og bakre del (grått pilhode). (F) P5 - 6, Malpighian tubuli overføre (vanskelig å se om dekket av blodsugende). Pupal figuren er dannet av pupal epitel og pupal cuticle. (G) P7, den gul kroppen kan observeres i dorsal side (svart pilspiss). (H) P8, øyne er gule. (I) P9, øynene er oransje. (J) P10 øynene er røde. (K) P11, bane og ocellar bust (grått pilhode), vibrissae, thorax macrochaetae (svart pilspiss) og tarsal bust er svart og synlig. (L) P12(i), tips av vingene er grå. (M) P12(ii), alle deler av vingene er grå (svart pilspiss). (N) P13, vingene er helt svart. (O) P14, hodet og beina er helt mørkt. (P) P15(i), meconium kan observeres på dorsal magen (svart pilspiss). (Q) P15(ii), fly er eclosing. Detaljer om disse stadiene ble beskrevet i Fukutomi et al. 19 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Utviklingen av pigmentering rundt en companiform sensillum på en vinge. Sirkler angir individuelle ΔODs, og horisontale barer angir gjennomsnitt. P10: n = 10, P11: n = 10, 12(i): n = 10, P15(i): n = 11, 3 h: n = 8, 24 h: n = 7 7 dager: n = 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Komponent | |
| Hvit myk sukker | 51.6 g |
| Maismel | 172.4 g |
| Korn grits - C | 86.4 g |
| Tørr øl gjær | 106 g |
| Agar pulver | 35.28 g |
| ddH2O | 4000 mL |
| Koke i 30 minutter og la avkjøles til 70 ° C. | |
| Legge til 4 g butyl p-hydroxybenzoate oppløst i 40 mL av etanol. | |
| Bland godt og hell 9 mL i plast ampuller (diameter 25 mm x høyde 96 mm). | |
Tabell 1. Sammensetningen av standard cornmeal/sukker/gjær/agar mat.
| Komponent | Beløp |
| NaCl | 80 g |
| KCl | 2 g |
| Na2HPO4·12H2O | 29 g |
| KH2PO4 | 2 g |
| ddH2O | opptil 10 L |
| Angi pH 7.4 |
Tabell 2. Sammensetningen av PBS (1 X).
| Scenen | Mener varighet (h) | SD | n |
| P1 - 2 | 1.7 | 0,65 | 16 |
| P3 | 2.1 | 0,65 | 16 |
| P4(i) | 2.1 | 1.69 | 19 |
| P4(II) | 0,3 | 0.28 | 29 |
| P5 - 6 | 5.0 | 3.07 | 30 |
| P7 | 31,9 | 7.22 | 46 |
| P8 | 9.6 | 2,81 | 57 |
| P9 | 10.9 | 2,66 | 55 |
| P10 | 11,7 | 2,96 | 39 |
| P11 | 4.4 | 2,81 | 44 |
| P12(i) | 1.1 | 0.76 | 44 |
| P12(II) | 2.0 | 0.70 | 43 |
| P13 | 2.2 | 0,68 | 10 |
| P14 - 15(i) | 28,6 | 2,75 | 10 |
| P15(II) | 1.4 | 0.87 | 10 |
| Totalt | 121.7 |
Tabell 3. Målt varighet for pupal stadier av D. guttifera.
| OD | ΔOD | |||||||
| Campaniform sensilum | Langsgående blodåre tips | Bakre crossvein | Kontroll | Campaniform sensilum | Langsgående blodåre tips | Bakre crossvein | ||
| Enkelte | (Punkt A) | (Punkt B) | (Punkt C) | (Punkt D) | (Punkt A - punktet D) | (Punkt B - punktet D) | (Punkt C - punktet D) | |
| 1 | 0.549 | 0.484 | 0.515 | 0.256 | 0.293 | 0.228 | 0.259 | |
| 2 | 0.529 | 0.489 | 0.516 | 0.254 | 0.275 | 0,235 | 0.262 | |
| 3 | 0.546 | 0.48 | 0.533 | 0.255 | 0.291 | 0.225 | 0.278 | |
| 4 | 0.583 | 0.496 | 0.566 | 0.255 | 0.328 | 0.241 | 0.311 | |
| 5 | 0.523 | 0.479 | 0.528 | 0,235 | 0.288 | 0.244 | 0.293 | |
| 6 | 0.572 | 0.509 | 0.546 | 0.265 | 0.307 | 0.244 | 0.281 | |
| 7 | 0.568 | 0.511 | 0,56 | 0.256 | 0.312 | 0.255 | 0.304 | |
| 8 | 0,56 | 0.507 | 0.562 | 0,27 | 0.29 | 0.237 | 0.292 | |
| 9 | 0.551 | 0.485 | 0.569 | 0.259 | 0.292 | 0.226 | 0.31 |
Tabell 4. Målt ODs og ΔODs av D. guttifera voksne 7 dager etter eclosion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her protokollene for definisjonen av pupal stadier, fjerne blodsugende for detaljert observasjon, måling varighet for pupal stadier, og måling av intensiteten av svarte flekker på en fløy i D. guttifera. Disse protokollene kan brukes for mange Drosophila og relaterte fly arter, særlig arter med vinge pigmentering.
