Summary
Apresentamos um protocolo para o uso de microscopia STED simultaneamente estruturas da imagem actina, microtúbulos e proteínas microtubule plus-final em células B que se espalharam em lamelas revestidas com anticorpos contra o receptor de células B, um modelo para a fase inicial de formação de sinapse imunológica.
Abstract
Células B que se ligam aos antígenos de membrana-limite (por exemplo, na superfície de uma célula apresentadora de antígeno) formam uma sinapse imunológica, uma estrutura celular especializada que otimiza a sinalização da B-pilha do receptor (BCR) e aquisição de antígeno BCR-mediada. A remodelação do citoesqueleto de actina e a reorientação da rede microtubule em direcção ao local de contato do antígeno são essenciais para a formação de sinapse imunológica. Remodelação do citoesqueleto de actina, em um anel periférico denso de F-Actina é acompanhada de polarização do centro em direção a sinapse imunológica microtubule-organizadora. Proteínas microtubule plus-final, bem como proteínas cortical plus-final captura mediam interações físicas entre o citoesqueleto de actina e microtúbulos, que lhes permite a ser reorganizado de forma coordenada. Elucidação dos mecanismos que controle Esta reorganização do citoesqueleto, bem como a compreensão de como essas estruturas do citoesqueleto forma formação sinapse imunológica e BCR sinalização, pode fornecer novos insights sobre a ativação de células B. Isto tem sido ajudado pelo desenvolvimento de abordagens de microscopia de super-resolução que revelam novos detalhes de organização da rede do citoesqueleto. Descrevemos aqui um método para usar microscopia de depleção (STED) emissão estimulada simultaneamente estruturas da imagem actina, microtúbulos e proteínas microtubule GFP-etiquetado transfectadas plus-final nas células B. Para modelar os eventos iniciais na formação de sinapse imunológica, podemos permitir que as células B espalhar em lamelas revestidas com anti-imunoglobulina (anti-Ig) anticorpos, que iniciam a remodelação do citoesqueleto e sinalização de BCR. Nós fornecemos protocolos passo a passo para expressar proteínas da fusão de GFP nas células A20 B-linfoma de célula anti Ig-induzida por espalhamento e para fixação da pilha subsequentes, imunocoloração, aquisição de imagem e imagem deconvolução etapas. As imagens de alta resolução obtidas usando estes procedimentos permitem visualizar simultaneamente estruturas de actina, os microtúbulos e as proteínas de ligação plus-final microtubule que podem unir essas duas redes do citoesqueleto.
Introduction
Quando as células B vincular a polarizada matrizes de antígenos (por exemplo, exibido na superfície do antígeno-apresentando células (APCs)), o resultante receptor de células B (BCR) sinalização drives a formação de uma estrutura clássica sinapse imunológica, que foi primeira descrita em T células1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Inicialmente, microclusters de antígeno-limite BCRs verbo na periferia da célula B: APC contato local. Estes microclusters, em seguida, mover em direção ao centro do site contato antígeno, onde se fundirem em um cluster de activação supramolecular central (cSMAC) que forma o núcleo da sinapse imunológica. Formação de sinapse imunológica otimiza BCR sinalização e facilita a extração de BCR-mediada do antígeno de membrana APC14. Esta aquisição do antígeno, que é seguida por internalização mediada por BCR antígeno e processamento do antígeno subsequentes, permite que as células B apresentar peptídeo: MHC complexos II para células T e obter ajuda de células T14. Porque a formação de imune sinapse promove a ativação de células B, elucidar os mecanismos que estabelecem que este padrão funcional da organização do receptor pode fornecer novos insights sobre como humorais respostas imunes são iniciadas e regulamentadas.
Reorganização do citoesqueleto de actina e microtúbulos é essencial para a formação de sinapse imunológica. BCR localizada sinalização estimulados por uma matriz espacialmente polarizado de antígenos induz rápida e dramática que remodela o citoesqueleto de actina1,15. A formação de estruturas dendríticas actina na periferia da célula B exerce forças empurra na membrana plasmática e promove a disseminação de células B. Isto permite que a célula B para fazer a varredura de uma área maior da superfície do antígeno-rolamento e aumenta o número de BCRs que ligam o antígeno e ativar BCR vias de sinalização. Ao mesmo tempo, o MTOC e a rede de microtúbulos são reorientados para o local de contato do antígeno. Como o MTOC aproxima-se o local de contato do antígeno, microtúbulos emana o MTOC se estendem ao longo da face interna da membrana plasmática na interface entre a célula B e a superfície do antígeno-rolamento16,17. Estes microtúbulos juxtamembrane podem então agir como faixas para o movimento centrípeto mediada por Dineína de antígeno-limite BCR microclusters18, levando à formação de um cSMAC.
