Summary
Presenteren we een protocol voor het gebruik van STED microscopie gelijktijdig afbeelding actine structuren, microtubuli en microtubulus plus-end bindende proteïnen in B-cellen die zich hebben verspreid op coverslips bekleed met antilichamen aan de B-cel receptor, een model voor de eerste fase van immuun synapse formatie.
Abstract
B-cellen die zich aan antigenen van de membraan-gebonden (bijvoorbeeldop het oppervlak van een antigeen-presenteren cel binden) vormen een immuun SYNAPS, een gespecialiseerde cellulaire structuur die B-cel receptor (BHG) signalering optimaliseert en BCR-gemedieerde antigeen acquisitie. Zowel de verbouwing van het cytoskelet actine en de heroriëntatie van de microtubuli-netwerk naar de contact site van antigeen zijn essentieel voor immuun synapse formatie. Verbouwing van het cytoskelet van actine in een dichte perifere ring van F-actine gaat gepaard met de polarisatie van het center microtubulus-organiseren naar de immuun synaps. Microtubulus plus-end bindende proteïnen, evenals corticale plus-einde opname eiwitten bemiddelen fysieke interactie tussen de actine en microtubulus cytoskeletons, waarmee ze op een gecoördineerde wijze worden gereorganiseerd. Het ophelderen van de mechanismen die dat besturingselement deze cytoskeletal reorganisatie, alsmede inzicht in hoe deze cytoskeletal structuren vorm immuun synapse formatie en het BHG signalering, nieuwe inzichten in de B-cel-activatie kan leveren. Dit heeft geholpen door de ontwikkeling van super resolutie microscopie benaderingen die nieuwe details van cytoskeletal netwerkorganisatie onthullen. Hier beschrijven we een methode voor het gebruik van gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie gelijktijdig afbeelding actine structuren, microtubuli en transfected GFP-gelabeld microtubulus plus-end bindende proteïnen in B cellen. Om het model van de vroege gebeurtenissen in immuun synaps formatie, toestaan we dat B-cellen te verspreiden op coverslips bekleed met anti-immunoglobuline (anti-Ig) antistoffen, die BHG signalering en cytoskelet remodeling initiëren. Wij bieden stapsgewijze protocollen voor het uitdrukken van GFP fusion proteïnen in cellen van de A20-B-lymfoom, voor het verspreiden van anti-Ig-geïnduceerde cel, en voor de daaropvolgende cel fixatie, immunokleuring Beeldacquisitie en afbeelding deconvolutie stappen. De hoge resolutie beelden verkregen met behulp van deze procedures kunnen men gelijktijdig visualiseren actine structuren, microtubuli, en de microtubulus plus-end bindende proteïnen die deze twee cytoskeletal netwerken kunnen koppelen.
Introduction
Wanneer B cellen binden aan gepolariseerde arrays van antigenen (bijvoorbeeldweergegeven op het oppervlak van het antigeen-presenteren cellen (APCs)), de resulterende B-cel receptor (BHG) signalering stations de vorming van een klassieke immuun synapse structuur die werd voor het eerst beschreven in T cellen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Aanvankelijk, microclusters van antigeen-gebonden vorm van de BCRs aan de rand van de B-cel: APC contact site. Deze microclusters wordt vervolgens verplaatst naar het midden van de antigeen contact site, waar ze in een centrale supramoleculaire activering cluster (cSMAC samensmelten) de kern van de immuun SYNAPS vormt. Immuun synapse formatie optimaliseert BHG signalering en faciliteert het BCR-gemedieerde antigeen extractie van de APC membraan14. Deze overname van antigeen, die wordt gevolgd door antigeen BCR-gemedieerde internalisering en latere antigeen processing, kunt B cellen te presenteren peptide: MHC II complexen naar T-cellen en T-cel help14uitlokken. Omdat immuun synapse formatie B cel activatie bevordert, ophelderen van de mechanismen die stellen dat dit functionele patroon van receptor organisatie kan bieden nieuwe zijn inzichten in hoe humorale immuunreacties gestart en wordt geregeld.
Reorganisatie van zowel de actine en microtubulus cytoskeletons is essentieel voor immuun synapse formatie. Gelokaliseerde BHG signalering gestimuleerd door een ruimtelijk-gepolariseerde scala aan antigenen induceert snelle en dramatische remodelleren van de actine cytoskelet1,15. De vorming van dendritische actine structuren aan de rand van de B-cel oefent duwen krachten op het plasma-membraan en bevordert de verspreiding van de B-cel. Dit maakt de B-cel voor het scannen van een grotere ruimte van de antigeen-steunvlak, en verhoogt het aantal BCRs dat antigeen te binden en te activeren BHG signalering trajecten. Op hetzelfde moment zijn de MTOC en het netwerk van microtubuli omgebogen naar de site van antigeen contact. Als de MTOC de contact site van antigeen nadert, uitbreiden microtubuli die afkomstig zijn van de MTOC langs de binnenzijde van het plasma-membraan op het raakvlak tussen de B-cel en de antigeen-dragende oppervlak16,17 Deze juxtamembrane microtubuli kunnen vervolgens fungeren als tracks voor de dynein-gemedieerde centripetale beweging van antigeen-gebonden BHG microclusters18, wat leidt tot de vorming van een cSMAC.
