Summary
Vi presentiamo un protocollo per l'utilizzo di microscopia STED contemporaneamente strutture di actina di immagine, microtubuli e proteine leganti plus-fine dei microtubuli in cellule di B che si sono diffuse sulle lamelle rivestite con gli anticorpi per il recettore delle cellule B, un modello per la fase iniziale di formazione della sinapsi immuni.
Abstract
Cellule di B che si legano agli antigeni di membrana-limiti (per esempio, sulla superficie di una cellula presentanti l'antigene) formano una sinapsi immuni, una struttura cellulare specializzata che ottimizza la segnalazione della B-cellula recettore (BCR) e acquisizione di antigene BCR-mediata. Il rimodellamento del citoscheletro di actina e il riorientamento della rete dei microtubuli verso il sito di contatto dell'antigene sono essenziali per la formazione della sinapsi immuni. Rimodellamento del citoscheletro in un denso anello periferico di F-actina è accompagnata dalla polarizzazione del centro di organizzazione dei microtubuli verso la sinapsi immune. Proteine leganti plus-fine dei microtubuli, come pure proteine corticale plus-fine acquisizione mediano interazioni fisiche tra il cytoskeletons actina e dei microtubuli, che consentono loro di essere riorganizzata in modo coordinato. Chiarire i meccanismi che questa riorganizzazione del citoscheletro, nonché a comprendere come queste strutture citoscheletriche forma formazione della sinapsi immuni e BCR di segnalazione, di controllo può fornire nuove intuizioni l'attivazione delle cellule B. Ciò è stata facilitata dallo sviluppo di approcci di microscopia di Super-risoluzione che rivelano nuovi dettagli di organizzazione della rete del citoscheletro. Descriviamo qui un metodo per l'utilizzo di microscopia di svuotamento (STED) emissione stimolata contemporaneamente strutture di actina di immagine, microtubuli e proteine leganti plus-fine transfected GFP-etichettato microtubuli in cellule di B. Per modellare i primi eventi nella formazione della sinapsi immuni, permettiamo a cellule B a diffondersi sulle lamelle ricoperte di anticorpi (anti-Ig) anti-immunoglobulina, che avviano la segnalazione di BCR e rimodellamento del citoscheletro. Forniamo dettagliate protocolli per esprimere proteine di fusione di GFP in cellule di B-linfoma A20, per la diffusione di anti-Ig-indotta delle cellule e per la fissazione delle cellule successive, Immunostaining, acquisizione di immagini e passaggi di deconvoluzione di immagine. Le immagini ad alta risoluzione ottenute utilizzando queste procedure permettono di visualizzare contemporaneamente l'actina strutture, i microtubuli e proteine obbligatorie plus-fine dei microtubuli che possono collegare queste due reti del citoscheletro.
Introduction
Quando le cellule B associare polarizzati matrici di antigeni (ad es., visualizzato sulla superficie dell'antigene-presentare cellule (APC)), il recettore della B-cellula risultante (BCR) segnalazione unità la formazione di una struttura classica sinapsi immuni, che era prima descritto in T cellule1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Inizialmente, microclusters di form di BCRs antigene associato alla periferia del sito contatto B cellulare: APC. Questi microclusters quindi spostare verso il centro del sito contatto antigene, dove si fondono in un cluster centrale attivazione supramolecolari (cSMAC) che costituisce il nucleo della sinapsi immune. Formazione della sinapsi immuni ottimizza la segnalazione di BCR e facilita l'estrazione dell'antigene BCR-mediata dalla membrana APC14. Questa acquisizione di antigene, che è seguita da BCR-mediata antigene internalizzazione e l'elaborazione successiva dell'antigene, permette alle cellule di B di presentare i peptide: MHC II complessi alle cellule di T e suscitare la cellula T Guida14. Perché la formazione della sinapsi immunitaria promuove l'attivazione delle cellule B, chiarire i meccanismi che stabiliscono che questo modello funzionale dell'organizzazione del ricevitore può offrire nuove intuizioni in risposte immunitarie umorali come sono avviate e regolati.
Riorganizzazione dell'actina sia microtubule cytoskeletons è essenziale per la formazione della sinapsi immuni. Segnalazione stimolata da una matrice spazialmente polarizzato degli antigeni localizzati di BCR induce rapida e drammatica rimodellamento del citoscheletro dell'actina1,15. La formazione di strutture dendritiche actina alla periferia della cellula B esercita forze che spinge sulla membrana plasmatica e promuove la diffusione delle cellule di B. Questo permette alla cellula di B di acquisire una maggiore area di superficie del antigene-cuscinetto e aumenta il numero di BCRs che legano l'antigene e attivare vie di segnalazione di BCR. Allo stesso tempo, il MTOC e la rete dei microtubuli sono riorientati verso il sito di contatto dell'antigene. All'approssimarsi del contatto dell'antigene il MTOC, microtubuli che emana dal MTOC si estendono lungo la faccia interna della membrana del plasma all'interfaccia fra la cellula di B e l'antigene-cuscinetto superficie16,17. Questi microtubuli juxtamembrane possono quindi fungere da tracce per il movimento centripeto dineina-mediata di antigene associato BCR microclusters18, portando alla formazione di un cSMAC.
