Summary
Vi præsenterer en protokol for at bruge STED mikroskopi til samtidigt billede actin strukturer, mikrotubuli og mikrotubulus plus-end bindende proteiner i B-celler, der har spredt på coverslips belagt med antistoffer til B-celle receptoren, en model for den indledende fase af immun synapse dannelse.
Abstract
B-celler, der bindes til membran-bundet antigener (fx, på overfladen af en antigen-præsenterer celle) udgør en immun synapse, en specialiseret cellestruktur, der optimerer B-celle receptoren (BCR) signalering og BCR-medieret antigen erhvervelse. Begge remodellering af actin cytoskelettet og omlægning af mikrotubulus netværk mod antigenet kontakt site er afgørende for immun synapse dannelse. Ombygning af actin cytoskeleton i en tætte perifere ring af F-actin er ledsaget af polarisering af den organisering af mikrotubulus center mod immun synapse. Mikrotubulus plus-end bindende proteiner samt kortikale plus-ende capture proteiner mægle fysiske vekselvirkninger mellem actin og mikrotubulus cytoskeletons, som tillader dem at blive reorganiseret på en koordineret måde. Belyse de mekanismer at kontrollere denne cytoskeletal reorganisering, samt forstå hvordan disse cytoskeletal strukturer forme immun synapse dannelse og BCR signalering, kan give ny indsigt i B-celle aktivering. Dette har været hjulpet af udviklingen af super-resolution mikroskopi metoder, der afslører nye detaljer om cytoskeletal netværksorganisation. Vi beskriver her en metode for at anvende stimuleret emission udtynding (STED) mikroskopi til samtidigt billede actin strukturer, mikrotubuli og transfekteret normal god landbrugspraksis-tagged mikrotubulus plus-end bindende proteiner i B-celler. Til model de tidlige begivenheder i immun synapse dannelse, tillader vi B-celler til at sprede på coverslips belagt med anti-immunglobulin (anti-Ig) antistoffer, der indleder BCR signalering og cytoskeleton remodellering. Vi leverer en trinvis protokoller for at give udtryk for normal god landbrugspraksis fusion proteiner i A20 B-lymfom celler, for anti-Ig-induceret celle spredning og for efterfølgende celle fiksering, immunfarvning, image erhvervelse og billede deconvolution trin. Billeder med høj opløsning fremstillet ved hjælp af disse procedurer, at man kan samtidig visualisere actin strukturer, mikrotubuli og mikrotubulus plus-end bindende proteiner, der kan forbinde disse to cytoskeletal netværk.
Introduction
Når B-celler bindes til polariseret arrays af antigener (f.eks.vises på overfladen af antigen-præsentere celler (PMV'er)), den resulterende B-celle receptoren (BCR) signalering drev dannelsen af en klassisk immun synapse struktur, som først blev beskrevet i T celler1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. I første omgang, microclusters af antigen-bundet oplysningspligt form i periferien af B celle: APC kontakt site. Disse microclusters derefter bevæge sig mod midten af antigen kontakt site, hvor de hånd i hånd i en central Supramolekylær aktivering klynge (cSMAC), der udgør kernen i den immun synapse. Immun synapse dannelse optimerer BCR signalering og letter BCR-medieret antigen udvinding fra APC membran14. Denne antigen erhvervelse, som efterfølges af BCR-medieret antigen internalisering og efterfølgende antigen behandling, giver mulighed for B-celler til at præsentere peptid: MHC II komplekser til T-celler og fremkalde T-celle hjælp14. Fordi immun synapse dannelse fremmer B celle aktivering, belyse de mekanismer, der etablerer denne funktionelle mønster af receptor organisation kan give nye er indsigt i hvordan LUN immun svar indledt og reguleret.
Reorganisering af både aktin og mikrotubulus cytoskeletons er afgørende for immun synapse dannelse. Lokaliseret BCR signalering stimuleret af et rumligt polariseret vifte af antigener inducerer hurtige og dramatiske remodellering af actin cytoskeleton1,15. Dannelsen af dendritiske actin strukturer i periferien af cellen B udøver skubbe styrker på plasma membran og fremmer spredning af B-celle. Dette giver mulighed for B-celle til at scanne et større område af antigen-bærende overflade, og øger antallet af referencematerialer, der binder antigen og aktivere BCR signalering veje. På samme tid er MTOC og mikrotubulus netværk omlagt til stedet af antigen kontakt. Da MTOC tilgange antigen kontakt site, udvide mikrotubuli stammer fra MTOC langs indersiden af plasma membran på grænsefladen mellem B-celle og antigen-bærende overflade16,17. Disse juxtamembrane mikrotubuler kan derefter fungere som spor til de dynein-medieret centripetale bevægelse af antigen-bundet BCR microclusters18, fører til dannelsen af en cSMAC.
Omlægning og polarisering af MTOC mod immun synapse kræver intakt aktin og mikrotubulus cytoskeletons, og ofte afhænger af samspillet mellem den kortikale actin netværk og mikrotubuli16,17, 19,20. Kortikale actin-bindende proteiner, såsom IQGAP1, kan fange mikrotubuli ved at interagere med proteinkomplekser, at dekorere mikrotubulus plus-slutter21. Disse dynamiske komplekser af plus-end bindende proteiner omfatter EB1 og klip-170, som benævnes kollektivt som mikrotubulus plus-ende tracking proteiner (+ TIPs)21,22. + TIPs i enderne af mikrotubuli kan binder sig til proteiner, der er forbundet med enten plasma membran eller kortikale actin cytoskelet. Dette giver kraft-genererende mekanismer (f.eks.minus-ende instrueret bevægelse af cortically forankret dynein langs mikrotubuli) at udøve trække styrker på mikrotubuli, og dermed flytte MTOC. CLIP-170 kan binde til aktin-associerede stilladser protein IQGAP123, og vi har vist, at begge af disse proteiner er nødvendige for BCR-induceret MTOC polarisering mod immun synapse17. Denne IQGAP1-klip-170 interaktion kan spille en central rolle i koordineringen af ombygning af actin cytoskeleton med Repositionering af mikrotubulus nettet på B-celle immun synapse.
