Summary
Vi presenterar ett protokoll för att använda STED mikroskopi samtidigt bilden aktin strukturer, mikrotubuli och mikrotubuli plus-end bindande proteiner i B-celler som har spridit sig på coverslips belagd med antikroppar till B-cells receptor, en modell för den inledande fasen immun synaps bildas.
Abstract
B-celler som binder till membran-bundna antigener (t.ex., på ytan av en antigen-presenterande cell) bildar en immun synaps, en specialiserad cellstruktur som optimerar B-cells receptor (BCR) signalering och BCR-medierad antigen förvärv. Både den omdaning av aktin cytoskelettet och reorientationen av det mikrotubulära nätverket mot antigen Kontakta webbplatsen är väsentliga för immun synaps bildas. Ombyggnad av aktin cytoskelettet i en tät perifera ring av F-aktin åtföljs av polarisering av mikrotubuli-organisera centrum mot immun synapsen. Mikrotubuli plus-end bindande proteiner, liksom kortikala plus-end fånga proteiner medla fysiska interaktioner mellan de aktin och mikrotubuli cytoskeletons, som tillåter dem att omorganiseras på ett samordnat sätt. Klarlägga mekanismerna att kontroll denna cytoskeletal omorganisation, samt förstå hur dessa cytoskeletal strukturer formar immun synaps bildas och BCR signalering, kan ge nya insikter i B-cellsaktivering. Detta har varit hjälpt av utvecklingen av super-resolution mikroskopi metoder som avslöjar nya Detaljer för cytoskeletal nätverk organisation. Här beskriver vi en metod för att använda stimulerad emission utarmning (STED) mikroskopi samtidigt bilden aktin strukturer, mikrotubuli och transfekterade GFP-märkta mikrotubulära plus-end bindande proteiner i B-celler. För att modellera de tidiga händelserna i immun synaps bildas, tillåter vi B-celler att sprida på coverslips belagd med anti immunglobulin (anti-Ig) antikroppar, som inleda BCR signalering och cytoskelettet remodeling. Vi tillhandahåller stegvisa protokoll för uttrycker GFP fusionsproteinerna i A20 B-lymfom celler, anti-Ig-inducerad cell spridning och för efterföljande cell fixering, immunfärgning, bild förvärv och image deconvolution steg. De högupplösta bilder som erhållits med dessa förfaranden tillåter en att samtidigt visualisera aktin strukturer, mikrotubuli och de mikrotubuli plus-end bindande proteiner som kan länka dessa två cytoskeletal nätverk.
Introduction
När B-celler binder till polariserade matriser av antigener (t.ex., visas på ytan av antigen-presenterande celler (APC)), den resulterande B-cells receptor (BCR) signalering enheter bildandet av en klassisk immun synaps struktur, som först beskrivs i T celler1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Inledningsvis, kontakta microclusters av antigen-bundna bindande företagsbestämmelser form vid periferin av B cell: APC webbplats. Dessa microclusters sedan gå mot mitten av antigen kontakta platsen, där de smälter samman till en central supramolekylär aktiveringen kluster (cSMAC) som utgör kärnan i immun synapsen. Immun synaps bildas optimerar BCR signalering och underlättar BCR-medierad antigen extraktion från APC membran14. Detta antigen förvärv, som följs av BCR-medierad antigen internalisering och efterföljande antigen bearbetning, tillåter B-celler att presentera peptid: MHC II komplex att T-celler och framkalla T cell hjälp14. Eftersom immunförsvaret synaps bildas främjar B cellaktivering, klarlägga mekanismerna som fastställer detta funktionella mönster av receptorn organisation kan ge nya är insikter i hur humoralt immunsvar initierat och reglerade.
Omorganisation av både aktin och mikrotubuli cytoskeletons är viktigt för immunsystemet synaps bildas. Lokaliserade BCR signalering stimuleras av ett rumsligt-polariserade utbud av antigener inducerar snabba och dramatiska remodeling av aktin cytoskelettet1,15. Bildandet av dendritiska aktin strukturer på peripheryen av cellen B utövar driftiga styrkor på plasmamembranet och främjar B cell spridning. Detta gör den B-cellen att skanna ett större område av antigen-uthärda ytbehandlar, och ökar antalet bindande företagsbestämmelser som binder antigen och aktivera BCR signalering vägar. Samtidigt är MTOC och det mikrotubulära nätverket omorienteras mot platsen för antigen kontakt. MTOC nalkas antigen Kontakta webbplatsen, mikrotubuli som härrör från MTOC sträcker sig längs inre ansiktet av plasmamembranet på gränssnittet mellan den B-cellen och de antigen-bärande yta16,17. Dessa juxtamembrane mikrotubuli kan sedan fungera som spår för dynein-medierad centripetal förflyttning av antigen-bundna BCR microclusters18, leder till bildandet av en cSMAC.