De heroriëntatie en polarisatie van de MTOC naar de immuun SYNAPS vereist intact actine en microtubulus cytoskeletons en hangt vaak af van interacties tussen de corticale actine netwerk en microtubuli16,17, 19,20. Corticale actine-bindende eiwitten, zoals IQGAP1, kunnen het vangen van microtubuli door interactie met eiwitcomplexen dat de microtubulus plus-ends21 versieren. Deze dynamische complexen van plus-end bindende proteïnen bevatten EB1 en CLIP-170, die gezamenlijk worden aangeduid als microtubulus plus-einde bijhouden van eiwitten (+ TIPs)21,22. + TIPs aan de uiteinden van de microtubuli kunnen binden aan eiwitten die gekoppeld aan het plasma-membraan of de corticale actine cytoskelet zijn. Hierdoor treden genererende mechanismen (bijvoorbeeldhet min-uiteinde gericht verkeer van dynein cortically-verankerd langs de microtubuli) te oefenen trekken krachten op de microtubuli, en daarmee de MTOC verplaatsen. CLIP-170 kan binden aan de steigers actine-geassocieerde proteïne IQGAP123, en we hebben aangetoond dat zowel van deze proteïnen vereist voor het BCR-geïnduceerde MTOC polarisatie richting de immuun synapse17 zijn. Deze IQGAP1-CLIP-170 interactie kan een belangrijke rol bij de coördinatie van de verbouwing van het cytoskelet actine met de herpositionering van het netwerk van microtubuli in de B-cel immuun synaps.
Conventionele fluorescentie microscopie is gebleken dat de dramatische reorganisatie van de actine en microtubulus cytoskeletons tijdens de B-cel immuun synapse formatie2. Echter, deze aanpak niet het oplossen van kleine cellulaire structuren in detail toe te schrijven aan de limiet van de diffractie van licht, die, volgens Abbe de wet, afhankelijk van de golflengte van licht bestemd is tot verlichting van het monster en de opening van de objectieve24. Deze limiet diffractie Hiermee beperkt u de resolutie van conventionele lichte microscopen 200-300 nm in de laterale richting te 500-700 nm in de axiale richting25. Daarom, kleinere subcellular structuren, evenals de fijne details van de actine en microtubulus-cytoskeletons, kunnen alleen worden waargenomen met behulp van elektronenmicroscopie. Elektronenmicroscopie beeldvorming van het cytoskelet is tijdrovend, harde monster fixatie en voorbereiding protocollen die biologische structuren kunnen veranderen, en is beperkt tot de antilichaam-gemedieerde detectie vereist. Het vermogen om immunokleuring en gelijktijdig afbeelding meerdere eiwitten of cellulaire structuren is een aanzienlijk voordeel van fluorescentie microscopie. Anderzijds uiting van fluorescerende fusion eiwitten in cellen kunt real-time imaging en is nuttig wanneer daadwerkelijke antilichamen voor immunokleuring de proteïne van belang niet beschikbaar zijn.
Recente technologische vooruitgang in super resolutie microscopie overwinnen van de grenzen van de diffractie van licht en de visualisatie van nanoschaal cellulaire structuren24toegestaan. Een dergelijke super resolutie microscopie techniek heet gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie. STED maakt gebruik van twee lasers, waar een laser prikkelt de fluorophore en een tweede laser met een donut-vormige patroon selectief onderdrukt de fluorescentie emissie rond de fluorophore. Dit vermindert de punt-spread-functie (schijnbare gebied) van een één fluorescerende deeltje en zorgt voor een sub diffractie limiet fluorescerende afbeelding25,26. Grondtoestand uitputting microscopie hanteert ook fluorescentie gebaseerde technieken te verwerven Super resolutiebeelden. De afbeelding verwerving en wederopbouw tijden zijn lang, er zijn echter slechts een beperkt aantal fluorophores die kunnen worden gebruikt, en de gelijktijdige high-resolution beeldvorming van meerdere cytoskeletal onderdelen is technisch uitdagend omdat handhaving actine en microtubulus structuren vereist verschillende fixatie procedures. Daarom STED heeft meerdere voordelen ten opzichte van elektronenmicroscopie en andere super resolutie microscopie nadert dat het biedt snelle Beeldacquisitie post-processing minimumvereisten heeft en maakt gebruik van de dezelfde fluorophores en kleuring technieken die worden gebruikt voor conventionele fluorescentie microscopie van vaste monsters26.
Nu al super resolutie microscopie hanteert voor het visualiseren van actine structuren in de immuun SYNAPS in natural killer (NK) cellen en T cellen26,27,28,29,30, 31. echter super resolutie beeldvorming van het cytoskelet van de microtubuli, alsmede de gecoördineerde reorganisatie van de actine en microtubulus cytoskeletons tijdens immuun synaps formatie, is slechts onlangs gemelde17. Wij STED microscopie gewend in afbeelding B-cellen die verspreid over coverslips bekleed met anti-immunoglobuline (anti-Ig) antilichamen, die stimuleren BHG signalering en initiëren cytoskelet reorganisatie had gekregen. Bij het uitplaten op geïmmobiliseerdet anti-Ig antilichamen, ondergaan B-cellen dramatische actine-afhankelijke verspreiden, die de eerste gebeurtenissen recapituleert tijdens immuun synapse formatie. Bovenal bleek STED microscopie de fijne details van de dendritische ring van F-actine die vormen aan de rand van het immuunsysteem synapsen en toonde aan dat de MTOC, evenals de microtubuli die eraan verbonden zijn, dicht bij de antigeen contact site17was verhuisd. Deze microtubuli uitgebreid naar buiten naar de perifere ring van F-actine. Bovendien Multi-Color STED beeldvorming van verschillende combinaties van F-actine, tubuline, IQGAP1, en GFP-gelabeld CLIP-170 + TIPs toonden dat microtubulus plus-ends gekenmerkt door CLIP-170-GFP nauw verbonden met de perifere actine gevlochten en met IQGAP1, een corticale opname eiwitten17.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor imaging-de actine en microtubulus cytoskeletons in de immuun Synaps met behulp van microscopie STED. Deze methoden zijn geoptimaliseerd met behulp van de A20 lymfkliertest B-cel-lijn, die veel heeft gewerkt voor de studie BHG signalering en immuun synapse formatie17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. omdat commerciële antilichamen tegen CLIP-170 niet goed voor immunokleuring in eerdere experimenten werkte, we beschrijven in detail de uitdrukking van GFP-gelabeld CLIP-170 op de A20 cellen, samen met de protocollen voor het visualiseren van gelijktijdig maximaal kleuring drie cytoskeletal componenten of cytoskelet-geassocieerde eiwitten. Methoden voor het gebruik van STED microscopie naar afbeelding actine op NK-cel immuun synapsen zijn40eerder is beschreven. Hier, breiden we dit aan het verwerven van Multi-Color Super resolutiebeelden van zowel de actine en microtubulus cytoskeletons in B cellen.
