Summary
Biz coverslips karşı antikorlar için B-hücre reseptör, ilk aşama için bir model ile kaplı üzerinde yayılmış B hücreleri aynı anda görüntü aktin yapıları, mikrotübüller ve Mikrotubul artı uç proteinler STED mikroskobu kullanılarak bir protokol mevcut bağışıklık synapse oluşumu.
Abstract
Membran bağlı antijenleri (örneğin, bir antijen sunan hücre yüzeyinde) bağlamak B hücreleri bağışıklık sinaps, B hücre reseptörü (BCR) sinyal en iyi duruma getirir özel bir hücresel yapısı ve antijen BCR aracılık edinme formu. Her iki aktin sitoiskeleti ve hale gelmesini karşı antijen iletişim site Mikrotubul ağının remodeling bağışıklık synapse oluşumu için gerekli. F-aktin bir yoğun periferik ringe aktin sitoiskeleti remodeling Mikrotubul organize merkezine doğru bağışıklık synapse kutuplaşma eşlik ediyor. Mikrotubul artı uç proteinler gibi kortikal artı uç yakalama proteinler arasında koordineli bir şekilde yeniden izin aktin ve Mikrotubul cytoskeletons fiziksel etkileşimleri aracılık. Denetim hücre iskeleti nasıl bu yapıların anlama yanı sıra, bu hücre iskeleti yeniden yapılanma bağışıklık synapse oluşumu ve BCR sinyal, Şekil B hücre aktivasyonu yeni görüşler sağlayabilir mekanizmaları elucidating. Bu yeni hücre iskeleti ağ organizasyon ayrıntılarını ortaya süper çözünürlük mikroskobu yaklaşımlar geliştirme tarafından destekli. Biz burada uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi aynı anda görüntü aktin yapıları, mikrotübüller ve transfected GFP öğesini Mikrotubul artı uç proteinler B hücreleri kullanmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bağışıklık sinaps oluşumunda erken olayları modellemek için B hücreleri BCR sinyal ve sitoiskeleti remodeling başlatmak Anti-immünglobulin (anti-IG) antikorları ile kaplı coverslips yaymak için izin verir. Biz adım adım protokoller GFP füzyon protein A20 B-Lenfoma hücrelerdeki ifade etmek için anti-IG-indüklenen hücre yaymak için ve sonraki hücre fiksasyon, Immunostaining, resim alma ve görüntü deconvolution adımları sağlar. Bu yordamları kullanarak elde edilen yüksek çözünürlüklü görüntüleri aynı anda aktin yapıları, mikrotübüller ve bu iki hücre iskeleti ağ bağlantı olabilir Mikrotubul artı uç bağlayıcı proteinler görselleştirmek izin.
Introduction
Ne zaman B hücreleri bağlamak polarize diziler antijenleri (antijen sunan yüzeyinin üzerinde görüntülenenörneğin, hücreleri (ZPT)), ilk bir klasik bağışıklık synapse yapısı oluşumu açıklanan sürücüler sinyal elde edilen B hücre reseptörü (BCR) T hücreleri1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Başlangıçta, microclusters antijen-bağlı BCRs formun B hücre: APC iletişim site çevre. Bu microclusters sonra nerede bağışıklık synapse özünü oluşturan bir merkez supramolecular etkinleştirme küme (cSMAC) birleşim antijen iletişim site merkezine doğru hareket ettirin. Bağışıklık synapse oluşumu BCR sinyal en iyi duruma getirir ve BCR aracılık antijen APC membran14çıkarma kolaylaştırır. BCR aracılık antijen içselleştirilmesi ve sonraki antijen işleme takip eder, bu antijen satın alma B hücreleri peptid: MHC II kompleksleri T hücreleri için mevcut ve T hücre yardım14temin için sağlar. B hücre aktivasyonu, reseptör organizasyon bu fonksiyonel model yeni sağlayabilir kurmak mekanizmaları elucidating bağışıklık synapse oluşumu teşvik çünkü nasıl humoral bağışıklık yanıtı anlayışlar başlatılan ve düzenlenir.
Yeniden düzenleme-in belgili tanımlık aktin ve Mikrotubul cytoskeletons bağışıklık synapse oluşumu için önemlidir. Yerelleştirilmiş BCR antijenleri dağınık şekilde polarize dizisi tarafından uyarılan sinyal hızlı ve dramatik aktin sitoiskeleti1,15remodeling neden olmaktadır. B hücresi çevre dendritik aktin yapıların oluşumu plazma zarı itme Kuvvetleri giderek artan ve B hücre yayılmasını teşvik etmektedir. Bu hücre B antijeni taşıyan yüzeyinde daha büyük bir alanı taramak izin verir ve antijen bağlamak ve yolları sinyal BCR etkinleştirmek BCRs sayısını artırır. Aynı zamanda, MTOC ve Mikrotubul ağ antijen iletişim site doğru reoriented. MTOC antijen iletişim site yaklaşırken, MTOC yayılan mikrotübüller plazma zarı B hücresi antijen taşıyıcı yüzey16,17arasındaki arabirimi, iç yüzü boyunca uzanır. Bu juxtamembrane mikrotübüller sonra parça dinein aracılı merkezcil hareketinin önde gelen bir cSMAC oluşumu için antijen-bağlı BCR microclusters18, için kullanılabilir.