A reorientação e a polarização do MTOC no sentido da sinapse imunológica requer actina intacta e citoesqueleto do microtúbulo e muitas vezes depende de interações entre o actin cortical rede e microtúbulos16,17, 19,20. Proteínas de ligação de actina corticais, como IQGAP1, podem capturar os microtúbulos interagindo com complexos de proteína que decoram o microtubule mais fins-de-21. Estes dinâmicos complexos de proteínas plus-final incluem EB1 e CLIP-170, que são coletivamente referidos como microtubule plus-final rastreamento proteínas (+ dicas)21,22. + Dicas nas extremidades dos microtúbulos podem ligar às proteínas que estão associadas com a membrana plasmática ou o citoesqueleto de actina cortical. Isso permite que os mecanismos de geração de força (por exemplo, o subtração-final dirigido movimento de Dineína corticalmente ancorada ao longo de microtúbulos) exercer forças de tração sobre os microtúbulos, e desse modo reposicionar o MTOC. CLIP-170 pode ligar à proteína associada a actina andaimes IQGAP123, e mostramos que ambos destas proteínas são necessários para a polarização induzida por BCR MTOC em direção a sinapse imunológica17. Essa interação IQGAP1-clipe-170 pode desempenhar um papel fundamental na coordenação a remodelação do citoesqueleto de actina com o reposicionamento da rede microtubule a sinapse imunológica célula B.
Microscopia de fluorescência convencional revelou a reorganização dramática do citoesqueleto de actina e microtúbulos durante a célula B sinapse imune formação2. No entanto, esta abordagem não pode resolver pequenas estruturas celulares em detalhe devido o limite de difração de luz, que, de acordo com a lei do Abbe, depende do comprimento de onda de luz que serve para iluminar a amostra e a abertura do objetiva24. Este limite de difração restringe a resolução dos microscópios de luz convencionais para 200-300 nm no sentido lateral e 500-700 nm na direção axial25. Portanto, menores estruturas subcelulares, bem como os detalhes do citoesqueleto de actina e microtúbulos, poderiam apenas ser observados usando microscopia eletrônica. Imagem de microscopia eletrônica do citoesqueleto é demorada, exige protocolos de fixação e preparação amostra dura que podem alterar estruturas biológicas e é limitado à detecção do anticorpo-negociada. A capacidade de delgados e simultaneamente várias proteínas de imagem ou estruturas celulares é uma vantagem substancial de microscopia de fluorescência. Além disso, expressar proteínas da fusão fluorescente em células permite a geração de imagens em tempo real e é útil quando não existem anticorpos eficazes para immunostaining da proteína de interesse.
Recentes avanços tecnológicos em microscopia de super-resolução superaram os limites de difração de luz e permitiu a visualização de estruturas celulares de nanoescala24. Uma tal técnica de microscopia de super-resolução chama-se microscopia de depleção (STED) emissão estimulada. STED emprega dois lasers, onde um laser excita o fluoróforo e um segundo laser com um padrão em forma de donut seletivamente suprime a emissão de fluorescência em torno do fluoróforo. Isto reduz a função de ponto-propagação (área aparente) de uma única partícula fluorescente e fornece um sub difração limite imagem fluorescente25,26. Microscopia de esgotamento do solo-estado também emprega técnicas baseadas em fluorescência para adquirir imagens de super-resolução. No entanto, os tempos de aquisição e reconstrução de imagem são longos, há apenas um número limitado de fluorophores que pode ser usado, e a imagem de alta resolução simultânea de vários componentes do citoesqueleto é tecnicamente desafiador porque manter estruturas de actina e microtúbulos requer procedimentos de fixação diferentes. Portanto, STED tem várias vantagens sobre microscopia eletrônica e outra microscopia de super-resolução se aproxima em que oferece aquisição de imagem rápida, tem requisitos mínimos de pós-processamento e emprega a mesma fluorophores e técnicas de coloração que são utilizados para microscopia de fluorescência convencional de amostras fixas26.
Microscopia de super-resolução agora tem sido utilizada para visualizar estruturas de actina na sinapse imunológica em assassino naturais (NK) células e T células26,,27,28,29,30, 31. no entanto, imagem de super-resolução de citoesqueleto do microtúbulo, bem como a reorganização coordenada do citoesqueleto de actina e microtúbulos durante a formação da sinapse imunológica, só foi recentemente relatado17. Nós costumávamos microscopia STED células de imagem B que tinham sido autorizadas a espalhar em lamelas revestidas com anti-imunoglobulina (anti-Ig) anticorpos que estimulam a BCR sinalização e iniciar a reorganização do citoesqueleto. Quando banhado em imobilizado anticorpos anti-Ig, células B submeter-se dramática dependente de actina se espalhando, que recapitula os eventos iniciais durante a formação da sinapse imunológica. Importante, microscopia STED revelou os detalhes do anel dendrítica de F-Actina que formulários na periferia de imune a sinapse e mostraram que o MTOC, bem como os microtúbulos ligados a ela, havia se mudado perto o antígeno contato local17. Estes microtúbulos estendido para fora para o anel periférico de F-Actina. Além disso, imagens de STED multi cor de várias combinações de F-Actina, tubulina, IQGAP1 e GFP-etiquetado CLIP-170 + dicas mostraram que microtubule mais fins-de-marcados pelo CLIP-170-GFP eram intimamente associados com a malha de actina periférica e com IQGAP1, um proteína de captura cortical17.
