Summary
Nous présentons un protocole pour microscopie STED simultanément les structures image actine, microtubules et protéines microtubule bout plus contraignantes dans les cellules de B qui se sont propagés sur lamelles recouvertes d’anticorps dirigés contre le récepteur des cellules B, un modèle pour la phase initiale de formation de la synapse immunitaire.
Abstract
Les lymphocytes B qui se lient aux antigènes membranaires (par exemple, sur la surface d’une cellule de présentatrices) forment une synapse immunitaire, une structure cellulaire spécialisée qui optimise la signalisation de cellules B récepteur (BCR) et acquisition d’antigène induite par la BCR. Le remodelage du cytosquelette d’actine et de la réorientation de la réseau de microtubules vers le site de contact de l’antigène sont essentiels pour la formation des synapses immunitaire. Remodelage du cytosquelette d’actine dans un anneau périphérique dense d’actine-F est accompagnée par la polarisation du pôle Organisation des microtubules vers la synapse immunitaire. Protéines microtubule bout plus contraignantes, ainsi que les protéines corticale plus-fin capture la médiation des interactions physiques entre l’actine et des microtubules cytosquelettes, qui leur permettent d’être réorganisé de manière coordonnée. Élucider les mécanismes que cette réorganisation du cytosquelette, mais aussi comprendre comment ces structures du cytosquelette façonner la formation des synapses immunitaire et BCR de signalisation, de contrôle peuvent apporter un nouvel éclairage sur l’activation des lymphocytes B. Cela a été favorisé par l’élaboration de méthodes de microscopie de Super-résolution qui révèlent de nouveaux détails de l’organisation en réseau du cytosquelette. Nous décrivons ici une méthode pour microscope émission stimulée épuisement (STED) simultanément les structures image actine, microtubules et plus-fin transfectées GFP-étiquetée microtubule protéines dans les cellules de B. Pour modéliser les événements précoces dans la formation des synapses immunitaire, nous laisser diffuser sur lamelles enduites d’anticorps de anti-l’immunoglobuline (anti-Ig), qui déclenchent la BCR de signalisation et de remodelage du cytosquelette des cellules B. Nous fournissons des protocoles étape par étape pour exprimer les protéines de fusion de GFP dans des cellules A20 B-lymphome, pour la diffusion cellulaire induite par l’anti-Ig et pour la fixation ultérieure de cellule, immunomarquage, acquisition d’images et image déconvolution étapes. Les images haute résolution obtenues à l’aide de ces procédures permettent de visualiser simultanément les structures de l’actine, les microtubules et les protéines de liaison de plus en bout de microtubules qui peuvent lier ces deux réseaux du cytosquelette.
Introduction
Quand les cellules B lient à polarisé tableaux d’antigènes (p. ex., affichés sur l’aire des présentatrices d’antigène cellules (CPA)), le récepteur des cellules B (BCR) qui en résulte la formation d’une structure classique de synapse immunitaire, qui a été décrit dans les disques de signalisation T les cellules1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Au départ, amas de forme de RCO antigène liée à la périphérie de la cellule B : APC Contactez le site. Ces amas se déplacent ensuite vers le centre du site contact de l’antigène, où ils se fondre en une grappe d’activation supramoléculaire central (cSMAC) qui constitue le noyau de la synapse immunitaire. La formation des synapses immunitaire optimise la signalisation de la BCR et facilite l’extraction induite par la BCR l’antigène de la membrane APC14. Cette acquisition d’antigène, qui est suivie de l’internalisation médiée par BCR antigène et du traitement subséquent de l’antigène, permet aux cellules de B de présenter peptide : MHC complexes II aux cellules T et susciter des lymphocytes T aide14. Parce que la formation des synapses immunitaire favorise l’activation des lymphocytes B, élucider les mécanismes qui établissent que ce schéma fonctionnel de l’organisme récepteur peut fournir de nouveaux aperçus de comment d’immunité humorale sont initiées ou réglementés.
Réorganisation de l’actine et microtubules cytosquelettes est essentielle pour la formation des synapses immunitaire. BCR localisé signalisation stimulée par un tableau polarisé dans l’espace des antigènes induit rapide et spectaculaire de remodelage de l’actine cytosquelette1,15. La formation de structures dendritiques actine à la périphérie de la cellule B exerce des forces poussant sur la membrane plasmique et favorise la propagation des cellules B. Cela permet à la cellule B balayer une surface plus grande de la surface de l’antigène-roulement et augmente le nombre des RCO qui se lient à l’antigène et activer la BCR, voies de signalisation. Dans le même temps, la MTOC et le réseau de microtubules sont réorientés vers le site de contact de l’antigène. La MTOC approche le site contact de l’antigène, les microtubules émanant de la MTOC s’étendent le long de la face interne de la membrane plasmique à l’interface entre la cellule de B et de l’antigène-roulement surface16,17. Ces microtubules juxtamembrane peuvent alors servir de pistes pour le mouvement centripète dynéine-mediated de liaison antigène BCR amas18, conduisant à la formation d’un cSMAC.