Konventionelle Fluorescens mikroskopi har afsløret den dramatiske reorganisering af actin og mikrotubulus cytoskeletons under B-celle immun synapse dannelse2. Men denne fremgangsmåde ikke kan løse små cellulære strukturer i detaljer på grund af diffraktion grænse af lys, som ifølge Abbes lov, er afhængig af bølgelængde af lys bruges til at belyse prøven og blænde af de objektive24. Denne diffraktion grænse begrænser opløsning af konventionelle lys mikroskoper til 200-300 nm i lateral retning og 500-700 nm i aksial retning25. Derfor, mindre subcellulært strukturer, som de fine detaljer af actin og mikrotubulus cytoskeletons, kunne kun konstateres ved hjælp af elektronmikroskopi. Elektronmikroskopi billeddannelse af cytoskelettet er tidskrævende, kræver hård prøve fiksering og forberedelse protokoller, der kan ændre biologiske strukturer, og er begrænset til antistof-medieret påvisning. Mulighed for at immunostain og samtidigt billede flere proteiner eller cellulære strukturer er en væsentlig fordel ved Fluorescens mikroskopi. Desuden udtrykker fluorescerende fusion proteiner i cellerne giver mulighed for real-time imaging og er nyttig, når effektive antistoffer for immunfarvning protein af interesse ikke er tilgængelige.
Seneste teknologiske fremskridt i Super-resolution mikroskopi har overvundet diffraktion grænserne af lys og tilladt visualisering af nanoskala cellestrukturer24. En sådan super-resolution mikroskopi teknik kaldes stimuleret emission udtynding (STED) mikroskopi. STED beskæftiger to lasere, hvor en laser ophidser fluorophore og en anden laser med en doughnut-formet mønster selektivt undertrykker fluorescens emission omkring fluorophore. Dette reducerer funktionen punkt-spredning (tilsyneladende område) af en enkelt partikel, fluorescerende og giver en sub diffraktion grænse fluorescerende billede25,26. Grundtilstand udtynding mikroskopi beskæftiger også fluorescens-baserede teknikker til at erhverve super-resolution billeder. Dog billede erhvervelse og genopbygning gange er lange, der er kun et begrænset antal fluorophores, der kan bruges, og den samtidige høj opløsning billeddannelse af flere cytoskeletal komponenter teknisk udfordrende fordi opretholde aktin og mikrotubulus strukturer kræver forskellige fiksering procedurer. Således STED har flere fordele over elektronmikroskopi og andre super-resolution mikroskopi nærmer sig, det tilbyder hurtig billede erhvervelse, har minimal post-processing krav, og beskæftiger det samme fluorophores og farvning teknikker der anvendes til konventionelle Fluorescens mikroskopi af faste prøver26.
Super-resolution mikroskopi er nu blevet brugt til at visualisere actin strukturer på den immun synapse i natural killer (NK) celler og T celler26,27,28,29,30, 31. dog super-resolution billeddannelse af mikrotubulus cytoskeleton, samt koordineret reorganisering af actin og mikrotubulus cytoskeletons under immune synapse dannelse, har først for nylig blevet rapporteret17. Vi brugte STED mikroskopi billede B celler, der havde fået lov til at sprede på coverslips belagt med anti-immunglobulin (anti-Ig) antistoffer, som stimulerer BCR signalering og indlede cytoskeleton reorganisering. Når belagt på immobiliserede anti-Ig antistoffer, gennemgå B-celler dramatiske actin-afhængige spredning, som sammenfatter de indledende events under immune synapse dannelse. Vigtigere, afslørede STED mikroskopi de fine detaljer af dendritiske ring af F-actin, der former i periferien af immun synapse og viste, at MTOC samt mikrotubuli knyttet til det, havde flyttet tæt på antigen kontakt site17. Disse mikrotubuli udvides udad mod den perifere ring af F-actin. Derudover flerfarvet STED billeddannelse af forskellige kombinationer af F-actin, tubulin, IQGAP1, og normal god landbrugspraksis-tagged klip-170 + TIPs viste at mikrotubulus plus-ends præget af CLIP-170-normal god landbrugspraksis var tæt forbundet med den perifere actin meshwork og med IQGAP1, en kortikale capture protein17.
Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for imaging aktin og mikrotubulus cytoskeletons på immun synapse ved hjælp af STED mikroskopi. Disse metoder har været optimeret ved hjælp af linjen A20 murine B-celle, som er blevet bredt ansat til at studere BCR signalering og immun synapse dannelse17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. fordi kommercielle antistoffer mod klip-170 ikke virkede godt for immunfarvning i tidligere forsøg, vi beskriver i detaljer udtrykket for normal god landbrugspraksis-tagged klip-170 i A20 celler, sammen med farvning protokoller for samtidig visualisere op til tre cytoskeletal komponenter eller cytoskeleton-associerede proteiner. Metoder til brug af STED mikroskopi til billede actin på NK celle immun synapser har været beskrevet tidligere40. Her, udvider vi det til hentning af multi-farve Super-opløsning billeder af både aktin og mikrotubulus cytoskeletons i B-celler.