Hale gelmesini ve MTOC karşı bağışıklık synapse kutuplaşma olduğu gibi aktin ve Mikrotubul cytoskeletons gerektirir ve genellikle kortikal aktin ağ ve mikrotübüller16,17arasındaki etkileşimler bağlıdır, 19,20. Kortikal aktin bağlanıcı proteinler, IQGAP1 gibi mikrotübüller Mikrotubul artı-uçları21süslemeleri protein kompleksleri ile etkileşerek yakalayabilirsiniz. Artı uç proteinler dinamik bu komplekslerin EB1 ve CLIP-170, topluca Mikrotubul artı izleme proteinler (+ ipuçları)21,22uç denir içerir. + İpuçları mikrotübüller ucunda plazma zarı veya kortikal aktin sitoiskeleti ile ilişkili proteinler bağlayabilirsiniz. Bu güç üreten mekanizmalar sağlar (örneğin, eksi uç yönetmen cortically bağlantılı dinein mikrotübüller boyunca hareketi) çekme kuvvetleri mikrotübüller uygulamak ve böylece MTOC yeniden konumlandırmak için. KLİP-170 iskele aktin ilişkili protein IQGAP123bağlayabilirsiniz ve her ikisi de bu proteinler BCR kaynaklı MTOC polarizasyon bağışıklık synapse17doğru için gerekli olduğunu göstermiştir. Bu IQGAP1-klip-170 etkileşim B-hücre bağışıklık synapse Mikrotubul ağ konumlandırma ile aktin sitoiskeleti remodeling yönetiminde önemli bir rol oynayabilir.
Geleneksel floresan mikroskopi aktin ve Mikrotubul cytoskeletons dramatik düzenlenmesi B-hücre bağışıklık synapse oluşumu2sırasında ortaya koymuştur. Ancak, bu yaklaşım küçük Hücresel yapıları ayrıntılı ışık, Abbe'nın yasasına göre örnek ve objektif24diyafram aydınlatmak için kullanılan ışığın dalga boyu üzerinde bağlıdır kırınım sınırı nedeniyle çözümlenemiyor. Bu kırınım sınırı 200-300 nm yanal yönde ve eksenel yönde25500-700 nm konvansiyonel ışık mikroskoplar çözünürlüğü sınırlar. Bu nedenle, küçük hücre altı yapıları gibi aktin ve Mikrotubul cytoskeletons ince detaylar sadece gözlenen elektron mikroskobu kullanarak. Elektron mikroskobu görüntüleme sitoiskeleti zaman alıcıdır, biyolojik yapıları değiştirebilir ve antikor aracılıklı algılama için sınırlıdır sert örnek fiksasyon ve hazırlık protokolleri gerektirir. İmmunostain ve aynı anda birden fazla protein görüntü veya hücresel yapılar Floresans mikroskobu önemli bir avantajı olduğunu. Ayrıca, floresan füzyon protein hücrelerdeki ifade gerçek zamanlı görüntüleme sağlar ve etkili antikorlar immunostaining protein ilgi için kullanılabilir olduğunda yararlıdır.
Süper çözünürlük mikroskobu son teknolojik gelişmeler ışığın kırınım sınırları aşmak ve Nano hücresel yapılar24görselleştirme izin. Bir tür süper çözünürlük mikroskobu teknik uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi denir. STED iki lazerler, nerede bir lazer fluorophore heyecanlandıran ve ikinci bir lazer ile bir çörek-şekilli desen seçici Floresans emisyon fluorophore çevresinde bastırır kullanır. Bu tek bir floresan parçacık noktası yayıldı fonksiyonu (açık alan) azaltır ve bir alt kırınım sınırı floresan görüntü25,26sağlar. Zemin-devlet tükenmesi mikroskobu da süper çözünürlük görüntüleri Floresans tabanlı teknikleri kullanır. Ancak, görüntü alma ve yeniden yapılanma kez uzun, orada sınırlı sayıda kullanılabilir fluorophores ve birden çok hücre iskeleti bileşenlerinin aynı anda yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknik bakımı çünkü meydan okuyor aktin ve Mikrotubul yapıları farklı fiksasyon yordamlar gerektirir. Bu nedenle, STED elektron mikroskobu üzerinde birden çok avantajları vardır ve hızlı resim alma sunar, en az son işlemci gereksinimleri vardır ve aynı fluorophores ve teknikleri boyama istihdam diğer süper çözünürlük mikroskobu yaklaşımlar Bu sabit örnekleri26geleneksel floresan mikroskopi için kullanılır.
Süper çözünürlük mikroskobu aktin yapıları bağışıklık synapse doğal öldürücü (NK) hücreleri ve T hücreleri26,27,28,29,30, , görselleştirmek için artık kullanılmıştır 31. ancak, süper kararlılık düşsel mikrotubul sitoiskeleti in yanı sıra, aktin ve Mikrotubul cytoskeletons koordineli düzenlenmesi sırasında bağışıklık synapse oluşumu, ancak son zamanlarda bildirilen17olmuştur. Anti-immünglobulin BCR sinyal teşvik ve sitoiskeleti reorganizasyon başlatmak (anti-IG) antikor kaplı coverslips yaymak için izin vermişti resim B hücreleri STED mikroskobu yapardık. Ne zaman üzerinde immobilize anti-IG antikorlar kaplama, B hücreleri dramatik aktin bağımlı yayma, hangi bağışıklık synapse oluşumu sırasında ilk olaylar beyannamedir tabi. Önemlisi, STED mikroskobu F-aktin bağışıklık çevre formları sinaps ve MTOC yanı sıra, bağlı mikrotübüller yakın antijen iletişim site17hareket ettiğini gösterdi dendritik yüzük ince detayları ortaya koydu. Bu mikrotübüller dışa F-aktin periferik halka doğru genişletilmiş. Ayrıca, F-aktin, tübülin, IQGAP1 ve GFP tagged klip-170 + ipuçları çeşitli kombinasyonları çok renkli STED görüntüleme Mikrotubul artı klip-170-GFP tarafından işaretlenmiş uçları ile IQGAP1, periferik aktin meshwork ile yakından ilişkili olduğunu gösterdi bir kortikal yakalama protein17.
Burada, aktin ve Mikrotubul cytoskeletons STED mikroskobu kullanarak bağışıklık sinaps, görüntüleme için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntemler yaygın BCR sinyal ve bağışıklık synapse oluşumu17,32,33,34,35 eğitim için istihdam edilmiştir A20 fare B hücre satırı kullanarak optimize edilmiştir , 36 , 37 , 38 , 39. ticari karşı antikorlar için klip-170 immunostaining önceki deneylerde için de işe yaramadı çünkü biz ifade GFP tagged klip-170 kadar aynı anda görüntülenmesi için protokol boyama ile birlikte A20 hücre içinde ayrıntılı olarak tarif üç hücre iskeleti bileşenleri veya sitoiskeleti ilişkili proteinler. NK hücre bağışıklık sinapslarda STED mikroskobu Image aktin için kullanma yöntemleri-si olmak be daha önce açıklanan40. Biz bu uzatmak B hücreleri aktin ve Mikrotubul cytoskeletons çok renkli süper çözünürlük görüntüleri elde etmek.