La réorientation et la polarisation de la MTOC vers la synapse immunitaire nécessite l’actine intact et cytosquelettes des microtubules et dépend souvent des interactions entre l’actine corticale réseau et les microtubules16,17, 19,20. Protéines actine corticales, tels que IQGAP1, peuvent capturer des microtubules en interagissant avec des complexes protéiques qui décorent les microtubules plus-extrémités21. Ces dynamiques complexes de protéines liant le bout plus incluent EB1 et CLIP-170, qui sont collectivement désignés comme les microtubules plus-fin suivi de protéines (+ conseils)21,22. + Conseils aux extrémités des microtubules peuvent se lier aux protéines qui sont associées à la membrane plasmique ou le cytosquelette d’actine corticale. Cela permet les mécanismes générateurs de force (par exemple, la fin du moins de mouvement de dynéine corticalement ancrés le long des microtubules dirigé) pour exercer une force de traction sur les microtubules et ainsi replacer la MTOC. CLIP-170 peut se lier à la protéine d’échafaudage associées à l’actine IQGAP123, et nous avons montré que tous les deux de ces protéines sont nécessaires pour la polarisation induite par le BCR MTOC vers la synapse immunitaire17. Cette interaction IQGAP1-CLIP-170 peut jouer un rôle clé dans le remodelage du cytosquelette d’actine avec le repositionnement de la réseau de microtubules à la synapse immunitaire de B-cellule de coordination.
La microscopie en fluorescence conventionnelle a révélé la réorganisation dramatique de l’actine et des microtubules cytosquelettes lors de B-cellule immunitaire synapse formation2. Toutefois, cette approche ne peut pas résoudre les petites structures cellulaires en détail en raison de la limite de diffraction de la lumière, qui, conformément à la Loi de l’Abbe, dépend de la longueur d’onde de la lumière utilisée pour éclairer l’échantillon et l’ouverture de l' objectif24. Cette limite de diffraction limite la résolution des microscopes à lumière conventionnelles à 200-300 nm dans le sens latéral et de 500 à 700 nm dans le sens axial25. Par conséquent, plus petites structures subcellulaires, ainsi que les détails fins de l’actine et des microtubules cytosquelettes, pourraient être observées seulement au microscope électronique. Microscopie imagerie du cytosquelette prend du temps, nécessite des protocoles de fixation et préparation de témoin sévères qui peuvent altérer les structures biologiques et sont limite à médiée par les anticorps de détection. La capacité de réagissent et simultanément plusieurs protéines d’image ou de structures cellulaires est un avantage considérable de la microscopie de fluorescence. Par ailleurs, exprimant des protéines de fusion fluorescent dans des cellules permet une imagerie en temps réel et est utile lorsque des anticorps efficaces pour immunostaining la protéine d’intérêt ne sont pas disponibles.
Les progrès technologiques récents en microscopie de Super-résolution ont dépasser les limites de la diffraction de la lumière et a permis la visualisation des nano structures cellulaires24. Une telle technique de microscopie de Super-résolution est appelée émission stimulée épuisement (STED) microscopie. STED emploie deux lasers, où un seul laser excite le fluorophore et un deuxième laser avec un motif en forme de beignet sélectivement supprime l’émission de fluorescence autour le fluorophore. Ceci réduit la fonction de point-propagation (zone apparente) d’une seule particule fluorescente et fournit une diffraction sous limite image fluorescente25,26. Microscopie de l’appauvrissement de l’état fondamental emploie également basés sur la fluorescence des techniques d’acquisition d’images de Super-résolution. Cependant, les temps d’acquisition et de la reconstruction image sont longs, il y a seulement un nombre limité de fluorophores qui peut être utilisés, et l’imagerie haute résolution simultanée de plusieurs composants du cytosquelette est techniquement difficile parce qu’il est maintenant structures d’actine et les microtubules nécessite des procédures différentes de fixation. Par conséquent, STED a plusieurs avantages par rapport à la microscopie électronique et autre microscopie Super-résolution s’approche car elle offre d’acquisition d’images rapide, a des exigences minimales de post-traitement et emploie les mêmes fluorophores et techniques de coloration qui sont utilisés pour la microscopie de fluorescence conventionnels d’échantillons fixe26.
Super-résolution microscopie a maintenant été utilisée pour visualiser des structures de l’actine à la synapse immunitaire aux cellules tueuses naturelles de (NK) et T cellules26,27,28,29,30, 31. Toutefois, imagerie de Super-résolution du cytosquelette de microtubules, ainsi que la réorganisation coordonnée de l’actine et des microtubules cytosquelettes au cours de la formation des synapses immune, a seulement récemment rapporté17. Nous avons utilisé la microscopie STED pour les cellules d’image B qui avaient été autorisées à diffuser sur les lamelles enduites d’anticorps de anti-l’immunoglobuline (anti-Ig), qui stimulent la BCR de signalisation et de lancer la réorganisation du cytosquelette. Quand plaqué sur les anticorps anti-Ig immobilisés, les cellules B subissent dramatique s’étalant actine-dépendante, qui récapitule les événements initiaux au cours de la formation des synapses immunitaire. Ce qui est important, la microscopie STED a révélé les détails de l’anneau dendritique d’actine-F qui se forme à la périphérie du système immunitaire font synapse et a montré que la MTOC, ainsi que les microtubules attachées à elle, avaient déménagé à proximité de l’antigène contact site17. Ces microtubules étendu vers l’extérieur vers l’anneau périphérique d’actine-F. En outre, imagerie STED multicolore de diverses combinaisons de F-actine, tubuline, IQGAP1 et GFP-étiquetée CLIP-170 + conseils ont montré que les microtubules plus-extrémités marquées par CLIP-170-GFP étaient étroitement liés avec le réseau d’actine périphérique et IQGAP1, un corticale capture protéines17.