Den omorientering och polarisering av MTOC mot immun synapsen kräver intakt aktin och mikrotubuli cytoskeletons, och beror ofta på interaktioner mellan de kortikala aktin nätverk och mikrotubuli16,17, 19,20. Kortikala aktin-bindande proteiner, såsom IQGAP1, kan fånga mikrotubuli genom att interagera med proteinkomplex som pryder det mikrotubulära plus-avslutar21. Dessa dynamiska komplex av plus-end bindningsproteiner inkluderar EB1 och klipp-170, vilka benämns kollektivt som mikrotubulära plus-end spårning proteiner (+ TIPs)21,22. + TIPs på ändarna av mikrotubuli kan binda till proteiner som är associerade med plasmamembranet eller kortikal aktin cytoskelettet. Detta tillåter kraft genererar mekanismer (t.ex., minus-slutet riktad rörelse av cortically-förankrade dynein längs mikrotubuli) att utöva dragande krafter på mikrotubuli, och därmed flytta MTOC. KLIPP-170 kan binda till proteinet aktin-associerade byggnadsställningar IQGAP123, och vi har visat att båda dessa proteiner är nödvändiga för BCR-inducerad MTOC polarisering mot immun synaps17. IQGAP1-CLIP-170 interaktionen kan spela en viktig roll i samordningen av ombyggnaden av aktin cytoskelettet med ompositioneringen av det mikrotubulära nätverket på B-cellen immun synapsen.
Konventionella fluorescensmikroskopi har visat dramatiska omorganiseringen av de aktin och mikrotubuli cytoskeletons under B-cell immun synaps bildas2. Dock inte kan denna metod lösa små cellulära strukturer i detalj på grund av diffraktionsgränsen av ljus, som enligt Abbes lag, är beroende av våglängden på ljuset används för att belysa provet och bländare på objektiv24. Detta diffraktionsgränsen begränsar upplösningen av konventionella ljus Mikroskop till 200-300 nm i lateral riktning och 500-700 nm i axiell riktning25. Därför mindre subcellulära strukturer, samt fina detaljer av de aktin och mikrotubuli cytoskeletons, kunde endast observeras med hjälp av elektronmikroskopi. Elektronmikroskopi imaging i cytoskeleton är tidsödande, kräver hårda prov fixering och förberedelse protokoll som kan förändra biologiska strukturer och är begränsad till antikroppsmedierad upptäckt. Förmåga att immunostain och samtidigt bild flera proteiner eller cellulära strukturer är en betydande fördel med fluorescensmikroskopi. Dessutom uttrycker fluorescerande fusionsproteiner i celler kan realtid imaging och är användbart när effektiva antikroppar för immunfärgning proteinet av intresse inte är tillgängliga.
Senaste tekniska framsteg i super-resolution mikroskopi har övervunnit de diffraktion begränsningarna av ljus och tillåtna visualisering av nanoskala cellulära strukturer24. En sådan super-resolution mikroskopi teknik kallas stimulerad emission utarmning (STED) mikroskopi. STED sysselsätter två lasrar, där en laser retar fluorophore och en andra laser med en donut-formade mönster selektivt dämpar fluorescens utsläpp runt fluorophore. Detta minskar funktionen point-spread (skenbara area) på en enda fluorescerande partikel och ger en sub diffraktion gränsen fluorescerande bild25,26. Grundtillståndet utarmning mikroskopi sysselsätter också fluorescens-baserad teknik för att förvärva super-upplösning bilder. Dock de bild förvärv och återuppbyggnad är lång, det finns endast ett begränsat antal fluorophores som kan användas och den samtidiga högupplöst avbildning av flera cytoskeletal komponenter tekniskt utmanande eftersom att upprätthålla aktin och mikrotubuli strukturer kräver olika fixering förfaranden. Därför STED har flera fördelar jämfört med elektronmikroskopi och andra super-resolution mikroskopi närmar sig i att den erbjuder snabb bild förvärv, har minimal efterbearbetning krav och sysselsätter den samma fluorophores och färgningsteknik som används för konventionella fluorescensmikroskopi av fasta prover26.
Super-resolution mikroskopi har nu använts för att visualisera aktin strukturer på immun synapsen i natural killer (NK) celler och T celler26,27,28,29,30, 31. super-upplösning imaging av mikrotubuli cytoskelettet, samt samordnad omorganiseringen av de aktin och mikrotubuli cytoskeletons under immun synaps bildandet, har bara nyligen dock rapporterade17. Vi brukade bild B celler som hade tillåtits att sprida på coverslips belagd med anti immunglobulin (anti-Ig) antikroppar, som stimulerar BCR signalering och initiera cytoskelettet omorganisation STED mikroskopi. När pläterade på immobiliserade anti-Ig antikroppar, genomgå B-celler dramatiska aktin-beroende fördelning, som recapitulates inledande händelserna under immun synaps bildas. Ännu viktigare, visade STED mikroskopi fina detaljer av dendritiska ringen av F-aktin som former vid periferin av immunförsvaret synaps och visade att MTOC, liksom den mitotiska fäst vid den, hade flyttat nära antigen kontakta plats17. Dessa mikrotubuli utsträckta utåt mot perifer ringen av F-aktin. Dessutom flerfärgade STED avbildning av olika kombinationer av F-aktin, tubulin, IQGAP1, och GFP-märkta CLIP-170 + TIPs visade att mikrotubulära plus-avslutar präglas av CLIP-170-GFP var nära förknippad med den perifera aktin meshwork och med IQGAP1, en kortikala fånga protein17.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för imaging de aktin och mikrotubuli cytoskeletons på immun synapsen använder STED mikroskopi. Dessa metoder har optimerats med raden murina B cell A20, som allmänt har använts för att studera BCR signalering och immun synaps bildas17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. eftersom kommersiella antikroppar till klipp-170 inte fungerade bra för immunfärgning i tidigare experiment, beskriver vi i detalj uttrycket av GFP-märkta CLIP-170 i A20 celler, tillsammans med Färgprotokoll för att visualisera samtidigt upp till tre cytoskeletal komponenter eller cytoskelettet-associerade proteiner. Metoder för att använda STED mikroskopi till bild aktin på NK cell immun synapser har varit beskrivs tidigare40. Här, utvidga vi detta till flerfärgade super-upplösning bilder av både aktin och mikrotubuli cytoskeletons i B-celler.