Een belangrijke overweging voor super-resolutie microscopie is met behulp van de juiste fixatie-procedures voor het onderhouden van cellulaire structuren en voorkomen van schade aan fluorescerende eiwitten. De fixatie en kleuring van de hier vermelde methoden zijn geoptimaliseerd om te behouden GFP fluorescentie en hoge resolutie beeldvorming van de actine- en microtubulus-netwerken. Wanneer het uiten van fluorescente proteïnen, opgemerkt moet worden dat B-cellen meestal moeilijk zijn te transfect. Met behulp van dit protocol, 20-50% van de A20 express cellen meestal de transfected GFP fusieproteïne, en onder deze populatie de hoeveelheid eiwit expressie variabel. Niettemin, super resolutie beeldvorming van actine en microtubuli met behulp van de procedures die we beschrijven is heel robuust en afbeeldingen van hoge kwaliteit zijn gemakkelijk verkregen. Ondanks hun kleine formaat ten opzichte van de A20 cellen, laten we zien dat deze procedures kunnen ook worden gebruikt om het imago van het netwerk van microtubuli in primaire B-cellen die kort zijn geactiveerd met lipopolysaccharide (LPS). We hebben aangetoond dat de LPS-geactiveerde primaire B cellen kunnen zijn transfected met siRNAs op relatief hoge rendement (dat wil zeggen, zodanig dat eiwit uitputting kan worden gedetecteerd door immunoblotting), waardoor ze een goed alternatief voor het gebruik van B cellijnen voor sommige studies 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van British Columbia Animal Care Comité.
1. uiten van GFP-fusion proteïnen in cellen van de A20-B-lymfoom
- Cultuur A20 cellen in volledige RPMI medium (RPMI-1640 aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS), 50 µM 2-mercaptoethanol, 2 mM glutamine, 1 mM pyruvaat, 50 U/mL penicilline en 50 µg Mo/mL streptomycine) bij 37 ° C in een broedstoof weefselkweek met 5 % CO2.
- Voorbereiden van de transfectiereagens (Zie de Tabel van materialen) volgens instructies van de fabrikant.
Opmerking: Dit protocol is geoptimaliseerd voor de specifieke reagentia en transfectie protocol beschreven de Tabel van materialen. Andere transfectie reagentia die we hebben geprobeerd hebben geen voldoende transfectie efficiëntie opgeleverd. - Met behulp van een hemocytometer cellen tellen. Cellen in een centrifuge 2.5 x 10-6 A20 (voor elke transfectie) voor 5 min op 525 x g. resuspendeer de cellen in 100 µL van transfectiereagens met 1-2,5 µg plasmide DNA. Gebruik voor DNA codering CLIP-170-GFP23, 2,5 µg per transfectie. Meng voorzichtig.
- De cellen overbrengen in een putje van de plaat van een 6-well, en pas het volume aan 2 mL met voorverwarmde volledige RPMI medium. Cultuur van de cellen gedurende 18 uur bij 37 ° C eiwit expressie mogelijk te maken.
2. primaire muisknop B cellen isoleren en je ze activeert met LP 's
- Gesteriliseerde chirurgische hulpmiddelen gebruiken voor het verwijderen van de milt van een muis, protocollen door de instelling Animal Care Commissie goedgekeurd.
- Plaats een steriele 70-µm cel zeef in de weefselkweek kap, in een 35-mm weefselkweek schotel met 3 mL steriele PBS kamertemperatuur. Gebruik de rubberen deel van de zuiger van een 5 ml-spuit te verpletteren de milt door de zeef van de cel.
- Pipetteer eencellige opschorting van splenoctyes in een steriele tube van 15 mL en centrifugeer bij 525 x g gedurende 5 min.
- Gebruik een magnetische kraal gebaseerde B-cel isolatie kit (Zie Tabel van materialen) te verkrijgen van een hoogverrijkt bevolking van B-cellen.
- Resuspendeer de cellen van B naar 3 x 106/mL in volledige RPMI medium aangevuld met 2,5 µg Mo/mL LPS plus 5 ng/mL B-cel activeren factor (BAFF; een cytokine overleven).
- Cultuur van de cellen voor 6 hr bij 37 ° C.
3. coating glas Coverslips met Anti-Ig antilichamen
- Bereid de antilichaam-oplossing voor het coaten van de coverslips. Verdun de stockoplossing van geit-anti-muis Ig antilichamen in kamertemperatuur steriele PBS te maken een 12,5 µg Mo/mL oplossing; 400 µL van antilichaam oplossing is vereist voor elke dekglaasje aan.
Opmerking: Gebruik geit-antimuis IgG voor A20 cellen; geit-antimuis IgM gebruiken voor primaire B cellen. Geit IgG antilichamen binden niet ook aan muis Fc receptoren. Echter, om te voorkomen dat elke potentiële Fc receptor bindende, kunt een F(ab) of F(ab')2 fragmenten van anti-muis IgG of IgM-antistoffen anti-muis. - Duik een dekglaasje aan van #1.5, 18-mm ronde glas in 100% methanol en laat het volledig drogen (~ 10 min).
- Plaats de gedroogde dekglaasje aan met pincet in een 12-well weefselkweek plaat en Pipetteer 400 µL van de 12,5 µg Mo/mL antilichaam oplossing (5 µg totaal; 2 µg/cm2) op het dekglaasje aan, zodat het vormen van een zeepbel in het midden van het dekglaasje aan en zich naar de randen uitbreidt.
- Wees voorzichtig ter dekking van de gehele dekglaasje aan, maar laat niet de antilichaam-oplossing om uit te breiden voorbij de rand van het dekglaasje glas aan en op de plastic weefselkweek. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Wassen van de coverslips door pipetting 1 mL steriele PBS in het goed en vervolgens zuigen uit de oplossing. Herhaal de twee meer tijden voor het verwijderen van niet-afhankelijke antistoffen.