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o citoesqueleto de actina e microtúbulos na sinapse imune usando microscopia STED de imagem. Esses métodos foram otimizados usando a linha de murino B célula A20, que tem sido amplamente utilizada para estudar a sinalização BCR e sinapse imune formação17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. porque anticorpos comerciais para CLIP-170 não funcionou bem para immunostaining em experiências anteriores, descrevemos em detalhe a expressão de GFP-etiquetado CLIP-170 nas células A20, juntamente com protocolos para a visualização em simultâneo de até de coloração três componentes do citoesqueleto ou proteínas de citoesqueleto associadas. Métodos para usando microscopia STED actina imagem em sinapses imunes do NK células têm sido descritos anteriormente40. Aqui, podemos estender esta para aquisição de imagens de resolução super multi cor do citoesqueleto de actina e microtúbulos nas células B.
Uma consideração crítica para microscopia de super-resolução é usando os procedimentos de fixação adequadas para a manutenção de estruturas celulares e prevenção de danos às proteínas fluorescentes. A fixação e coloração métodos aqui apresentados foram otimizados para reter a fluorescência de GFP e fornecer imagens de alta resolução das redes de actina e microtúbulos. Quando expressar proteínas fluorescentes, deve notar-se que as células B são geralmente difíceis de transfect. Usando este protocolo, 20-50% de A20 células geralmente expressam a proteína de fusão de GFP transfectada, e entre esta população, os níveis de expressão da proteína são variáveis. Não obstante, imagem latente de super-resolução de actina e microtúbulos usando os procedimentos que descrevemos é bastante robusto e imagens de alta qualidade são facilmente obtidas. Apesar de seu tamanho pequeno em relação as células A20, mostramos que esses procedimentos também podem ser usados para a rede de microtúbulos na primárias células B que foram ativados brevemente com lipopolissacarídeo (LPS) de imagem. Temos demonstrado que as células B primárias LPS-ativado podem ser transfected com siRNAs com eficiência relativamente alta (ou seja, tal que a depleção de proteína pode ser detectada pelo immunoblotting), tornando-os uma boa alternativa para o uso de linhas de células B para alguns estudos 17.
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Protocol
Todos os procedimentos de animais foram aprovados pela Universidade de British Columbia Animal conta Comité.
1. expressar proteínas GFP-fusão células A20 B-linfoma
- Células de cultura A20 em completar meio RPMI (RPMI-1640 suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS), 50 µM 2-Mercaptoetanol, glutamina 2mm, piruvato de 1 mM, 50 penicilina U/mL e 50 µ g/mL Estreptomicina) a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos com 5 % CO2.
- Preparar o reagente de transfeccao (consulte a Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
Nota: Este protocolo foi otimizado para os reagentes específicos e protocolo do transfection descrito na Tabela de materiais. Outros reagentes de transfecção que tentamos não deram suficiente eficiência do transfection. - Conte as células usando um hemocytometer. Centrífuga de 2.5 x 106 A20 células (para cada transfeccao) durante 5 min à x 525 g. Ressuspender as células em 100 µ l de reagente de transfeccao contendo de 1 a 2,5 µ g do ADN do plasmídeo. Para DNA codificação CLIP-170-GFP23, use 2,5 µ g por transfecção. Misture suavemente.
- As células de transferência de um bem de uma placa de 6 e ajustar o volume de 2 mL com o meio RPMI pré-aquecido completo. Cultura de células para 18 h a 37 ° C, para permitir a expressão da proteína.
2. isolar células primárias do B e ativando-os com LPS
- Use esterilização de instrumentos cirúrgicos para remover o baço de um rato, seguindo o protocolo aprovado pelo Comitê de cuidado Animal da instituição.
- O capuz de cultura de tecidos, coloque um coador de pilha de estéril 70-µm em um prato de cultura de tecidos de 35mm contendo 3 mL de PBS estéril de temperatura. Use a parte de borracha do êmbolo de uma seringa de 5 ml para esmagar o baço através do filtro de célula.
- Pipetar a suspensão única célula de splenoctyes em um tubo estéril 15 mL e centrifugar 525 x g por 5 min.
- Uso um isolamento magnético baseado em grânulo de células B kit (veja a Tabela de materiais) para obter uma população altamente enriquecida de células B.
- Ressuspender as células B de 3 x 106/mL em meio RPMI completo suplementado com 2,5 µ g/mL LPS mais 5 ng/mL B célula ativando o fator (BAFF; uma citocina de sobrevivência).
- Cultura de células para hr 6 a 37 ° C.
3. revestimento as lamelas de vidro com anticorpos Anti-Ig
- Prepare a solução de anticorpo para revestir as lamelas. Diluir a solução-mãe de anticorpos Ig de cabra anti-mouse em PBS estéril de temperatura ambiente para fazer uma solução de 12,5 µ g/mL; 400 µ l de solução de anticorpo é necessária para cada lamela.
Nota: Use o cabra anti-mouse IgG para células A20; Use o cabra anti-mouse IgM para primário de células B. Anticorpos IgG cabra não se ligam bem a receptores de Fc de rato. No entanto, para evitar qualquer potencial ligação ao receptor Fc, um pode usar F(ab) ou F(ab')2 fragmentos do anti-mouse IgG ou anticorpos de IgM antirato. - Mergulhe uma lamela de vidro redondo-18mm #1.5 em metanol 100% e deixe secar completamente (~ 10 min).
- Usando a pinça, coloca a lamela seca para uma cultura de tecidos de 12 poços placa e pipetar 400 µ l da 12,5 µ g/mL anticorpo solução (5 µ g total; 2 µ g/cm2) no sentido da lamela para que forma uma bolha no centro da lamela e se espalha para as bordas.