Il riorientamento e la polarizzazione del MTOC verso la sinapsi immunitaria richiede l'actina intatto e cytoskeletons dei microtubuli e spesso dipende dalle interazioni tra l'actina corticale rete e microtubuli16,17, 19,20. Proteine leganti l'actina corticale, come IQGAP1, possono catturare i microtubuli interagendo con complessi proteici che decorano il microtubulo plus-estremità21. Questi dinamici complessi delle proteine leganti plus-fine includono EB1 e CLIP-170, che vengono definiti collettivamente come microtubule plus-fine rilevamento delle proteine (+ puntali)21,22. + Suggerimenti alle estremità dei microtubuli possono associare alle proteine che sono associate con la membrana plasmatica o il citoscheletro di actina corticale. In questo modo i meccanismi di generazione di forza (ad es., il meno-end diretto movimento di dineina corticale ancorata lungo i microtubuli) per esercitare forze di trazione su microtubuli e quindi riposizionare il MTOC. CLIP-170 può legarsi alla proteina actina-collegati ponteggi IQGAP123, e abbiamo dimostrato che entrambi di queste proteine sono necessari per polarizzazione indotta da BCR MTOC verso il sistema immunitario sinapsi17. Questa interazione IQGAP1-CLIP-170 può giocare un ruolo chiave nel coordinare il rimodellamento del citoscheletro di actina con il riposizionamento della rete dei microtubuli alla sinapsi immune della B-cellula.
Microscopia a fluorescenza convenzionale ha rivelato la riorganizzazione drammatica della cytoskeletons actina e dei microtubuli durante la B-cellula immunitaria sinapsi formazione2. Tuttavia, questo approccio non può risolvere piccole strutture cellulari in dettaglio a causa del limite di diffrazione della luce, che, secondo la legge di Abbe, dipende dalla lunghezza d'onda della luce utilizzata per illuminare il campione e l'apertura del obiettivo24. Questo limite di diffrazione vincola la risoluzione dei microscopi ottici convenzionali a 200-300 nm in direzione laterale e 500-700 nm nella direzione assiale25. Di conseguenza, più piccole strutture subcellulari, come pure i dettagli degli cytoskeletons actina e dei microtubuli, potrebbero solo essere osservati usando la microscopia elettronica. Formazione immagine di microscopia elettronica del citoscheletro è che richiede tempo, richiede protocolli fissazione e preparazione del campione duro che possono alterare strutture biologiche ed è limitata alla rilevazione dell'anticorpo-mediata. La capacità di immunostain e contemporaneamente l'immagine più proteine o strutture cellulari è un vantaggio notevole di microscopia di fluorescenza. Inoltre, che esprimono le proteine di fusione fluorescenti in cellule permette l'imaging in tempo reale ed è utile quando gli anticorpi efficaci per immunostaining la proteina di interesse non sono disponibili.
I recenti progressi tecnologici nella microscopia di Super-risoluzione hanno superato i limiti di diffrazione della luce e ha permesso la visualizzazione di nanoscala strutture cellulari24. Una tale tecnica di microscopia di Super-risoluzione viene chiamato emissione stimolata svuotamento (STED) microscopia. STED impiega due laser, dove un laser eccita il fluoroforo e un secondo laser con un motivo a forma di ciambella selettivamente sopprime l'emissione di fluorescenza intorno il fluoroforo. Questo riduce la funzione di punto di diffusione (zona apparente) di una singola particella fluorescente e fornisce un limite di Sub-diffrazione immagine fluorescente25,26. Microscopia di stato fondamentale svuotamento impiega anche tecniche basate sulla fluorescenza per acquisire immagini di Super-risoluzione. Tuttavia, i tempi di acquisizione e ricostruzione di immagine sono lunghi, ci sono solo un numero limitato di fluorofori che possono essere utilizzato, e l'imaging ad alta risoluzione simultanea di più componenti citoscheletriche è tecnicamente impegnativo, perché mantenere strutture di actina e microtubuli richiede le procedure di fissaggio diversi. Di conseguenza, STED ha più vantaggi rispetto la microscopia elettronica e altre microscopia di Super-risoluzione si avvicina in quanto esso offre acquisizione rapida di immagini, ha i requisiti minimi di post-elaborazione e impiega la stessa fluorofori e tecniche di colorazione che vengono utilizzati per microscopia di fluorescenza convenzionale di campioni fissati26.
Microscopia di Super-risoluzione ora è stata utilizzata per visualizzare le strutture di actina alla sinapsi immune in cellule natural killer (NK) e T cellule26,27,28,29,30, 31. Tuttavia, la formazione immagine di Super-risoluzione del citoscheletro dei microtubuli, così come la riorganizzazione coordinata della cytoskeletons di actina e dei microtubuli durante la formazione della sinapsi immuni, solo recentemente è stato segnalato17. Abbiamo usato la microscopia STED per celle di immagine B che erano state lasciate a diffondersi sulle lamelle ricoperte di anticorpi (anti-Ig) anti-immunoglobulina, che stimolano la segnalazione di BCR e avviare la riorganizzazione del citoscheletro. Quando placcato sugli anticorpi anti-Ig immobilizzati, le cellule B subiscono drammatica diffusione actina-dipendente, che ricapitola gli eventi iniziali durante la formazione della sinapsi immuni. D'importanza, microscopia STED ha rivelato i dettagli dell'anello dendritica di F-actina che forme alla periferia del sistema immunitario sinapsi e ha mostrato che il MTOC, come pure i microtubuli collegati ad esso, avevano spostato vicino l'antigene contatto sito17. Questi microtubuli esteso verso l'esterno verso l'anello periferico di F-actina. Inoltre, formazione immagine di STED multi-colore di varie combinazioni di F-actina, tubulina, IQGAP1 e GFP-etichettato CLIP-170 + suggerimenti ha indicato che microtubule plus-estremità segnata da CLIP-170-GFP erano strettamente associata con il reticolo di actina periferici e con IQGAP1, un corticale cattura proteina17.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'actina e microtubule cytoskeletons alla sinapsi immune usando la microscopia STED di imaging. Questi metodi sono stati ottimizzati utilizzando la linea A20 murino delle cellule di B, che è stato ampiamente impiegata per lo studio della segnalazione di BCR e immuni sinapsi formazione17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. perché gli anticorpi commerciali a CLIP-170 non hanno funzionato bene per immunostaining in precedenti esperimenti, descriviamo dettagliatamente l'espressione della GFP-etichettato CLIP-170 in cellule A20, con macchiatura dei protocolli per visualizzare contemporaneamente fino a tre componenti del citoscheletro o proteine associate al citoscheletro. Metodi per l'utilizzo di microscopia STED all'actina di immagine a livello delle sinapsi immune delle cellule NK sono stati descritti in precedenza40. Qui, estendiamo questo per l'acquisizione di immagini ad alta super-risoluzione multi-colore di actina sia microtubule cytoskeletons in cellule di B.