Nous présentons ici un protocole détaillé d’imagerie de l’actine et des microtubules cytosquelettes à la synapse immunitaire à l’aide de la microscopie STED. Ces méthodes ont été optimisées en utilisant la ligne de murin B cellule A20, qui a été largement utilisée pour l’étude de signalisation de la BCR et synapse immunitaire formation17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. parce que les anticorps commerciaux à CLIP-170 ne fonctionnent pas bien pour l’immunomarquage dans des expériences antérieures, nous décrivons en détail l’expression de la GFP-étiquetée CLIP-170 dans les cellules A20, ainsi que de protocoles pour visualiser simultanément jusqu'à la coloration trois éléments du cytosquelette ou protéines associées au cytosquelette. Méthodes pour l’utilisation de la microscopie STED à l’actine image aux synapses immunitaires de cellules NK ont été décrits précédemment40. Ici, nous étendre cela à acquérir des images de Super-résolution multicolore de cytosquelettes fois l’actine et les microtubules dans les cellules de B.
Un facteur critique pour la microscopie de Super-résolution est en utilisant les procédures de fixation appropriés pour le maintien des structures cellulaires et prévenant les dommages aux protéines fluorescentes. La fixation et coloration des méthodes présentées ici ont été optimisés afin de conserver la fluorescence GFP et fournir une imagerie des réseaux actine et les microtubules. En exprimant des protéines fluorescentes, il convient de noter que les cellules B sont généralement difficiles à transfecter. Utilisant ce protocole, 20-50 % de l’A20, cellules expriment généralement la protéine de fusion de GFP transfectée, et parmi cette population, les niveaux d’expression de protéine sont variables. Néanmoins, l’imagerie Super-résolution d’actine et les microtubules en utilisant les procédures que nous décrivons est assez robuste et sont facilement obtenir des images de haute qualité. Malgré leur petite taille par rapport aux cellules A20, nous montrons que ces procédures peuvent également servir à l’image du réseau de microtubules dans les cellules de B primaires qui ont été brièvement activés avec le lipopolysaccharide (LPS). Nous avons montré qu’activés par le LPS des cellules de B primaires peuvent être transfectées avec siARN à relativement haute efficacité (c.-à-d., tels que l’appauvrissement de protéine peut être détectée par immunoblotting), ce qui les rend une bonne alternative à l’utilisation de lignées cellulaires B pour certaines études 17.
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Protocol
Toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par l’University of British Columbia Animal Care Committee.
1. exprimant des protéines de GFP-fusion dans les cellules A20 B-lymphome
- Toutes les cellules A20 en culture en milieu RPMI (RPMI 1640, additionné de 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF), 50 µM 2-mercaptoéthanol, 2 mM de glutamine, pyruvate de 1 mM, 50 U/mL de pénicilline et 50 µg/mL de streptomycine) à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire avec 5 % De CO2.
- Préparer le réactif de transfection (voir la Table des matières) selon les instructions du fabricant.
Remarque : Ce protocole a été optimisé pour les réactifs spécifiques et de protocole de transfection décrit dans la Table des matières. Les autres réactifs de transfection que nous avons essayé n’ont pas donné suffisamment efficacité de transfection. - Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifugeuse 2,5 x 106 A20 cellules (pour chaque transfection) pendant 5 min à 525 x g. remettre en suspension les cellules dans 100 µL de réactif de transfection contenant de 1 à 2,5 µg d’ADN plasmidique. Pour l’ADN codant la GFP-170-CLIP23, utilisez 2,5 µg par transfection. Mélanger doucement.
- Les cellules de transfert vers un puits d’une plaque 6 puits, puis réglez le volume à 2 mL avec préchauffé milieu RPMI complet. La culture des cellules pendant 18 heures à 37 ° C, afin de permettre l’expression de la protéine.
2. isoler les cellules de souris primaire B et leur activation au LPS
- Utiliser des outils chirurgicaux stérilisés pour retirer la rate de souris, suivant les protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux de l’institution.
- Dans la hotte de culture tissulaire, placer une passoire de cellule stérile 70 µm dans une boite de culture de tissus de 35 mm contenant 3 mL de PBS stérile de la température ambiante. Utilisez la partie en caoutchouc du piston d’une seringue de 5 ml pour écraser la rate à travers la crépine de la cellule.
- Pipette la suspension monocellulaire de splenoctyes dans un tube stérile de 15 mL et centrifuger à 525 x g pendant 5 min.
- Utiliser une isolation magnétique base perle B cell kit (voir Table des matières) pour obtenir une population fortement enrichie des cellules B.
- Remettre en suspension les cellules B à 3 x 10,6/ml en milieu RPMI complet complété avec 2,5 µg/mL LPS plus facteur (BAFF ; une cytokine de survie) d’activation de cellules de B de 5 ng/mL.
- Culture des cellules de 6 heures à 37 ° C.
3. revêtement couvre-objet en verre avec des anticorps Anti-Ig
- Préparer la solution d’anticorps pour enduire les lamelles couvre-objet. Diluer la solution mère d’anticorps Ig anti-chèvre-souris en température ambiante de PBS stérile pour préparer une solution à 12,5 µg/mL ; 400 µL de solution d’anticorps est requis pour chaque lamelle couvre-objet.
Remarque : Utilisez la anti-souris IgG de chèvre pour cellules A20 ; Utilisez chèvre anti-souris IgM pour les cellules de B primaires. Les anticorps IgG de chèvre ne lient pas bien aux récepteurs de Fc de souris. Toutefois, pour éviter toute éventuelle liaison aux récepteurs Fc, on peut utiliser F(ab) ou f2 fragments de anti-souris IgG ou des anticorps IgM anti-souris. - Tremper une lamelle de verre rond 18 mm #1.5 à 100 % de méthanol et laissez-le sécher complètement (~ 10 min).
- Avec une pincette, placer la lamelle séchée dans une culture de tissu de 12 puits plaque et pipette 400 µL de 12,5 µg/mL anticorps solution (5 µg total ; 2 µg/cm2) sur la lamelle couvre-objet pour qu’il forme une bulle au centre de la lamelle et s’étend jusqu’aux bords.