- Tenha cuidado para cobrir a lamela toda, mas não permitem a solução de anticorpo para ultrapassar a borda da lamela de vidro e em plástico a cultura de tecidos. Incube a temperatura ambiente por 30 min.
- Lave as lamínulas por pipetagem 1 mL de PBS estéril para o bem e, posteriormente, aspirar a solução. Repita mais duas vezes para remover anticorpos não acoplados.
- Adicione 1 mL de PBS estéril para o bem que contém a lamela de anticorpo-revestido até células estão prontas para serem adicionados.
Nota: As lamelas podem ser mantidas em temperatura ambiente, coberta com PBS, para uso no mesmo dia.
4. as células B se espalhando em lamelas Anti-Ig-revestido
- Prepare-se modificado tampão HEPES salina (mHBS): 25mm HEPES, pH 7.2, 125 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1mm Na2HPO4, 0,5 mM de MgSO4, glicose de 1 mg/mL, glutamina 2mm, piruvato de sódio de 1 mM e 50 µM 2-Mercaptoetanol). Filtro de esterilizar esta solução e armazenar a 4 ° C.
- No dia do experimento, fazer 50 mL de mHBS com 2% FBS (mHBS-FBS), adicionando 1 mL de FBS inactivadas pelo calor para 50 mL mHBS. Aquecer as mHBS-FBS a 37 ° C antes do uso.
- Centrifugar as células A20 transfectadas ou as células B primárias que tinham sido cultivadas com BAFF além de LPS em 525 x g durante 5 min.
- Ressuspender as células em 1 mL de mHBS-FBS, contar as células usando um hemocytometer e diluir as células de 2 x 105 células/mL em mHBS-FBS.
- Usando fórceps, transferi a lamela da placa de cultura de tecido para um pedaço de filme de parafina.
- Adicione 250 µ l de células B (5 x 104 células) para cada lamela.
- Incube as lamelas a 37 ° C por 15 min no escuro para permitir que as células B espalhar sobre a superfície anti-IgG-revestido.
5. fixação e Immunostaining as células
- Prepare a solução de fixação diluindo a solução estoque de paraformaldeído 16% e a solução de reserva de 50% de glutaraldeído em água à temperatura água destilada para produzir concentrações finais de 3% paraformaldeído e 0,1% de glutaraldeído. Prepare a solução de fixação no dia é para ser usado e descartar qualquer excesso.
Atenção: As soluções estoque paraformaldeído e glutaraldeído só devem ser usadas em uma coifa de química. Siga as instruções na folha de dados de segurança material (MSDS). - Preparar o buffer de permeabilização/bloqueio (BSA 3% e 0,1% Triton X-100 diluído em PBS). Filtro de esterilizar esta solução e armazenar a 4 ° C. No dia do experimento, aquecer a quantidade necessária à temperatura ambiente.
- Prepare o buffer de coloração (1% BSA e 0,1% saponina em PBS). Esterilizar esta solução usando um filtro de 0,2 µm e armazenar a 4 ° C. No dia do experimento, aquecer a quantidade necessária à temperatura ambiente.
- Pipeta 350 µ l da solução de fixação no sentido cada lamela, garantindo que a superfície está completamente coberta. Incube a temperatura ambiente por 10 min no escuro.
- Remova a solução de fixação de lamela aspirando cuidadosamente da borda da lamela usando uma micropipetas.
Atenção: A solução de fixação deve ser eliminada como resíduos químicos perigosos. - Lave as lamínulas uma vez com 500 µ l de tampão de permeabilização/bloqueio. Pipetar o líquido.
- Permeabilize e bloquear as células adicionando 250 µ l de tampão de permeabilização/bloqueio para cada lamela, e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro.
- Dilua a 1: 100 do anticorpo antitubulina coelho de coloração, o tampão.
- Aspire o buffer permeabilização/bloqueio das lamelas e adicionar 50 µ l da solução diluída anticorpo antitubulina para cada lamela. Incube a temperatura ambiente por 30 min no escuro.
- Prepare a solução de mancha do anticorpo secundário/actina diluindo o anticorpo secundário da Alexa Fluor 532-conjugados cabra anti-coelho IgG e Alexa Fluor 568-conjugados faloidina 1: 100 de coloração, o tampão.
- Lave as lamelas 3 vezes para remover o excesso anticorpo primário adicionando 500 µ l de tampão de coloração e em seguida por aspiração.
- Adicionar 50 µ l de solução de mancha do anticorpo secundário/actina para cada lamela e incube por 30 min à temperatura ambiente no escuro.
- Lave as lamelas 3 vezes para remover o excesso anticorpo secundário adicionando 500 µ l de tampão de coloração e em seguida por aspiração.
- Adicione 10 µ l de reagente de montagem para uma lâmina de microscópio. Monte a lamela sobre a lâmina de microscópio com o lado da célula para baixo.
Nota: Um meio de montagem de "anti-fade" (ver Tabela de materiais) é altamente recomendável para preservar a intensidade da fluorescência das proteínas da fusão de GFP. Evite o uso de reagentes contendo DAPI, que pode interferir com a imagem do fluorophores quando usando o laser STED de montagem. - Permitir que os slides para secar durante a noite no escuro. Os slides da imagem no dia seguinte.