En kritisk fråga för super-resolution mikroskopi använder lämpliga fixering förfaranden för att upprätthålla cellulära strukturer och att förebygga skador på fluorescerande proteiner. Fixering och färgning metoder som presenteras häri har optimerats för att behålla god Jordbrukarsed fluorescens och tillhandahålla högupplösta imaging av aktin- och mikrotubuli. När uttrycker fluorescerande proteiner, bör det noteras att B-celler är oftast svåra att transfect. Användning av detta protokoll, 20-50% av A20 celler vanligtvis uttrycker de transfekterade GFP-fusionsprotein, och bland denna population nivåerna av proteinuttryck är variabel. Ändå är super-upplösning imaging aktin och mikrotubuli använder de förfaranden som vi beskriver ganska robusta och högkvalitativa bilder erhålls lätt. Trots sin storlek i förhållande till A20 celler visar vi att dessa förfaranden kan också användas till bild det mikrotubulära nätverket i primära B-celler som kort har aktiverats med lipopolysackarid (LPS). Vi har visat att LPS-aktiverat primära B-celler kan vara transfekterade med siRNAs på relativt hög verkningsgrad (dvs.sådana att protein utarmning kan upptäckas av immunoblotting), vilket gör dem ett bra alternativ till användning av B cellinjer för vissa studier 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur förfaranden godkändes av University of British Columbia djur eftervård kommittén.
1. uttrycker GFP-fusion proteiner i A20 B-lymfom celler
- Kultur A20 celler i slutföra RPMI medium (RPMI-1640 kompletteras med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS), 50 µM 2-merkaptoetanol, 2 mM glutamin, 1 mM pyruvat, 50 U/mL penicillin och 50 µg/mL streptomycin) vid 37 ° C i en vävnadskultur inkubator med 5 % CO2.
- Förbereda transfection reagens (se Tabell för material) enligt tillverkarens anvisningar.
Obs: Detta protokoll har optimerats för de specifika reagenserna och transfection protokollet beskrivs i Tabell för material. Andra transfection reagenser som vi har provat har inte gett tillräcklig transfection effektivitet. - Räkna de celler som använder en hemocytometer. Centrifugera 2,5 x 106 A20 celler (för varje transfection) för 5 min vid 525 x g. resuspendera cellerna i 100 µL transfection reagens innehållande 1-2,5 µg av plasmid DNA. För DNA-kodning CLIP-170-GFP23, använda 2,5 µg per transfection. Blanda försiktigt.
- Överföra cellerna till en väl 6-well platta och justera volymen till 2 mL med pre värmde komplett RPMI medium. Odla cellerna för 18 h vid 37 ° C tillåter proteinuttryck.
2. isolera primära mus B celler och aktivera dem med LPS
- Använd steriliserad kirurgiska verktyg bort mjälten från en mus, efter protokoll godkänts av institutets djur eftervård kommittén.
- I vävnadsodling huven, placera en steril 70 µm cell SIL i en 35 mm vävnadsodling maträtt innehållande 3 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning rumstemperatur. Använd den gummidelen av kolven från en 5 ml spruta för att krossa mjälte genom cell Silen.
- Pipettera den enda cellsuspensionen av splenoctyes in i ett sterilt 15 mL rör och centrifugera vid 525 x g i 5 min.
- Använd en magnetisk pärla-baserade B cell isolering kit (se Tabell för material) för att få en höganrikat befolkning av B-celler.
- Att resuspendera cellerna B till 3 x 106/ml i komplett RPMI medium kompletteras med 2,5 µg/mL LPS plus 5 ng/mL B cell aktivering faktor (BAFF; en överlevnad cytokin).
- Odla cellerna för 6 tim vid 37 ° C.
3. beläggning glas Coverslips med Anti-Ig antikroppar
- Bered den antikropp för beläggning av coverslips. Späd stamlösningen av get-anti-mus Ig antikroppar i rumstemperatur steril fosfatbuffrad Koksaltlösning att göra en 12,5 µg/mL lösning. 400 µL antikropp lösning krävs för varje täckglas.
Använd Get antimus IgG för A20 celler; Använd Get antimus IgM för primära B-celler. Geten IgG antikroppar binder inte väl till mus Fc receptorer. Men för att undvika eventuella potentiella Fc receptor bindande, kan man använda F(ab) eller F(ab')2 fragment av antimus IgG eller IgM anti-mus-antikroppar. - Doppa en #1.5: a 18 mm runda täckglas i 100% metanol och låt dem torka (~ 10 min).
- Med pincett, placera det torkade täckglaset i en 12-väl vävnadsodling plattan och Pipettera 400 µL av 12,5 µg/mL antikroppar lösningen (5 µg totalt; 2 µg/cm2) på täckglaset så att det bildar en bubbla i mitten av täckglaset och sprider sig till kanterna.
- Var noga med att täcka det hela täckglaset, men låt inte antikropp lösningen att förlänga förbi kanten på täckglas och på vävnadsodling plast. Odla i rumstemperatur i 30 min.