Una considerazione critica per microscopia di Super-risoluzione è utilizzando le procedure di fissazione appropriato per il mantenimento di strutture cellulari e prevenendo danni to le proteine fluorescenti. La fissazione e la macchiatura metodi presentati qui sono stati ottimizzati per conservare la fluorescenza di GFP e fornire imaging ad alta risoluzione delle reti di actina e dei microtubuli. Quando è necessario esprimere proteine fluorescenti, dovrebbe essere notato che le cellule B sono solitamente difficili a transfect. Usando questo protocollo, 20-50% di A20 cellule tipicamente esprimono la proteina di fusione GFP transfettata, e fra questa popolazione i livelli di espressione della proteina sono variabili. Tuttavia, super-resolution imaging di actina e i microtubuli utilizzando le procedure che descriviamo è abbastanza robusta e immagini di alta qualità sono facilmente ottenute. Nonostante le piccole dimensioni rispetto a cellule A20, mostriamo che queste procedure utilizzabile anche all'immagine della rete dei microtubuli in cellule primarie di B che sono stati attivati brevemente con il lipopolysaccharide (LPS). Abbiamo dimostrato che cellule di B primarie LPS-attivato possono trasfettate con siRNA a relativamente alta efficienza (cioè, tale che lo svuotamento della proteina può essere rilevato dall'immunoblotting), che li rende una buona alternativa all'uso di linee di cellule di B per alcuni studi 17.
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Protocol
Tutte le procedure di animali sono state approvate dall'Università della British Columbia Comitato di cura degli animali.
1. esprimere proteine di GFP-fusione in cellule di B-linfoma A20
- Cellule di cultura A20 in completano medium RPMI (RPMI-1640 completati con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS), 50 µM 2-mercaptoetanolo, glutamina 2mm, piruvato di 1 mM, 50 U/mL di penicillina e 50 µ g/mL di streptomicina) a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto con 5 % CO2.
- Preparare il reagente di transfezione (Vedi la Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore.
Nota: Questo protocollo è stato ottimizzato per i reagenti specifici e protocollo di transfezione descritto nella Tabella materiali. Altri reagenti di transfezione che abbiamo provato non hanno dato sufficiente efficienza di trasfezione. - Contare le celle utilizzando un emocitometro. Centrifuga 2,5 x 106 A20 cellule (per ogni trasfezione) per 5 min a x 525 g. Risospendere le cellule in 100 µ l di reagente di transfezione contenente 1-2,5 µ g di DNA plasmidico. Per il DNA codifica CLIP-170-GFP23, utilizzare 2,5 µ g per la transfezione. Mescolare delicatamente.
- Trasferire le cellule in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e regolare il volume a 2 mL con terreno RPMI completo pre-riscaldato. Coltura delle cellule per 18 h a 37 ° C per consentire l'espressione della proteina.
2. isolamento primario del Mouse B cellule e loro attivazione con LPS
- Utilizzare strumenti chirurgici sterilizzati per rimuovere la milza da un mouse, seguendo protocolli approvati dal comitato di cura degli animali dell'istituzione.
- Nella coltura del tessuto cappa, posizionare un colino di cella sterile 70 µm in un piatto di coltura del tessuto 35 mm contenente 3 mL di PBS sterile temperatura ambiente. Utilizzare la parte di gomma dello stantuffo da una siringa da 5 ml per schiacciare la milza attraverso il filtro delle cellule.
- Dispensare la sospensione unicellulare di splenoctyes in una provetta sterile da 15 mL e centrifugare a 525 x g per 5 min.
- Uso un isolamento magnetico basato su perlina B cellula kit (Vedi Tabella materiali) per ottenere una popolazione altamente arricchita delle cellule B.
- Risospendere le cellule di B di 3 x 106/ml in completa medium RPMI completate con 2,5 µ g/mL LPS più fattore (BAFF; una citochina di sopravvivenza) di attivazione delle cellule di B di 5 ng/mL.
- Le cellule della coltura per 6 ore a 37 ° C.
3. rivestimento vetrini coprioggetti con gli anticorpi Anti-Ig
- Preparare la soluzione di anticorpo per il rivestimento di lamelle. Diluire la soluzione madre di capra-anti-mouse Ig anticorpi nella temperatura ambiente PBS sterile per rendere un 12,5 µ g/mL di soluzione; 400 µ l di soluzione di anticorpo è richiesto per ogni vetrino coprioggetti.
Nota: Utilizzare il anti-topo di capra IgG per celle A20; utilizzare anti-topo di capra IgM per cellule primarie di B. Gli anticorpi IgG di capra non si legano bene ai recettori Fc del mouse. Tuttavia, per evitare qualsiasi potenziale grippaggio del ricevitore di Fc, uno può usare F(ab) o punto2 frammenti di anti-IgG di topo o di anticorpi IgM anti-topo. - Immergere un coprioggetto in vetro rotondo 18 mm #1.5 in 100% di metanolo e lasciarla asciugare completamente (~ 10 min).
- Usando il forcipe, porre il coprivetrino secco in una coltura del tessuto 12-pozzetti piastra e dispensare 400 µ l di 12,5 µ g/mL Anticorpo soluzione (5 µ g totale; 2 µ g/cm2) sul coprioggetto affinché si forma una bolla al centro del coprivetrino e si diffonde ai bordi.
- Essere attenti a coprire l'intero vetrino coprioggetti, ma non lasciare che la soluzione di anticorpo di estendere oltre il bordo del vetrino coprioggetti e sulla plastica di coltura del tessuto. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
- Lavare i vetrini coprioggetto di pipettaggio 1 mL di PBS sterile nel bene e, successivamente, aspirare la soluzione. Ripetere altre due volte per rimuovere gli anticorpi non legati.