Nota: Os slides de imagem, tão logo a lamela é seca é altamente recomendável, como a fluorescência de GFP irá diminuir ao longo do tempo.
6. geração de imagens usando o microscópio STED
Nota: Por favor, note que todos os passos de software descritos abaixo são específicos para o microscópio e o software utilizados (consulte a Tabela de materiais). Os passos e configurações precisará ser ajustado se a imagem é executada usando um microscópio/software diferente.
- Ligue o microscópio STED, ativar o laser e a lâmpada de iluminação de epifluorescência e iniciar o software do microscópio.
- Defina os parâmetros para os lasers de depleção STED.
Nota: Isso vai depender o microscópio específico a ser usado e os lasers que é dotado. Algumas recomendadas configurações são a luz branca (WLL) 70%; 592 nm laser 80%; 660 nm laser 80%. - Activar as definições de STED e alinhar os raios de laser STED usando o objectivo X 100.
- Usando a ocular, concentrar a amostra e selecionar uma célula com expressão moderada de GFP.
Nota: A expressão baixa GFP não será visível porque STED reduz a intensidade de emissão. Por outro lado, alta expressão de CLIP-170-GFP induz a formação espontânea de grandes aglomerados, que não reflete o normal microtubule plus-final proteína complexa morfologia e distribuição. Selecionando uma célula com expressão moderada de GFP é essencial para imagens com precisão as estruturas do citoesqueleto no local de contato do antígeno. - Zoom em célula selecionada e escolha a região de interesse para ser fotografada. Ajuste o foco para que no plano x-y da célula B que está mais próximo da lamela está em foco.
- Para fazer isso, mova o objectivo progressivamente mais perto para a lamela para que as estruturas do citoesqueleto da célula B entram em foco e depois ir fora de foco. Então gradualmente mover o objetivo na direção oposta, até as estruturas do citoesqueleto da célula B primeiro voltar em foco.
- Otimize as configurações, incluindo o poder do laser, feixe de excitação e gama do detector. Iniciar com as configurações recomendadas pelo fabricante. Fazendo ajustes necessários para otimizar o sinal para as amostras. Todas as amostras para ser comparado com os outros com as mesmas configurações da imagem.
- Sob a aba "adquirir" do software, como a aquisição de imagem aquisição sequencial de quadro no painel do canto inferior esquerdo "Varredura sequencial" marcando a opção "entre quadros".
- Defina a sequência de aquisição.
Nota: Adquirimos a fluorescência de GFP primeiro para evitar a degradação do sinal de GFP.
Dependendo da combinação de fluorophores usados além de GFP, imagem do sinal de fluorescência de comprimento de onda mais primeiro pode produzir melhores resultados. No entanto, a ordem em que os fluorophores ou proteínas fluorescentes são sujeitos ao esgotamento de emissão estimulada e fotografadas deve ser otimizada para obter os sinais de fluorescência mais fortes e melhor resolução. - Selecionar e definir a potência do laser STED para cada fluoróforo sob a aba "Acquire" do software e use a barra deslizante para o 592-nm ou o laser STED 660 nm para ajustar a potência do laser. Ajuste a potência para o esgotamento de 592-nm laser para as boas práticas agrícolas e Alexa Fluor 532. Ajuste a potência do laser de 660 nm esgotamento para Alexa Fluor 568.
- Para aumentar a resolução e reduzir o sinal de fundo, vá para as configurações de "Aquisição" sob a aba "Acquire" do software, aumentar a linha e/ou quadro, em média, selecionando um valor maior que 1, usando o menu suspenso para cada opção.
- Também, adquirir o sinal fluorescente usando STED dependentes de tempo, verificando a opção associada para o fluoróforo sob a aba "Adquirir" e especificando valores para retenção de tempo (ver nota abaixo). Aumente a potência do laser STED para melhorar a resolução, embora isso também aumentará fotobranqueamento do fluorophores.
Nota: O tempo associado precisará ser otimizado para o microscópio, amostra e fluorophores sendo usado. Um tempo de retenção de 0,3 a 6 ns é recomendado. Após a fixação, a GFP é particularmente sensível ao poder do laser de alta. Para reduzir o fotobranqueamento de GFP, tempo de retenção deve ser aplicada e a potência do laser STED deve ser reduzida. - Para capturar imagens STED 3D, use o controle deslizante para alterar o ponto de espalhar função (PSF) para "STED 3D".
- Manualmente adquira várias imagens para garantir a reprodutibilidade. Deconvolve as imagens (ver Figura 1) usando um software de deconvolução pacote41(ver Tabela de materiais).