- Veillez à couvrir la lamelle entière, mais ne permettent pas la solution d’anticorps pour s’étendre au delà du bord de la lamelle de verre et sur le plastique de culture de tissus. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Laver les lamelles de pipetage 1 mL de PBS stérile dans le bien et par la suite aspirer la solution. Répéter deux fois plus d’enlever les anticorps non fixés.
- Ajouter 1 mL de PBS stérile dans la cupule contenant la lamelle revêtus d’anticorps jusqu'à ce que les cellules soient prêts à être ajoutés.
Remarque : Les lamelles peuvent être conservés à température ambiante, couvert avec du PBS, pour une utilisation sur le même jour.
4. les lymphocytes B épandage sur Anti-Ig-Coated lamelles couvre-objet
- Préparer modifiée HEPES-buffered saline (mHBS) : 25 mM HEPES, pH 7,2, 125 mM NaCl, KCl, 1 mM CaCl2à 5 mM, 1 mM Na2HPO4, 0,5 mM MgSO4, dextrose de 1 mg/mL, 2 mM de glutamine, pyruvate de sodium 1 mM et 50 µM 2-mercaptoéthanol). Filtre stériliser cette solution et conserver à 4 ° C.
- Le jour de l’expérience, faire 50 mL de mHBS avec 2 % SVF (mHBS-BF) en ajoutant 1 mL de FBS inactivés par la chaleur à 50 mL mHBS. Réchauffer le mHBS-FBS à 37 ° C avant utilisation.
- Centrifuger l’A20 transfectées ou les cellules de B primaires qui avaient été cultivées avec BAFF plus LPS à 525 x g pendant 5 min.
- Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de mHBS-FBS, compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et diluer les cellules à 2 x 105 cellules/mL dans le mHBS-FBS.
- Avec une pincette, transférer la lamelle de la plaque de culture tissulaire sur un morceau de pellicule de paraffine.
- Ajouter 250 µL de cellules de B (5 x 104 cellules) à chaque lamelle couvre-objet.
- Incuber les lamelles à 37 ° C pendant 15 minutes dans l’obscurité pour permettre les cellules B à étaler sur la surface anti-IgG-enduit.
5. fixation et immunomarquage des cellules
- Préparer la solution de fixation par dilution de la solution mère de paraformaldéhyde à 16 % et la solution mère de glutaraldéhyde à 50 % dans de l’eau distillée à température ambiante pour donner une concentration finale de glutaraldéhyde paraformaldéhyde et 0,1 % à 3 %. Préparer la solution de fixation sur la journée que c’est de servir et d’ignorer tout excès.
ATTENTION : Les solutions mères paraformaldéhyde et glutaraldéhyde ne doivent servir dans une hotte chimique. Suivez les instructions sur la fiche signalétique (FS). - Préparer le tampon perméabilisation/blocage (3 % de BSA et 0,1 % Triton X-100 dilué dans du PBS). Filtre stériliser cette solution et conserver à 4 ° C. Le jour de l’expérience, réchauffer la quantité requise à la température ambiante.
- Préparer le tampon de coloration (1 % de BSA et 0,1 % de saponine dans du PBS). Stériliser cette solution filtre 0,2 µm et conserver à 4 ° C. Le jour de l’expérience, réchauffer la quantité requise à la température ambiante.
- Pipette 350 µL de la solution de fixation sur chaque lamelle, veiller à ce que la surface soit entièrement recouverte. Incuber à température ambiante pendant 10 min dans l’obscurité.
- Enlever la solution de fixation de la lamelle couvre-objet en aspirant soigneusement le bord de la lamelle couvre-objet à l’aide d’une micropipette.
ATTENTION : La solution de fixation doit être jetée comme des déchets chimiques dangereux. - Laver les lamelles couvre-objet avec 500 µL de tampon de perméabilisation/blocage. Ajouter le liquide.
- Permeabilize et bloque les cellules en ajoutant 250 µL de tampon de perméabilisation/blocage à chaque lamelle et en incubant pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité.
- Diluer l’anticorps anti-tubuline lapin au 1/100 en souillant la mémoire tampon.
- Aspirer au large de la mémoire tampon de perméabilisation/blocage de le lamelles et ajouter 50 µL de la solution d’anticorps anti-tubuline dilué dans chaque lamelle couvre-objet. Incuber à température ambiante pendant 30 min à l’obscurité.
- Préparer la solution de tache d’anticorps secondaire/actine en diluant l’anticorps secondaire IgG anti-lapin de chèvre conjugué Alexa Fluor 532 et la phalloïdine conjugué Alexa Fluor 568 au 1/100 en souillant la mémoire tampon.
- Laver les lamelles 3 fois pour enlever l’excès d’anticorps primaire en ajoutant 500 µL de tampon de coloration et aspirant puis il.
- Ajouter 50 µL de la solution de tache d’anticorps secondaire/actine dans chaque lamelle et incuber 30 min à température ambiante dans l’obscurité.
- Laver les lamelles 3 fois pour enlever l’excès anticorps secondaire en ajoutant 500 µL de tampon de coloration et aspirant puis il.
- Ajouter 10 µL de réactif de montage d’une lame de microscope. Monter la lamelle sur la lame de microscope avec le côté de la cellule vers le bas.
Remarque : Un support de montage « anti-fade » (voir Table des matières) est fortement recommandé de conserver l’intensité de la fluorescence des protéines de fusion de GFP. Éviter l’utilisation de réactifs contenant DAPI, qui peut interférer avec l’imagerie des fluorophores lors de l’utilisation du laser STED de montage. - Laisser les lames sécher pendant la nuit dans l’obscurité. L’image de la glisse le lendemain.