- Aggiungere 1 mL di PBS sterile la ben contenente il coprioggetto anticorpo-rivestite fino a quando le cellule sono pronte per essere aggiunti.
Nota: Lamelle possono essere conservate a temperatura ambiente, coperto con PBS, per l'uso sullo stesso giorno.
4. diffusione sulle lamelle Anti-Ig-rivestito delle cellule B
- Preparare per volta tamponata HEPES salino (mHBS): 25mm HEPES, pH 7,2, 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1mm Na2HPO4, 0,5 mM MgSO4, destrosio di 1 mg/mL, glutamina 2mm, piruvato di sodio di 1 mM e 50 µM 2-mercaptoetanolo). Filtro sterilizzare questa soluzione e conservare a 4 ° C.
- Il giorno dell'esperimento, fare 50 mL di mHBS con 2% FBS (mHBS-FBS) aggiungendo 1 mL di FBS inattivati a 50 mL mHBS. Caldo mHBS-FBS a 37 ° C prima dell'uso.
- Centrifugare le cellule transfected A20 o le cellule di B primarie che erano state coltivate con BAFF plus LPS a 525 x g per 5 min.
- Risospendere le cellule in 1 mL di mHBS-FBS, contare le celle utilizzando un emocitometro e diluire le cellule a 2 x 105 cellule/mL in mHBS-FBS.
- Usando il forcipe, trasferire il coprioggetto dalla piastra di coltura del tessuto per un pezzo di pellicola di paraffina.
- Aggiungere 250 µ l di B cellule (5 x 104 ) per ogni vetrino coprioggetti.
- Incubare i vetrini coprioggetti a 37 ° C per 15 min al buio per consentire le cellule B a diffondersi su tutta la superficie anti-IgG-rivestito.
5. fissaggio e Immunostaining le cellule
- Preparare la soluzione di fissazione diluendo la soluzione di riserva 16% paraformaldeide e la soluzione di riserva 50% glutaraldeide in acqua distillata a temperatura ambiente per produrre concentrazioni finali di 3% di paraformaldeide e 0,1% di glutaraldeide. Preparare la soluzione di fissazione del giorno che è di essere usato e scartare qualsiasi eccesso.
Attenzione: Le soluzioni stock paraformaldeide e glutaraldeide devono essere utilizzate solo in una cappa chimica. Seguire le istruzioni della scheda di dati di sicurezza (MSDS). - Preparare il tampone di permeabilizzazione/blocco (3% BSA e 0,1% Triton X-100 diluito in PBS). Filtro sterilizzare questa soluzione e conservare a 4 ° C. Il giorno dell'esperimento, calda la quantità necessaria a temperatura ambiente.
- Preparare il tampone di colorazione (saponina BSA e 0,1% 1% in PBS). Questa soluzione utilizzando un filtro di 0,2 µm di sterilizzare e conservare a 4 ° C. Il giorno dell'esperimento, calda la quantità necessaria a temperatura ambiente.
- Pipettare 350 µ l della soluzione di fissaggio su ogni vetrino coprioggetti, assicurando che la superficie sia completamente coperta. Incubare a temperatura ambiente per 10 min al buio.
- Rimuovere la soluzione di fissaggio da coprivetrino aspirando attentamente dal bordo del coprivetrino utilizzando una micropipetta.
Attenzione: La soluzione di fissaggio deve essere eliminata come rifiuti chimici pericolosi. - Lavare i vetrini coprioggetti una volta con 500 µ l di tampone di permeabilizzazione/blocco. Dispensare il liquido.
- Permeabilize e bloccare le cellule aggiungendo 250 µ l di tampone di permeabilizzazione di blocco per ogni vetrino coprioggetto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Diluire 1: 100 dell'anticorpo anti-tubulina coniglio nella macchiatura buffer.
- Aspirare il tampone permeabilizzazione/blocco da lamelle e aggiungere 50 µ l della soluzione diluita dell'anticorpo anti-tubulina ogni vetrino coprioggetti. Incubare a temperatura ambiente per 30 min al buio.
- Preparare la soluzione di anticorpo secondario/actina macchia diluendo falloidina coniugati Alexa Fluor 568 1: 100 in buffer di colorazione sia l'anticorpo secondario coniugato con Alexa Fluor 532 capra anti-coniglio IgG.
- Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte per rimuovere l'anticorpo primario in eccesso aggiungendo 500 µ l di buffer di colorazione e quindi ad aspirazione e.
- Aggiungere 50 µ l della soluzione macchia secondaria dell'anticorpo/actina ogni vetrino coprioggetto e incubare per 30 min a temperatura ambiente al buio.
- Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte per rimuovere l'eccesso anticorpo secondario aggiungendo 500 µ l di buffer di colorazione e quindi ad aspirazione e.
- Aggiungere 10 µ l di reagente di montaggio di un vetrino da microscopio. Montare il vetrino coprioggetto sulla diapositiva microscopio con il lato di cella verso il basso.
Nota: Un mezzo di montaggio "anti-dissolvenza" (Vedi Tabella materiali) è fortemente consigliato per preservare l'intensità della fluorescenza delle proteine di fusione di GFP. Evitare l'uso di reagenti contenenti DAPI, che può interferire con l'imaging dei fluorophores quando si utilizza il laser STED di montaggio. - Lasciare i vetrini per asciugare durante la notte al buio. Le diapositive di immagini il giorno successivo.
Nota: Le diapositive di Imaging, non appena il coprioggetto è asciutto è fortemente consigliato, come la fluorescenza di GFP si riduce nel tempo.