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Representative Results
Para as pilhas de B se espalhando em imobilizado anti-Ig, microscopia STED usada em conjunto com software de deconvolução fornece imagens de alta resolução de estruturas do citoesqueleto de microscopia confocal. Isto é evidente na Figura 1, onde a rede de F-Actina foi visualizada usando o protocolo descrito acima. Uma comparação de confocal e imagens de super-resolução STED da mesma amostra mostra que as imagens STED são de resolução mais alta e revelam mais detalhadas estruturas do citoesqueleto de actina (Figura 1). Esta figura mostra também que deconvolução é essencial para a obtenção de imagens de alta qualidade STED qual actina filamentos mais claramente definidos. Apesar de deconvolução de imagens confocal produz uma melhoria substancial na resolução da imagem, imagens STED deconvolved fornecem informações estruturais mais detalhadas do que deconvolved imagens confocal. Em particular, a estrutura dendrítica do anel periférico F-Actina é revelada em maior detalhe por microscopia STED (Figura 1 e Figura 2). A rede de microtúbulos no local de contato do antígeno também foi fotografada usando a preparação da amostra e imagem protocolo descrito acima (Figura 3). Os microtúbulos se originam de um ponto central, que é o MTOC, e emanam para fora em direção a periferia da célula. Neste experimento, as células B foram autorizadas a espalhar em lamelas anti-Ig-revestido por 15 min (Figura 3), um ponto de tempo no qual o MTOC mudou-se para o antígeno contato local17. CLIP-170-GFP aglomerados que marcam as plus-extremidades dos microtúbulos podem ser vistos nas extremidades dos microtubules mostrados na Figura 3. Quando a preparação da amostra e a imagem de STED da rede microtubule é ideal, contínua e distintas microtúbulos são observados, com CLIP-170-GFP localizada ao longo de microtúbulos ou nas extremidades-plus (Figura 3A). Microtubule sub-ótimo coloração, que foi observada quando usando concentrações de anticorpos ou lotes de α-tubulina os anticorpos que são mais de um anos de idade, resulta em microtúbulos aparecendo como seções descontínuas que são mal resolvidas de coloração em cima de deconvolução (Figura 3B; ver também Figura 5). Apesar de tudo da fluorescência nestas imagens CLIP-170-GFP é associado com estruturas de α-tubulina-immunostained, um não pode distinguir se o CLIP-170-GFP está localizado nas extremidades mais, ou ao longo do comprimento dos microtubules, devido a coloração incompleta dos microtúbulos. Portanto, é importante que o anticorpo de α-tubulina armazenados sob o fabricante recomendado condições de armazenamento e usado dentro de um ano.
Usando este protocolo, imagens de STED de multi cores de alta qualidade que mostram a organização e estrutura do citoesqueleto de actina e a rede de microtúbulos, bem como as proteínas tais como IQGAP1 e CLIP-170 que associar estas duas citoesqueleto17, pôde ser adquirido. As imagens STED na Figura 4 mostram o anel periférico de actina dendrítica, bem como os microtúbulos que emanam de uma localização central na célula onde a coloração da actina é muito menos densa. CLIP-170-GFP nas extremidades destes microtúbulos está intimamente associada com a F-Actina periférica. Este protocolo permite visualizar estruturas do citoesqueleto na sinapse imune usando STED cor única imagem (Figura 2) ou multicolor STED imagiologia (Figura 3 e Figura 4). No entanto, deve notar-se que a única cor STED geração de imagens (Figura 2) pode produzir resolução melhor das estruturas de actina e os microtúbulos nas células B que STED multi cor (Figura 4). Isto pode ser devido fotobranqueamento causado pela aquisição de imagens sequencial STED para o diferente fluorophores. Para obter as melhores imagens de super-resolução, a combinação de fluorophores e proteínas fluorescentes selecionadas, bem como a sequência em que eles são imagens usando os lasers da excitação e prostração, deve ser otimizada para a amostra. Não obstante, imagem latente de STED multi cor fornece imagens de alta resolução destas estruturas do citoesqueleto do que convencional microscopia confocal. Além disso, cor única STED pode ser usado para adquirir imagens de super-resolução 3-dimensional da rede de actina ou microtubule toda a célula B (filme 1).
Quando usar células transfectadas com proteínas da fusão fluorescente, alcançando níveis de expressão ideal e evitar artefatos devido à superexpressão são considerações importantes. Nas células onde CLIP-170-GFP é overexpressed, formam-se grandes agregados de CLIP-170-GFP (Figura 5A). Além deste mislocalization do CLIP-170-GFP, apenas parte da rede do microtubule nesta cela estava situado no plano focal mais próximo para a lamela (Figura 5B). Isto sugere que CLIP-170 superexpressão também pode afectar a polarização induzida por BCR MTOC. Por outro lado, porque os sinais de forte fluorescência são normalmente exigidos para a aquisição de imagens de alta qualidade STED, baixa expressão de proteínas da fusão fluorescente como CLIP-170-GFP (Figura 5) resulta em imagens de má qualidade. Daí, quando usando células que têm sido transfectadas com proteínas fluorescentes, é importante a imagem somente as células com ótimos níveis de expressão da proteína de fusão. Também é importante notar que o protocolo de transfeccao que foi usado para A20 células (ver Tabela de materiais) geralmente resulta em 20-50% das células expressando a proteína transfectada. Por plasmídeo (ao contrário de siRNAs), frequências de Transfeccao para primário de células B são frequentemente muito mais baixo do que para as células A20, exigindo o uso de linhas de células B. No entanto, imagens de alta qualidade STED de elementos do citoesqueleto na untransfected de células B primário podem ser obtidas usando esse protocolo (Figura 6).