Grundig observasjon og beskrivelse av mer detaljert utviklingsmessige hendelser vil gjøre videre underinndeling av stadier. I mange tilfeller en utviklingsmessige hendelse krever disseksjon eller snitting av august er ikke egnet for scenen definisjon, fordi man må drepe august for regi, og videre bruk av som er vanskelig. For bruk av en ny Drosophila Art bruke en utviklingsmessige hendelser skjelnes fra utenfor blodsugende først. Avhengig av formålet av studien, kan en så videre dele stadier basert på bestemte organogenesen eller andre utviklingsmål.
Interspesifikk sammenligning av flere stadier er potensielle problemer en inversjon av utviklingsmessige hendelser arter (heterochrony27). For eksempel i D. melanogaster, Malpighian tubule blir grønn og gul kroppen blir synlig, mens denne rekkefølgen kan inverteres i noen pupae D. guttifera19. I slike tilfeller er strenge sammenligning mellom homologe stadier vanskelig. Avhengig av fenomenet interesse må en omdefinere eller dele et bestemt stadium basert på en utviklingsmessig hendelse. For eksempel kan vi omtrent velge pupae av P5 - 6 og gjøre interspesifikk sammenligning av genet uttrykk i pupal vinger med vinge morfologi som en indikator på utviklingsmessige timing14.
Vanligvis tar det 10-30 min å fjerne blodsugende. Hvis man ønsker å observere en kort scene, bør pupae være forberedt tar hensyn til tiden som går under blodsugende fjerning. For eksempel hvis man ønsker å observere P12(i) av D. guttifera, som har bare 1.1 h varighet, vil forbereder pupae på P11 gi et godt resultat.
I vår protokollen brukes fuktet silkepapir til bakgrunnen for pupal bilder. Avhengig av scenen observasjon og strukturer man ønsker å vise i en figur, kan man bruke hvit eller svart papir. For P3 P4(ii) overgang, plasseringen av boblen i puppe er viktig for å skille stadier, og svart papir hjelper for å observere plasseringen av boblen. For fasen etter P5 er hvitt papir bedre for å observere den gul kropp, øyenfarge, bust og kroppen farge.
Bainbridge og Bownes17 beregnet varighet pupal stadier fra frekvensen av utseende. Bordet deres oppsetning er den mest brukte D. melanogaster18. For deres metode, de utarbeidet fire mat flaskene inneholder fem voksne hunner og fem voksne hanner og holdt dem i mørket, og deretter pupae var tilfeldig tatt ut fra en flaske hver på 11, 12, 13 og 14 dager etter utbruddet av egglegging. De telles antall pupae i bestemt stadier og beregnet gjennomsnitt. Lengden på hvert pupal nivå kan anslås basert på data i den totale varigheten av pupal perioden og disse frekvensdata. Et problem med denne metoden er at den ikke kan brukes til å beregne nøyaktige varigheten av pupal stadier hvis utviklingsmessige timing tendens til å synkroniseres blant pupae.
Faktisk vi prøvde Bainbridge og Bowness metode i D. guttifera, og vi fikk partisk data på grunn av synkronisering mellom pupae. Vi kunne ikke identifisere årsaken til dette fenomenet, men noen muligheter er 1) pupae beholdt døgnrytmen fra deres unge scenen og/eller 2) de reagerte eksponeringene til lys som skjedde på observasjon. Vi har derfor besluttet å måle faktiske varighet av direkte observasjon. Dette minimerer bias skyldes døgnrytmen.
Metoden beskrevet her er en metode å kvantifisere ekstra opphopning av melanin i flekker i forhold til deres kontroll området (ΔOD), ved å trekke OD i kontrollen området fra OD i stedet området. Denne metoden ble inspirert av en metode for å kvantifisere kjernefysiske DNA innhold av Feulgen flekker og image analysis (densitometry28,29). Som en av potensielle problemer for å bruke denne metoden for vinge pigmentering, kan ΔOD være en negativ verdi, spesielt når august er veldig ung og har nesten ingen pigmentering. I senere stadier, kan det være noen pigmentering i kontrollen området. Bruk av enkle OD av spot området i seg selv kan brukes i stedet for ΔOD avhengig av formålet av studien. Ved D. guttifera, endre bruk av enkle OD i stedet for ΔOD ikke tendensen til dataene eller konklusjonene i studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Sean B. Carroll og Thomas Werner for å fly aksjer, Naoyuki sikring for utstyr, Byung Seok Jin for hans hjelp filming, Kiyokazu Agata for veiledning og Elizabeth Nakajima for engelsk redigering. Dette arbeidet ble støttet av KAKENHI 17K 19427 og Takeda Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits - C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits - C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 - 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
- Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. Hecht, M. K., Steere, W. C. , Springer (Meredith Corporation). New York. 437-543 (1970).
- Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: a guide to species identification and use. , Academic Press. New York. (2006).
- Patterson, J. T. The Drosophilidae of the southwest. 4313, University of Texas Publication. 7-216 (1943).
- Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
- Werner, T., Jaenike, J. Drosophilids of the Midwest and Northeast. , River Campus Libraries, University of Rochester. Rochester. (2017).
- Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
- Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136 (2015).
- Gompel, N., Prud'homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
- Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
- Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
- Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
- McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
- Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
- Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
- Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).
- Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
- Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. Sekimura, T., Nijhout, H. F. , Springer. New York. in press (2017).
- True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051 (2016).
- Resh, V. H., Cardé, R. T. Encyclopedia of Insects. , 2nd ed, Academic Press. Burlington. (2009).
- DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
- McKinney, M. L., McNamara, K. Heterochrony: the evolution of ontogeny. , Plenum Press. New York. (1991).
- Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners' guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
- Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).