Süper çözünürlük mikroskopi için kritik bir dikkate uygun fiksasyon yordamlar hücresel yapıların Bakımı ve floresan proteinler için hasar önleme kullanıyor. Fiksasyon ve burada sunulan yöntemleri boyama GFP Floresans korumak ve aktin ve Mikrotubul ağların yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlamak için optimize edilmiştir. Floresan proteinler ifade edilirken, B hücreleri transfect genellikle zor olduğu unutulmamalıdır. Bu iletişim kuralı, 20-%50 kullanarak A20 hücre genellikle transfected GFP füzyon protein hızlı, ve bu halk arasında protein ifadesi düzeyi değişken. Bununla birlikte, süper kararlılık düşsel aktin ve biz tarif yordamları kullanarak mikrotübüller oldukça sağlam ve yüksek-nitelik imge kolayca elde edilir. A20 hücre göre küçük boyutlarına rağmen bu yordamları da kısaca lipopolysaccharide (LPS) ile aktive edilmiş birincil B hücreleri Mikrotubul şebekede görüntüye kullanılabileceğini göstermektedir. LPS-harekete geçirmek birincil B hücreleri ile çift (Yani, böyle protein tükenmesi immunoblotting tarafından tespit edilebilir), nispeten yüksek verimlilikle transfected göstermiştir onları B hücre hatları kullanımı için bazı çalışmalar için iyi bir alternatif yapmak 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan yordamları University of British Columbia hayvan bakımı Komitesi tarafından kabul edildi.
1. A20 B-Lenfoma hücreleri GFP-füzyon proteinler ifade
- Kültür A20 hücre doku kültürü kuluçka 5 37 ° C'de RPMI orta (RPMI-1640 % 10 ısı inaktive fetal sığır serum (FBS), 50 µM 2-mercaptoethanol, 2 mM glutamin, 1 mM pyruvate, 50 U/mL penisilin ve 50 µg/mL streptomisin ile desteklenmiş) tamamlamak % CO2.
- Transfection reaktif hazırlamak ( Tablo reçetesigörmek) üretici yönergelerine göre.
Not: Bu protokol için belirli reaktifler getirilmiş ve transfection Protokolü açıklanan Tablo reçetesi. Biz-si olmak güvenilir diğer transfection reaktifler yeterli transfection verimliliği vermiştir değil. - Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Santrifüj 2.5 x 106 A20 hücreleri (her transfection için) x 525 g., 5 min için 100 µL transfection reaktif 1-2,5 µg, plazmid DNA içeren hücrelerde Resuspend. KLİP-170-GFP23kodlama DNA örneği almak için transfection başına 2,5 µg kullanın. Hafifçe karıştırın.
- 6-şey plaka bir kuyu için hücreleri aktarmak ve Önceden ısıtılmış tam RPMI orta ile 2 ml ses seviyesini. 18 h 37 ° C'de protein ifade izin vermek için hücreleri kültür.
2. birincil fare B hücreleri izole edip onları LPS ile aktive
- Kurumun hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri takip bir fareden dalak silmek için steril cerrahi araçlarını kullanın.
- Doku kültürü başlık, bir steril 70 µm hücre süzgeç 3 mL steril oda sıcaklığında PBS içeren bir 35 mm doku kültürü tabak yerleştirin. Dalak hücre süzgeç aracılığıyla ezmek için 5 ml şırıngadan pistonu kauçuk parçası kullanın.
- Damlalıklı splenoctyes steril 15 mL tüp ve 5 min için 525 x g, santrifüj içine tek hücre süspansiyon.
- Manyetik boncuk tabanlı B hücre izolasyon Kiti ( Tablo malzemelerigörmek) B hücreleri zenginleştirilmiş nüfusu elde etmek için kullanın.
- 3 x 106/mL 2,5 µg/mL LPS artı 5 ng/mL B faktörü (BAFF; bir hayatta kalma sitokin) aktive hücre ile desteklenmiş tam RPMI ortamda B hücrelere resuspend.
- İçin 6 saat 37 ° C'de hücreler kültür
3. kaplama cam Coverslips Anti-IG antikorlar ile
- Antikor çözüm coverslips kaplama için hazırlayın. Keçi-anti-fare IG antikorlar içine oda sıcaklığında steril PBS 12.5 µg/mL solüsyon yapmak için hisse senedi çözüm seyreltik; Antikor çözüm 400 µL her coverslip için gereklidir.
Not: keçi Anti-IgG A20 hücre için fare; keçi Anti-fare IgM birincil B hücreleri için kullanın. Keçi IgG antikorlar de fare Fc reseptör bağlamak etmeyin. Ancak, herhangi bir potansiyel Fc reseptör bağlama önlemek için bir anti-fare IgG F(ab) veya F(ab')2 parçaları veya anti-fare IgM antikor kullanabilirsiniz. - #1.5 18 mm yuvarlak cam coverslip % 100 metanol içinde daldırma ve kurumasını bekleyin (~ 10 dk).
- Coverslip ortasındaki bir kabarcık oluşturur ve kenarlar'yayılır forseps kullanarak, kurutulmuş coverslip çözümün 12.5 µg/mL antikor (5 µg Toplam; 2 µg/cm2) coverslip üzerine 12-iyi doku kültürü plaka ve damlalıklı 400 µL içine yerleştirin.
- Tüm coverslip karşılamak dikkatli olun, ama geçmiş kenarına cam coverslip ve doku kültürü plastik üzerine genişletmek antikor çözüm izin vermez. 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Coverslips steril PBS tarafından pipetting 1 mL de ve daha sonra çözüm alıyorum içine yıkayın. İlişkisiz antikorlar kaldırmak için iki kez daha tekrarlayın.