- Voeg 1 mL steriel PBS tot het putje met de antilichaam-gecoate dekglaasje aan totdat cellen zijn klaar om te worden toegevoegd.
Opmerking: De coverslips is houdbaar bij kamertemperatuur, bedekt met PBS, voor gebruik op dezelfde dag.
4. B-cel verspreiden op Anti-Ig-Coated Coverslips
- Bereiden gewijzigd HEPES-gebufferde zoutoplossing (mHBS): 25 mM HEPES pH 7,2, 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM nb2HPO4, 0.5 mM MgSO4, 1 mg/mL dextrose, 2 mM glutamine, 1 mM natrium pyruvaat, en 50 µM 2-mercaptoethanol). Filter deze oplossing steriliseren en bewaren bij 4 ° C.
- Breng 50 mL mHBS met 2% op de dag van het experiment, FBS (mHBS-FBS) door toevoeging van 1 mL van de warmte-geïnactiveerd FBS aan 50 mL mHBS. Warm de mHBS-FBS tot 37 ° C vóór gebruik.
- Centrifugeer transfected cellen A20 of de primaire B-cellen, die had zijn gekweekt met BAFF plus LPS bij 525 x g gedurende 5 min.
- Resuspendeer de cellen in 1 mL mHBS-FBS, met behulp van een hemocytometer cellen tellen en verdunnen van de cellen tot 2 x 105 cellen/mL in mHBS-FBS.
- Met behulp van Tang, overbrengen in het dekglaasje aan van de weefselkweek plaat een stuk van paraffine film.
- 250 µL van B-cellen (5 x 104 cellen) aan elke dekglaasje aan toevoegen.
- Incubeer de coverslips bij 37 ° C gedurende 15 min. in het donker te staan van de B-cellen te verspreiden over het anti-IgG-gecoate oppervlak.
5. vaststelling en immunokleuring de cellen
- De oplossing van de fixatie door verdunning van de stockoplossing paraformaldehyde 16% en de 50% Glutaaraldehyde stockoplossing in kamertemperatuur gedestilleerd water aan opbrengst eindconcentraties van 3% paraformaldehyde en 0,1% Glutaaraldehyde voorbereiden. Bereid de oplossing van de fixatie op de dag dat het is om te worden gebruikt en overmaat negeren.
Let op: De paraformaldehyde en Glutaaraldehyde voorraadoplossingen mag alleen worden gebruikt in een chemische zuurkast. Volg de instructies op het veiligheidsinformatieblad (MSDS). - Voorbereiden van de permeabilization/blokkeren buffer (3% BSA en 0,1% Triton X-100 verdund in PBS). Filter deze oplossing steriliseren en bewaren bij 4 ° C. Warm op de dag van het experiment, het normbedrag tot kamertemperatuur.
- Bereiden de kleuring buffer (1% BSA en 0,1% saponine in PBS). Deze oplossing met behulp van een 0,2 µm filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C. Warm op de dag van het experiment, het normbedrag tot kamertemperatuur.
- Pipetteer 350 µL van de oplossing van de fixatie op elke dekglaasje aan, ervoor te zorgen dat het oppervlak volledig bedekt is. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in het donker.
- Verwijder de fixatie oplossing uit het dekglaasje aan door zorgvuldig zuigen van de rand van het dekglaasje aan met behulp van een micropipet.
Let op: De fixatie oplossing moet worden weggegooid als gevaarlijk chemisch afval. - Wassen van de coverslips eens met 500 µL van buffer permeabilization/blokkeren. Pipetteer uit de vloeistof.
- Permeabilize en blokkeren de cellen door 250 µL van permeabilization/blokkeren buffer toe te voegen aan elke dekglaasje aan en incubatie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Verdun het konijn anti-tubuline antilichaam 1:100 in buffer kleuring.
- Gecombineerd uit de buffer permeabilization/blokkeren van de coverslips, en 50 µL van de verdunde anti-tubuline antilichaam-oplossing toevoegen aan elke dekglaasje aan. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. in het donker.
- Bereid de oplossing van de vlek secundair antilichaam/actine door verder verdunnen van zowel de Alexa Fluor 532-geconjugeerde geit anti-konijn IgG secundair antilichaam en de Alexa Fluor 568-geconjugeerde phalloidin 1:100 in de kleuring van de buffer.
- De coverslips 3 keer voor het verwijderen van overtollige primair antilichaam door toevoeging van 500 µL van kleuring van buffer en aspirating dan het wassen.
- 50 µL van het secundaire antilichaam/actine vlek oplossing toevoegen aan elke dekglaasje aan en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- De coverslips 3 keer voor het verwijderen van overtollige secundair antilichaam door toevoeging van 500 µL van kleuring van buffer en aspirating dan het wassen.
- Voeg 10 µL van montage reagens op een microscoopglaasje. Monteer het dekglaasje aan op het microscoopglaasje met de cel-zijde naar beneden.
Opmerking: Een "anti-fade" montage-medium (Zie Tabel van materialen) wordt sterk aanbevolen voor het behoud van de intensiteit van de fluorescentie van GFP fusion eiwitten. Vermijd het gebruik van montage van reagentia met DAPI, die met de beeldvorming van de fluorophores interfereren kan bij het gebruik van de laser STED. - Laat de dia's te droog 's nachts in het donker. Het imago van de dia's de volgende dag.
Opmerking: De dia's Imaging zodra het dekglaasje aan droge sterk wordt aanbevolen, omdat het GFP-fluorescentie in de tijd afnemen zal.
6. met behulp van de Microscoop STED imaging
Opmerking: Houd er rekening mee dat alle software stappen hieronder beschreven zijn specifiek voor de Microscoop en de software die we gebruikt (Zie de Tabel van de materialen). De stappen en de instellingen zal moeten worden aangepast als beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van een andere Microscoop/software.