6. imaging mediante il microscopio STED
Nota: Si prega di notare che tutti i passaggi di software descritte di seguito sono specifici per il microscopio e il software che abbiamo usato (Vedi la Tabella materiali). I passaggi e le impostazioni dovrà essere regolato se imaging viene eseguita utilizzando un microscopio/software diversi.
- Accendere il microscopio STED, attivare il laser e la lampada di illuminazione epifluorescenza e avviare il software di microscopio.
- Impostare i parametri per i laser di svuotamento STED.
Nota: Questo dipenderà il microscopio specifico utilizzato e i laser che è dotato. Alcune consigliate sono le impostazioni di luce bianca (WLL) 70%; 592 nm laser 80%; 660 nm laser 80%. - Attivare le impostazioni di STED e allineare i raggi laser STED utilizzando l'obiettivo 100x.
- Utilizzando l'oculare, concentrare il campione e selezionare una cella con espressione di GFP moderata.
Nota: Espressione di GFP basso non sarà visibile perché STED riduce l'intensità di emissione. Al contrario, un'alta espressione di CLIP-170-GFP induce la formazione spontanea di cluster di grandi dimensioni, che non riflette il normale microtubule plus-fine proteina complessa morfologia e distribuzione. Selezionando una cella con espressione moderata GFP è essenziale per l'imaging con precisione le strutture citoscheletriche il contatto dell'antigene. - Zoom nella cella selezionata e scegliere la regione di interesse per l'imaging. Regolare il fuoco in modo che il piano x-y della cellula B che è più vicino il coprioggetto è a fuoco.
- Per effettuare questa operazione, è possibile spostare progressivamente più vicino l'obiettivo al vetrino coprioggetti in modo che le strutture del citoscheletro delle cellule di B vengono messi a fuoco e poi andare fuori fuoco. Poi gradualmente spostare l'obiettivo nella direzione opposta fino a quando le strutture del citoscheletro delle cellule di B prima tornare a fuoco.
- Ottimizzare le impostazioni tra cui la potenza del laser, fascio di eccitazione e gamma del rivelatore. Iniziare con le impostazioni consigliate dalle istruzioni del produttore. Quindi apportare modifiche necessarie per ottimizzare il segnale per i campioni. Tutti i campioni da confrontare a vicenda con le stesse impostazioni di immagine.
- Sotto la scheda "acquisire" del software, impostare l'acquisizione dell'immagine su acquisizione sequenziale fotogramma nel pannello inferiore sinistro "Scansione sequenziale" selezionando l'opzione "tra i frame".
- Impostare la sequenza di acquisizione.
Nota: Acquisiamo la fluorescenza di GFP in primo luogo al fine di evitare la degradazione del segnale GFP.
A seconda della combinazione di fluorofori utilizzati oltre a GFP, prima il segnale di fluorescenza di lunghezza d'onda più lungo di imaging può produrre risultati migliori. Tuttavia, l'ordine in cui i fluorofori o proteine fluorescenti sono sottoposti a svuotamento stimolato dell'emissione e imaged dovrebbe essere ottimizzato per ottenere i più forti segnali di fluorescenza e la migliore risoluzione. - Selezionare e impostare la potenza del laser STED per ogni fluoroforo sotto la scheda "Acquire" del software e utilizzare la barra di scorrimento per il 592-nm o il laser STED 660 nm per regolare la potenza del laser. Regolare la potenza del laser lo svuotamento 592-nm per GFP e Alexa Fluor 532. Regolare la potenza del laser di svuotamento di 660 nm per Alexa Fluor 568.
- Per aumentare la risoluzione e ridurre il segnale di fondo, andare alle impostazioni "Acquisizione" sotto la scheda "Acquire" del software, aumentare la linea e/o il frame in media selezionando un valore maggiore di 1 utilizzando il menu a discesa per ogni opzione.
- Inoltre, acquisire il segnale fluorescente usando tempo-gated STED spuntando l'opzione gating per il fluoroforo sotto la scheda "Acquire", e specificando i valori per tempo-gating (Vedi nota sotto). Aumentare la potenza del laser STED per migliorare la risoluzione, anche se ciò aumenterà anche photobleaching di fluorophores.
Nota: Il tempo di gating dovrà essere ottimizzato per il microscopio, il campione e fluorofori utilizzati. Un tempo gating da 0,3 a 6 ns è raccomandato. Dopo la fissazione, la GFP è particolarmente sensibile ad alta potenza laser. Per ridurre il photobleaching di GFP, deve essere applicato il tempo gating e la potenza del laser STED deve essere ridotta. - Per catturare immagini in 3D STED, usare il cursore per modificare il punto diffusa funzione (PSF) in "3D STED".
- Acquisire manualmente immagini multiple per assicurare la riproducibilità. Deconvoluzione le immagini (Vedi Figura 1) utilizzando un software di deconvoluzione di confezionare41(Vedi Tabella materiali).