- Tvätta coverslips genom pipettering 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning in den väl och därefter aspirera ut lösningen. Upprepa två gånger att ta bort obundna antikroppar.
- Tillsätt 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning till den brunn innehållande de antikroppsbelagda täckglaset tills cellerna är redo att läggas.
Obs: Coverslips kan förvaras vid rumstemperatur, täckt med PBS, för användning på samma dag.
4. B-Cell spridning på Anti-Ig-Coated Coverslips
- Förbereda modified HEPES-buffrad koksaltlösning (mHBS): 25 mM HEPES, pH 7,2, 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM Na2HPO4, 0,5 mM MgSO4, 1 mg/mL dextros, 2 mM glutamin, 1 mM natrium pyruvat, och 50 µM 2-merkaptoetanol). Filter sterilisera denna lösning och förvaras vid 4 ° C.
- På dagen för experimentet, göra 50 mL mHBS med 2% FBS (mHBS-FBS) genom att tillsätta 1 mL Värmeinaktiverade FBS till 50 mL mHBS. Varma mHBS-FBS till 37 ° C före användning.
- Centrifugera de transfekterade cellerna A20 eller de primära B-celler som hade varit odlade med BAFF plus LPS vid 525 x g i 5 min.
- Att resuspendera cellerna i 1 mL mHBS-FBS räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och späd cellerna till 2 x 105 celler/mL i mHBS-FBS.
- Med pincett, överför täckglaset från vävnadsodling plattan till en bit paraffin film.
- Tillsätt 250 µL av B-celler (5 x 104 celler) till varje täckglas.
- Inkubera i coverslips vid 37 ° C i 15 min i mörkret att tillåta B celler att sprida över anti-IgG-belagda ytan.
5. fastställande och immunfärgning cellerna
- Förbereda den fixering lösningen genom att späda ut 16% PARAFORMALDEHYD stamlösning och 50% glutaraldehyd stamlösning i rumstemperatur destillerat vatten för att ge slutliga koncentrationer av 3% PARAFORMALDEHYD och 0,1% glutaraldehyd. Bered den fixering på dagen är det användas och ta bort eventuellt överskott.
Varning: De PARAFORMALDEHYD och glutaraldehyd stamlösningar bör endast användas i kemiska dragskåp. Följ instruktionerna på den materiella varuinformationsblad (MSDS). - Förbereda permeabilisering/blockering bufferten (3% BSA och 0,1% Triton x-100 utspätt i PBS). Filter sterilisera denna lösning och förvaras vid 4 ° C. På dagen för experimentet, varma det erforderliga beloppet till rumstemperatur.
- Förbereda färgning bufferten (1% BSA och 0,1% saponin i PBS). Sterilisera denna lösning med ett 0,2 µm filter och förvaras vid 4 ° C. På dagen för experimentet, varma det erforderliga beloppet till rumstemperatur.
- Pipettera 350 µL av fixering lösningen på varje täckglas, att säkerställa att ytan är helt täckt. Odla i rumstemperatur i 10 min i mörker.
- Ta bort den fixering lösningen från täckglaset genom noggrant aspirera från kanten av den täckglas med hjälp av en micropipet.
FÖRSIKTIGHET: Fixering lösningen kasseras som farliga kemiska avfall. - Tvätta coverslips en gång med 500 µL av permeabilisering/blockerande buffert. Pipettera upp vätskan.
- Permeabilize och blockera cellerna genom att lägga till 250 µL av permeabilisering/blockerande buffert varje täckglas, och ruvar i ca 10 min i rumstemperatur i mörkret.
- Späd den kanin anti tubulin antikropp 1: 100 i färgning buffert.
- Aspirera off permeabilisering/blockering bufferten från coverslips och tillsätt 50 µL utspädda anti tubulin antikropp lösningen till varje täckglas. Odla i rumstemperatur i 30 min i mörker.
- Bered den sekundära antikroppar/aktin fläcken genom att späda ut både Alexa Fluor 532-konjugerad get-anti-kanin IgG sekundär antikropp och Alexa Fluor 568-konjugerad phalloidin 1: 100 i färgning buffert.
- Tvätta coverslips 3 gånger att ta bort överflödig primär antikropp genom att lägga till 500 µL av färgning buffert och sedan aspirera det.
- Tillsätt 50 µL av sekundär antikropp/aktin fläcken lösningen till varje täckglas och inkubera i 30 min i rumstemperatur i mörkret.
- Tvätta coverslips 3 gånger att ta bort överflödig sekundära antikroppar genom att lägga till 500 µL av färgning buffert och sedan aspirera det.
- Tillsätt 10 µL av montering reagens till ett objektglas. Montera täckglaset på objektglas med cell sida ner.
Obs: Ett ”anti fade” monteringsmedium (se Tabell för material) rekommenderas starkt att bevara fluorescensintensiteten hos GFP fusionsproteinerna. Undvika användning av montering reagenser som innehåller DAPI, som kan störa avbildning av fluorophores när du använder STED lasern. - Låt bilderna ska torka över natten i mörkret. Bild bilder nästa dag.
Obs: Imaging bilderna så snart täckglaset är torr rekommenderas starkt, som GFP fluorescensen minskar över tiden.
6. imaging använder mikroskopet STED
Obs: Observera att alla programvara stegen som beskrivs nedan är specifika för den Mikroskop och programvara som vi använde (se Tabell för material). Stegen och inställningar kommer att behöva justeras om imaging utförs med en annan Mikroskop/programvara.