En kritisk overvejelse for Super-resolution mikroskopi ved hjælp af passende fiksering procedurer for vedligeholdelse af cellestrukturer og at forebygge skade fluorescerende proteiner. Fiksering og farvning metoder præsenteres heri er blevet optimeret for at opretholde normal god landbrugspraksis fluorescens og giver høj opløsning billeddannelse af actin- og mikrotubulus. Når at udtrykke fluorescerende proteiner, skal det bemærkes, at B-celler er normalt vanskelige at transfect. Ved hjælp af denne protokol, 20-50% af A20 celler typisk express transfected normal god landbrugspraksis fusion protein, og denne befolkningen niveauer af protein udtryk er variabel. Ikke desto mindre super-resolution billeddannelse af actin og mikrotubuli ved hjælp af de procedurer, der beskriver vi er ganske robust og høj kvalitet billeder opnås let. På trods af deres lille størrelse i forhold til A20 celler viser vi, at disse procedurer kan også bruges til at afbilde mikrotubulus netværk i primære B-celler, der har været kortvarigt aktiveret med LPS (LPS). Vi har vist, at LPS-aktiveret primær B-celler kan være transfekteret med siRNAs ved relativt høj effektivitet (dvs., sådan at protein nedbrydning kan påvises ved immunoblotting), hvilket gør dem et godt alternativ til brugen af B-cellelinier til nogle undersøgelser 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr procedurer blev godkendt af University of British Columbia dyr efterbehandling udvalget.
1. at give udtryk for normal god landbrugspraksis-fusion proteiner i A20 B-lymfom celler
- Kultur A20 celler i komplet RPMI medium (RPMI-1640 suppleret med 10% varme-inaktiverede føtal bovint serum (FBS), 50 µM 2-mercaptoethanol, 2 mM glutamin, 1 mM pyruvat, 50 U/mL penicillin og 50 µg/mL streptomycin) ved 37 ° C i en vævskultur kuvøse med 5 % CO2.
- Forberede Transfektion reagens (Se Tabel af materialer) ifølge producentens anvisninger.
Bemærk: Denne protokol er blevet optimeret til de specifikke reagenser og Transfektion protokollen beskrevet i Tabel af materialer. Andre Transfektion reagenser, som vi har prøvet har ikke givet tilstrækkelig Transfektion effektivitet. - Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer. Centrifuge 2,5 x 106 A20 celler (for hver Transfektion) i 5 min på 525 x g. Resuspend celler i 100 µL Transfektion reagens indeholdende 1-2,5 µg af plasmid DNA. DNA kodning klip-170-NGL23, bruge 2,5 µg pr. Transfektion. Bland forsigtigt.
- Overfør celler til et godt af en 6-godt plade, og justere lydstyrken til 2 mL med pre varmede komplet RPMI medium. Kultur celler i 18 timer ved 37 ° C at tillade protein udtryk.
2. isolering primære mus B celler og aktivere dem med LP'ER
- Bruge steriliseret kirurgiske værktøjer til at fjerne milten fra en mus, efter protokoller godkendt af institutionens dyr efterbehandling udvalget.
- I vævskultur hætte, skal du placere en steril 70 µm celle si til en 35-mm vævskultur skål indeholdende 3 mL stuetemperatur steril PBS. Brug gummi del af stemplet fra en 5-ml sprøjte til at knuse milten gennem celle si.
- Med pipette overfoeres enkelt celle suspensionen af splenoctyes i en steril 15 mL rør og centrifugeres ved 525 x g i 5 min.
- Brug en magnetisk bead-baserede B celle isolering kit (Se Tabel af materialer) for at opnå et højt beriget befolkning af B-celler.
- Resuspend B-celler til 3 x 106/mL i komplet RPMI medium suppleret med 2,5 µg/mL LP'ER plus 5 ng/mL B celle aktivering faktor (BAFF; en overlevelse cytokin).
- Kultur cellerne for 6 timer ved 37 ° C.
3. belægning glas Coverslips med Anti-Ig antistoffer
- Forberede antistof løsning for belægning af coverslips. Fortynd stamopløsningen af gede-anti-mus Ig antistoffer i stuetemperatur steril PBS til at gøre en 12,5 µg/mL løsning; 400 µL antistof løsning er påkrævet for hver coverslip.
Bemærk: Brug ged anti-musen IgG til A20 celler; bruge ged anti-musen IgM til primære B-celler. Ged IgG antistoffer binder ikke godt til musen Fc receptorer. Men for at undgå enhver potentiel Fc receptor binding, kan man bruge F(ab) eller F(ab')2 fragmenter af anti-mus IgG eller anti-mus IgM antistoffer. - Dyp en #1.5 18-mm runde glas coverslip i 100% methanol og lad det tørre helt (~ 10 min).
- Brug af pincet, placere den tørrede coverslip i 12-godt vævskultur plade og afpipetteres 400 µL af 12,5 µg/mL antistof-løsning (5 µg total; 2 µg/cm2) på coverslip, så de danner en boble på midten af coverslip og breder sig til kanterne.
- Vær omhyggelig med at dække hele coverslip, men tillader ikke antistof løsning at udvide forbi kanten af glas coverslip og på vævskultur plast. Inkuber ved stuetemperatur i 30 min.
- Vaske coverslips af pipettering 1 mL steril PBS til godt og efterfølgende sugning ud løsningen. Gentag to gange for at fjerne ubundne antistoffer.