Figura 1: comparação de confocal STED imagem de F-Actina e. Imagens confocal (topo) e imagens STED (inferior) de uma célula A20 que espalhou-se em lamelas anti-IgG-revestido por 15 min antes de ser manchada com Alexa Fluor 532-conjugados faloidina. Usando o microscópio confocal de STED, a mesma célula foi fotografada primeiramente por microscopia confocal e depois por STED. O inicial confocal e imagens STED são mostradas, juntamente com o mesmo confocal e imagens STED depois deconvolução. Barra de escala: 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O citoesqueleto de actina no local de contato do antígeno. Células A20 que tinham sido autorizadas a espalhar em lamelas anti-IgG-revestido por 15 min foram coradas com Alexa Fluor 568-conjugados faloidina e fotografadas por microscopia STED. As imagens STED iniciais foram deconvolved. Painéis A-B e painéis C-E mostram imagens representativas de duas células diferentes. Painel E mostra um alargamento de X 3 da região na caixa branca no painel C. Barra de escala para os painéis A-D: bar 5 µm. escala para painel E: 1 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagens STED da rede de microtúbulos e CLIP-170-GFP. Células A20 expressando GFP-CLIP-170 foram autorizadas a espalhar em lamelas anti-IgG-revestido por 15 min antes de ser fixado e immunostained com um anticorpo de α-tubulina além de um anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 532. (A) imagem representativa mostrando immunostaining da rede de microtúbulos, com CLIP-170-GFP, localizado principalmente nas extremidades-adição de microtúbulos. (B) coloração sub-ótimo e resolução de microtúbulos devido ao uso de um estoque desatualizado de anticorpo de α-tubulina. Barras de escala: 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: imagens STED do citoesqueleto de actina e microtúbulos. Células A20 expressando GFP-CLIP-170 foram autorizadas a espalhar em lamelas anti-IgG-revestido por 15 min antes de ser fixadas e coradas com Alexa Fluor 568-conjugados faloidina Visualizar F-Actina e com um anticorpo de α-tubulina mais uma Alexa Fluor 532-conjugados anticorpo secundário para visualizar os microtúbulos. Painéis A-D e painéis E-F mostram imagens representativas de duas células diferentes. Painel D é um alargamento X 3.5 da região na caixa branca no painel C. Barras de escala: 5 µm para painéis A-C e E-F; 1 µm para painel D. A imagem no painel A é a mesma imagem usada na Figura 3A , mas inclui a sobreposição do canal F-Actina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: exemplos de imagens de má qualidade STED devido à superexpressão ou insuficiente expressão da proteína de fusão do GFP. Células A20 expressando GFP-CLIP-170 foram autorizadas a se espalhar em lamelas anti-IgG-revestido por 15 min antes de ser fixo e manchado como na Figura 4. (A, B) Resultados do CLIP-170-GFP superexpressão em agregados grandes, anormais de CLIP-170-GFP (A) e prejudicada polarização MTOC para o contato do antígeno local (B). (C) compensando a expressão insuficiente de CLIP-170-GFP, aumentando os resultados de potência do laser em imagens de má qualidade STED. Barras de escala: 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: imagem STED do citoesqueleto microtúbulos nas células primárias de B. Pilhas de B splenic primárias foram cultivadas para 6 h com 5 ng / µ l BAFF plus 2,5 µ g/mL LPS e então autorizadas a espalhar-se por 15 min em lamelas que tinham sido revestidas com anticorpos anti-IgM. As células foram fixados e corados com um anticorpo de α-tubulina e um anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 568 Visualizar microtúbulos mais. É mostrada uma imagem representativa. Barra de escala: 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: reconstrução 3D da rede microtubule célula B. Células A20 foram autorizadas a se espalhar em lamelas anti-IgG-revestido por 15 min antes de ser fixado e immunostained com um anticorpo de α-tubulina além de um anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488. Z-fatias foram capturadas em 0,2 µm tamanhos de etapa para um total de 37 frames. Reconstrução 3D foi feita usar o microscópio STED é software de imagem. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Imagens detalhadas das estruturas do citoesqueleto podem ser obtidas usando microscopia de super-resolução STED, que teoricamente pode alcançar uma resolução de 50 nm, em comparação com microscopia confocal convencional, para os quais a resolução de difração limitada é ~ 200 nm 24. a capacidade de resolver estruturas mais finas é reforçada por usando deconvolução software para calcular a posição mais provável da fonte de luz original do sinal de fluorescência "turva" observados. Este protocolo descreve métodos para usar STED a imagem o citoesqueleto de actina e microtúbulos, bem como proteínas de citoesqueleto associadas.
Ativação de células b induz a remodelação de ambos o citoesqueleto de actina e a rede de microtúbulos, com a regulação coordenada do dois citoesqueleto sendo importante para a formação de sinapse imunológica17,42. O método que apresentamos foi otimizado para imagens simultaneamente o citoesqueleto de actina e microtúbulos no local de contato do antígeno usando multi cor STED, mas é igualmente aplicável para STED cor única. Estudos anteriores que foi realizado sobre o destaque do citoesqueleto de células B que STED pode fornecer novos insights sobre estruturas celulares como estão organizados e como eles interagem uns com os outros. Utilizando microscopia confocal e total interno da fluorescência (TIRF), tinha-se observado que os microtúbulos entre em contato com o anel de F-Actina na periferia do antígeno contato local17. Usando microscopia STED, fomos capazes de mostrar que as extremidades mais de microtúbulos que foram marcados pelo + TIP CLIP-170 associar-se intimamente com a rede de actina dendríticas na periferia da célula (veja Figura 4).