- Inschakelen van de Microscoop STED, activeren de lasers en epifluorescence verlichting lamp en opstarten van de Microscoop software.
- Stel de parameters voor de STED uitputting lasers.
Opmerking: Dit zal afhangen van de specifieke Microscoop wordt gebruikt en de lasers die is uitgerust met. Enkele aanbevolen instellingen zijn wit licht (WLL) 70%; 592 nm laser 80%; 660 nm laser 80%. - Activeer de instellingen STED en uitlijnen van de STED laserstralen, het streven naar 100 X.
- Met behulp van het oculair, concentreren van het monster en selecteer een cel met matige GFP expressie.
Opmerking: Lage GFP expressie worden niet zichtbaar omdat STED de emissie-intensiteit vermindert. Omgekeerd, hoge uitdrukking van CLIP-170-GFP induceert de spontane vorming van grote clusters, die niet met de normale microtubulus plus-end eiwit complex morfologie en distributie overeenkomt. Selecteren van een cel met matige GFP-expressie is essentieel voor het nauwkeurig imaging de cytoskeletal structuren op de contact site van antigeen. - Inzoomen op de geselecteerde cel en kies de regio van belang zijn voor het image worden gemaakt. De focus aanpassen zodat de x-y -vlak van de B-cel die zich het dichtst bij het dekglaasje aan in focus is.
- Om dit te doen, door het doel geleidelijk dichter naar het dekglaasje aan verplaatsen zodat de B-cel cytoskeletal structuren naar voren komen en vervolgens gaan onscherp. Vervolgens geleidelijk de doelstelling in de tegenovergestelde richting totdat de B-cel cytoskeletal structuren eerst in focus terugkomt.
- Optimaliseer de instellingen met inbegrip van de macht van de laser, excitatie lichtbundel en detector bereik. Begin met de instellingen die zijn aanbevolen door de instructies van de fabrikant. Dan pas zo nodig voor het optimaliseren van het signaal voor de monsters. Het imago van alle monsters worden vergeleken aan elkaar met dezelfde instellingen.
- Onder het tabblad "verwerven" van de software instellen de Beeldacquisitie sequentiële frame overname in het lagere linker "Sequentiële scannen" paneel door de optie "tussen frames".
- Stel de volgorde van de overname.
Opmerking: We krijgen het GFP-fluorescentie eerst om te voorkomen dat de aantasting van het GFP-signaal.
Afhankelijk van de combinatie van fluorophores die naast GFP worden gebruikt, kan de langere golflengte fluorescentie signaal imaging eerst betere resultaten opleveren. De volgorde waarin de fluorophores of fluorescerende eiwitten zijn onderworpen aan de gestimuleerde emissie uitputting en beeld moet echter worden geoptimaliseerd om de sterkste fluorescentie signalen en beste resolutie te verkrijgen. - Selecteer en stel de STED laser macht voor elke fluorophore onder het tabblad "Verwerven" van de software, en gebruik de schuifbalk voor de 592-nm of de 660 nm STED laser aan te passen de kracht van de laser. Pas de macht voor de 592-nm uitputting laser voor GFP en Alexa Fluor 532. De kracht voor de 660 nm uitputting laser voor Alexa Fluor 568 aanpassen.
- Verhogen van de resolutie en verminderen het signaal van de achtergrond, ga naar de "Overname" instellingen onder het tabblad "Verwerven" van de software, de lijn en/of frame gemiddeld door het selecteren van een waarde groter dan 1 met behulp van het drop-down menu voor elke optie te verhogen.
- Ook het verwerven van het fluorescerende signaal tijd-gated STED via de gating optie voor de fluorophore onder het tabblad "Verwerven" te controleren en waarden opgeven voor de tijd-gating (zie hieronder nota). Verhoog het vermogen laser STED ter verbetering van de resolutie, hoewel dit ook photobleaching van de fluorophores zal verhogen.
Opmerking: De gating tijd moet worden geoptimaliseerd voor de Microscoop, monster en fluorophores wordt gebruikt. Een tijd gating van 0,3 tot en met 6 ns wordt aanbevolen. Na fixatie is GFP bijzonder gevoelig voor de laser van de hoge macht. Verklein de photobleaching van GFP en tijd gating moet worden toegepast en de kracht van de laser STED verlaagd moet worden. - 3D STED beelden vastleggen, gebruikt u de schuifregelaar naar het punt wijzigen verspreid functie (PSF) aan "3D STED".
- Handmatig meerdere afbeeldingen zodat de reproduceerbaarheid te verwerven. Deconvolve de beelden (Zie Figuur 1) met behulp van een deconvolutie software pakket41(Zie Tabel van materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor B-cellen verspreiden op geïmmobiliseerdet anti-Ig, biedt STED microscopie gebruikt in combinatie met deconvolutie software hogere resolutiebeelden van cytoskeletal structuren dan confocale microscopie. Dit blijkt duidelijk uit Figuur 1, waar de F-actine-netwerk werd gevisualiseerd met behulp van het protocol zoals hierboven beschreven. Een vergelijking van de confocal en STED Super resolutiebeelden van hetzelfde voorbeeld toont aan dat de STED beelden van hogere resolutie zijn en onthullen meer gedetailleerde structuren van het actine cytoskelet (Figuur 1). Deze figuur toont ook dat deconvolutie is van essentieel belang voor het verkrijgen van hoge kwaliteit STED beelden in welke actine filamenten duidelijker worden geformuleerd. Hoewel deconvolutie confocal beelden een substantiële verbetering in de resolutie van de afbeelding levert, deconvolved STED beelden meer gedetailleerde structurele informatie verstrekken dan deconvolved confocal beelden. In het bijzonder wordt de dendritische structuur van het perifere F-actine-ring geopenbaard in meer detail door STED microscopie (Figuur 1 en Figuur 2). Het netwerk van microtubuli op de contact site van antigeen was ook beeld met behulp van de bereiding van de monsters en imaging protocol beschreven (Figuur 3). Microtubuli zijn afkomstig uit een centraal punt, oftewel de MTOC, en naar buiten uitstralen naar de periferie van de cel. In dit experiment mochten de B-cellen verspreid over anti-Ig-gecoate coverslips voor 15 min (Figuur 3), een tijdstip waarop de MTOC is verhuisd naar de antigeen contact site17. CLIP-170-GFP-clusters die mark van de plus-uiteinden van microtubuli te zien aan de uiteinden van de microtubuli in Figuur 3aangegeven. Bij de bereiding van de monsters en STED beeldvorming van het netwerk van microtubuli is optimale, continue en verschillende microtubuli in acht worden genomen, met CLIP-170-GFP gelokaliseerd hetzij langs de microtubuli, hetzij op de plus-uiteinden (figuur 3A). Sub-optimale microtubulus kleuring, die werd waargenomen bij het gebruik van lagere concentraties van kleuring van antilichamen of batches van α-tubuline antilichamen die meer dan een jaar oud, resultaten in microtubuli verschijnen als discontinue secties die slecht opgelost zijn bij deconvolutie (figuur 3B; Zie ook figuur 5C). Hoewel alle van de CLIP-170-GFP fluorescentie in deze beelden geassocieerd met α-tubuline-immunostained structuren, een kan geen onderscheid maken van of CLIP-170-GFP bevindt zich aan de uiteinden van de plus, of langs de lengte van de microtubuli, als gevolg van de onvolledige kleuring van de microtubuli. Daarom is het belangrijk dat het α-tubuline antilichaam worden opgeslagen onder de fabrikant aanbevolen opslagomstandigheden zijn bepaald en gebruikt binnen één jaar.