- 1 mL steril PBS hücreleri eklemek hazır olana de antikor kaplı coverslip içeren için ekleyin.
Not: Aynı gün kullanmak için PBS ile kaplı oda sıcaklığında coverslips tutulabilir.
4. B hücre Coverslips Anti-IG-kaplı Yayilim
- Hazırlamak HEPES tampon modifiye serum fizyolojik (mHBS): 25 mM HEPES, pH 7.2, 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM Na2HPO4, 0,5 mM MgSO4, 1 mg/mL dekstroz, 2 mM glutamin, 1 mM sodyum pyruvate ve 50 µM 2-mercaptoethanol). Filtre bu çözüm sterilize ve 4 ° C'de depolayın
- Deneme günü, mHBS % 2 ile 50 mL olun FBS ısı inaktive 1 mL 50 mL mHBS ekleyerek FBS (mHBS-FBS). MHBS-FBS kullanmadan önce 37 ° c sıcak.
- Transfected A20 hücre veya BAFF artı LPS-var kültürlü 525 x g 5 min için de birincil B hücreleri santrifüj kapasitesi.
- 1 mL mHBS-FBS hücrelerde resuspend, bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve 2 x 105 hücre/mL mHBS-FBS hücrelere oranında seyreltin.
- Forseps kullanarak, coverslip parafin film bir parça için doku kültürü plaka aktarın.
- B hücreleri (5 x 104 hücreleri) 250 µL her coverslip için ekleyin.
- B hücreleri anti-IgG-boyalı yüzeye yaymak için izin vermek için karanlıkta 15 dakika 37 ° C'de coverslips kuluçkaya.
5. sabitleme ve Immunostaining hücreleri
- % 16 paraformaldehyde hisse senedi çözüm sulandrarak tarafından fiksasyon çözüm ve % 50 oxazolidin hisse senedi çözüm oda sıcaklığında distile su son %3 paraformaldehyde ve % 0.1 oxazolidin konsantrasyonları verim için hazır olun. Fiksasyon çözüm kullanılabilir ve herhangi bir aşırı atmak için o gün hazırlayın.
Dikkat: Paraformaldehyde ve oxazolidin hisse senedi çözümleri yalnızca bir kimyasal duman mahallede kullanılmalıdır. Malzeme güvenlik bilgi formu (MSDS) üzerinde yönergelere bakın. - Permeabilization/engelleme arabellek hazırlamak (% 3 BSA ve % 0.1 Triton X-100 seyreltilmiş PBS içinde). Filtre bu çözüm sterilize ve 4 ° C'de depolayın Deneme günü, oda sıcaklığında için gerekli miktar sıcak.
- Boyama arabellek (%1 BSA ve % 0.1 saponin PBS içinde) hazırlayın. 0.2 µm filtre kullanarak bu çözüm sterilize ve 4 ° C'de depolayın Deneme günü, oda sıcaklığında için gerekli miktar sıcak.
- Damlalıklı 350 µL fiksasyon çözüm yüzey tamamen kaplıdır sağlanması her coverslip üzerine. 10 dk içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Fiksasyon çözüm coverslip dikkatle alıyorum bir micropipet kullanarak coverslip kenarından tarafından kaldırın.
Dikkat: Fiksasyon çözüm tehlikeli kimyasal atık atılmalıdır. - Coverslips permeabilization/engelleme arabelleği 500 µL hemen ile yıkayın. Damlalıklı sıvı kapalı.
- Permeabilize ve her coverslip için 250 µL permeabilization/engelleme arabelleği ekleyerek ve karanlık oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçka hücreleri engellemek.
- Arabellek boyama, tavşan Anti-tübülin antikor 1: 100 oranında seyreltin.
- Coverslips permeabilization/engelleme arabelleğinden kapalı Aspire edin ve her coverslip için 50 µL seyreltilmiş Anti-tübülin antikor çözüm ekleyin. 30 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.
- İkincil antikor/aktin leke çözüm Alexa Fluor 532 Birleşik keçi Anti-tavşan IgG ikincil antikor ve tampon boyama içinde Alexa Fluor 568-Birleşik phalloidin 1: 100 sulandrarak hazırlayın.
- Coverslips arabellek boyama ve sonra aspirating 500 µL ekleyerek aşırı birincil antikor kaldırmak için 3 kez yıkayın.
- Her coverslip için 50 µL ikincil antikor/aktin leke çözüm ekleyin ve karanlık oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
- Coverslips arabellek boyama ve sonra aspirating 500 µL ekleyerek aşırı ikincil antikor kaldırmak için 3 kez yıkayın.
- Montaj reaktif 10 µL mikroskop slayda ekleyin. Aşağı coverslip hücre tarafı ile mikroskop slayda bağlayın.
Not: Bir "Anti-fade" montaj orta ( Tablo malzemelerigörmek) GFP füzyon protein floresan yoğunluğu korumak için önerilir. Fluorophores görüntüleme ile STED lazer kullanırken engelleyebilir DAPI içeren reaktifler montaj kaçının. - Kuru gecede slaytlara karanlıkta izin. Slaytları ertesi gün görüntü.
Not: GFP Floresans zamanla azalacak gibi coverslip kuru olduğunda slaytları Imaging, önerilir.
6. STED mikroskop kullanarak görüntüleme
Not: Lütfen aşağıda açıklanan tüm yazılım adımları biz kullanılan yazılım ve mikroskop belirli olduğuna dikkat edin (bkz. Tablo malzeme). Adımları ve ayarları farklı bir mikroskop/yazılım kullanarak görüntüleme gerçekleştirdiyseniz ayarlanması gerekir.
- STED mikroskobunun açın, lazerler ve epifluorescence aydınlatma lambası etkinleştirmek ve belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı başlatın.
- STED tükenmesi lazerler için parametrelerini ayarlamak.