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Representative Results
Per le cellule B diffusione su immobilizzato anti-Ig, microscopia STED utilizzata in combinazione con il software di deconvoluzione fornisce immagini ad alta risoluzione delle strutture citoscheletriche di microscopia confocale. Questo è evidente nella Figura 1, dove la rete di F-actina è stata visualizzata mediante il protocollo descritto sopra. Un confronto tra confocale e immagini ad alta super-risoluzione STED dello stesso esempio illustra che le immagini STED sono di maggiore risoluzione e rivelano maggiori strutture del citoscheletro (Figura 1). Questa figura mostra anche che deconvoluzione è essenziale per ottenere immagini di alta qualità STED in quali actina filamenti sono definiti più chiaramente. Sebbene deconvoluzione delle immagini confocal si ottiene un miglioramento sostanza nella risoluzione dell'immagine, Quantificaizone STED immagini forniscono informazioni più dettagliate strutturali di Quantificaizone immagini confocal. In particolare, la struttura dendritica dell anello periferico di F-actina si rivela più dettagliatamente da microscopia STED (Figura 1 e Figura 2). La rete dei microtubuli del contatto antigene era imaged anche usando la preparazione del campione e imaging protocollo descritto sopra (Figura 3). Microtubuli provengono da un punto centrale, ovvero il MTOC, ed emanano verso l'esterno verso la periferia della cellula. In questo esperimento, le cellule di B sono stati ammessi a diffondersi sulle lamelle anti-Ig-coated per 15 min (Figura 3), un punto di tempo in cui il MTOC è spostato verso l'antigene contatto sito17. I cluster di CLIP-170-GFP che contrassegnano la plus-fine dei microtubuli possono essere visto alle estremità dei microtubuli illustrati nella Figura 3. Quando la preparazione del campione e STED imaging della rete dei microtubuli è ottimale, continuo e distinti i microtubuli sono osservati, con CLIP-170-GFP localizzate lungo i microtubuli o alle plus-estremità (Figura 3A). Sub-ottimale dei microtubuli che macchia, che è stato osservato quando si utilizzano concentrazioni più basse di macchiatura anticorpi o lotti di anticorpi di α-tubulina che sono più di un anno di età, risultati in microtubuli che appaiono come sezioni discontinue che vengono mal risolte al momento di deconvoluzione (Figura 3B; Vedi anche Figura 5). Anche se tutti la fluorescenza di CLIP-170-GFP in queste immagini è associata con α-tubulina-immunostained strutture, uno non può distinguere se CLIP-170-GFP si trova alle estremità plus, o lungo la lunghezza dei microtubuli, colorazione incompleta dei microtubuli. Quindi è importante che l'anticorpo di α-tubulina essere archiviati sotto il produttore condizioni di stoccaggio raccomandate e utilizzato entro un anno.
Utilizzando questo protocollo, le immagini di STED multi-colore di alta qualità che mostrano l'organizzazione e la struttura del citoscheletro di actina e i microtubuli, come pure proteine quali IQGAP1 e CLIP-170 che associano con questi due cytoskeletons17, potrebbe essere acquisita. Le immagini STED nella Figura 4 mostrano l'anello periferico di actina dendritica, come pure i microtubuli che emanano da una posizione centrale nella cella dove la colorazione di actina è molto meno densa. CLIP-170-GFP alle estremità di questi microtubuli è strettamente associato con il periferico F-actina. Questo protocollo permette di visualizzare le strutture citoscheletriche alla sinapsi immunitaria utilizza colore singolo STED imaging (Figura 2) o multicolor STED imaging (Figura 3 e Figura 4). Tuttavia, dovrebbe essere notato che la formazione immagine STED singolo colore (Figura 2) può produrre la migliore risoluzione delle strutture di actina e i microtubuli in cellule di B di multi-colore STED (Figura 4). Questo può essere dovuto photobleaching causato da acquisizione di immagini STED sequenziale per i diversi fluorofori. Per ottenere le migliori immagini di Super-risoluzione, la combinazione di fluorofori e proteine fluorescenti selezionate, come pure la sequenza in cui sono evidenziati chiaramente usando i laser di eccitazione e lo svuotamento, dovrebbe essere ottimizzato per il campione. Tuttavia, multi-colore STED formazione immagine fornisce immagini ad alta risoluzione di queste strutture citoscheletriche di microscopia confocale convenzionale. Inoltre, STED di singolo-colore può essere utilizzato per acquisire immagini ad alta super-risoluzione 3-dimensionale della rete intera B cella actina o dei microtubuli (1 film).
Quando usando le cellule transfected con proteine di fusione fluorescenti, conseguire i livelli di espressione ottimale ed evitare artefatti dovuto sovraespressione sono considerazioni rilevanti. Nelle cellule dove è overexpressed CLIP-170-GFP, si formano grandi aggregati di CLIP-170-GFP (Figura 5A). Oltre a questo mislocalization di CLIP-170-GFP, solo una parte della rete dei microtubuli in questa cella era all'interno del piano focale più vicino il coprioggetto (figura 5B). Ciò suggerisce che la sovraespressione di CLIP-170 può anche alterare la polarizzazione indotta da BCR MTOC. Al contrario, perché segnali di forte fluorescenza sono in genere necessari per l'acquisizione di immagini di alta qualità STED, bassa espressione di proteine di fusione fluorescenti come CLIP-170-GFP (Figura 5) si traduce in immagini di scarsa qualità. Quindi, quando si utilizza celle che sono state trasfettate con proteine fluorescenti, è importante solo quelle cellule con livelli ottimali di espressione della proteina di fusione di immagine. È anche importante notare che il protocollo di transfezione utilizzato per A20 cellule (Vedi Tabella materiali) in genere risultati nel 20-50% delle cellule esprimenti la proteina trasfettata. Per il DNA del plasmide (al contrario di siRNA), frequenze di transfezione di cellule B primarie sono spesso molto inferiore a quello di celle A20, che richiedono l'uso di linee di cellule di B. Tuttavia, immagini di alta qualità STED di elementi del citoscheletro in cellule B primarie untransfected possono essere ottenute utilizzando questo protocollo (Figura 6).