Vários fatores influenciam a qual técnica de imagem é mais adequada para a aplicação específica. Estes incluem a resolução necessária, as estruturas para ser fotografada, a técnica de rotulagem e sua relação sinal-ruído (ou seja, contraste), tempo de aquisição, facilidade de preparação da amostra e reprodutibilidade. Preparação da amostra para STED não é significativamente diferente do que para a microscopia confocal, e combina alta resolução com aquisição de imagem rápida. Uma grande vantagem do STED é que é um processo óptico em que a imagem diretamente é adquirida a partir da amostra e a resolução pode ser ajustada alterando-se o poder do laser STED24. Ao contrário de microscopia de super-resolução de depleção estado fundamental, que reconstrói imagens de milhares de imagem sucessiva captura, extenso processamento computacional não é necessário para STED e evita-se a introdução de artefatos de reconstrução de imagem 24. no entanto, o contraste nas imagens STED é frequentemente baixo24, no qual caso processamento de pós-imagem usando software como o ImageJ pode ser necessária para realçar o contraste. Isto é particularmente importante para imagens com estruturas densas, como uma rede de actina dendríticas. Para melhorar o contraste da imagem durante a aquisição de imagens, um pode reduzir a potência do laser de esgotamento e/ou aplicar a linha ou o quadro em média. Tempo-dependentes STED, que capta os fótons após um atraso de tempo do usuário-definido, pode aumentar a resolução, diminuindo a área da qual os fótons são coletados24,43. Recomendamos otimizando a imagem STED de estruturas do citoesqueleto na sinapse imunológica por meio de uma combinação desses métodos para melhorar o contraste e resolução.
Atualmente, fluorophores nem todas são ideais para a imagem latente com STED, e nem todas as combinações de fluoróforo são adequadas para a obtenção de imagens STED multi cores. Ajuste cuidadoso dos intervalos de deteção é importante para garantir a infiltração mínima de fluorophores em canais adjacentes. A combinação de fluorophores utilizados neste protocolo (ou seja, as boas práticas agrícolas, Alexa Fluor 532 e Alexa Fluor 568) é ideal para a imagem latente de super-resolução STED multicolor. Em comparação com microscopia de iluminação estruturada (SIM) e métodos de localização de único-molécula (SMLM), tais como a microscopia de Localização foto-ativado (PALM), STED não é tipicamente ideal para geração de imagens de várias cor. No entanto, aqui mostramos essa saturação ligeira excesso de detecção de fluoróforo, emparelhado com simples ferramentas de processamento de imagem, pode entregar imagens de alta resolução de cores multi do citoesqueleto de actina e microtúbulos.
Este protocolo para a imagem latente de STED das estruturas do citoesqueleto revelou novos detalhes da arquitetura do citoesqueleto na célula B sinapse imunológica. Embora nós aperfeiçoamos o presente protocolo para o citoesqueleto de actina e microtúbulos no local em células B antígeno-contato de imagem, estes métodos devem ser aplicáveis a outros tipos de células, especialmente células imunes (linfócitos T, células NK, mastócitos, etc.) que formam sinapses imunes. Além disso, o utilitário do presente protocolo poderia ser estendido para revestimento de lamelas com outros ligantes ou substratos adesivos. No entanto, é importante otimizar o protocolo e as configurações de aquisição de imagem para o tipo de célula e a montagem experimental.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o Instituto de ciências biomédicas da UBC (LSI) Imaging Facility para apoiar e manter o microscópio STED. Este trabalho foi financiado por grant #68865 dos institutos canadenses de pesquisa em saúde (M.R.G.). Agradecemos o Dr. Kozo Kaibuchi (Universidade de Nagoya, Nagoya, Japão) para o plasmídeo CLIP-170-GFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| A20 mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamine | Millipore Sigma | G5763 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P5280 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid, 10,000 units |
| Additional materials for primary B cells | |||
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| Magnetic bead-based B cell isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep Mouse B cell Isolation kit |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS from E. coli 0111:B4 |
| B cell-activating factor (BAFF) | R&D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid encoding CLIP-170-GFP | Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
| Recommended transfection reagents and equipment | |||
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Falcon 6-well plates, TC treated, sterile | Corning | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating coverslips | |||
| 18-mm diameter round #1.5 cover glasses | Thomas Scientific | 1217N81 | Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580 |
| Forceps | Fisher Scientific | 1381242 | Dissecting extra fine splinter forceps |
| Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate | Corning | 353043 | |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | For A20 cells |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | For primary mouse B cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Paraformaldehyde (16% stock solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute with PBS to working concentration |
| Glutaraldehyde (50% stock solution) | Millipore Sigma | 340855 | Dilute with PBS to working concentration |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| Bovine serum albumin (BSA), Fraction V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| Rabbit anti-tubulin antibody | Abcam | ab52866 | 1:250 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 1:100 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1:100 dilution recommneded but should be optimized |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Without DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica | ||
| Huygens deconvolution software | Scientific Voume Imaging | See https://svi.nl/HuygensProducts |
References
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