Not: Bu kullanılan belirli mikroskop ve ile donatılmış lazerler göre değişir. Önerilen bazı ayarlarıdır beyaz ışık (WLL) % 70; 592 nm lazer % 80; 660 nm lazer %80. - STED ayarlarını etkinleştirin ve 100 X amacı istimal STED lazer ışınları hizalayın.
- Mercek kullanarak örnek odaklanmak ve ılımlı GFP ifade içeren bir hücreyi seçin.
Not: STED emisyon yoğunluğu azalttığı düşük GFP ifade görünür olmaz. Diğer taraftan, klip-170-GFP yüksek ifade büyük kümeler, normal Mikrotubul artı uç protein kompleksi morfoloji ve dağıtım yansıtmaz kendiliğinden oluşumu neden olmaktadır. Orta GFP ifade içeren bir hücreyi seçerek doğru antijen iletişim site, hücre iskeleti yapıları görüntüleme için esastır. - Seçili hücreye zoom ve yansıması ilgi bölge seçin. Coverslip için en yakın olan B hücresi x-y düzlemi odakta odak ayarlamak.
- B hücre hücre iskeleti yapıları odak haline gelir ve sonra odak dışında gider bunu yapmak için hedefi giderek daha yakın coverslip için taşıyın. B hücre hücre iskeleti yapıları ilk odak haline gelene sonra yavaş yavaş amacı ters yönde hareket.
- Lazer güç, uyarma kiriş ve Dedektör aralığı da dahil olmak üzere ayarları optimize etmek. Üreticinin yönergelerini tarafından önerilen ayarlarla başlatın. Ardından sinyal örnekleri için en iyi duruma getirmek için gerekli ayarlamaları yapın. Birbirlerine aynı ayarlara sahip karşılaştırılmak üzere tüm örneklerini görüntü.
- Yazılım "elde" sekmesi altında resim alma sıralı çerçeve kazanım alt sol panelinde "sıralı tarama" için seçenek "Çerçeveler arasında" kontrol ederek ayarlayın.
- Satın alma sırası oluşturun.
Not: Biz GFP Floresans ilk GFP sinyal bozulması önlemek için elde.
GFP ek olarak kullanılan fluorophores birlikte bağlı olarak, daha uzun dalga boyu Floresans sinyal görüntüleme ilk daha iyi sonuçlar verebilir. Ancak, hangi fluorophores veya floresan proteinler uyarılmış emisyonu tükenmesi için tabi ve yansıma sipariş en güçlü floresan sinyallerini ve en iyi çözünürlük elde etmek için optimize edilmelidir. - Seçin ve yazılımın "Ele geçirme" sekmesi altında her fluorophore STED lazer güç ayarla ve lazer güç ayarlamak için 592-nm ve 660 nm STED lazer için kaydırma çubuğunu kullanın. 592-nm tükenmesi lazer için güç GFP ve Alexa Fluor 532 ayarlayın. 660-nm tükenmesi lazer için güç Alexa Fluor 568 için ayarlayın.
- Çözünürlüğünü artırmak ve arka plan sinyal azaltmak için yazılım "Ele geçirme" sekmesi altında "Satın alma" ayarlarına gidin, satır ve/veya damla-aşağı yemek listesi için her seçeneğini kullanarak 1'den büyük bir değer seçerek ortalama çerçeve artırmak.
- Ayrıca, fluorophore "Ele geçirme" sekmesi altında gating seçeneğini kontrol ve zaman geçişi için değerler belirterek zaman Geçitli STED kullanarak floresan sinyali elde etmek (aşağıdaki nota bakın). Bu da fluorophores photobleaching artacak rağmen çözünürlük artırmak için STED lazer gücünü arttırın.
Not: Gating zaman mikroskop, örnek ve kullanılan fluorophores için optimize edilmiş olması gerekir. Bir zaman 0,3 ns tavsiye edilir 6 toplam geçişi. Fiksasyon sonra GFP yüksek lazer gücü özellikle duyarlıdır. GFP photobleaching azaltmak için zaman geçişi uygulanmalıdır ve STED lazer güç azaltılmalıdır. - 3D STED çekim, bir noktayı değiştirmek için kaydırıcıyı kullanın işlev (PSF) "için 3D STED" yayıldı.
- El ile yeniden üretilebilirlik sağlamak için birden çok görüntüyü elde etmek. (Bkz: şekil 1) görüntüleri deconvolve deconvolution yazılımını kullanarak paket41( Tablo malzemelerigörmek).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
B hücreleri için immobilize anti-IG üzerinde yayılan STED mikroskopi deconvolution yazılımı ile birlikte kullanılan hücre iskeleti yapıları daha yüksek çözünürlük görüntüleri confocal mikroskobu daha sağlar. Bu, şekil 1' de, belirgindir F-aktin ağ yukarıda açıklanan protokolü kullanılarak görüntülenir yerde. Confocal karşılaştırılması ve STED süper çözünürlük fotoğraf aynı örnek daha yüksek çözünürlüğe STED görüntülerdir gösterir ve daha ayrıntılı aktin sitoiskeleti (şekil 1) yapıları ortaya koyuyor. Bu rakam da bu deconvolution hangi aktin filamentleri daha net bir şekilde tanımlanmış yüksek kaliteli STED görüntüler elde etmek için gerekli olduğunu gösterir. Confocal görüntü deconvolution görüntü çözünürlüğünde önemli bir gelişme verir ancak deconvolved STED görüntüleri deconvolved confocal görüntüleri daha ayrıntılı yapısal bilgilerini sağlar. Özellikle, periferik F-aktin yüzük dendritik yapısını STED mikroskobu (Resim 1 ve Şekil 2) daha ayrıntılı olarak ortaya çıkıyor. Antijen iletişim site Mikrotubul ağı da numune hazırlama kullanarak ve yukarıda (şekil 3) açıklanan protokol Imaging görüntüsü. Mikrotübüller MTOC olan bir merkez noktasından kaynaklanan ve dışa doğru hücre çevre doğru sızmak. Bu deneyde, B hücreleri üzerinde anti-IG-kaplı coverslips 15 dk (şekil 3), hangi karşı antijen iletişim site17MTOC taşındı zaman noktası için yaymak için izin verildi. Şekil 3' te gösterilen mikrotübüller ucunda mikrotübüller artı sonunu klip-170-GFP kümeleri görülebilir. Numune hazırlama ve STED görüntüleme Mikrotubul ağının en uygun, sürekli ve farklı olduğunda klip-170-GFP mikrotübüller boyunca ya da artı ucu (şekil 3A) Lokalize ile mikrotübüller gözlenir. Antikorlar veya toplu halde daha bir yıl eski, α-tübülin antikorlar kötü çözümlenir kesintili bölümleri görünen mikrotübüller sonuçlarında boyama düşük konsantrasyonlarda kullanırken gözlendi boyama, alt-optimal mikrotubul deconvolution üzerine (şekil 3B; Ayrıca bakınız şekil 5C). Tüm bu görüntüler klip-170-GFP Floresans olmasına rağmen α-tübülin-immunostained yapıları ile ilişkili olup olmadığını klip-170-GFP artı ucunda veya eksik boyama nedeniyle mikrotübüller, uzunluğu boyunca yer alır bir ayırt edemez mikrotübüller. Bu nedenle α-tübülin antikor önerilen depolama şartları ve bir yıl içinde kullanılan üreticiler alanında depolanması önemlidir.