- Der tilsættes 1 mL steril PBS til den godt med antistof-coverslip indtil celler er klar til at blive tilføjet.
Bemærk: Coverslips kan opbevares ved stuetemperatur, dækket med PBS, til brug på samme dag.
4. B celle spredning på Anti-Ig-Coated Coverslips
- Forberede modificeret HEPES-bufferet saltvand (mHBS): 25 mM HEPES, pH 7,2, 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM Na2HPO4, 0,5 mM MgSO4, 1 mg/mL dextrose, 2 mM glutamin, 1 mM natrium pyruvat, og 50 µM 2-mercaptoethanol). Filter sterilisere denne løsning og opbevares ved 4 ° C.
- På dagen for eksperimentet, gøre 50 mL af mHBS med 2% FBS (mHBS-FBS) ved tilsætning af 1 mL af varme-inaktiverede FBS til 50 mL mHBS. Varm mHBS-FBS til 37 ° C før brug.
- Der centrifugeres transfected A20 cellerne eller primære B-celler, der havde været kulturperler med BAFF plus LP'ER på 525 x g i 5 min.
- Resuspend celler i 1 mL af mHBS-FBS, tælle celler ved hjælp af en hemocytometer, og fortynd celler til 2 x 105 celler/mL i mHBS-FBS.
- Brug pincet, overførsel af coverslip fra vævskultur plade til et stykke paraffin film.
- Tilsæt 250 µL af B-celler (5 x 104 celler) til hver coverslip.
- Inkubér coverslips ved 37 ° C i 15 min. i mørke til at tillade B-celler til at sprede over den anti-IgG-coated overflade.
5. fastsættelse og immunfarvning cellerne
- Forberede fiksering løsning ved fortynding af stamopløsningen 16% PARAFORMALDEHYD og 50% glutaraldehyd stamopløsning i stuetemperatur destilleret vand til at give endelige koncentrationer af 3% PARAFORMALDEHYD og 0,1% glutaraldehyd. Forberede fiksering løsning på den dag, det er at blive brugt og kassér overskydende.
Forsigtig: De PARAFORMALDEHYD og glutaraldehyd Stamopløsninger bør kun bruges i en kemisk stinkskab. Følg vejledningen på de materielle sikkerhedsdatabladet (MSDS). - Forberede den permeabilization/blokerende buffer (3% BSA og 0,1% Triton X-100 fortyndes i PBS). Filter sterilisere denne løsning og opbevares ved 4 ° C. På dagen for eksperimentet, varm det krævede beløb til stuetemperatur.
- Forberede den farvning buffer (1% BSA og 0,1% saponin i PBS). Sterilisere denne løsning ved hjælp af en 0,2 µm filter og opbevares ved 4 ° C. På dagen for eksperimentet, varm det krævede beløb til stuetemperatur.
- Med pipette overfoeres 350 µL af opløsningen fiksering på hver coverslip, at sikre, at overfladen er helt dækket. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min. i mørke.
- Fjern fiksering løsning fra coverslip ved omhyggeligt sugning fra kanten af coverslip ved hjælp af en micropipet.
Forsigtig: Fiksering løsning skal kasseres som farligt kemisk affald. - Vask coverslips gang med 500 µL af permeabilization/blokerende buffer. Med pipette overfoeres fra væsken.
- Permeabilize og blokere cellerne ved at tilføje 250 µL af permeabilization/blokerende buffer til hver coverslip, og inkubere i 10 min. ved stuetemperatur i mørke.
- Fortynd kanin anti-tubulin antistof 1: 100 i farvning buffer.
- Opsug fra permeabilization/blokerende buffer fra coverslips, og tilføje 50 µL af de fortyndede anti-tubulin antistof løsning til hver coverslip. Inkuber ved stuetemperatur i 30 min. i mørke.
- Forberede sekundær antistof/actin pletten løsning ved at fortynde både Alexa Fluor 532-konjugeret gede anti-kanin IgG sekundær antistof og Alexa Fluor 568-konjugeret phalloidin 1: 100 i farvning buffer.
- Vask af coverslips 3 gange for at fjerne overskydende primære antistof ved at tilføje 500 µL af farvning buffer og derefter sugning det.
- Tilføje 50 µL af sekundær antistof/actin pletten løsning til hver coverslip, og der inkuberes i 30 min. ved stuetemperatur i mørke.
- Vask af coverslips 3 gange for at fjerne overskydende sekundær antistof ved at tilføje 500 µL af farvning buffer og derefter sugning det.
- Tilsæt 10 µL montering reagens til et objektglas. Montere coverslip på objektglas med celle side ned.
Bemærk: Et "anti-fade" montering medium (Se Tabel af materialer) anbefales kraftigt at bevare fluorescens-intensiteten af normal god landbrugspraksis fusion proteiner. Undgå brug af montering reagenser indeholdende DAPI, som kan forstyrre billeddannelse af fluorophores, når du bruger STED laser. - Tillad dias til tørre natten i mørke. Image dias næste dag.
Bemærk: Imaging dias, så snart coverslip er tør anbefales kraftigt, som normal god landbrugspraksis fluorescens vil falde over tid.
6. imaging ved hjælp af STED mikroskop
Bemærk: Vær opmærksom på at alle software trin beskrives nedenfor er specifikke for mikroskop og vi anvendte software (Se Tabel af materialer). Trin og indstillinger skal justeres, hvis imaging udføres ved hjælp af en anden mikroskop/software.