Remarque : Les diapositives d’imagerie dès que la lamelle est sec est fortement recommandé, comme la fluorescence GFP va diminuer au fil du temps.
6. l’imagerie utilisant le Microscope STED
Remarque : Veuillez noter que toutes les étapes de logiciel décrites ci-dessous sont spécifiques au microscope et logiciel, nous avons utilisé (voir la Table des matières). Les étapes et paramètres devront être ajustées si l’imagerie est réalisée à l’aide d’un microscope/logiciel différent.
- Allumez le microscope STED, activer les lasers et la lampe d’éclairage épifluorescence et lancer le logiciel de microscope.
- Définissez les paramètres pour les lasers de déplétion STED.
Remarque : Cela dépendra du microscope spécifique utilisé et les lasers qui elle est équipée. Certains ont recommandé les paramètres sont lumière blanche (WLL) 70 % ; 592 nm laser 80 % ; 660 nm laser 80 %. - Activer les paramètres STED et aligner les faisceaux laser STED utilisant l’objectif X 100.
- À l’aide de l’oculaire, l’accent de l’échantillon et sélectionnez une cellule avec l’expression de la GFP modérée.
NOTE : Expression de la GFP faible sera pas visible car STED réduit l’intensité des émissions. À l’inverse, forte expression de CLIP-170-GFP induit la formation spontanée de grands groupes, qui ne reflète pas la morphologie complexe de protéine plus-fin normale microtubule et la distribution. En sélectionnant une cellule avec l’expression de la GFP modérée est essentiel pour l’imagerie avec précision les structures du cytosquelette sur le site de contact de l’antigène. - Zoomer dans la cellule sélectionnée et choisissez la région d’intérêt à être photographié. Ajuster le focus pour que le plan x-y de la cellule B qui est plus proche de la lamelle est au point.
- Pour ce faire, placer l’objectif progressivement de la lamelle couvre-objet pour que les structures du cytosquelette cellulaire B puis aller hors du foyer et venir dans le foyer. Puis déplacer progressivement l’objectif dans le sens inverse jusqu'à ce que les structures du cytosquelette cellulaire B tout d’abord revenir dans le foyer.
- Optimiser les paramètres, y compris la puissance du laser et faisceau d’excitation détecteur de portée. Commencez avec les paramètres recommandés par le fabricant. Puis faire des ajustements selon les besoins afin d’optimiser le signal pour les échantillons. Tous les échantillons à comparer les uns aux autres avec les mêmes paramètres de l’image.
- Sous l’onglet « acquérir » du logiciel, affectez l’acquisition d’image acquisition de trame séquentielle dans le panneau inférieur gauche « Scan séquentiels » en cochant l’option « entre cadres ».
- Définir la séquence d’acquisition.
Remarque : Nous acquérons la fluorescence GFP tout d’abord afin d’éviter la dégradation du signal GFP.
Selon la combinaison des fluorophores utilisés en plus de la GFP, le signal de fluorescence plus longs longueur d’onde d’imagerie tout d’abord peut donner de meilleurs résultats. Toutefois, l’ordre dans lequel les fluorophores ou protéines fluorescentes sont soumis à l’épuisement de l’émission stimulée et imagés doit être optimisé pour obtenir les plus forts signaux de fluorescence et la meilleure résolution. - Sélectionner et régler la puissance de laser STED pour chaque fluorophore sous l’onglet « Acquérir » du logiciel et utilisez la barre de défilement pour le 592 nm ou le laser STED de 660 nm pour ajuster la puissance du laser. Régler la puissance du laser de déplétion 592 nm pour GFP et Alexa Fluor 532. Régler la puissance du laser de déplétion de 660 nm pour Alexa Fluor 568.
- Pour augmenter la résolution et réduire le signal de fond, allez dans les paramètres « Acquisition » sous l’onglet « Acquire » du logiciel, augmenter la ligne et/ou la trame en moyenne en sélectionnant une valeur supérieure à 1 en utilisant le menu déroulant pour chaque option.
- En outre, acquérir le signal fluorescent utilisant STED temps-dépendants en cochant l’option de blocage pour le fluorophore sous l’onglet « Acquérir », en indiquant les valeurs pour cloisonnement temps (voir note ci-dessous). Augmenter la puissance du laser STED pour améliorer la résolution, mais cela augmentera également le photoblanchiment des fluorophores.
Remarque : Le temps de blocage devra être optimisé pour le microscope, échantillon et fluorophores utilisés. Un blocage de temps de 0,3 à 6 ns est recommandé. Après fixation, GFP est particulièrement sensible aux laser haute puissance. Pour réduire le photoblanchiment de GFP, temps de déclenchement doit être appliquée et la puissance du laser STED devrait être réduite. - Pour capturer des images 3D de STED, utilisez le curseur pour modifier le point de fonction (PSF) d’étalement pour « STED 3D ».
- Manuellement l’acquisition des images multiples pour assurer la reproductibilité. Donne les images (voir Figure 1) en utilisant un logiciel de déconvolution paquet41(voir Table des matières).
