الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس
Summary
ظهارة صباغ الشبكية (RPE) ظهارة متعدد الوظائف للعين. نقدم هنا بروتوكولا لإنشاء الثقافات الخلية الأولية المستمدة من RPE مورين.
Abstract
ظهارة صباغ الشبكية (RPE) هو ظهارة متعددة الوظائف عالية استقطاب الذي يقع بين الشبكية العصبية والمشيميه في العين. أنها ورقة واحدة من الخلايا المصطبغة وجبات هاكسغنلي ومتصلة بواسطة تقاطعات ضيق. تشمل المهام الرئيسية ل RPE امتصاص الضوء، البلعمه من الجزء الخارجي مستقبله تسلط، التخزين المؤقت المكانية من أيونات، ونقل المواد الغذائية والايونات والماء، فضلا عن المشاركة النشطة في دورة البصرية. بهذه المهام الهامة والمتنوعة، أنها ذات أهمية حاسمة لدراسة بيولوجيا الخلايا RPE. وقد تم إنشاء عدد من خطوط الخلايا RPE؛ ومع ذلك، المعروف الخلايا باساجيد ومخلدة سرعان ما يفقد بعض الخصائص المورفولوجية والفسيولوجية الطبيعية RPE الخلايا. وهكذا، الخلايا الأولية أكثر ملاءمة لدراسة الجوانب المختلفة لبيولوجيا الخلايا RPE والدالة. الماوس الأساسي RPE خلية ثقافة مفيد جداً للباحثين نظراً لنماذج الماوس تستخدم على نطاق واسع في الدراسات البيولوجية، ومع ذلك جمع RPE الخلايا من الماوس أيضا صعبة للغاية بسبب صغر حجمها. نقدم هنا، بروتوكول لإنشاء الماوس الأساسي RPE خلية الثقافات التي تشمل انوكلييشن وتشريح العيون وعزل الأوراق RPE لإنتاج الخلايا لاستزراع. هذا الأسلوب يتيح استعادة كفاءة الخلية. RPE الخلايا التي تم الحصول عليها من اثنين من الفئران يمكن أن تصل إلى كونفلوينسي في أحد إدراج غشاء البوليستر 12 مم محملة مسبقاً في لوحة الثقافة بعد أسبوع واحد من عرض بعض الخصائص الأصلية لحسن النية RPE الخلايا مثل سداسية الشكل وتصبغ بعد سنتين والثقافة أسابيع للثقافة.
Introduction
ظهارة صباغ الشبكية (RPE) هي طبقة واحدة من الخلايا الظهارية الاستقطاب الذي يقع بين الشبكية العصبية والمشيميه في العين. الأداء الوظيفي للخلايا RPE وسلامة أحادي الطبقة RPE حاسمة بالنسبة لرؤية سبب RPE دوراً رئيسيا في عمليات متعددة مثل الحفاظ على حاجز الدم-الشبكية الخارجي، نقل الماء والايونات بين الشبكية شرويد، على ضوء الاستيعاب، الحماية من الأكسدة، والسيطرة على عملية الأيض ريتينويد والبلعمه من الجزء الخارجي من1،فوتوريسيبتورس2. موقع RPE في الجزء الخلفي من العين، فضلا عن وظيفتها حاجز منع المخدرات تدار النظامية من المرور من الدم إلى الزجاجي، تجعل من الصعب على دراسة تعقيد RPE الدالة في فيفو. ومن ثم، هناك حاجة كبيرة لإنشاء RPE الثقافات الخلية لدراسة الخلايا RPE في بيئة مرنة، التي تسيطر عليها3،4.