- Tænd STED mikroskop, aktivere lasere og epifluorescensmikroskop belysning lampe, og starte op mikroskop software.
- Angiv parametrene for STED udtynding lasere.
Bemærk: Dette vil afhænge specifikke mikroskop bruges og lasere, som det er udstyret med. Nogle anbefalede indstillinger er hvidt lys (WLL) 70%; 592 nm laser 80%; 660 nm laser 80%. - Aktivere indstillingerne STED og justere STED laserstråler ved hjælp af de 100 X mål.
- Ved hjælp af okularet, fokusere prøven og marker en celle med moderat normal god landbrugspraksis udtryk.
Bemærk: Lav normal god landbrugspraksis udtryk kan ikke ses fordi STED reducerer emission intensitet. Omvendt, højt udtryk af CLIP-170-NGL inducerer den spontane dannelse af store klynger, som ikke afspejler den normale mikrotubulus plus-end protein kompleks morfologi og distribution. At vælge en celle med moderat normal god landbrugspraksis udtryk er afgørende for præcist imaging cytoskeletal strukturer på webstedet antigen kontakt. - Zoom ind på den markerede celle og vælge regionen af interesse til afbildning. Justere fokus, så x-y planet for den B-celle, der er tættest på coverslip er i fokus.
- For at gøre dette, flytte mål gradvist tættere til coverslip så cytoskeletal B cellestrukturer kommer i fokus og derefter gå ud af fokus. Derefter flytte gradvist målet i den modsatte retning, indtil cytoskeletal B cellestrukturer først kommer tilbage til fokus.
- Optimere indstillingerne, herunder laser magt, excitation stråle og detektor rækkevidde. Starte med indstillingerne anbefalet af producentens anvisninger. Derefter foretage justeringer efter behov for at optimere signalet til prøverne. Billede alle prøver at være i forhold til hinanden med de samme indstillinger.
- Under fanen "erhverve" af software indstillet billede erhvervelse til sekventielle ramme erhvervelse i nederste venstre "Sekventiel Scan" panel ved at kontrollere indstillingen "mellem rammer".
- Indstille erhvervelse sekvens.
Bemærk: Vi erhverve normal god landbrugspraksis fluorescens først for at undgå nedbrydning af normal god landbrugspraksis signal.
Afhængig af kombinationen af fluorophores, der anvendes ud over normal god landbrugspraksis, kan imaging længere bølgelængde fluorescens signalet først give bedre resultater. Men den rækkefølge som fluorophores eller fluorescerende proteiner er udsat for stimuleret emission udtynding og afbildet skal optimeres for at opnå de stærkeste fluorescens signaler og bedste opløsning. - Vælg og indstille STED laser effekt for hver fluorophore under fanen "Erhverve" af software, og bruge skyderen for enten 592-nm eller 660 nm STED laser til at regulere laser magten. Justere magt for 592-nm udtynding laser for normal god landbrugspraksis og Alexa Fluor 532. Justere magt for 660 nm udtynding laser for Alexa Fluor 568.
- For at øge opløsningen og reducere baggrund signal, gå til "Køb"-indstillinger under fanen "Erhverve" i softwaren, øge den linje og/eller ramme gennemsnit ved at vælge en værdi større end 1 ved hjælp af drop-down menuen for hver indstilling.
- Også, erhverve de fluorescerende signal ved hjælp af tid-gated STED ved at markere indstillingen gating for fluorophore under fanen "Erhverve", og angive værdier for tid-gating (Se bemærkningen nedenfor). Øge STED laser power til at forbedre opløsning, selvom dette vil også øge photobleaching af fluorophores.
Bemærk: Gating tiden skal være optimeret til mikroskop-, prøve- og fluorophores bliver brugt. En tid gating 0,3 til 6 ns anbefales. Efter fiksering er normal god landbrugspraksis særligt følsomme over for høje laser power. For at reducere photobleaching af normal god landbrugspraksis, tid gating bør anvendes og STED laser power bør reduceres. - At fange 3D STED billeder, skal du bruge skyderen til at ændre punktet spredes funktion (PSF) til "3D STED".
- Manuelt erhverve flere billeder for at sikre reproducerbarhed. Deconvolve billeder (Se figur 1) ved hjælp af en deconvolution software pakke41(Se Tabel af materialer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For B-celler spredes på immobiliserede anti-Ig, giver STED mikroskopi anvendes i forbindelse med deconvolution software billeder i højere opløsning af cytoskeletal strukturer end Konfokal mikroskopi. Dette er tydeligt i figur 1, hvor F-actin netværk blev visualiseret ved hjælp af den protokol, der er beskrevet ovenfor. En sammenligning af Konfokal og STED super-resolution billeder af den samme prøve viser, at STED billederne er af højere opløsning og afsløre mere detaljerede strukturer af actin cytoskeleton (figur 1). Dette tal viser også, at deconvolution er afgørende for at opnå høj kvalitet STED billeder i hvilken actin filamenter defineres mere klart. Selvom deconvolution Konfokal billeder giver en betydelig forbedring i opløsning af billedet, indeholder deconvolved STED billeder mere detaljerede strukturelle oplysninger end deconvolved Konfokal billeder. Især er dendritiske strukturen i de perifere F-actin ring åbenbaret i større detalje af STED mikroskopi (figur 1 og figur 2). Mikrotubulus netværk på webstedet antigen kontakt var også afbildet ved hjælp af forberedelsen af prøver og imaging protokollen beskrevet ovenfor (figur 3). Mikrotubuli stammer fra et centralt punkt, som er MTOC, og udspringe udad mod periferien af cellen. I dette eksperiment, var B-celler tilladt at spredes på anti-Ig-coated coverslips for 15 min (figur 3), et tidspunkt, hvor MTOC har bevæget sig mod antigenet kontakt site17. CLIP-170-NGL klynger, der markerer plus-enderne af mikrotubuli kan ses på enderne af mikrotubuli vist i figur 3. Når prøveforberedelsen og STED billeddannelse af mikrotubulus netværk er optimal, kontinuerlig og særskilte er mikrotubuli observeret, med CLIP-170-NGL lokaliseret langs mikrotubuli eller i plus-enderne (figur 3A). Sub-optimale mikrotubulus farvning, som blev observeret ved brug af lavere koncentrationer af farvning antistoffer eller partier af α-tubulin antistoffer, der er mere end et år gamle, resultater i mikrotubuli optræder som diskontinuerlig sektioner, der er dårligt løst ved deconvolution (figur 3B; Se også figur 5 c). Selv om alle klip-170-NGL fluorescens i disse billeder er forbundet med α-tubulin-immunostained strukturer, ikke kan man skelne om CLIP-170-normal god landbrugspraksis er placeret i de plus ender, eller langs længden af mikrotubuli, på grund af ufuldstændig farvning af mikrotubuli. Derfor er det vigtigt, at α-tubulin antistof opbevares under producenten anbefalede opbevaringsforhold og anvendes inden for et år.