Met behulp van dit protocol, hoge kwaliteit Multi-Color STED beelden die aantonen dat de organisatie en de structuur van het cytoskelet actine en de microtubulus netwerk, evenals eiwitten zoals IQGAP1 en CLIP-170 die met deze twee cytoskeletons17 associëren, kan worden verkregen. De STED afbeeldingen in Figuur 4 tonen de perifere ring van dendritische actine, evenals de microtubuli die afkomstig zijn vanaf een centrale locatie in de cel waar de actine-kleuring veel minder dicht is. CLIP-170-GFP aan de uiteinden van deze microtubuli is nauw verbonden met de perifere F-actine. Dit protocol maakt het mogelijk om te visualiseren cytoskeletal structuren in de immuun Synaps met één kleur STED imaging (Figuur 2) of multicolor STED imaging (Figuur 3 en Figuur 4). Echter moet worden opgemerkt dat één kleur STED imaging (Figuur 2) betere resolutie van actine structuren en microtubuli in de B-cellen dan Multi-Color STED (Figuur 4) kan opleveren. Dit kan worden veroorzaakt door photobleaching veroorzaakt door sequentiële STED Beeldacquisitie voor de verschillende fluorophores. Voor de beste Super resolutiebeelden, de combinatie van fluorophores en fluorescente proteïnen geselecteerd, evenals de volgorde waarin ze zijn beeld met behulp van de excitatie en uitputting lasers, moet worden geoptimaliseerd voor het monster. Multi-Color STED imaging biedt echter hogere resolutiebeelden van deze cytoskeletal structuren dan conventionele confocale microscopie. Bovendien kan één kleur STED te verwerven van 3-dimensionale Super resolutiebeelden van de gehele B-cel actine of microtubulus netwerk (film 1) worden gebruikt.
Wanneer met behulp van cellen transfected met fluorescerende fusion eiwitten, zijn bereiken van optimale expressie niveaus en het vermijden van artefacten als gevolg van overexpressie belangrijke overwegingen. In cellen waar CLIP-170-GFP is overexpressie, grote aggregaten van de CLIP-170-GFP worden gevormd (figuur 5A). Naast deze mislocalization van de CLIP-170-GFP was slechts een deel van het netwerk van microtubuli in deze cel binnen het brandvlak dichtst bij het dekglaasje aan (figuur 5B). Dit suggereert dat CLIP-170 overexpressie BCR-geïnduceerde MTOC polarisatie ook kan schaden. Omgekeerd, omdat sterke fluorescentie signalen doorgaans vereist zijn voor het verkrijgen van STED afbeeldingen van hoge kwaliteit, lage expressie van fluorescerende fusion eiwitten zoals GFP-170-CLIP (figuur 5C) resulteert in slechte kwaliteitsbeelden. Vandaar, als u hebben zijn transfected cellen met fluorescente proteïnen, het is belangrijk om het imago van alleen die cellen met optimale niveaus van fusion eiwit expressie. Het is ook belangrijk op te merken dat de transfectie-protocol, dat werd gebruikt voor A20 cellen (Zie Tabel van materialen) meestal als resultaat 20-50% van de cellen, uiting geven aan de transfected proteïne. Voor plasmide DNA (in tegenstelling tot siRNAs), transfectie frequenties voor primaire B-cellen zijn vaak veel lager dan voor A20 cellen, waarbij het gebruik van B cellijnen. Niettemin, afbeeldingen van hoge kwaliteit STED cytoskeletal elementen in untransfected primaire B cellen kunnen worden verkregen met behulp van dit protocol (Figuur 6).