- Slå på mikroskopet STED, Aktivera lasrar och epifluorescence belysning lampa och starta upp Mikroskop mjukvaran.
- Ställa in parametrar för STED utarmning lasrar.
Obs: Detta beror på specifika mikroskopet som används och lasrar som är utrustad med. Några rekommenderade inställningar är vitt ljus (WLL) 70%; 592 nm laser 80%; 660 nm laser 80%. - Aktivera STED inställningarna och justera laserlinjerna STED med målsättningen 100 X.
- Använda okularet, fokusera exemplet och markera en cell med måttlig god Jordbrukarsed uttryck.
Obs: Låg GFP uttryck syns inte eftersom STED minskar utsläpp intensiteten. Däremot inducerar hög uttryck för CLIP-170-GFP spontana bildandet av stora kluster, vilket inte återspeglar den normala mikrotubulära plus-end protein komplex morfologi och distribution. Att markera en cell med måttlig god Jordbrukarsed uttryck är viktigt för korrekt imaging cytoskeletal strukturer på webbplatsen antigen kontakt. - Zooma in på den markerade cellen och välj region för intresse att avbildas. Justera fokus så att x-y i B cellen som är närmast täckglaset är i fokus.
- Detta gör flytta målet successivt närmare täckglaset så att B-cell cytoskeletal strukturer kommer i fokus och sedan går ur fokus. Sedan flytta gradvis målet i motsatt riktning tills B-cell cytoskeletal strukturer kommer först tillbaka i fokus.
- Optimera inställningarna inklusive lasereffekt, excitation beam och detektor utbud. Börja med de inställningar som rekommenderas av tillverkarens anvisningar. Sedan göra justeringar som behövs för att optimera signalen för proverna. Bild alla prover ska jämföras med varandra med samma inställningar.
- Under fliken ”förvärva” av programvaran, inställt bild förvärv sekventiell ram förvärv i den nedersta vänstra ”sekventiella Scan” panelen genom att markera alternativet ”mellan ramar”.
- Ange sekvensen förvärv.
Obs: Vi förvärvar GFP fluorescensen först för att undvika nedbrytning av GFP signalen.
Beroende på kombinationen av fluorophores som används utöver god Jordbrukarsed, kan imaging längre våglängd fluorescens signalen först ge bättre resultat. Den ordning i vilken den fluorophores eller fluorescerande proteiner utsätts för stimulerad emission utarmning och avbildas bör dock optimeras för att få den starkaste fluorescens signaler och bästa upplösning. - Välj och ange STED laser makt för varje fluorophore under fliken ”skaffa” av programvaran, och Använd skjutreglaget för antingen den 592-nm eller 660-nm STED lasern för att justera lasereffekten. Justera kraften för 592-nm utarmning laser för god Jordbrukarsed och Alexa Fluor 532. Justera kraften för 660-nm utarmning laser för Alexa Fluor 568.
- För att öka upplösningen och minska bakgrund signal, gå till ”förvärv” inställningarna under fliken ”skaffa” av programvaran, öka den linje eller ram genomsnitt genom att välja ett värde större än 1 använda droppa-ned menyn för varje alternativ.
- Också, förvärva fluorescerande signalen med tid-gated STED genom att markera alternativet portande för fluorophore under fliken ”skaffa”, och ange värden för tid-gating (se not nedan). Öka STED laser kraften att förbättra resolutionen, även om detta kommer också att öka fotoblekning av fluorophores.
Obs: Usenets tiden behöver optimeras för Mikroskop, prov och fluorophores som används. En tid gating av 0,3 till 6 ns rekommenderas. Efter fixering är GFP särskilt känsliga för höga lasereffekt. För att minska fotoblekning av GFP, tid gating bör tillämpas och den STED lasereffekten bör minskas. - Att fånga 3D STED-bilder, Använd skjutreglaget för att ändra punkten sprider funktion (PSF) till ”3D STED”.
- Manuellt hämta flera bilder för att säkerställa reproducerbarhet. Deconvolve bilder (se figur 1) med en deconvolution programvara paketera41(se Tabell för material).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För B-celler spridning på immobiliserade anti-Ig, ger STED mikroskopi används tillsammans med deconvolution programvara högre upplösning bilder av cytoskeletal strukturer än konfokalmikroskopi. Detta är tydligt i figur 1, där F-aktin nätverket var visualiserat med hjälp av protokollet som beskrivs ovan. En jämförelse av confocal och STED super-upplösning bilder av samma prov visar att STED bilderna är av högre upplösning och avslöja mer detaljerade strukturer av aktin cellskelettet (figur 1). Denna figur visar också att deconvolution är viktigt för att få bilder av hög kvalitet STED i varav aktin filament definieras tydligare. Även om deconvolution confocal bilder ger en betydande förbättring i upplösning på bilden, ger deconvolved STED bilder mer detaljerad strukturell information än deconvolved confocal bilder. I synnerhet uppenbaras perifera F-aktin ringen dendritiska struktur i större detalj av STED mikroskopi (figur 1 och figur 2). Det mikrotubulära nätverket på antigen kontakta platsen fotograferades också använder provpreparering och protokoll som beskrivs ovan (figur 3). Mikrotubuli härstammar från en central punkt, som är MTOC, och utgår utåt mot periferin av cellen. I detta experiment tilläts B cellerna sprids på anti-Ig-coated coverslips för 15 min (figur 3), en tidpunkt som MTOC har rört sig mot antigen kontakta plats17. KLIPP-170-GFP kluster som markerar plus-ändarna av mikrotubuli kan ses i ändarna av de mikrotubuli som visas i figur 3. När provberedning och STED avbildning av det mikrotubulära nätverket är optimal, kontinuerlig och distinkta observeras mikrotubuli, med CLIP-170-GFP lokaliserade antingen längs mitotiska eller plus-ändar (figur 3A). Suboptimal mikrotubulära färgning, som observerades vid användning av lägre koncentrationer av färgning antikroppar eller partier av α-tubulin antikroppar som är mer än ett år gamla, resultat i mikrotubuli visas som diskontinuerligt sektioner som är dåligt lösta vid deconvolution (figur 3B; Se även figur 5 c). Trots alla klipp-170-GFP fluorescensen i dessa bilder är associerade med α-tubulin-immunostained strukturer, kan inte man skilja om CLIP-170-GFP ligger plus ändar, eller längs längden av mikrotubuli, på grund av ofullständig färgningen av mikrotubuli. Därför är det viktigt att α-tubulin antikroppen lagras enligt tillverkaren rekommenderade förvaringsförhållanden och används inom ett år.
