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Immunology and Infection

बी सेल प्रतिरक्षा Synapse में Actin और Microtubule Cytoskeletons visualizing प्रेरित उत्सर्जन घट (STED) माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Published: April 9, 2018 doi: 10.3791/57028
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia

Summary

हम एक साथ STED माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान छवि actin संरचनाओं, microtubules, और microtubule प्लस बी कोशिकाओं है कि बी सेल रिसेप्टर, प्रारंभिक चरण के लिए एक मॉडल के लिए एंटीबॉडी के साथ लेपित coverslips पर फैल गया है में अंत बंधन प्रोटीन प्रतिरक्षा synapse गठन की ।

Abstract

बी कोशिकाओं है कि झिल्ली के लिए बाध्य प्रतिजनों (उदाहरण के लिए, एक प्रतिजन प्रस्तुत कक्ष की सतह पर) एक प्रतिरक्षा synapse, एक विशेष सेलुलर संरचना है कि बी-सेल रिसेप्टर (BCR) संकेतन और BCR मध्यस्थता प्रतिजन अधिग्रहण का अनुकूलन के रूप में। actin cytoskeleton और प्रतिजन संपर्क साइट की दिशा में microtubule नेटवर्क के पुनर्अभिविन्यास के दोनों remodeling प्रतिरक्षा synapse गठन के लिए आवश्यक हैं । एफ-actin के एक घने परिधीय अंगूठी में actin cytoskeleton के remodeling microtubule के ध्रुवीकरण के साथ है-प्रतिरक्षा synapse की ओर केंद्र का आयोजन । Microtubule प्लस अंत बंधन प्रोटीन, साथ ही cortical प्लस अंत पर कब्जा प्रोटीन actin और Microtubule cytoskeletons, जो उंहें एक समंवित तरीके से पुनर्गठित किया जा करने की अनुमति के बीच शारीरिक बातचीत मध्यस्थता । Elucidating तंत्र है कि नियंत्रण इस cytoskeletal पुनर्गठन, साथ ही साथ समझ कैसे इन cytoskeletal संरचनाओं आकार प्रतिरक्षा synapse गठन और BCR संकेतन, बी सेल सक्रियण में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । यह सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण है कि cytoskeletal नेटवर्क संगठन के नए विवरण प्रकट के विकास के द्वारा सहायता प्राप्त किया गया है । हम यहां का वर्णन एक विधि का उपयोग करने के लिए प्रेरित उत्सर्जन घट (STED) माइक्रोस्कोपी करने के लिए एक साथ छवि actin संरचनाओं, microtubules, और transfected GFP-टैग microtubule प्लस-बी कोशिकाओं में बंधन प्रोटीन अंत । प्रतिरक्षा synapse गठन में जल्दी घटनाओं मॉडल, हम बी कोशिकाओं विरोधी immunoglobulin (विरोधी ़) एंटीबॉडी, जो BCR संकेतन और cytoskeleton remodeling आरंभ के साथ लेपित coverslips पर प्रसार करने के लिए अनुमति देते हैं । हम A20 बी-लिंफोमा कोशिकाओं में GFP फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त करने के लिए कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, विरोधी के लिए-़ प्रेरित सेल प्रसार, और बाद में सेल निर्धारण, Immunostaining, छवि अधिग्रहण, और छवि deconvolution कदम के लिए । इन प्रक्रियाओं का उपयोग कर प्राप्त उच्च संकल्प छवियों को एक साथ एक साथ actin संरचनाओं, microtubules कल्पना, और microtubule प्लस अंत बाध्यकारी प्रोटीन है कि इन दो cytoskeletal नेटवर्क को लिंक कर सकते हैं ।