Figuur 1: vergelijking van de confocal en STED beeldvorming van F-actine. Confocale beelden (boven) en STED beelden (onder) van een cel A20 had verspreid over anti-IgG-coated coverslips gedurende 15 minuten voordat het wordt gekleurd met Alexa Fluor 532-geconjugeerd phalloidin. Met behulp van de confocal microscoop STED, was dezelfde cel beeld eerst door confocale microscopie en vervolgens door STED. De initiële confocale en STED afbeeldingen worden weergegeven, samen met de zelfde confocale en STED beelden na deconvolutie. Schaal bar: 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: het cytoskelet actine op de contact site van antigeen. A20 cellen die verspreid over anti-IgG-gecoate coverslips voor 15 min had gekregen werden gekleurd met Alexa Fluor 568-geconjugeerde phalloidin en beeld door STED microscopie. De eerste beelden van de STED waren deconvolved. Panelen A-B - en C-E panelen weergeven representatieve beelden van twee verschillende cellen Paneel E toont een 3 X vergroting van de regio in het witte vak in deelvenster C. Schaal bar voor panelen A-D: 5 µm. schaal bar voor paneel E: 1 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: STED beelden van de microtubuli netwerk en CLIP-170-GFP. A20 cellen uiten CLIP-170-GFP mochten verspreid over anti-IgG-gecoate coverslips voor 15 min voordat wordt vastgesteld en immunostained met een α-tubuline antilichaam plus een Alexa Fluor 532-geconjugeerde secundair antilichaam. (A) representatieve afbeelding toont immunokleuring van het netwerk van microtubuli, met CLIP-170-GFP ligt voornamelijk aan de plus-uiteinden van microtubuli. (B) suboptimale kleuring en resolutie van microtubuli als gevolg van het gebruik van een verouderde voorraad van α-tubuline antilichaam. Schaal bars: 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: STED beelden van de actine en microtubulus cytoskeletons. A20 cellen uiten CLIP-170-GFP mochten verspreid over anti-IgG-gecoate coverslips voor 15 min voordat wordt vastgesteld en gekleurd met Alexa Fluor 568-geconjugeerde phalloidin te visualiseren F-actine, en met een antilichaam α-tubuline plus een Alexa Fluor 532-geconjugeerde secundair antilichaam te visualiseren van microtubuli. Panelen A-D en E-F panelen tonen representatieve beelden van twee verschillende cellen. Paneel D is een 3,5 X vergroting van de regio in het witte vak in deelvenster C. Schaal bars: 5 µm voor panelen A-C en E-F; 1 µm voor deelvenster D. De afbeelding in het deelvenster A is het hetzelfde beeld gebruikt in figuur 3A maar omvat de overlay van de F-actine-kanaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: voorbeelden van slechte kwaliteit STED beelden te wijten aan overexpressie of onvoldoende expressie van het GFP-fusieproteïne. A20 cellen uiten CLIP-170-GFP mochten verspreid over anti-IgG-gecoate coverslips voor 15 min voordat wordt vastgesteld en gekleurd zoals in Figuur 4. (A, B) CLIP-170-GFP overexpressie resultaten op grote, abnormale aggregaten van CLIP-170-GFP (A) en verminderde MTOC polarisatie richting de antigeen-contact site (B). Onvoldoende uitdrukking van CLIP-170-GFP (C) te compenseren door verhoging van de laser macht resulteert in afbeeldingen van slechte kwaliteit STED. Schaal bars: 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: STED beeld van het cytoskelet van de microtubuli in primaire B cellen. Primaire milt B cellen werden gekweekt voor 6 h met 5 ng/µL BAFF plus 2,5 µg Mo/mL LPS, en dan mag verspreid gedurende 15 minuten op coverslips, die had zijn bekleed met een anti-IgM-antistoffen. De cellen werden dan vast en gekleurd met een α-tubuline antilichaam plus een Alexa Fluor 568-geconjugeerde secundair antilichaam te visualiseren van microtubuli. Een representatieve afbeelding wordt getoond. Schaal bar: 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Film 1: 3D reconstructie van het netwerk van B-cel microtubulus. A20 cellen mochten verspreid over anti-IgG-gecoate coverslips voor 15 min voordat wordt vastgesteld en immunostained met een α-tubuline antilichaam plus een Alexa Fluor 488-geconjugeerde secundair antilichaam. Z-segmenten werden gevangen op 0,2 µm stap maten voor een totaal van 37 frames. 3D reconstructie werd gedaan met behulp van de Microscoop STED de beeldbewerkingssoftware. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gedetailleerde beelden van cytoskeletal structuren kunnen worden verkregen met behulp van STED super resolutie microscopie, wat theoretisch van een oplossing van 50 bereiken kan nm, in vergelijking met conventionele confocale microscopie, waarvoor de diffractie-beperkte resolutie ~ 200 is nm 24. de mogelijkheid om op te lossen fijnere structuren wordt verder verbeterd deconvolutie door software te gebruiken voor het berekenen van de meest waarschijnlijke positie van de oorspronkelijke lichtbron van het waargenomen "wazig" fluorescentie-signaal. Dit protocol wordt beschreven methoden voor het gebruik van STED om het imago van de actine en microtubulus cytoskeletons, evenals de cytoskelet-geassocieerde eiwitten.
B-cel activatie induceert remodelleren van zowel het cytoskelet actine en het netwerk van microtubuli, met de gecoördineerde regulering van de twee cytoskeletons belangrijk voor immuun synapse formatie17,42. De methode die wij presenteren is geoptimaliseerd voor het gelijktijdig de actine en microtubulus cytoskeletons op de antigeen-contact-site met behulp van Multi-Color STED imaging, maar geldt evenzeer voor eenkleurige STED. Eerdere onderzoeken we op de B-cel cytoskelet hoogtepunt dat STED nieuwe inzichten in hoe cellulaire structuren bieden kan zijn georganiseerd en hoe ze omgaan met elkaar. Met behulp van microscopie van de confocal en totale interne fluorescentie (TIRF), hadden we waargenomen dat microtubuli Neem contact op met de ring van F-actine aan de rand van het antigeen contact site17. Met behulp van STED microscopie, konden we aantonen dat de plus uiteinden van microtubuli, die werden gekenmerkt door de + TIP CLIP-170 nauw gekoppeld aan de dendritische actine-netwerk op de rand van de cel (Zie Figuur 4).