ويوجد عدد من خطوط الخلايا RPE الراسخة، يوفر طريقة ملائمة وسهولة الحصول عليها وتخزينها في الخلايا؛ ومع ذلك، تحتوي الخلايا باساجيد بعض العيوب مقارنة بالخلايا الأولية2،،من34. أولاً، أنها غالباً ما تتسم بتغييرات في مورفولوجيا الخلايا. على سبيل المثال، لم يعثر أي من خطوط الخلايا الموجودة تكون مناسبة لدراسة موثوقة لخصائص RPE الحاجز بسبب فقدان الخلية القطبية النمط الظاهري واختفاء جزئي تقاطعات ضيق4. بالإضافة إلى فقدان قطبية والسليم خلية إلى خلية اتصالات، خطوط الخلايا RPE سرعان ما يفقد ما تصبغ نظراً للغياب الإنزيمات ميلانوجينيسيس الرئيسية في RPE الكبار5. يمكن استعادة التصبغ، ولكن التحليل الشامل لآلية إعادة تصبغ تشمل مزيجاً من مجهر إلكتروني، الجينات التعبير فحوصات التحليل والمواد الكيميائية للتأكد من وجود الميلانين قد ابدأ وقد أجرى6. القيد أكثر واحد هو أن خطوط الخلايا RPE الحياة الخلية الموسعة (في بعض الأحيان-الخلود) وفي ظل ظروف معينة، يمكن أن تتحول إلى تجديد الذاتي الخلايا الجذعية البالغة multipotent الذي فصل من الركازة وشكل عائم المستعمرات7، 8-هذا القيد يجعل من المستحيل استخدام خطوط الخلية لزرع الأعضاء والتجارب3.
قد RPE الابتدائي خلية الثقافات التي تم الحصول عليها من أنسجة جديدة نظراً لمساوئ خطوط الخلايا RPE المنشأة، بمثابة نموذج ذات صلة أكثر بيولوجيا للدراسة RPE. خلايا أولية RPE قد استخدمت ليس فقط لدراسة مهام محددة RPE مثل الأيض فيتامين (أ)9، البلعمه مستقبله شرائح الخارجي10 وأيون النقل11، ولكن أيضا لدراسة بيولوجيا الخلية الأساسية مثل طلائي قطبية الخلية2 والتوازن الليزوزومية أوتوفاجي،من1213.
في اليومين الماضيين من سنوات كان هناك عدد من المنشورات بشأن إنشاء الأولية RPE الثقافات، مما يشير إلى اهتمام متزايد في هذا المجال من البحوث3،،من1415. البروتوكولات العديدة للخلايا RPE البشرية وغير البشرية RPE الخلايا مثل الخلايا RPE البقر والخنزير وقد نشرت16،17،،من1819. ومع ذلك، أنها أكثر صعوبة في التعامل مع الماوس RPE الخلايا بسبب حجمها أصغر بكثير. على الرغم من أن عددا كبيرا من المنشورات وصف بروتوكولات لعزل الخلايا RPE من الماوس14،،من2021، لا تزال هناك العديد من الباحثين تكافح من أجل عزل الخلايا RPE دون تلوث شرويد الخلايا أو الخلايا من الحطام الشبكية العصبية. وهنا يقدم البروتوكول المتعلق بوضع الماوس الأساسي RPE ثقافة الخلية، بما في ذلك الحصول على العيون من الماوس، وتشريح العيون وعزل الأوراق RPE لإنتاج الخلايا لاستزراع. هذا البروتوكول الفيديو سيكون مفيداً بشكل خاص للباحثين الذين بدأوا العمل مع الماوس الأساسي RPE الثقافات وتحتاج إلى إرشادات بشأن تقنيات التشريح.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح البروتوكول مفصلاً قدم إنشاء موثوق بها الماوس الثقافات RPE الأولية التي تصل إلى كونفلوينسي بعد أسبوع واحد، وعرض الخصائص RPE الرئيسية مثل سداسية الشكل وتصبغ بعد أسبوعين. يمكن استخدام خلايا RPE التي تم الحصول عليها لعدد من التطبيقات المصب مثل فيتامين (أ) الأيض9، البلعمه من قطاع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة جزئيا بالمؤسسة برايتفوكوس (إلى DS).
Materials
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1×0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
References
- Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
- Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
- Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
- Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
- Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
- Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
- Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
- Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
- Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
- Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
- Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
- Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
- Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).