Introduction

जब बी कोशिकाओं प्रतिजनों के ध्रुवीकरण arrays के लिए बाइंड (उदा, antigen-पेश कोशिकाओं (APCs) की सतह पर प्रदर्शित), जिसके परिणामस्वरूप बी-सेल रिसेप्टर (BCR) संकेत एक क्लासिक प्रतिरक्षा synapse संरचना है, जो पहले में वर्णित किया गया था के गठन ड्राइव टी कोशिकाओं1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. प्रारंभ में, microclusters की परिधि में antigen-बाउंड BCRs प्रपत्र का B कक्ष: APC संपर्क साइट । ये microclusters तब antigen संपर्क साइट के केंद्र की ओर ले जाएं, जहां वे एक केंद्रीय supramolecular सक्रियण क्लस्टर (cSMAC) जो प्रतिरक्षा synapse के मूल रूपों में एक साथ जुड़ते हैं । प्रतिरक्षा synapse गठन BCR संकेतन का अनुकूलन और APC झिल्ली से BCR-मध्यस्थता प्रतिजन निष्कर्षण की सुविधा14. यह antigen प्राप्ति, जो BCR-मध्यस्थ antigen internalization और क्रमिक antigen संसाधन के बाद है, B कक्ष पेप्टाइड को पेश करने के लिए अनुमति देता है: MHC द्वितीय के लिए टी कोशिकाओं और बटोरना टी सेल सहायता14। क्योंकि प्रतिरक्षा synapse गठन को बढ़ावा देता है बी सेल सक्रियण, elucidating तंत्र है कि रिसेप्टर संगठन के इस कार्यात्मक पैटर्न की स्थापना कैसे विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में नए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है शुरू की और विनियमित रहे हैं ।

दोनों actin और microtubule cytoskeletons के पुनर्गठन प्रतिरक्षा synapse गठन के लिए आवश्यक है । स्थानीयकृत BCR संकेतन प्रतिजनों की एक विशेष रूप से-ध्रुवीय सरणी द्वारा उत्तेजित actin cytoskeleton1,15के तेजी से और नाटकीय remodeling लाती है । बी सेल की परिधि में वृक्ष actin संरचनाओं के गठन प्लाज्मा झिल्ली पर बलों धक्का डालती है और बी सेल प्रसार को बढ़ावा देता है । यह B कक्ष antigen-असर सतह का एक बड़ा क्षेत्र को स्कैन करने के लिए अनुमति देता है, और BCRs की संख्या को बढ़ाता है जो antigen बाइंड और BCR संकेतन मार्ग को सक्रिय करें । एक ही समय में, MTOC और microtubule नेटवर्क antigen संपर्क की साइट की ओर reओरिएंटेड हैं । के रूप में MTOC प्रतिजन संपर्क साइट दृष्टिकोण, MTOC से निकल microtubules बी सेल और प्रतिजन-असर सतह16,17के बीच इंटरफेस पर प्लाज्मा झिल्ली के भीतरी चेहरे के साथ विस्तार । इन juxtamembrane microtubules तो dynein के मध्यस्थ गड़बडिय़ों आंदोलन के लिए पटरियों के रूप में कार्य कर सकते हैं प्रतिजन बाध्य BCR microclusters18, एक cSMAC के गठन के लिए अग्रणी.

पुनर्अभिविन्यास और प्रतिरक्षा synapse की ओर MTOC के ध्रुवीकरण बरकरार actin और microtubule cytoskeletons की आवश्यकता है, और अक्सर cortical actin नेटवर्क और microtubules के बीच बातचीत पर निर्भर करता है,17, 19,20. Cortical actin-बंधन प्रोटीन, IQGAP1 के रूप में, microtubule प्लस-समाप्त होता है कि सजाने प्रोटीन परिसरों के साथ बातचीत के द्वारा microtubules कब्जा कर सकते हैं21. प्लस अंत बाध्यकारी प्रोटीन के इन गतिशील परिसरों EB1 और क्लिप 170, जो सामूहिक रूप से microtubule प्लस अंत ट्रैकिंग प्रोटीन (+ टिप्स)21,22के रूप में जाना जाता है शामिल हैं । + microtubules के सिरों पर सुझाव है कि या तो प्लाज्मा झिल्ली या cortical actin cytoskeleton के साथ जुड़े रहे है प्रोटीन के लिए बाध्य कर सकते हैं । यह बल-तंत्र पैदा करने की अनुमति देता है (जैसे, शूंय से अंत cortically-लंगर dynein microtubules के साथ आंदोलन का निर्देश दिया) microtubules पर खींच बलों लागू है, और इस तरह MTOC की स्थिति । CLIP-170 actin-जुड़े मचान प्रोटीन IQGAP123के लिए बाध्य कर सकते हैं, और हमें पता चला है कि इन दोनों प्रोटीन के प्रतिरक्षा synapse17के प्रति BCR प्रेरित MTOC ध्रुवीकरण के लिए आवश्यक हैं । इस IQGAP1-CLIP-170 बातचीत बी सेल प्रतिरक्षा synapse में microtubule नेटवर्क की स्थिति के साथ actin cytoskeleton के remodeling समंवय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है ।

पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी बी के दौरान actin और microtubule cytoskeletons के नाटकीय पुनर्गठन से पता चला है कोशिका प्रतिरक्षा synapse गठन2। हालांकि, इस दृष्टिकोण प्रकाश की विवर्तन सीमा के कारण विस्तार में छोटे सेलुलर संरचनाओं को हल नहीं कर सकते, जो, अब्बे कानून के अनुसार, के लिए नमूना रोशन और उद्देश्य24के एपर्चर इस्तेमाल किया प्रकाश की तरंग दैर्ध्य पर निर्भर है । यह विवर्तन सीमा परम्परागत प्रकाश माइक्रोस्कोपी के संकल्प को पार्श्व दिशा में २००-३०० एनएम तक और 500-700 एनएम को अक्षीय दिशा में25में रखने के लिए विवश करती है । इसलिए, छोटे सेलुलर संरचनाओं, साथ ही actin और microtubule cytoskeletons के ठीक विवरण, केवल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मनाया जा सकता है । cytoskeleton की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग समय लेने वाली है, कठोर नमूना निर्धारण और तैयारी प्रोटोकॉल है कि जैविक संरचनाओं में परिवर्तन कर सकते हैं की आवश्यकता है, और एंटीबॉडी-मध्यस्थता का पता लगाने के लिए सीमित है. immunostain करने की क्षमता और एक साथ कई प्रोटीन या सेलुलर संरचनाओं छवि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का एक बड़ा लाभ है । इसके अलावा, कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन एक्सप्रेस वास्तविक समय इमेजिंग सक्षम बनाता है और उपयोगी है जब immunostaining के लिए प्रभावी एंटीबॉडी ब्याज की प्रोटीन उपलब्ध नहीं हैं ।

सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी में हाल ही में तकनीकी प्रगति प्रकाश की विवर्तन सीमा को दूर किया है और नेनो सेलुलर संरचनाओं के दृश्य24की अनुमति दी । एक ऐसी सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तकनीक प्रेरित उत्सर्जन घट (STED) माइक्रोस्कोपी कहा जाता है । STED दो पराबैंगनीकिरण, जहां एक लेजर fluorophore और एक डोनट के आकार का पैटर्न के साथ एक दूसरे लेजर उत्तेजित का काम चुनिंदा fluorophore के आसपास प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को रोकता है । यह एक एकल फ्लोरोसेंट कण के बिंदु प्रसार समारोह (स्पष्ट क्षेत्र) कम कर देता है और एक उप विवर्तन सीमा फ्लोरोसेंट छवि25,26प्रदान करता है । जमीन-राज्य कमी माइक्रोस्कोपी भी सुपर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रतिदीप्ति आधारित तकनीक को रोजगार । हालांकि, छवि अधिग्रहण और पुनर्निर्माण बार लंबे होते हैं, वहां केवल fluorophores कि इस्तेमाल किया जा सकता है की एक सीमित संख्या में हैं, और एकाधिक cytoskeletal घटकों के एक साथ उच्च संकल्प इमेजिंग तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि बनाए रखने actin और microtubule संरचनाओं अलग निर्धारण प्रक्रियाओं की आवश्यकता है । इसलिए, STED इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और अन्य सुपर संकल्प सूक्ष्म दृष्टिकोण है कि यह तेजी से छवि अधिग्रहण प्रदान करता है पर कई फायदे हैं, न्यूनतम पोस्ट प्रसंस्करण आवश्यकताओं है, और एक ही fluorophores और धुंधला तकनीक को रोजगार कि निर्धारित नमूनों की पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए26का उपयोग किया जाता है ।

सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी अब प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं और टी कोशिकाओं में प्रतिरक्षा synapse पर actin संरचनाओं कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है26,27,28,29,30, 31. हालांकि, microtubule cytoskeleton के सुपर संकल्प इमेजिंग, साथ ही प्रतिरक्षा cytoskeletons गठन के दौरान actin और microtubule synapse के समंवित पुनर्गठन, हाल ही में17सूचना दी गई है । हम छवि बी कोशिकाओं है कि विरोधी immunoglobulin (विरोधी ़) एंटीबॉडी, जो BCR संकेतन उत्तेजित और आरंभ cytoskeleton पुनर्गठन के साथ लेपित coverslips पर प्रसार करने की अनुमति दी गई थी STED माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया । जब मैटीरियल विरोधी ़ एंटीबॉडी पर चढ़ाया, बी कोशिकाओं को नाटकीय actin-निर्भर प्रसार है, जो प्रतिरक्षा synapse गठन के दौरान प्रारंभिक घटनाओं recapitulates गुजरना । महत्वपूर्ण बात, STED माइक्रोस्कोपी एफ के वृक्ष अंगूठी के ठीक विवरण-actin है कि प्रतिरक्षा synapse की परिधि में रूपों से पता चला और पता चला है कि MTOC, साथ ही साथ इससे जुड़ी microtubules, प्रतिजन संपर्क साइट17के करीब स्थानांतरित कर दिया था । इन microtubules ने F-actin के परिधीय वलय की ओर जावक को विस्तारित कर दिया । इसके अलावा, बहु रंग STED एफ के विभिंन संयोजनों के इमेजिंग-actin, tubulin, IQGAP1, और GFP-क्लिप टैग-170 + युक्तियां दिखाया है कि microtubule प्लस-समाप्त क्लिप द्वारा चिह्नित-170-GFP निकट परिधीय actin meshwork के साथ जुड़े थे और IQGAP1 के साथ, एक cortical कैप्चर प्रोटीन17।

यहां, हम इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल वर्तमान actin और microtubule cytoskeletons प्रतिरक्षा synapse में STED माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । इन तरीकों A20 murine बी सेल लाइन है, जो व्यापक रूप से अध्ययन BCR संकेतन और प्रतिरक्षा synapse गठन के लिए नियोजित किया गया है का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. क्योंकि वाणिज्यिक एंटीबॉडी क्लिप के लिए-170 अच्छी तरह से पिछले प्रयोगों में immunostaining के लिए काम नहीं किया, हम विस्तार में वर्णन GFP की अभिव्यक्ति-A20 कोशिकाओं में क्लिप-170 टैग की गईं, साथ ही साथ करने के लिए visualizing प्रोटोकॉल के लिए तीन cytoskeletal अवयव या cytoskeleton-संबंधित प्रोटीन. NK सेल प्रतिरक्षा synapses में छवि actin को STED माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए तरीके पहले40वर्णित किया गया है । यहां, हम दोनों actin और बी कोशिकाओं में microtubule cytoskeletons के बहु रंग सुपर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए यह विस्तार ।

सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए एक महत्वपूर्ण विचार सेलुलर संरचनाओं को बनाए रखने और फ्लोरोसेंट प्रोटीन को नुकसान को रोकने के लिए उचित निर्धारण प्रक्रियाओं का उपयोग कर रहा है । निर्धारण और दाग के साथ साथ प्रस्तुत तरीकों को GFP प्रतिदीप्ति बनाए रखने और actin और microtubule नेटवर्क के उच्च संकल्प इमेजिंग प्रदान अनुकूलित किया गया है । जब फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बी कोशिकाओं को आम तौर पर transfect मुश्किल हैं । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, A20 कोशिकाओं के 20-50% आम तौर पर transfected GFP फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त करते हैं, और इस आबादी के बीच प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर चर रहे हैं । फिर भी, actin और microtubules के सुपर संकल्प इमेजिंग प्रक्रियाओं हम वर्णन का उपयोग कर काफी मजबूत है और उच्च गुणवत्ता छवियों को आसानी से प्राप्त कर रहे हैं । A20 कोशिकाओं के सापेक्ष उनके छोटे आकार के बावजूद, हम बताते है कि इन प्रक्रियाओं को भी microtubule नेटवर्क प्राथमिक बी कोशिकाओं है कि संक्षेप में lipopolysaccharide (एलपीएस) के साथ सक्रिय किया गया है में छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमें पता चला है कि एलपीएस-सक्रिय प्राथमिक बी कोशिकाओं को अपेक्षाकृत उच्च दक्षता पर siRNAs के साथ transfected जा सकता है (यानी, इस तरह कि प्रोटीन घट immunoblotting द्वारा पता लगाया जा सकता है), उन्हें कुछ अध्ययनों के लिए बी सेल लाइनों के उपयोग के लिए एक अच्छा विकल्प बना 17.