Bu iletişim kuralı, organizasyon ve aktin sitoiskeleti ve Mikrotubul ağ, aynı zamanda bu iki cytoskeletons17ile ilişkilendirmek proteinler IQGAP1 ve CLIP-170 gibi yapısını göstermek yüksek kaliteli çok renkli STED görüntüleri kullanarak, elde edilebilir. Şekil 4 STED Albümdeki dendritik aktin yanı sıra aktin boyama daha az yoğun nerede hücre içinde merkezi bir konumdan sızmak mikrotübüller periferik yüzüğü göster. KLİP-170-GFP bu mikrotübüller ucunda periferik F-aktin ile yakından ilişkilidir. Bu iletişim kuralı bir tek renkli STED (Şekil 2) Imaging veya Imaging (şekil 3 ve şekil 4) çok renkli STED kullanarak bağışıklık synapse hücre iskeleti yapılara görselleştirmek izin verir. Ancak, tek renk STED görüntüleme (Şekil 2) daha iyi çözünürlüğe aktin yapıları ve mikrotübüller B hücreleri daha çok renkli STED (şekil 4) verim unutulmamalıdır. Bunun nedeni photobleaching sıralı STED resim alma için farklı fluorophores neden olabilir. En iyi süper çözünürlük fotoğraf, fluorophores ve floresan proteinler seçili yanı sıra hangi onlar uyarma ve tükenmesi lazerler kullanarak yansıma sıra elde etmek için örnek için optimize edilmelidir. Yine de, çok renkli STED görüntüleme daha geleneksel confocal mikroskobu hücre iskeleti bu yapıların daha yüksek çözünürlük görüntüleri sağlar. Ayrıca, tek renkli STED tüm B hücre aktin veya Mikrotubul ağın (film 1) 3 boyutlu süper çözünürlük fotoğraf elde etmek için kullanılabilir.
En iyi ifade düzeyleri ulaşmak ve eserler overexpression nedeniyle kaçınarak kullanarak hücreleri floresan füzyon proteinler ile transfected zaman önemli dikkat edilmesi gereken noktalar vardır. Nerede klip-170-GFP overexpressed hücrelerde, klip-170-GFP büyük agrega oluşmaktadır (şekil 5A). KLİP-170-GFP bu mislocalization ek olarak, yalnızca bu hücredeki Mikrotubul ağ coverslip (şekil 5B) en yakın odak düzlemi içinde bir parçasıydı. Bu klip-170 overexpression Ayrıca MTOC BCR kaynaklı polarizasyon bozabilen göstermektedir. Diğer taraftan, güçlü floresan sinyallerini genellikle yüksek kaliteli STED görüntüleri elde etme için gerekli olduğundan, floresan füzyon protein klip-170-GFP (şekil 5C) gibi düşük ifade kalitesiz Albümdeki sonuçlanır. Bu nedenle, transfected hücreleri floresan proteinler ile kullanırken, yalnızca füzyon protein ifadesi en uygun düzeyi içeren hücreleri görüntü önemlidir. A20 için kullanılan transfection Protokolü ( Tablo malzemelerigörmek) genellikle % 20-50 sonuçlarında transfected protein ifade hücrelerin hücrelere unutmamak önemlidir. (Çift karşı) plazmid DNA için transfection Frekanslar birincil B hücreleri için çoğu kez çok A20 hücre, B hücre hatları kullanımı gerektiren için daha düşük. Yine de, yüksek kaliteli STED görüntüler untransfected birincil B hücreleri hücre iskeleti unsurların bu Protokolü (şekil 6) kullanılarak elde edilebilir.