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Representative Results
Pour les cellules de B épandage sur immobilisé anti-Ig, microscopie STED utilisée en conjonction avec le logiciel de déconvolution fournit des images de résolution supérieure des structures du cytosquelette de microscopie confocale. Cela est évident dans la Figure 1, où le réseau d’actine F a été visualisé en utilisant le protocole décrit ci-dessus. Une comparaison des confocale et STED Super-résolution images du même échantillon montre que les images STED ont une résolution plus élevée et révèlent plus détaillée des structures du cytosquelette d’actine (Figure 1). Cette figure montre également que déconvolution est indispensable à l’obtention des images haute qualité STED dans laquelle actine, filaments sont plus clairement définis. Bien que la déconvolution d’images confocales donne une amélioration substantielle dans la résolution de l’image, deconvolved STED images fournissent des informations structurelles plus détaillées que les images confocales deconvolved. En particulier, la structure dendritique de l’anneau F-actine périphérique se révèle plus en détail par microscopie STED (Figure 1 et Figure 2). Le réseau de microtubules sur le site de contact de l’antigène a été également projeté à l’aide de la préparation des échantillons et d’imagerie protocole décrit plus haut (Figure 3). Microtubules proviennent d’un point central, qui est la MTOC, et émanent de l’extérieur vers la périphérie de la cellule. Dans cette expérience, les cellules de B étaient autorisés à diffuser sur anti-Ig-coated lamelles pendant 15 min (Figure 3), un point dans le temps au cours de laquelle la MTOC se déplace vers l’antigène contact site17. Grappes de CLIP-170-GFP qui marquent les plus-extrémités des microtubules sont visibles aux extrémités des microtubules illustrés à la Figure 3. Lors de la préparation de l’échantillon et l’imagerie STED du réseau de microtubules est optimale, continu et distincts les microtubules sont observées, avec CLIP-170-GFP localisée le long des microtubules ou aux extrémités plus-(Figure 3 a). Microtubule sous-optimal de coloration, qui a été observé lors de l’utilisation des concentrations plus faibles de la coloration des anticorps ou des lots de tubuline α des anticorps qui ont plus d’un ans, résultats dans les microtubules apparaissant comme des sections discontinues qui sont mal résolues sur la déconvolution (Figure 3 b; Voir aussi la Figure 5). Bien que tous de la fluorescence de CLIP-170-GFP dans ces images est associée de le α-tubuline-immunomarquage structures, on ne peut pas distinguer si CLIP-170-GFP est situé à l’extrémité plues, ou le long des microtubules, en raison de la coloration incomplète des microtubules. C’est pourquoi il est important que l’anticorps de le α-tubuline est enregistré sous le fabricant recommande des conditions de stockage et utilisé moins d’un an.
Utilisant ce protocole, de haute qualité multicolores STED images qui montrent l’organisation et la structure du cytosquelette d’actine et le réseau de microtubules, ainsi que les protéines telles que IQGAP1 et CLIP-170 qui associent à ces deux cytosquelettes17, pourraient être acquis. Les images STED dans la Figure 4 montrent l’anneau périphérique d’actine dendritique, ainsi que les microtubules qui émanent d’un emplacement central dans la cellule où la coloration de l’actine est beaucoup moins dense. CLIP-170-GFP aux extrémités de ces microtubules est étroitement liée à l’actine F périphérique. Ce protocole permet de visualiser les structures du cytosquelette à la synapse immunitaire utilisant STED de simple-couleur d’imagerie (Figure 2) ou STED multicolore imagerie (Figure 3 et Figure 4). Toutefois, il convient de noter que l’imagerie couleur unique STED (Figure 2) peut donner de meilleure résolution des structures de l’actine et des microtubules dans les cellules de B que multi-couleur STED (Figure 4). Ceci peut être dû photoblanchiment causé par l’acquisition d’images séquentielle STED pour les fluorophores différents. Pour obtenir les meilleures images de Super-résolution, la combinaison des fluorophores et protéines fluorescentes sélectionnés, ainsi que l’ordre dans lequel ils sont imagés utilisant des lasers de l’excitation et l’épuisement, doit être optimisée pour l’échantillon. Néanmoins, l’imagerie multicolore STED fournit des images de résolution supérieure de ces structures du cytosquelette qu’en microscopie confocale classique. En outre, monochrome STED permet d’acquérir des images de Super-résolution 3-dimensionnelle du réseau entier B cell actine ou microtubules (film 1).
Quand à l’aide de cellules transfectées avec des protéines de fusion fluorescent, atteindre des niveaux d’expression optimale et d’éviter les artefacts en raison de la surexpression sont des considérations importantes. Dans les cellules où le CLIP-170-GFP est surexprimé, sont forment les grands agrégats de CLIP-170-GFP (Figure 5 a). En plus de ce niveau de CLIP-170-GFP, seulement une partie du réseau de microtubules dans cette cellule était dans le plan focal plus proche de la lamelle couvre-objet (Figure 5 b). Ceci suggère que la surexpression de CLIP-170 qui risqueraient également polarisation induite par le BCR MTOC. À l’inverse, parce que les signaux de forte fluorescence sont habituellement requis pour l’acquisition des images de haute qualité STED, faible expression des protéines de fusion fluorescente comme la GFP-170-CLIP (Figure 5) entraîne des images de mauvaise qualité. Par conséquent, lors de l’utilisation de cellules qui ont été transfectées avec des protéines fluorescentes, il faut uniquement les cellules avec les niveaux optimaux d’expression de protéine de fusion d’images. Il est également important de noter que le protocole de transfection utilisé pour l’A20 cellules (voir Table des matières) typiquement résultats dans 20 à 50 % des cellules exprimant la protéine transfectée. Pour l’ADN plasmidique (par opposition à des siARN), fréquences de transfection de cellules de B primaires sont souvent bien inférieurs à ceux des cellules A20, nécessitant l’utilisation de lignées de cellules B. Néanmoins, des images STED de haute qualité des éléments du cytosquelette dans des cellules de B primaires celllulaire peuvent être obtenues en utilisant ce protocole (Figure 6).