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं विश्वविद्यालय ब्रिटिश कोलंबिया पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. A20 बी-लिंफोमा कोशिकाओं में GFP-फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त

  1. संस्कृति A20 पूर्ण RPMI मध्यम में कोशिकाओं (RPMI-१६४० 10% गर्मी के साथ पूरक-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 50 µ एम 2-mercaptoethanol, 2 मिमी glutamine, 1 मिमी पाइरूवेट, 50 U/एमएल पेनिसिलिन, और 50 µ जी/एमएल streptomycin) 37 ° c में एक ऊतक संस्कृति मशीन के साथ 5 % सह2।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार अभिकर्मक रिएजेंट ( सामग्री की तालिकादेखें) तैयार करें ।
    नोट: यह प्रोटोकॉल विशिष्ट रिएजेंट और अभिकर्मक प्रोटोकॉल सामग्री की तालिकामें वर्णित के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है । अंय अभिकर्मक एजेंट है कि हम कोशिश की है पर्याप्त अभिकर्मक दक्षता नहीं झुकेंगे ।
  3. किसी hemocytometer का उपयोग करके कक्षों की गणना करना. केंद्रापसारक 2.5 x 106 A20 कोशिकाओं (प्रत्येक अभिकर्मक के लिए) 5 मिनट के लिए 525 x जी में कोशिकाओं reसस्पेंड 100 µ एल में अभिकर्मक के 1-2.5 µ g प्लाज्मिड डीएनए युक्त एजेंट । डीएनए एंकोडिंग क्लिप के लिए-170-GFP23, अभिकर्मक प्रति 2.5 µ g का उपयोग करें । मिश्रण धीरे ।
  4. कोशिकाओं के एक अच्छी तरह से एक 6-अच्छी प्लेट के लिए स्थानांतरण, और पूर्व गर्म पूरा RPMI मध्यम के साथ 2 मिलीलीटर के लिए मात्रा समायोजित करें । संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए कोशिकाओं प्रोटीन अभिव्यक्ति की अनुमति दें ।

2. अलग प्राथमिक माउस बी कोशिकाओं और उंहें एलपीएस के साथ सक्रिय

  1. एक माउस से तिल्ली हटाने के लिए निष्फल शल्य उपकरण का प्रयोग करें, संस्था की पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल निम्नलिखित.
  2. ऊतक संस्कृति हुड में, एक बाँझ 70-µm सेल छलनी में एक 35 मिमी ऊतक संस्कृति के कमरे के तापमान बाँझ पंजाबियों के 3 मिलीलीटर युक्त पकवान में जगह है । सेल छलनी के माध्यम से तिल्ली को कुचलने के लिए 5 मिलीलीटर सिरिंज से गोताख़ोर के रबर भाग का उपयोग करें ।
  3. प्लास्टिक एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में splenoctyes के एकल सेल निलंबन और 5 मिनट के लिए 525 x g पर केंद्रापसारक ।
  4. एक चुंबकीय मनका-आधारित बी सेल आइसोलेशन किट का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) बी कोशिकाओं की एक अत्यधिक समृद्ध जनसंख्या प्राप्त करने के लिए.
  5. बी कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड करें 3 x 106/mL में पूर्ण RPMI मध्यम के साथ पूरक 2.5 µ g/ml एलपीएस plus 5 एनजी/एमएल बी सेल सक्रिय कारक (बैफ; एक उत्तरजीविता cytokine) ।
  6. संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 hr के लिए कोशिकाओं ।