Ved hjælp af denne protokol, høj kvalitet flerfarvet STED billeder, som viser de organisation og struktur af actin cytoskelettet og mikrotubulus netværk samt proteiner som IQGAP1 og klip-170, at omgås disse to cytoskeletons17, kunne erhverves. STED billederne i figur 4 viser de perifere ring af dendritiske actin, samt mikrotubuli, der stammer fra en central placering i cellen hvor actin farvning er langt mindre tætte. CLIP-170-NGL i enderne af disse mikrotubuli er tæt forbundet med den perifere F-actin. Denne protokol tillader en at visualisere cytoskeletal strukturer på immun synapse ved hjælp af enten en ensfarvet STED imaging (figur 2) eller flerfarvet STED imaging (figur 3 og figur 4). Dog skal det bemærkes, at én farve STED imaging (figur 2) kan give bedre opløsning af actin strukturer og mikrotubuli i B-celler end flere farve STED (figur 4). Dette kan skyldes photobleaching forårsaget af sekventielle STED billede anskaffelsessum for de forskellige fluorophores. For at opnå de bedste super-opløsning, kombinationen af fluorophores og fluorescerende proteiner markeret, samt den rækkefølge, hvori de er afbildet ved hjælp af excitation og udtynding lasere, skal være optimeret til prøven. Ikke desto mindre giver multi-farve STED imaging billeder i højere opløsning af disse cytoskeletal strukturer end konventionelle Konfokal mikroskopi. Ensfarvet STED kan geometriprogrammet desuden bruges til at erhverve 3-dimensionelle super-opløsning billeder af hele B celle actin eller mikrotubulus netværk (film 1).
Når du bruger celler transfekteret med fluorescerende fusion proteiner, er opnå optimal udtryk niveauer og undgå artefakter som følge af overekspression betydelige overvejelser. I celler hvor klip-170-normal god landbrugspraksis er overexpressed, store aggregater af CLIP-170-normal god landbrugspraksis er dannet (figur 5A). Ud over denne mislocalization af CLIP-170-normal god landbrugspraksis var kun en del af denne celle mikrotubulus netværk inden for brændplanet tættest på coverslip (figur 5B). Dette tyder på, at CLIP-170 overekspression også kan forringe BCR-induceret MTOC polarisering. Omvendt, fordi stærke fluorescens signaler er typisk kræves for at opnå høj kvalitet STED billeder, lave udtryk af fluorescerende fusion proteiner som klip-170-normal god landbrugspraksis (figur 5 c) resulterer i dårlig kvalitetsbilleder. Derfor, når ved hjælp af celler, der har været transfekteret med fluorescerende proteiner, er det vigtigt at billede kun disse celler med optimale niveauer af fusion protein udtryk. Det er også vigtigt at bemærke, at Transfektion protokollen, der blev brugt til A20 celler (Se Tabel af materialer) typisk resulterer i 20-50% af de celler, der udtrykker den transfected protein. For plasmid DNA (i modsætning til siRNAs), Transfektion frekvenser for primære B-celler er ofte meget lavere end for A20 celler, der kræver brug af B-cellelinier. Ikke desto mindre, høj kvalitet STED billeder af cytoskeletal elementer i untransfected primære B-celler kan opnås ved hjælp af denne protokol (figur 6).