Figure 1 : comparaison des confocale et imagerie STED actine F. Images confocales (en haut) et les images STED (en bas) d’une cellule A20 qui s’était propagé sur anti-IgG-coated lamelles pendant 15 minutes avant d’être colorées avec la phalloïdine conjugué Alexa Fluor 532. À l’aide de microscope confocal STED, la même cellule a été photographiée tout d’abord par microscopie confocale, puis par STED. Les initiales confocale et les images STED sont indiqués, ainsi que les mêmes confocale et images STED après déconvolution. Barre d’échelle : 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : le cytosquelette d’actine sur le site de contact de l’antigène. Cellules A20 qui avaient été autorisés à se répandre sur les lamelles anti-IgG-enduit pour 15 min ont été colorées avec la phalloïdine conjugué Alexa Fluor 568 et imagés par microscopie STED. Les images STED initiales ont été deconvolved. Groupes A-B et panneaux C-E montre des images représentatives de deux cellules différentes. Panneau E montre un élargissement X 3 de la région dans la case blanche en panneau C. Echelle pour panneaux A-D: 5 µm. Echelle pour panneau E: 1 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : des images du réseau de microtubules et CLIP-170-GFP STED. A20 cellules exprimant CLIP-170-GFP ont été autorisés à diffuser sur anti-IgG-coated lamelles pendant 15 minutes avant d’être fixé et immunomarquage avec un anticorps de tubuline α plus un anticorps secondaire conjugué Alexa Fluor 532. (A) image représentative montrant immunomarquage du réseau de microtubules, avec CLIP-170-GFP située principalement aux plus-extrémités des microtubules. Coloration sous-optimal (B) et la résolution des microtubules grâce à l’utilisation d’un stock obsolète des anticorps de le α-tubuline. Barreaux de l’échelle : 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : des images de l’actine et des microtubules cytosquelettes STED. A20 cellules exprimant CLIP-170-GFP ont été autorisés à se répandre sur les lamelles anti-IgG-enduit pendant 15 minutes avant d’être fixé et coloré avec la phalloïdine conjugué Alexa Fluor 568 pour visualiser l’actine F et avec un anticorps de tubuline α plus un conjugué Alexa Fluor 532 anticorps secondaire pour visualiser les microtubules. Panneaux A-D et E-F de panneaux montre des images représentatives de deux cellules différentes. Panneau D est un agrandissement X 3,5 de la région dans la case blanche en panneau C. Barreaux de l’échelle : 5 µm pour les panneaux de A à C et E-F ; 1 µm pour panneau D. L’image dans le groupe A est la même image utilisée dans la Figure 3 a mais comprend la superposition du canal F-actine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : exemples d’images de STED de qualité médiocre en raison d’une surexpression ou une expression insuffisante de la protéine de fusion de GFP. A20 cellules exprimant CLIP-170-GFP ont été autorisés à diffuser sur anti-IgG-coated lamelles pendant 15 minutes avant d’être fixés et colorés comme dans la Figure 4. (A, B) Résultats de CLIP-170-GFP surexpression dans les grands agrégats anormaux de CLIP-170-GFP (A) et ayant une déficience polarisation MTOC vers le contact de l’antigène du site (B). (C) compenser une expression insuffisante de CLIP-170-GFP en augmentant les résultats de puissance de laser en images STED de qualité médiocre. Barreaux de l’échelle : 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : image STED du cytosquelette de microtubules dans les cellules primaires de B. Des cellules de B spléniques primaires ont été cultivés pendant 6 h 5 ng/µl BAFF, avec 2,5 µg/mL LPS et puis autorisés à diffuser pendant 15 minutes sur les lamelles qui avaient été recouvertes d’anticorps IgM anti. Les cellules étaient alors fixées et colorées avec un anticorps de α-tubuline et un anticorps secondaire conjugué Alexa Fluor 568 pour visualiser les microtubules. Montre une image représentative. Barre d’échelle : 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Movie 1 : reconstruction 3D du réseau de microtubules de cellules de B. Les cellules A20 étaient autorisés à diffuser sur anti-IgG-coated lamelles pendant 15 minutes avant d’être fixé et immunomarquage avec un anticorps de tubuline α plus un anticorps secondaire conjugué Alexa Fluor 488. Z-tranches ont été capturés à 0,2 µm taille d’étape pour un total de 37 cadres. Reconstruction 3D a été réalisée à l’aide de la microscopie STED de logiciels d’imagerie. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Des images détaillées des structures du cytosquelette peuvent être obtenus à l’aide de la microscopie STED Super-résolution, qui peut théoriquement atteindre une résolution de 50 nm, par rapport à la microscopie confocale classique, pour lequel la résolution diffraction-limited est ~ 200 nm 24. la capacité de résoudre des structures plus fines est encore améliorée en utilisant un logiciel de déconvolution pour calculer la position très probablement de la source lumineuse originale du signal de fluorescence « floue » observée. Ce protocole décrit les méthodes pour l’utilisation de STED afin d’imager les cytosquelettes actine et les microtubules, mais aussi des protéines associées au cytosquelette.
Activation des lymphocytes b induit remodelage du cytosquelette d’actine tant le réseau de microtubules, avec la régulation coordonnée des deux cytosquelettes importants pour synapse immunitaire formation17,,42. La méthode que nous présentons a été optimisée pour l’imagerie simultanément les cytosquelettes actine et des microtubules au site contact antigène utilisant multicolore STED, mais s’applique également pour STED de simple-couleur. Des études antérieures, que nous avons mené sur le clou du cytosquelette cellulaire B que STED peut apporter un nouvel éclairage dans les structures cellulaires comment sont organisés et comment ils interagissent entre eux. Par microscopie confocale et total fluorescence interne (FRBR), nous avions observé que les microtubules contacter l’anneau F-actine à la périphérie de l’antigène contact site17. Par microscopie STED, nous avons pu montrer que les plus fins des microtubules qui ont été marquées par la + astuce CLIP-170 associer étroitement avec le réseau d’actine dendritiques à la périphérie de la cellule (voir Figure 4).