Şekil 1: confocal karşılaştırılması ve F-aktin STED görüntüleme. Confocal görüntüler (üst) ve Alexa Fluor 532-Birleşik phalloidin ile lekeli önce anti-IgG-kaplı coverslips 15dk için üzerinde yayılan A20 hücre STED görüntüleri (altta). Confocal STED mikroskop kullanarak, aynı hücreyi ilk confocal mikroskobu ve sonra STED görüntüsü. İlk confocal ve STED görüntüleri, aynı confocal ve sonra deconvolution STED görüntüleri ile birlikte gösterilir. Ölçek çubuğu: 5 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: antijen iletişim site, aktin sitoiskeleti. Anti-IgG-kaplı coverslips 15dk için yaymak için izin vermişti A20 hücre Alexa Fluor 568-Birleşik phalloidin ile lekeli ve tarafından STED mikroskobu görüntüsü. İlk STED görüntüleri deconvolved. Paneller A-B ve C-E panelleri iki farklı hücre temsilcisi resimleri göster. Paneli E 3 X büyütme bölgenin Masası Cbeyaz kutusunda gösterir. Ölçek çubuğu panelleri A-D: 5 µm. ölçek çubuğu panelinin E: 1 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Mikrotubul ağ ve CLIP-170-GFP STED görüntülerini. KLİP-170-GFP ifade A20 hücre anti-IgG-kaplı coverslips sabit varlık önce 15 dakika ve immunostained bir α-tübülin antikor artı bir Alexa Fluor 532 Birleşik ikincil antikor yaymak için izin verildi. (A)temsilcisi görüntü ile klip-170-GFP esas olarak artı-uçları mikrotübüller bulunan immunostaining Mikrotubul ağının gösteren. (B) alt-optimal boyama yapmak ve mikrotübüller α-tübülin antikor modası geçmiş bir stok kullanımı nedeniyle. Ölçek çubukları: 5 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: aktin ve Mikrotubul cytoskeletons görüntülerini STED. KLİP-170-GFP ifade A20 hücre üzerinde anti-IgG-kaplı coverslips 15dk önce sabit ve F-aktin görselleştirmek için Alexa Fluor 568-Birleşik phalloidin ve bir α-tübülin antikor artı bir Alexa Fluor 532 Birleşik lekeli yaymak için izin verildi ikincil antikor mikrotübüller görselleştirmek için. Paneller A-D ve paneller E-F iki farklı hücre temsilcisi resimleri göster. D Cpanelinde beyaz kutu bölgesi 3,5 X büyütme paneldir. Ölçek çubukları: 5 mikron panelleri A-C ve E-F; 1 µm paneli Diçin. Görüntü panelinde A şekil 3A içinde kullanılan aynı görüntü ancak F-aktin kanal kaplama içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: kalitesiz STED görüntüleri nedeniyle overexpression veya GFP füzyon protein yetersiz ifade örnekleri. KLİP-170-GFP ifade A20 hücre üzerinde anti-IgG-kaplı coverslips 15dk önce sabit ve şekil 4olduğu gibi lekeli yaymak için izin verildi. (a, B) Büyük, anormal toplamları klip-170-GFP overexpression sonuçlarında klip-170-GFP (A) ve karşı antijen kişi Engelli MTOC polarizasyon (B)sitesi. (C) klip-170-GFP yetersiz ifade için kalitesiz STED görüntüleri lazer güç sonuçlarında artırarak telafi etmeye çalışıyor. Ölçek çubukları: 5 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: birincil B hücreleri mikrotubul sitoiskeleti görüntüsünü STED. Birincil dalak B hücreleri 6 h 5 ng/µL BAFF ile artı 2,5 µg/mL LPS kültürlü ve sonra anti-IgM antikorları ile kaplı coverslips üzerinde 15 dakika yaymak için izin. Hücreleri olduğunu daha sonra sabit ve bir α-tübülin antikor artı mikrotübüller görselleştirmek için bir Alexa Fluor 568 Birleşik ikincil antikor ile lekeli. Temsil edici bir resim gösterilir. Ölçek çubuğu: 5 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Film 1: 3D B hücre Mikrotubul ağ inşası. A20 hücre anti-IgG-kaplı coverslips sabit varlık önce 15 dakika ve immunostained bir α-tübülin antikor artı bir Alexa Fluor 488 Birleşik ikincil antikor yaymak için izin verildi. Z-dilim olmak üzere toplam 37 kare 0.2 µm adım boyutunda ele geçirildi. 3D imar yapıldı STED mikroskop kullanarak yazılım görüntüleme'nın. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre iskeleti yapıların detaylı görüntü elde teorik olarak 50 bir çözünürlük elde edebilirsiniz STED süper çözünürlük mikroskobu kullanılarak nm kırınım-sınırlı çözünürlük ~ 200 olduğu geleneksel confocal mikroskopi için karşılaştırıldığında, nm 24. ince yapıları gidermek yeteneği daha da gözlenen "bulanık" floresan sinyal özgün ışık kaynağından en olası konumunu hesaplamak için deconvolution yazılım kullanarak geliştirilmiştir. Bu iletişim kuralı STED sitoiskeleti ilişkili proteinler yanı sıra aktin ve Mikrotubul cytoskeletons görüntü için kullanma yöntemlerini açıklar.
B hücre aktivasyonu aktin sitoiskeleti ve Mikrotubul ağ bağışıklık synapse oluşumu17,42için önemli olan iki cytoskeletons koordineli Yönetmeliği ile remodeling neden olmaktadır. Biz mevcut yöntem çok renkli STED kullanarak antijen iletişim site, aktin ve Mikrotubul cytoskeletons aynı anda görüntüleme için optimize edilmiş, ancak aynı derecede tek renkli STED için geçerlidir. Önceki çalışmalarda STED nasıl hücresel yapılar yeni görüşler sağlayabilir B hücre sitoiskeleti vurgu üzerinde yapılan düzenlenir ve birbirleriyle nasıl etkileşim kurduklarını. Confocal ve toplam iç floresan (TIRF) mikroskopi kullanarak, biz mikrotübüller F-aktin antijen iletişim site17çevre halka iletişim gözlenen. STED mikroskobu kullanarak, biz bu tarafından işaretlenen mikrotübüller artı ucunun göstermek başardık + uç klip-170 ilişkilendirmek yakından hücre çevre dendritik aktin ağ ile (bkz. şekil 4).