3. विरोधी ़ एंटीबॉडी के साथ कोटिंग ग्लास Coverslips

  1. coverslips कोटिंग के लिए एंटीबॉडी समाधान तैयार करें । एक 12.5 µ g/एमएल समाधान बनाने के लिए कमरे के तापमान बाँझ पंजाब में बकरी विरोधी माउस ़ एंटीबॉडी के शेयर समाधान पतला; 400 µ l का एंटीबॉडी समाधान प्रत्येक coverslip के लिए आवश्यक है ।
    नोट: A20 कोशिकाओं के लिए बकरी विरोधी माउस आईजीजी का प्रयोग करें; प्राथमिक बी कोशिकाओं के लिए बकरी विरोधी माउस आईजीएम का प्रयोग करें । बकरी आईजीजी एंटीबॉडी माउस एफसी रिसेप्टर्स करने के लिए अच्छी तरह से बाइंड नहीं है । हालांकि, किसी भी संभावित एफसी रिसेप्टर बाइंडिंग से बचने के लिए, एक का उपयोग कर सकते हैं एफ (ab) या f (ab ')2 विरोधी माउस आईजीजी या विरोधी माउस आईजीएम एंटीबॉडी के टुकड़े.
  2. 100% मेथनॉल में एक #1 ५ १८ मिमी दौर ग्लास coverslip डुबकी और इसे पूरी तरह से सूखे (~ 10 मिनट) ।
  3. संदंश का प्रयोग करते हुए सूखे coverslip को 12-well टिशू कल्चर प्लेट में रखें और प्लास्टिक 400 µ l की 12.5 µ जी/एमएल एंटीबॉडी सॉल्यूशन (5 µ g total; 2 µ g/cm2) पर coverslip इतना है कि यह coverslip के केंद्र में एक बुलबुला रूपों और किनारों के लिए फैलता है ।
  4. पूरे coverslip को कवर करने के लिए सावधान रहें, लेकिन कांच coverslip के किनारे पिछले विस्तार करने के लिए और ऊतक संस्कृति प्लास्टिक पर एंटीबॉडी समाधान की अनुमति नहीं है । 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  5. अच्छी तरह से और बाद में समाधान बाहर aspirating में बाँझ पंजाबियों के pipetting 1 मिलीलीटर से coverslips धो लें । पुनरावृत्ति एंटीबॉडी को दूर करने के लिए दो बार दोहराएं ।
  6. जब तक कोशिकाओं को जोड़ा जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं अच्छी तरह से युक्त एंटीबॉडी-लेपित coverslip के लिए बाँझ पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: coverslips एक ही दिन पर उपयोग के लिए, पंजाबियों के साथ कवर कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है ।

4. बी सेल विरोधी ़ लेपित Coverslips पर फैल

  1. तैयार संशोधित HEPES-बफर खारा (mHBS): 25 मिमी HEPES, पीएच 7.2, 125 एमएम NaCl, 5 एमएम KCl, 1 एमएम CaCl2, 1 एमएम ना2HPO4, 0.5 एमएम MgSO4, 1 एमजी/एमएल डेक्सट्रोज, 2 एमएम glutamine, 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट, और 50 µ एम 2-mercaptoethanol) । फ़िल्टर इस समाधान निष्फल और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  2. प्रयोग के दिन पर, mHBS के 50 मिलीलीटर को 2% FBS (mHBS-FBS) के साथ जोड़कर 1 मिलीलीटर गर्मी-निष्क्रिय FBS को 50 मिलीलीटर mHBS से बनाएं । उपयोग करने से पहले mHBS-FBS को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें ।
  3. transfected A20 कोशिकाओं या प्राथमिक बी कोशिकाओं है कि बैफ प्लस एलपीएस के साथ 5 मिनट के लिए 525 x जी में कल्चरित किया गया था ।
  4. mHBS-FBS के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पैंड, एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना, और mHBS-FBS में 2 x 105 कोशिकाओं/एमएल के लिए कोशिकाओं को पतला ।
  5. संदंश का उपयोग कर, coverslip ऊतक संस्कृति प्लेट से तेल फिल्म का एक टुकड़ा करने के लिए स्थानांतरण ।
  6. प्रत्येक coverslip को बी कोशिकाओं (5 x 104 कोशिकाओं) के 250 µ एल जोड़ें ।
  7. अंधेरे में 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर coverslips मशीन विरोधी आईजीजी लेपित सतह पर फैल करने के लिए बी कोशिकाओं की अनुमति के लिए ।