Plusieurs facteurs influencent quelle technique d’imagerie est le plus approprié pour une application spécifique. Il s’agit de la résolution qui est requise, les structures à être photographiée, la technique d’étiquetage et son ratio signal-bruit (p. ex., contraste), temps d’acquisition, facilité de préparation des échantillons et de reproductibilité. Préparation des échantillons pour STED n’est pas sensiblement différente de celle pour la microscopie confocal, et il allie acquisition rapide des images de haute résolution. Un avantage majeur de STED est que c’est un procédé optique dans lequel l’image est directement acquis sur l’échantillon et la résolution peut être ajustée en changeant la puissance du laser STED24. Contrairement à la microscopie de Super-résolution état fondamental l’appauvrissement, qui reconstitue des images de plusieurs milliers d’images successives capture, traitement informatique étendu n’est pas requise pour STED et d’éviter l’introduction d’artefacts de reconstruction image 24. Cependant, le contraste dans les images STED est souvent faible24à laquelle affaire image après le traitement à l’aide de logiciels tels que ImageJ peut être nécessaire pour renforcer le contraste. Cela est particulièrement important pour les images avec des structures denses, tel qu’un réseau d’actine dendritiques. Pour améliorer le contraste de l’image lors de l’acquisition de l’image, on peut réduire la puissance de laser de l’appauvrissement et/ou appliquer ligne ou cadre en moyenne. STED temps-dépendants, qui capture les photons après une temporisation réglée par l’utilisateur, peut augmenter la résolution en diminuant la zone d'où les photons sont prélevés24,43. Nous vous recommandons d’optimiser l’imagerie STED de structures du cytosquelette à la synapse immunitaire en utilisant une combinaison de ces méthodes pour améliorer le contraste et la résolution.
Actuellement, pas tous les fluorophores sont optimales pour l’imagerie avec STED, et pas toutes les combinaisons de fluorophore ne conviennent pas pour l’obtention d’images STED multicolores. Un réglage judicieux des portées de détection est important pour assurer cordeau minime des fluorophores dans des canaux adjacents. La combinaison des fluorophores utilisés dans le présent protocole (c'est-à-dire, GFP, Alexa Fluor 532 et Alexa Fluor 568) est optimale pour l’imagerie de Super-résolution STED multicolore. Par rapport à la microscopie illumination structurée (SIM) et méthodes de localisation de la molécule unique (SMLM), telles que la microscopie de photoactivation de localisation (PALM), STED n’est pas généralement idéal pour l’imagerie multicolore. Cependant, nous montrons ici que la légère sursaturation de détection fluorophore, associé à des outils de traitement d’image simple, peut livrer images à haute résolution multicolores de l’actine et des microtubules cytosquelettes.
Ce protocole pour l’imagerie des structures du cytosquelette STED a révélé de nouveaux détails d’architecture du cytosquelette de la synapse immunitaire des lymphocytes B. Bien que nous avons optimisé ce protocole d’imagerie de l’actine et des microtubules cytosquelettes sur le site de l’antigène-contact dans les cellules de B, ces méthodes devraient être applicables à d’autres types de cellules, en particulier les cellules immunitaires (lymphocytes T, cellules NK, cellules de mât, etc.) qui se forment immunitaire de synapses. En outre, l’utilité de ce protocole pourrait être étendue à revêtement les lamelles couvre-objet avec d’autres ligands ou substrats adhésifs. Cependant, il est important d’optimiser le protocole et les paramètres d’acquisition image pour le type de cellule et le montage expérimental.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions l’UBC Life Sciences Institute (LSI) Imaging Facility pour soutenir et maintenir le microscope STED. Ce travail a été financé par subvention #68865 de l’instituts de recherche en santé du Canada (de M.R.G.). Nous remercions m. Kozo Kaibuchi (Université de Nagoya, Nagoya, Japon) pour le plasmide CLIP-170-GFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| A20 mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamine | Millipore Sigma | G5763 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P5280 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid, 10,000 units |
| Additional materials for primary B cells | |||
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| Magnetic bead-based B cell isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep Mouse B cell Isolation kit |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS from E. coli 0111:B4 |
| B cell-activating factor (BAFF) | R&D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid encoding CLIP-170-GFP | Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
| Recommended transfection reagents and equipment | |||
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Falcon 6-well plates, TC treated, sterile | Corning | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating coverslips | |||
| 18-mm diameter round #1.5 cover glasses | Thomas Scientific | 1217N81 | Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580 |
| Forceps | Fisher Scientific | 1381242 | Dissecting extra fine splinter forceps |
| Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate | Corning | 353043 | |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | For A20 cells |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | For primary mouse B cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Paraformaldehyde (16% stock solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute with PBS to working concentration |
| Glutaraldehyde (50% stock solution) | Millipore Sigma | 340855 | Dilute with PBS to working concentration |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| Bovine serum albumin (BSA), Fraction V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| Rabbit anti-tubulin antibody | Abcam | ab52866 | 1:250 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 1:100 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1:100 dilution recommneded but should be optimized |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Without DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica | ||
| Huygens deconvolution software | Scientific Voume Imaging | See https://svi.nl/HuygensProducts |
References
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