Figura 1: confronto tra confocale e STED imaging di F-actina. Immagini confocal (in alto) e STED immagini (in basso) di una cella A20 che si era sparso sulle lamelle anti-IgG-coated per 15 min prima di essere macchiato con falloidina Alexa Fluor 532-coniugati. Utilizzando il microscopio confocale di STED, la stessa cella era imaged in primo luogo mediante microscopia confocale e quindi di STED. L'iniziale confocale STED sono mostrate le immagini, insieme con la stessa confocale e immagini STED dopo deconvoluzione. Barra della scala: 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: il citoscheletro di actina del antigene contatto. Le celle A20 che erano state lasciate a diffondersi sulle lamelle anti-IgG-coated per 15 min erano macchiate con falloidina Alexa Fluor 568-coniugati e ripreso da microscopia STED. Le immagini STED iniziale erano deconvolute. Pannelli A-B e pannelli C-E mostrano immagini rappresentative di due diverse cellule. Pannello E Mostra un ingrandimento X 3 della regione nel riquadro bianco nel pannello C. Barra della scala per pannelli A-D: 5 µm. scala bar per pannello E: 1 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: immagini STED della rete dei microtubuli e CLIP-170-GFP. A20 cellule esprimenti CLIP-170-GFP sono stata autorizzate a diffondere il coprioggetti anti-IgG-coated per 15 min prima di essere fissata e immunostained con un anticorpo di α-tubulina plus un anticorpo secondario coniugato con Alexa Fluor 532. (A) immagine rappresentativa risultati immunostaining della rete dei microtubuli, con CLIP-170-GFP situate principalmente alle plus-estremità dei microtubuli. (B) la marcatura sub-ottimale e la risoluzione dei microtubuli dovute all'uso di uno stock obsoleto di anticorpo di α-tubulina. Scala bar: 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: immagini STED dell'actina e microtubule cytoskeletons. A20 cellule esprimenti CLIP-170-GFP sono stata autorizzate a diffondere sulle lamelle anti-IgG-coated per 15 min prima di essere fissato e tinto con Alexa Fluor 568-coniugato falloidina visualizzare F-actina e un Alexa Fluor 532-coniugate con un anticorpo di α-tubulina anticorpo secondario per visualizzare i microtubuli. Pannelli A-D e pannelli E-F Visualizza immagini rappresentative di due diverse cellule. Pannello D è un ingrandimento X 3,5 della regione nel riquadro bianco nel pannello C. Scala bar: 5 µm per pannelli A-C ed E-F; 1 µm per pannello D. L'immagine nel pannello A è la stessa immagine utilizzata in Figura 3A , ma include la sovrapposizione del canale F-actina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: esempi di immagini di STED di scarsa qualità a causa di insufficiente espressione della proteina di fusione GFP o sovraespressione. A20 cellule esprimenti CLIP-170-GFP sono stata autorizzate a diffondere sulle lamelle anti-IgG-coated per 15 min prima di essere fissato e macchiato come illustrato nella Figura 4. (A, B) Risultati di CLIP-170-GFP sovraespressione in aggregati grandi, anormali della CLIP-170-GFP (A) e alterata MTOC polarizzazione verso il contatto dell'antigene del sito (B). (C) compensazione per insufficiente espressione di CLIP-170-GFP aumentando i risultati di potere del laser in immagini di scarsa qualità STED. Scala bar: 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: immagine STED del citoscheletro dei microtubuli in cellule primarie di B. Cellule di B spleniche primarie erano coltivate per 6 h con 5 ng / µ l BAFF plus 2,5 µ g/mL LPS e quindi autorizzate a diffondere per 15 min sulle lamelle che erano stato ricoperto con gli anticorpi anti-IgM. Le cellule erano quindi fissi e macchiato con un anticorpo di α-tubulina plus un anticorpo secondario coniugato con Alexa Fluor 568 visualizzare i microtubuli. Viene mostrata un'immagine rappresentativa. Barra della scala: 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Movie 1: ricostruzione 3D della rete dei microtubuli delle cellule di B. Le celle A20 sono stata autorizzate a diffondere su vetrini coprioggetti anti-IgG-coated per 15 min prima di essere fissata e immunostained con un anticorpo di α-tubulina plus un anticorpo secondario coniugato con Alexa Fluor 488. Z-fette vennero catturati a 0,2 µm dimensioni di passaggio per un totale di 37 cornici. Ricostruzione 3D è stato fatto uso del microscopio STED di software di imaging. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
Immagini dettagliate di strutture citoscheletriche possono essere ottenuti usando la microscopia STED super-risoluzione, che teoricamente può raggiungere una risoluzione di 50 nm, rispetto al convenzionale microscopia confocale, per cui la risoluzione di diffrazione limitata è ~ 200 nm 24. la capacità di risolvere strutture più fini è ulteriormente migliorata utilizzando software di deconvoluzione per calcolare la posizione più probabile della sorgente luminosa originale dal segnale di fluorescenza "offuscata" osservati. Questo protocollo descrive i metodi per l'utilizzo di STED all'immagine il cytoskeletons actina e dei microtubuli, come pure le proteine associate al citoscheletro.
L'attivazione delle cellule b induce rimodellamento del citoscheletro di actina sia la rete dei microtubuli, con la regolazione coordinata dei due cytoskeletons sono importanti per formazione sinapsi immuni17,42. Il metodo che presentiamo è stato ottimizzato per l'imaging simultaneamente l'actina e microtubule cytoskeletons del contatto antigene utilizzando multi-colore STED, ma è ugualmente applicabile per singolo colore STED. Gli studi precedenti che abbiamo condotto sul clou del citoscheletro delle cellule di B che STED può fornire nuove intuizioni strutture cellulari come sono organizzati e come interagiscono con a vicenda. Usando la microscopia confocale e totale interno fluorescenza (TIRF), avevamo osservato che i microtubuli contattare l'anello di F-actina alla periferia del sito contatto antigene17. Usando la microscopia STED, siamo stati in grado di dimostrare che le estremità più dei microtubuli che sono stati contrassegnati dal + TIP CLIP-170 associare strettamente con la rete di actina dendritiche alla periferia delle cellule (Vedi Figura 4).