5. फिक्सिंग और Immunostaining कोशिकाओं

  1. कमजोर 16% paraformaldehyde शेयर समाधान और कमरे में 50% glutaraldehyde स्टॉक समाधान-तापमान आसुत जल 3% paraformaldehyde और 0.1% glutaraldehyde की अंतिम सांद्रता उपज के द्वारा निर्धारण समाधान तैयार करें । जिस दिन यह प्रयोग किया जाना है उस पर निर्धारण समाधान तैयार करें और किसी भी अतिरिक्त को त्यागें ।
    चेतावनी: paraformaldehyde और glutaraldehyde स्टॉक समाधान केवल एक रासायनिक धुएं हुड में इस्तेमाल किया जाना चाहिए । सामग्री सुरक्षा डेटा पत्रक (MSDS) पर दिए गए निर्देशों का पालन करें ।
  2. permeabilization/अवरुद्ध बफर तैयार (3% BSA और 0.1% ट्राइटन X-100 पंजाब में पतला) । फ़िल्टर इस समाधान निष्फल और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । प्रयोग के दिन, कमरे के तापमान के लिए आवश्यक राशि गर्म ।
  3. धुंधला बफर तैयार (1% BSA और पंजाब में 0.1% saponin) । यह एक 0.2 µm फ़िल्टर का उपयोग कर समाधान निष्फल और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । प्रयोग के दिन, कमरे के तापमान के लिए आवश्यक राशि गर्म ।
  4. प्लास्टिक प्रत्येक coverslip पर निर्धारण समाधान के 350 µ एल, यह सुनिश्चित करना है कि सतह पूरी तरह से कवर किया जाता है । अंधेरे में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  5. एक micropipet का उपयोग कर coverslip के किनारे से सावधानीपूर्वक aspirating करके coverslip से निर्धारण समाधान निकालें.
    चेतावनी: निर्धारण समाधान खतरनाक रासायनिक अपशिष्ट के रूप में खारिज किया जाना चाहिए ।
  6. permeabilization/अवरुद्ध बफर के 500 µ एल के साथ एक बार coverslips धो लें । प्लास्टिक बंद तरल ।
  7. Permeabilize और प्रत्येक coverslip के लिए permeabilization/अवरुद्ध बफर के 250 µ एल जोड़कर कोशिकाओं को ब्लॉक, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीनिंग ।
  8. पतला खरगोश विरोधी tubulin एंटीबॉडी 1:100 धुंधला बफर में ।
  9. coverslips से permeabilization/ब्लॉकिंग बफर महाप्राण, और प्रत्येक tubulin को पतला विरोधी एंटीबॉडी coverslip समाधान के 50 µ एल जोड़ें । अंधेरे में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  10. कमजोर द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी/actin दाग समाधान तैयार दोनों Alexa Fluor 532-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी और Alexa Fluor 568-संयुग्मित phalloidin 1:100 धुंधला बफर में ।
  11. coverslips 3 बार धो दाग बफर के 500 µ एल जोड़कर अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए और फिर इसे aspirating ।
  12. एक coverslip के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी/actin दाग समाधान के 50 µ एल जोड़ें, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  13. coverslips 3 बार धो दाग बफर के 500 µ एल जोड़कर अतिरिक्त माध्यमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए और फिर इसे aspirating ।
  14. एक खुर्दबीन स्लाइड करने के लिए बढ़ते एजेंट के 10 µ एल जोड़ें । सेल की ओर नीचे के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर coverslip माउंट ।
    नोट: एक "विरोधी फीका" बढ़ते मध्यम (देखें सामग्री की तालिका) दृढ़ता से GFP फ्यूजन प्रोटीन की प्रतिदीप्ति तीव्रता को बनाए रखने की सिफारिश की है । बढ़ते reDAPI, जो fluorophores के इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते है जब STED लेजर का उपयोग कर reagents के उपयोग से बचें ।
  15. स्लाइड्स को अंधेरे में रात भर सूखने दें । स्लाइड अगले दिन छवि ।
    नोट: coverslip शुष्क है जैसे ही स्लाइड इमेजिंग दृढ़ता से सिफारिश की है, के रूप में GFP प्रतिदीप्ति समय के साथ कम हो जाएगा ।