Med hjälp av detta protokoll, flerfärgade STED bilder av hög kvalitet som visar organisation och struktur av aktin cytoskelettet och det mikrotubulära nätverket, samt proteiner som IQGAP1 och klipp-170 som förknippar med dessa två cytoskeletons17, kunde förvärvas. STED bilderna i figur 4 visar perifera ringen av dendritiska aktin, liksom mikrotubuli som utgår från en central plats i cellen där aktin färgningen är mycket mindre tät. KLIPP-170-GFP i ändarna av dessa mikrotubuli är nära förknippad med den perifera F-aktin. Detta protokoll tillåter en att visualisera cytoskeletal strukturer på immun synapsen med antingen enfärgad STED imaging (figur 2) eller multicolor STED imaging (figur 3 och figur 4). Det bör dock noteras att enfärgad STED imaging (figur 2) kan ge bättre upplösning av aktin strukturer och mikrotubuli i B-celler än flerfärgade STED (figur 4). Detta kan bero på fotoblekning orsakas av sekventiell STED bild förvärv för de olika fluorophores. För att få de bästa super-upplösning bilderna, kombinationen av fluorophores och fluorescerande proteiner valt, samt sekvensen där de är avbildade med excitation och utarmning lasrar, bör optimeras för provet. Ändå, flerfärgade STED imaging ger högre upplösning bilder av dessa cytoskeletal strukturer än konventionella konfokalmikroskopi. Enfärgad STED kan dessutom användas för att förvärva 3-dimensionell super-upplösning bilder av hela B-cell aktin eller mikrotubulära nätverket (film 1).
När du använder celler transfekterade med fluorescerande fusionsproteinerna, är uppnå optimala nivåer och undvika artefakter på grund av överuttryck betydande överväganden. I celler där klipp-170-GFP förekommer i ökad utsträckning, stora aggregat av CLIP-170-GFP bildas (figur 5A). Förutom denna mislocalization av CLIP-170-GFP var endast en del av det mikrotubulära nätverket i denna cell inom fokalplanet närmast täckglaset (figur 5B). Detta tyder på att klipp-170 överuttryck också kan försämra BCR-inducerad MTOC polarisering. Omvänt, eftersom stark fluorescens signaler krävs normalt för att förvärva STED bilder av hög kvalitet, lågt uttryck av fluorescerande fusionsproteinerna såsom klipp-170-GFP (figur 5 c) resulterar i bilder med dålig kvalitet. Därför, när du använder celler som har transfekterats med fluorescerande proteiner, det är viktigt att bilden endast i de cellerna med optimala nivåer av fusion proteinuttryck. Det är också viktigt att notera att transfection protokollet som användes för A20 celler (se Tabell för material) vanligtvis resulterar i 20-50% av de celler som uttrycker transfekterade proteinet. För plasmid DNA (i motsats till siRNAs), transfection frekvenser för primära B-celler är ofta mycket lägre än för A20 celler, som kräver användning av B cellinjer. Ändå, högkvalitativa STED bilder av cytoskeletal element i untransfected primära B-celler kan erhållas med hjälp av detta protokoll (figur 6).