Figur 1: sammenligning af Konfokal og STED billeddannelse af F-actin. Konfokal billeder (øverst) og STED billederne (bund) af en A20 celle, der havde spredt på anti-IgG-coated coverslips for 15 min før der farves med Alexa Fluor 532-konjugeret phalloidin. Ved hjælp af en Konfokal STED mikroskop, var den samme celle afbildet først af Konfokal mikroskopi og så af STED. Den indledende Konfokal og STED billeder bliver vist sammen med den samme Konfokal og STED billeder efter deconvolution. Skalalinjen: 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: actin cytoskelettet på antigen kontakt site. A20 celler, der havde fået lov til at sprede på anti-IgG-coated coverslips for 15 min var plettet med Alexa Fluor 568-konjugeret phalloidin og afbildet af STED mikroskopi. De første STED billeder var deconvolved. Paneler A-B og C-E -paneler viser repræsentative billeder af to forskellige celler. Panel E viser en 3 X udvidelsen af regionen i den hvide boks i panelet C. Skalalinjen for paneler A-D: 5 µm. skalalinjen for panelet E: 1 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: STED billeder af mikrotubulus netværk og klip-170-NGL. A20 celler udtrykker klip-170-NGL fik lov til at sprede anti-IgG-coated coverslips for 15 min før fast og immunostained med en α-tubulin antistof plus en Alexa Fluor 532-konjugeret sekundær antistof. (A) repræsentative billede viser immunfarvning af mikrotubulus netværk, med CLIP-170-NGL ligger hovedsagelig i plus-enderne af mikrotubuli. (B) sub-optimale farvning og beslutningsforslaget af mikrotubuler som følge af brugen af et forældet materiel af α-tubulin antistof. Skalere barer: 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: STED billeder af actin og mikrotubulus cytoskeletons. A20 celler udtrykker klip-170-NGL fik lov til at sprede på anti-IgG-coated coverslips for 15 min før der fast og farves med Alexa Fluor 568-konjugeret phalloidin til at visualisere F-actin, og med en α-tubulin antistof plus en Alexa Fluor 532-konjugeret sekundær antistof til at visualisere mikrotubuli. Paneler A-D og E-F -paneler viser repræsentative billeder af to forskellige celler. Panelet D er en 3,5 X udvidelsen af regionen i den hvide boks i panelet C. Skalere barer: 5 µm for paneler A-C og E-F; 1 µm til panelet D. Billedet i panelet A er det samme billedet i figur 3A men omfatter overlejring af F-actin-kanal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: eksempler på dårlig kvalitet STED billeder på grund af overekspression eller utilstrækkelig udtryk for normal god landbrugspraksis fusion protein. A20 celler udtrykker klip-170-NGL fik lov til at sprede på anti-IgG-coated coverslips for 15 min før der fast og farves som i figur 4. (A, B) CLIP-170-NGL overekspression resulterer i store, unormal aggregater af CLIP-170-normal god landbrugspraksis (A) og nedsat MTOC polarisering mod antigenet kontakt site (B). (C) kompenserer for utilstrækkelig udtryk for CLIP-170-NGL ved at øge laser power resulterer i dårlig kvalitet STED billeder. Skalere barer: 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: STED billede af mikrotubulus cytoskelettet i primære B celler. Primære milt B-celler blev kulturperler for 6 h med 5 ng/µL BAFF plus 2,5 µg/mL LP'ER og derefter lov til at sprede for 15 min på coverslips, der havde været belagt med anti-IgM antistoffer. Cellerne blev så fast og farves med en α-tubulin antistof plus en Alexa Fluor 568-konjugeret sekundær antistof til at visualisere mikrotubuli. Et repræsentativt billede er vist. Skalalinjen: 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: 3D rekonstruktion af B-celle mikrotubulus netværk. A20 celler fik lov til at sprede anti-IgG-coated coverslips for 15 min før fast og immunostained med en α-tubulin antistof plus en Alexa Fluor 488-konjugeret sekundær antistof. Z-skiver blev fanget på 0,2 µm trin størrelser for i alt 37 rammer. 3D rekonstruktion blev gjort ved hjælp af STED mikroskop billedbehandlingsprogrammer. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detaljerede billeder af cytoskeletal strukturer kan opnås ved hjælp af STED super-resolution mikroskopi, der teoretisk set kan opnå en opløsning på 50 nm, i forhold til konventionelle Konfokal mikroskopi, hvor diffraktion-begrænset opløsning er ~ 200 nm 24. evnen til at løse finere strukturer er yderligere forbedret ved hjælp af deconvolution software til at beregne den mest sandsynlige placering af den oprindelige lyskilde fra det observerede "slørede" fluorescens signal. Denne protokol beskriver metoder til brug af STED til billede aktin og mikrotubulus cytoskeletons, samt cytoskeleton-associerede proteiner.
B celle aktivering inducerer remodellering af både actin cytoskelettet og mikrotubulus netværk, med den koordinerede regulering af de to cytoskeletons er vigtige for immun synapse dannelse17,42. Den metode, vi præsenterer er blevet optimeret til samtidig imaging aktin og mikrotubulus cytoskeletons på antigen kontakt site ved hjælp af multi-farve STED, men er lige så relevant for ensfarvet STED. Tidligere undersøgelser vi udført på B-celle cytoskeleton højdepunktet at STED kan give ny indsigt i hvordan cellulære strukturer er organiseret og hvordan de interagerer med hinanden. Bruger Konfokal og total interne fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi, havde vi observeret, at mikrotubuli kontakt ring af F-actin i periferien af antigen kontakt site17. Bruger STED mikroskopi, vi har kunnet vise, at plus enderne af mikrotubuli, der var præget af den + TIP klip-170 knyttes tæt dendritiske actin netværk i celle periferien (Se figur 4).