Influenza di molteplici fattori quale tecnica di imaging è più adatto per la specifica applicazione. Questi includono la risoluzione che è necessaria, le strutture per l'imaging, la tecnica d'etichettatura e rapporto segnale-rumore (cioè, contrasto), tempo di acquisizione, facilità di preparazione del campione e riproducibilità. Preparazione del campione per STED non è significativamente diverso da quello per la microscopia confocale e combina con acquisizione rapida di immagini ad alta risoluzione. Che è un processo ottico in cui l'immagine viene acquisito direttamente dal campione e la risoluzione può essere registrata cambiando la potenza del laser STED24è dei principali vantaggi di STED. A differenza di microscopia di Super-risoluzione di stato fondamentale lo svuotamento, che ricostruisce immagini da migliaia di immagini successive cattura, esteso trattamento computazionale non è richiesto per STED e si evita l'introduzione di artefatti ricostruzione dell'immagine 24. Tuttavia, il contrasto nelle immagini STED è spesso basso24, in cui post-l'immagine elaborazione del caso utilizzando software come ImageJ può essere necessaria per migliorare il contrasto. Ciò è particolarmente importante per le immagini con strutture dense, ad esempio una rete di actina dendritiche. Per migliorare il contrasto dell'immagine durante l'acquisizione di immagini, uno può ridurre la potenza del laser di svuotamento e/o applicare la linea o il frame in media. Tempo-gated STED, che cattura i fotoni dopo un ritardo specificato dall'utente, può aumentare la risoluzione facendo diminuire l'area da cui i fotoni sono raccolti24,43. Ti consigliamo di ottimizzare l'imaging STED delle strutture citoscheletriche alla sinapsi immune utilizzando una combinazione di questi metodi per migliorare il contrasto e risoluzione.
Attualmente, non tutti i fluorofori sono ottimali per l'imaging con STED, e non tutte le combinazioni di fluoroforo sono adatte per l'ottenimento di immagini a multi-colori STED. Attenta regolazione degli intervalli di rilevazione è importante per garantire minimo trapasso di fluorofori in canali adiacenti. La combinazione di fluorofori utilizzati in questo protocollo (cioè, GFP, Alexa Fluor 532 e Alexa Fluor 568) è ottima per l'imaging di Super-risoluzione STED multicolor. Rispetto alla microscopia strutturata di illuminazione (SIM) e metodi di localizzazione di singola molecola (SMLM), come il microscopio di localizzazione foto-attivata (PALM), STED non è in genere ideale per l'imaging multi-colore. Tuttavia, indichiamo qui quel lieve sovra-saturazione del fluoroforo rilevamento, accoppiato con semplici strumenti di elaborazione, in grado di fornire immagini ad alta risoluzione multi-colore della cytoskeletons di actina e dei microtubuli.
Questo protocollo per l'imaging di STED delle strutture citoscheletriche ha rivelato nuovi dettagli dell'architettura del citoscheletro alla sinapsi immunitaria delle cellule di B. Anche se abbiamo ottimizzato questo protocollo per l'actina e microtubule cytoskeletons presso il sito di antigene-contatto in cellule di B di imaging, questi metodi dovrebbero essere applicabili ad altri tipi di cellule, soprattutto le cellule immuni (cellule T, cellule NK, mastociti, ecc.) che formano immunitario le sinapsi. Inoltre, l'utilità di questo protocollo potrebbe essere esteso a lamelle con altri leganti o substrati adesivi del rivestimento. Tuttavia, è importante ottimizzare il protocollo e le impostazioni di acquisizione di immagine per il tipo di cella e il set-up sperimentale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo la struttura di Imaging di UBC Life Sciences Institute (LSI) per sostenere e mantenere il microscopio STED. Questo lavoro è stato finanziato da grant #68865 l'istituti canadesi di ricerca sanitaria (a M.R.G.). Ringraziamo il dottor Kozo Kaibuchi (Università di Nagoya, Nagoya, Giappone) per il plasmide CLIP-170-GFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| A20 mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamine | Millipore Sigma | G5763 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P5280 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid, 10,000 units |
| Additional materials for primary B cells | |||
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| Magnetic bead-based B cell isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep Mouse B cell Isolation kit |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS from E. coli 0111:B4 |
| B cell-activating factor (BAFF) | R&D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid encoding CLIP-170-GFP | Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
| Recommended transfection reagents and equipment | |||
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Falcon 6-well plates, TC treated, sterile | Corning | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating coverslips | |||
| 18-mm diameter round #1.5 cover glasses | Thomas Scientific | 1217N81 | Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580 |
| Forceps | Fisher Scientific | 1381242 | Dissecting extra fine splinter forceps |
| Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate | Corning | 353043 | |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | For A20 cells |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | For primary mouse B cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Paraformaldehyde (16% stock solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute with PBS to working concentration |
| Glutaraldehyde (50% stock solution) | Millipore Sigma | 340855 | Dilute with PBS to working concentration |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| Bovine serum albumin (BSA), Fraction V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| Rabbit anti-tubulin antibody | Abcam | ab52866 | 1:250 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 1:100 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1:100 dilution recommneded but should be optimized |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Without DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica | ||
| Huygens deconvolution software | Scientific Voume Imaging | See https://svi.nl/HuygensProducts |
References
- Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).
- Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
- Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
- Dustin, M. L. Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses. Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).
- Dustin, M. L. Modular design of immunological synapses and kinapses. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).
- Dustin, M. L. Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses. Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).
- Dustin, M. L. Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Monks, C. R., et al. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Yuseff, M. I., et al. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).
- Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).
- Kuhn, J. R., Poenie, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).
- Wang, J. C., et al. The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).
- Schnyder, T., et al. B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster. Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).
- Nath, S., et al. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).
- Combs, J., et al. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).
- Fukata, M., et al. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109 (7), 873-885 (2002).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X.
- Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
- Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).
- Tamarit, B., et al. Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells. J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).
- Brown, A. C., et al. Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins. Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).
- Dupre, L., et al. T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors. Front Immunol. 6, 586 (2015).
- Rak, G. D., et al. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
- Lin, K. B., et al. The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas. Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).
- Lin, K. B., et al. The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands. Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).
- McLeod, S. J., et al. The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes. J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).
- Christian, S. L., et al. Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation. J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Treanor, B., et al. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).
- Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
- Yuseff, M. -I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Russ, J. C. The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , CRC Press. (2011).
- Stinchcombe, J. C., et al. Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse. Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).
- Vicidomini, G., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).