Figur 1: jämförelse av confocal och STED avbildning av F-aktin. Confocal bilder (överst) och STED bilder (nederst) för en A20 cell som hade spridit sig på anti-IgG-coated coverslips för 15 min innan att vara målat med Alexa Fluor 532-konjugerad phalloidin. Samma cell använda confocal STED mikroskopet, och fotograferades först genom konfokalmikroskopi och sedan STED. De inledande confocal och STED bilder visas, tillsammans med samma confocal och STED bilder efter deconvolution. Skalstapeln: 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: aktin cytoskelettet på webbplatsen antigen kontakt. A20-celler som hade tillåtits att sprida på anti-IgG-coated coverslips för 15 min var fläckade av Alexa Fluor 568-konjugerad phalloidin och fotograferad av STED mikroskopi. Inledande STED bilderna var deconvolved. Paneler A-B och paneler C-E visar representativa bilder av två olika celler. Panelen E visar en 3 X förstoring av regionen i den vita rutan i panel C. Skalstapeln för paneler A-D: 5 µm. skalstapeln för panel E: 1 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: STED bilder av det mikrotubulära nätverket och klipp-170-GFP. A20-celler som uttrycker klipp-170-GFP tilläts sprids på anti-IgG-coated coverslips för 15 min innan fast och immunostained med en α-tubulin antikropp plus en sekundär Alexa Fluor 532-konjugerad antikropp. (A) representativ bild visar immunfärgning av det mikrotubulära nätverket, med CLIP-170-GFP ligger främst i plus-ändarna av mikrotubuli. (B) suboptimala färgning och upplösning av mikrotubuli på grund av användning av en föråldrad materiel av α-tubulin antikropp. Skala barer: 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: STED bilder av de aktin och mikrotubuli cytoskeletons. A20-celler som uttrycker klipp-170-GFP tilläts sprids på anti-IgG-coated coverslips för 15 min innan att fixeras och färgas med Alexa Fluor 568-konjugerad phalloidin att visualisera F-aktin och med en α-tubulin antikropp plus en Alexa Fluor 532-konjugerad sekundära antikroppar att visualisera mikrotubuli. Paneler A-D och paneler E-F visar representativa bilder av två olika celler. Panelen D är en 3,5 X förstoring av regionen i den vita rutan i panel C. Skala barer: 5 µm för paneler A-C och E-F; 1 µm för panel D. Bilden i panel A är samma bild används i figur 3A men inkluderar en överlagring av kanalen F-aktin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: exempel på dålig kvalitet STED bilder på grund av överuttryck eller otillräcklig uttryck av proteinet GFP fusion. A20-celler som uttrycker klipp-170-GFP tilläts sprids på anti-IgG-coated coverslips för 15 min innan att fixeras och färgas som i figur 4. (A, B) KLIPP-170-GFP överuttryck resulterar i stora, onormala mängder av CLIP-170-GFP (A) och nedsatt MTOC polarisering mot antigen kontakten webbplats (B). (C) kompensera för otillräcklig uttryck för CLIP-170-GFP genom att öka laser power resultaten i dålig kvalitet STED bilder. Skala barer: 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: STED bild av mikrotubuli cytoskelettet i primära B celler. Primära mjälten B-celler var odlade 6 h med 5 ng/µL BAFF plus 2,5 µg/mL LPS, och då tillåtet att sprida i 15 min på coverslips som hade varit belagd med anti-IgM antikroppar. Cellerna var sedan fixeras och färgas med en α-tubulin antikropp plus en sekundär Alexa Fluor 568-konjugerad antikropp att visualisera mikrotubuli. En representativ bild visas. Skalstapeln: 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Film 1: 3D rekonstruktion av det B cell mikrotubulära nätverket. A20 celler tilläts sprids på anti-IgG-coated coverslips för 15 min innan fast och immunostained med en α-tubulin antikropp plus en sekundär Alexa Fluor 488-konjugerad antikropp. Z-slices fångades på 0,2 µm steg storlekar för sammanlagt 37 ramar. 3D rekonstruktion utfördes med hjälp av mikroskopet STED bildhanteringsprogram. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detaljerade bilder av cytoskeletal strukturer kan erhållas med hjälp av STED super-resolution mikroskopi, som teoretiskt kan nå en lösning av 50 nm, jämfört med konventionella konfokalmikroskopi, där diffraktion begränsad upplösning är ~ 200 nm 24. förmåga att lösa finare strukturer förstärks ytterligare med hjälp av deconvolution programvara för att beräkna troligen positionen av ursprungliga ljuskällan från observerade ”suddig” fluorescens signalen. Det här protokollet beskriver metoder för att använda STED till bild den aktin och mikrotubuli cytoskeletons, samt cytoskelettet-associerade proteiner.
B-cellsaktivering inducerar omdaning av både aktin cytoskelettet och det mikrotubulära nätverket, med samordnad reglering av de två cytoskeletons som är viktig för immunförsvaret synaps bildas17,42. Den metod som vi presenterar har optimerats för samtidigt imaging de aktin och mikrotubuli cytoskeletons på webbplatsen antigen kontakt med flerfärgade STED, men är lika tillämplig för enfärgad STED. Tidigare studier har utförts på B-cell cytoskelettet höjdpunkten att STED kan ge nya insikter i hur cellulära strukturer är organiserade och hur de samverkar med varandra. Använda confocal och totala interna fluorescensmikroskopi (Frida), hade vi observerat att mikrotubuli kontakta ringen av F-aktin i periferin av antigen kontakta plats17. Använda STED mikroskopi, kunde vi visa att plus ändarna av mikrotubuli som präglades av den + TIP CLIP-170 associera noga med dendritiska aktin nätverket cell periferi (se figur 4).