Multipl faktörler etkisi kişinin belirli uygulama için en uygun hangi görüntüleme tekniğidir. Bunlar arasında gerekli çözümü, yansıması için yapıları, etiketleme tekniği ve sinyal-gürültü oranı (Yani, kontrast), satın alma zaman, numune hazırlama ve tekrarlanabilirlik kolaylığı. Numune hazırlama STED için confocal mikroskopi için önemli ölçüde farklı değildir ve yüksek çözünürlüklü hızlı resim alma ile birleştirir. STED önemli bir avantajı görüntü doğrudan alınan örneğin kazanılır optik bir süreçtir ve çözünürlük STED lazer24gücünü değiştirerek ayarlanabilir olduğunu. Zemin durumu tükenmesi süper çözünürlük mikroskobu, aksine hangi Art arda gelen görüntü binlerce görüntüleri yeniden yapılandırır yakalar, kapsamlı bir hesaplama işlenme STED için gerekli değildir ve görüntü yeniden yapılanma eserler getirilmesi kaçınılması 24. ancak, STED görüntülerdeki kontrast genellikle düşük24, ImageJ karşıtlığı artırmak için gerekli gibi yazılım kullanarak hangi durumda sonrası görüntü işleme olduğunu. Bu görüntüler ile dendritik aktin ağ gibi yoğun yapıları için özellikle önemlidir. Resim alma sırasında görüntü kontrastı artırmak için bir tükenmesi lazer gücü azaltmak ve/veya hat veya ortalama çerçeve geçerli. Hangi bir kullanıcı tarafından ayarlanan saat gecikmeyle fotonlar yakalar, çözünürlük alan hangi fotonlar toplanan24,43azaltarak artırabilir zaman Geçitli STED. Kontrast ve çözüm geliştirmek için bu yöntemlerin bir bileşimini kullanarak STED görüntüleme bağışıklık sinaps, hücre iskeleti yapıların en iyi duruma getirme tavsiye ediyoruz.
Şu anda, tüm fluorophores STED ile görüntüleme için en iyi durumda ve tüm fluorophore kombinasyonları çok renkli STED görüntüleri elde etmek için uygundur. Algılama aralıklarının dikkatli ayarlama fluorophores, çok az kanama ile bitişik kanallarına sağlamak için önemlidir. Bu protokol (Yani, GFP, Alexa Fluor 532 ve Alexa Fluor 568) için kullanılan fluorophores çok renkli STED süper çözünürlük görüntüleme için en uygun birleşimidir. Yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) karşılaştırıldığında ve fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu (PALM), STED gibi tek molekül yerelleştirme yöntemleri (SMLM), genellikle çok renkli görüntüleme için ideal değildir. Ancak, biz burada fluorophore algılama, o hafif aşırı doygunluk göstermek basit görüntü işleme araçları ile eşleştirilmiş, aktin ve Mikrotubul cytoskeletons yüksek çözünürlüklü çok renkli görüntüleri teslim edebilirsiniz.
Bu iletişim kuralı STED görüntüleme hücre iskeleti yapıları için B hücre bağışıklık sinaps, hücre iskeleti mimarisinin yeni ayrıntılar ortaya çıkarmıştır. Her ne kadar biz en iyi duruma getirilmiş aktin ve Mikrotubul cytoskeletons antijen-iletişim alanında B hücreleri içinde görüntüleme için bu iletişim kuralı, bu yöntemler diğer hücre tipleri, oluşturan özellikle bağışıklık hücreleri (T hücreler, NK hücreleri, mast hücreleri, vb) uygulanabilir olmalıdır bağışıklık sinapslarda. Ayrıca, yardımcı programı bu protokolün coverslips diğer ligandlar veya yapışkanlı yüzeylerde kaplama için uzun olabilir. Ancak, protokol ve hücre tipi ve deneysel kurulum görüntü alma ayarlarını optimize etmek önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
UBC Yaşam Bilimleri Enstitüsü (LSI) görüntüleme tesis STED mikroskop ve desteklenmesi için teşekkür ediyoruz. Bu eser hibe #68865 Kanada Sağlık Araştırma enstitüleri (için M.R.G.) tarafından finanse edildi. Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Üniversitesi, Nagoya, Japonya) klip-170-GFP plazmid için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| A20 mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamine | Millipore Sigma | G5763 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P5280 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid, 10,000 units |
| Additional materials for primary B cells | |||
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| Magnetic bead-based B cell isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep Mouse B cell Isolation kit |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS from E. coli 0111:B4 |
| B cell-activating factor (BAFF) | R&D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid encoding CLIP-170-GFP | Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
| Recommended transfection reagents and equipment | |||
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Falcon 6-well plates, TC treated, sterile | Corning | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating coverslips | |||
| 18-mm diameter round #1.5 cover glasses | Thomas Scientific | 1217N81 | Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580 |
| Forceps | Fisher Scientific | 1381242 | Dissecting extra fine splinter forceps |
| Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate | Corning | 353043 | |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | For A20 cells |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | For primary mouse B cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Paraformaldehyde (16% stock solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute with PBS to working concentration |
| Glutaraldehyde (50% stock solution) | Millipore Sigma | 340855 | Dilute with PBS to working concentration |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| Bovine serum albumin (BSA), Fraction V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| Rabbit anti-tubulin antibody | Abcam | ab52866 | 1:250 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 1:100 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1:100 dilution recommneded but should be optimized |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Without DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica | ||
| Huygens deconvolution software | Scientific Voume Imaging | See https://svi.nl/HuygensProducts |
References
- Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).
- Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
- Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
- Dustin, M. L. Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses. Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).
- Dustin, M. L. Modular design of immunological synapses and kinapses. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).
- Dustin, M. L. Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses. Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).
- Dustin, M. L. Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Monks, C. R., et al. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Yuseff, M. I., et al. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).
- Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).
- Kuhn, J. R., Poenie, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).
- Wang, J. C., et al. The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).
- Schnyder, T., et al. B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster. Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).
- Nath, S., et al. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).
- Combs, J., et al. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).
- Fukata, M., et al. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109 (7), 873-885 (2002).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X.
- Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
- Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).
- Tamarit, B., et al. Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells. J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).
- Brown, A. C., et al. Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins. Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).
- Dupre, L., et al. T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors. Front Immunol. 6, 586 (2015).
- Rak, G. D., et al. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
- Lin, K. B., et al. The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas. Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).
- Lin, K. B., et al. The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands. Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).
- McLeod, S. J., et al. The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes. J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).
- Christian, S. L., et al. Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation. J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Treanor, B., et al. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).
- Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
- Yuseff, M. -I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Russ, J. C. The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , CRC Press. (2011).
- Stinchcombe, J. C., et al. Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse. Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).
- Vicidomini, G., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).