Meerdere factoren invloed welke beeldvormende techniek is het meest geschikt voor een specifieke toepassing. Het gaat hierbij om de resolutie die nodig is, de structuren voor de image worden gemaakt, de labeling techniek en haar signal-to-noise verhouding (dat wil zeggen, contrast), Acquisitietijd, gebruiksgemak monstervoorbereiding en reproduceerbaarheid. Bereiding van de monsters voor STED is niet beduidend anders dan voor confocale microscopie, en het combineert hoge resolutie met snelle Beeldacquisitie. Een groot voordeel van STED is dat het een optische proces waarin de afbeelding rechtstreeks uit het monster overgenomen is en de resolutie kan worden aangepast door het veranderen van de macht van de STED laser24. In tegenstelling tot de grondtoestand uitputting super resolutie microscopie, die Hiermee reconstrueert u beelden van duizenden opeenvolgende beeld vangt, uitgebreide computationele verwerking is niet vereist voor STED en de invoering van afbeelding wederopbouw artefacten wordt vermeden 24. het contrast in STED beelden is echter vaak lage24, in welk geval na beeldverwerking met behulp van software zoals ImageJ kan nodig zijn ter verbetering van het contrast. Dit is vooral belangrijk voor afbeeldingen met dichte structuren, zoals een dendritische actine-netwerk. Om te verbeteren afbeeldingscontrast tijdens Beeldacquisitie, een kan verminderen de kracht van de laser uitputting en/of toepassing lijn of frame gemiddeld. Tijd-gated STED, die fotonen worden vastgelegd na een gebruiker ingestelde vertraging, kan de resolutie te verhogen door het verlagen van het gebied waaruit de fotonen verzamelde24,43 zijn. Het is raadzaam de STED beeldvorming van cytoskeletal structuren in de immuun SYNAPS optimaliseren met behulp van een combinatie van deze methoden ter verbetering van de contrastverhouding en resolutie.
Op dit moment niet alle fluorophores zijn optimaal voor beeldbewerking met STED, en niet alle combinaties van de fluorophore zijn geschikt voor het verkrijgen van afbeeldingen met meerdere kleuren STED. Zorgvuldige aanpassing van de detectie bereiken is belangrijk om te zorgen voor minimale bloeden-door middel van fluorophores in aangrenzende kanalen. De combinatie van fluorophores gebruikt in dit protocol (dat wil zeggen, GFP Alexa Fluor 532 en Alexa Fluor 568) is optimaal voor multicolor STED super resolutie beeldvorming. Vergeleken met gestructureerde verlichting microscopie (SIM) en single-molecuul lokalisatie methoden (SMLM), zoals foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM), STED is niet typisch ideaal voor Multi-Color imaging. Echter tonen we hier dat lichte overmatige verzadiging van de detectie van de fluorophore, gecombineerd met eenvoudige tools voor beeldverwerking, kunnen leveren multi-color resolutieafbeeldingen van de actine en microtubulus cytoskeletons.
Nieuwe details van cytoskeletal architectuur op de B-cel immuun SYNAPS is gebleken dat dit protocol voor STED beeldvorming van cytoskeletal structuren. Hoewel we geoptimaliseerd dit protocol voor imaging-de actine en microtubulus cytoskeletons op de site van de antigeen-contact in B-cellen, deze methoden gelden andere celtypen, met name immuuncellen (T-cellen, NK-cellen, mestcellen, etc.) die vormen immuun synapsen. Bovendien, het nut van dit protocol kan worden uitgebreid tot de coverslips met andere liganden of zelfklevende substraten coating. Het is echter belangrijk om het protocol en de overname-instellingen voor het celtype en de experimentele opstelling te optimaliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de UBC Life Sciences Institute (LSI) Imaging faciliteit voor ondersteuning en handhaving van de Microscoop STED. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie #68865 van de Canadese instituten van Health Research (M.R.G.). Wij danken Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya University, Nagoya, Japan) voor de CLIP-170-GFP plasmide.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| A20 mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamine | Millipore Sigma | G5763 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P5280 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid, 10,000 units |
| Additional materials for primary B cells | |||
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| Magnetic bead-based B cell isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep Mouse B cell Isolation kit |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS from E. coli 0111:B4 |
| B cell-activating factor (BAFF) | R&D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid encoding CLIP-170-GFP | Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
| Recommended transfection reagents and equipment | |||
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Falcon 6-well plates, TC treated, sterile | Corning | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating coverslips | |||
| 18-mm diameter round #1.5 cover glasses | Thomas Scientific | 1217N81 | Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580 |
| Forceps | Fisher Scientific | 1381242 | Dissecting extra fine splinter forceps |
| Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate | Corning | 353043 | |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | For A20 cells |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | For primary mouse B cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Paraformaldehyde (16% stock solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute with PBS to working concentration |
| Glutaraldehyde (50% stock solution) | Millipore Sigma | 340855 | Dilute with PBS to working concentration |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| Bovine serum albumin (BSA), Fraction V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| Rabbit anti-tubulin antibody | Abcam | ab52866 | 1:250 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 1:100 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1:100 dilution recommneded but should be optimized |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Without DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica | ||
| Huygens deconvolution software | Scientific Voume Imaging | See https://svi.nl/HuygensProducts |
References
- Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).
- Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
- Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
- Dustin, M. L. Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses. Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).
- Dustin, M. L. Modular design of immunological synapses and kinapses. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).
- Dustin, M. L. Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses. Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).
- Dustin, M. L. Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Monks, C. R., et al. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Yuseff, M. I., et al. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).
- Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).
- Kuhn, J. R., Poenie, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).
- Wang, J. C., et al. The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).
- Schnyder, T., et al. B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster. Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).
- Nath, S., et al. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).
- Combs, J., et al. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).
- Fukata, M., et al. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109 (7), 873-885 (2002).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X.
- Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
- Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).
- Tamarit, B., et al. Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells. J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).
- Brown, A. C., et al. Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins. Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).
- Dupre, L., et al. T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors. Front Immunol. 6, 586 (2015).
- Rak, G. D., et al. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
- Lin, K. B., et al. The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas. Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).
- Lin, K. B., et al. The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands. Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).
- McLeod, S. J., et al. The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes. J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).
- Christian, S. L., et al. Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation. J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Treanor, B., et al. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).
- Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
- Yuseff, M. -I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Russ, J. C. The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , CRC Press. (2011).
- Stinchcombe, J. C., et al. Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse. Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).
- Vicidomini, G., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).