Flere faktorer indflydelse som imaging teknik er mest velegnet til en specifik anvendelse. Disse omfatter den beslutning, som er påkrævet, strukturer til afbildning, mærkning teknikken og dens signal / støj-forhold (dvs., kontrast), erhvervelse gang, lette prøveforberedelsen og reproducerbarhed. Prøveforberedelse til STED er ikke væsentligt anderledes end for Konfokal mikroskopi, og det kombinerer høj opløsning med hurtig billede erhvervelse. En stor fordel af STED er at det er en optisk proces hvor købt billedet direkte fra prøven og beslutningen kan justeres ved at ændre kraften i STED laser24. I modsætning til grundtilstand udtynding super-resolution mikroskopi, der rekonstruerer billeder fra tusindvis af successive billede indfanger, omfattende computerstøttet forarbejdning er ikke påkrævet for STED og indførelsen af billede genopbygning artefakter er undgået 24. dog kontrasten i STED billeder er ofte lav24, i hvilke tilfælde efter billedbehandling benytter programmel såsom ImageJ kan være nødvendigt at øge kontrasten. Dette er især vigtigt for billeder med tætte strukturer, såsom dendritiske aktin. For at forbedre kontrasten i billedet i image erhvervelse, man kan reducere nedbrydningen laser power og/eller anvende streg eller ramme i gennemsnit. Tid-gated STED, som indfanger fotoner efter en bruger-sæt forsinkelse, kan øge opløsningen ved at reducere det areal, hvorfra fotoner indsamlede24,43. Vi anbefaler at du optimerer STED billeddannelse af cytoskeletal strukturer på den immun synapse ved hjælp af en kombination af disse metoder til at forbedre kontrast og opløsning.
I øjeblikket, ikke alle fluorophores er optimal for billeddannelse med STED, og ikke alle fluorophore kombinationer er velegnede til at opnå multi-farve STED billeder. Omhyggelig justering af påvisning intervaller er vigtig for at sikre minimal gennemblødning af fluorophores i tilstødende kanaler. Kombinationen af fluorophores anvendes i denne protokol (dvs., normal god landbrugspraksis, Alexa Fluor 532 og Alexa Fluor 568) er optimal for multicolor STED super-resolution billeddannelse. I forhold til struktureret belysning mikroskopi (SIM) og enkelt-molekyle lokalisering metoder (SMLM), såsom foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (PALM), STED er ikke typisk ideel til multi-farve billeddannelse. Men vi viser her den lille over mætning af fluorophore påvisning, parret med enkel billedbehandling værktøjer, kan levere multi-farve højopløsningsbilleder af actin og mikrotubulus cytoskeletons.
Denne protokol for STED billeddannelse af cytoskeletal strukturer har afsløret nye detaljer om cytoskeletal arkitektur på B-celle immun synapse. Selv om vi optimeret denne protokol for imaging aktin og mikrotubulus cytoskeletons på webstedet antigen-kontakt i B-celler, bør disse metoder finde anvendelse på andre celletyper, især immunceller (T-celler, NK-celler, mastceller, osv.) som danner immun synapser. Nytten af denne protokol kan desuden udvides til belægning coverslips med andre ligander eller selvklæbende underlag. Det er dog vigtigt at optimere protokollen og erhvervelse billedindstillinger for celletype og den eksperimentelle set-up.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker UBC Life Sciences Institute (LSI) Imaging facilitet for at støtte og vedligeholde STED mikroskop. Dette arbejde blev finansieret af tilskud #68865 fra den canadiske institutter for sundhedsforskning (til M.R.G.). Vi takker Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya University, Nagoya, Japan) for klip-170-NGL plasmidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| A20 mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamine | Millipore Sigma | G5763 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P5280 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid, 10,000 units |
| Additional materials for primary B cells | |||
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| Magnetic bead-based B cell isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep Mouse B cell Isolation kit |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS from E. coli 0111:B4 |
| B cell-activating factor (BAFF) | R&D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid encoding CLIP-170-GFP | Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
| Recommended transfection reagents and equipment | |||
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Falcon 6-well plates, TC treated, sterile | Corning | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating coverslips | |||
| 18-mm diameter round #1.5 cover glasses | Thomas Scientific | 1217N81 | Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580 |
| Forceps | Fisher Scientific | 1381242 | Dissecting extra fine splinter forceps |
| Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate | Corning | 353043 | |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | For A20 cells |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | For primary mouse B cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Paraformaldehyde (16% stock solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute with PBS to working concentration |
| Glutaraldehyde (50% stock solution) | Millipore Sigma | 340855 | Dilute with PBS to working concentration |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| Bovine serum albumin (BSA), Fraction V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| Rabbit anti-tubulin antibody | Abcam | ab52866 | 1:250 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 1:100 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1:100 dilution recommneded but should be optimized |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Without DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica | ||
| Huygens deconvolution software | Scientific Voume Imaging | See https://svi.nl/HuygensProducts |
References
- Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).
- Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
- Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
- Dustin, M. L. Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses. Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).
- Dustin, M. L. Modular design of immunological synapses and kinapses. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).
- Dustin, M. L. Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses. Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).
- Dustin, M. L. Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Monks, C. R., et al. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Yuseff, M. I., et al. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).
- Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).
- Kuhn, J. R., Poenie, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).
- Wang, J. C., et al. The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).
- Schnyder, T., et al. B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster. Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).
- Nath, S., et al. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).
- Combs, J., et al. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).
- Fukata, M., et al. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109 (7), 873-885 (2002).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
- Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).
- Tamarit, B., et al. Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells. J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).
- Brown, A. C., et al. Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins. Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).
- Dupre, L., et al. T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors. Front Immunol. 6, 586 (2015).
- Rak, G. D., et al. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
- Lin, K. B., et al. The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas. Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).
- Lin, K. B., et al. The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands. Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).
- McLeod, S. J., et al. The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes. J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).
- Christian, S. L., et al. Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation. J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Treanor, B., et al. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).
- Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
- Yuseff, M. -I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Russ, J. C. The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , CRC Press. (2011).
- Stinchcombe, J. C., et al. Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse. Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).
- Vicidomini, G., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).