Flera faktorer påverkar vilken bildteknik är lämpligast för en viss tillämpning. Dessa inkluderar den upplösning som krävs, strukturerna för att avbildas, märkning tekniken och dess signal-brus-förhållande (dvs, kontrast), förvärv tid, enkel provberedning och reproducerbarhet. Provberedning för STED är inte väsentligt annorlunda än för konfokalmikroskopi, och det kombinerar hög upplösning med snabb bild förvärv. En stor fördel med STED är att det är en optisk process där bilden förvärvas direkt från provet och upplösningen kan justeras genom att ändra strömmen av de STED laser24. Till skillnad från grundtillståndet utarmning super-resolution mikroskopi, som rekonstruerar bilder från tusentals successiva bild fångar, omfattande beräkningsmässig bearbetning krävs inte för STED och införandet av återuppbyggnad bildartefakter undviks 24. kontrasten i STED bilder är dock ofta låg24, i vilka fall efter bildbehandling med programvara såsom ImageJ kan behövas för att öka kontrasten. Detta är särskilt viktigt för bilder med täta strukturer, till exempel ett dendritiska aktin nätverk. För att förbättra bildens kontrast under bild förvärv, kan en minska utarmning laser makt eller tillämpa linje eller ram i genomsnitt. Tid-gated STED, som fångar fotoner efter en inställda tidsfördröjning, kan öka upplösningen genom att minska det område där fotoner är insamlade24,43. Vi rekommenderar att optimera STED bildtagning av cytoskeletal strukturer på immun synapsen genom en kombination av dessa metoder för att förbättra kontrast och upplösning.
För närvarande är inte alla fluorophores är optimala för imaging med STED, och inte alla fluorophore kombinationer är lämpliga för att erhålla flerfärgade STED bilder. Noggrann justering av upptäckt intervallen är viktiga för att garantera minimal genomlysningseffekten av fluorophores i intilliggande kanaler. Kombinationen av fluorophores som används i detta protokoll (dvs, GFP, Alexa Fluor 532 och Alexa Fluor 568) är optimal för multicolor STED super-upplösning imaging. Jämfört med strukturerade belysningen mikroskopi (SIM) och single-molekyl lokalisering metoder (SMLM), till exempel foto-aktiverat lokalisering mikroskopi (PALM), STED är inte vanligtvis perfekt för multi color imaging. Men vi visar här att liten över mättnad av fluorophore upptäckt, parat med enkel bildbehandling verktyg, kan leverera högupplösta flerfärgade bilder av de aktin och mikrotubuli cytoskeletons.
Detta protokoll för STED avbildning av cytoskeletal strukturer har avslöjat nya Detaljer för cytoskeletal arkitekturen på B-cellen immun synapsen. Även om vi optimerat detta protokoll för imaging de aktin och mikrotubuli cytoskeletons på webbplatsen antigen-kontakt i B-celler, bör dessa metoder vara tillämplig på andra celltyper, särskilt immunceller (T-celler, NK-celler, mastceller, etc.) som bildar immun synapser. Dessutom kan nyttan av detta protokoll utvidgas till beläggning av coverslips med andra ligander eller självhäftande substrat. Det är dock viktigt att optimera protokollet och förvärvet bildinställningarna för celltypen och experimentella set-up.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar UBC Life Sciences Institute (LSI) Imaging anläggningen för att stödja och upprätthålla mikroskopet STED. Detta arbete finansierades genom bidrag #68865 av kanadensiska institut för hälsa forskning (till M.R.G.). Vi tackar Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya University, Nagoya, Japan) för CLIP-170-GFP Plasmiden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| A20 mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamine | Millipore Sigma | G5763 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P5280 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid, 10,000 units |
| Additional materials for primary B cells | |||
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| Magnetic bead-based B cell isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep Mouse B cell Isolation kit |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS from E. coli 0111:B4 |
| B cell-activating factor (BAFF) | R&D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid encoding CLIP-170-GFP | Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
| Recommended transfection reagents and equipment | |||
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Falcon 6-well plates, TC treated, sterile | Corning | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating coverslips | |||
| 18-mm diameter round #1.5 cover glasses | Thomas Scientific | 1217N81 | Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580 |
| Forceps | Fisher Scientific | 1381242 | Dissecting extra fine splinter forceps |
| Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate | Corning | 353043 | |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | For A20 cells |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | For primary mouse B cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Paraformaldehyde (16% stock solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute with PBS to working concentration |
| Glutaraldehyde (50% stock solution) | Millipore Sigma | 340855 | Dilute with PBS to working concentration |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| Bovine serum albumin (BSA), Fraction V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| Rabbit anti-tubulin antibody | Abcam | ab52866 | 1:250 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 1:100 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1:100 dilution recommneded but should be optimized |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Without DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica | ||
| Huygens deconvolution software | Scientific Voume Imaging | See https://svi.nl/HuygensProducts |
References
- Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).
- Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
- Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
- Dustin, M. L. Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses. Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).
- Dustin, M. L. Modular design of immunological synapses and kinapses. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).
- Dustin, M. L. Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses. Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).
- Dustin, M. L. Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Monks, C. R., et al. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Yuseff, M. I., et al. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).
- Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).
- Kuhn, J. R., Poenie, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).
- Wang, J. C., et al. The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).
- Schnyder, T., et al. B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster. Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).
- Nath, S., et al. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).
- Combs, J., et al. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).
- Fukata, M., et al. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109 (7), 873-885 (2002).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
- Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).
- Tamarit, B., et al. Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells. J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).
- Brown, A. C., et al. Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins. Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).
- Dupre, L., et al. T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors. Front Immunol. 6, 586 (2015).
- Rak, G. D., et al. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
- Lin, K. B., et al. The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas. Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).
- Lin, K. B., et al. The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands. Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).
- McLeod, S. J., et al. The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes. J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).
- Christian, S. L., et al. Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation. J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Treanor, B., et al. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).
- Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
- Yuseff, M. -I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Russ, J. C. The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , CRC Press. (2011).
- Stinchcombe, J. C., et al. Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse. Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).
- Vicidomini, G., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).