6. इमेजिंग STED माइक्रोस्कोप का उपयोग

नोट: कृपया ध्यान दें कि सभी सॉफ्टवेयर नीचे वर्णित कदम माइक्रोस्कोप और सॉफ्टवेयर हम इस्तेमाल के लिए विशिष्ट है ( सामग्री की तालिकादेखें) । कदम और सेटिंग्स को समायोजित करने की आवश्यकता होगी अगर इमेजिंग एक अलग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर किया जाता है/

  1. STED माइक्रोस्कोप पर बारी, पराबैंगनीकिरण और epifluorescence रोशनी दीपक सक्रिय है, और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं ।
  2. STED कमी पराबैंगनीकिरण के लिए पैरामीटर सेट करें ।
    नोट: यह विशिष्ट सूक्ष्मदर्शी इस्तेमाल किया जा रहा है और पराबैंगनीकिरण है कि यह से सुसज्जित है पर निर्भर करेगा । कुछ अनुशंसित सेटिंग्स सफेद प्रकाश (डब्ल्यूएलएल) 70% हैं; 592 एनएम लेजर 80%; 660 एनएम लेजर 80% ।
  3. STED सेटिंग्स को सक्रिय करने और 100X उद्देश्य का उपयोग STED लेजर बीम संरेखित करें ।
  4. ऐपिस का उपयोग करके, नमूना फोकस करें और मॉडरेट GFP व्यंजक वाले किसी कक्ष का चयन करे.
    नोट: कम GFP एक्सप्रेशन दिखाई नहीं देंगे क्योंकि STED उत्सर्जन की तीव्रता को कम करता है । इसके विपरीत, क्लिप की उच्च अभिव्यक्ति-170-GFP बड़े समूहों, जो सामांय microtubule प्लस अंत प्रोटीन जटिल आकृति विज्ञान और वितरण को प्रतिबिंबित नहीं करता है के सहज गठन लाती है । मॉडरेट GFP व्यंजक के साथ किसी कक्ष का चयन करना antigen संपर्क साइट पर cytoskeletal संरचनाएं सही इमेजिंग के लिए आवश्यक है ।
  5. चयनित कक्ष में ज़ूम करें और छवि बनने के लिए रुचि के क्षेत्र का चयन करें । फ़ोकस समायोजित करें जिससे कि coverslip के निकटतम B कक्ष का x-y विमान फ़ोकस में हो ।
    1. ऐसा करने के लिए, उद्देश्य उत्तरोत्तर coverslip के करीब है ताकि बी सेल cytoskeletal संरचनाओं ध्यान में आते है और फिर ध्यान से बाहर जाने के लिए कदम । इसके बाद धीरे से उद्देश्य को विपरीत दिशा में ले जाएं जब तक बी सेल cytoskeletal संरचनाओं को पहले ध्यान में वापस न आ जाए ।
  6. लेजर शक्ति, उत्तेजना बीम, और डिटेक्टर रेंज सहित सेटिंग्स का अनुकूलन । निर्माता के निर्देशों द्वारा अनुशंसित सेटिंग्स के साथ प्रारंभ करें । इसके बाद नमूनों के लिए संकेत ऑप्टिमाइज़ करने के लिए आवश्यकतानुसार समायोजन करें । छवि सभी नमूनों एक ही सेटिंग्स के साथ एक दूसरे की तुलना में किया जाना है ।
  7. सॉफ्टवेयर के "अधिग्रहण" टैब के तहत, निचले बाएँ में अनुक्रमिक फ्रेम अधिग्रहण करने के लिए छवि अधिग्रहण सेट "फ्रेम के बीच" विकल्प की जाँच के द्वारा पैनल "अनुक्रमिक स्कैन".
  8. प्राप्ति अनुक्रम सेट करें ।
    नोट: हम GFP प्रतिदीप्ति पहले प्राप्त करने के क्रम में GFP संकेत के क्षरण से बचने के लिए ।
    GFP के अलावा में उपयोग किया जाता है fluorophores के संयोजन के आधार पर, इमेजिंग अब तरंग दैर्ध्य प्रतिदीप्ति संकेत पहले बेहतर परिणाम हो सकता है । हालांकि, जिस क्रम में fluorophores या फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रेरित उत्सर्जन में कमी के अधीन है और छवि को मजबूत प्रतिदीप्ति संकेतों और सबसे अच्छा संकल्प प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
  9. चुनें और सॉफ्टवेयर के "प्राप्त" टैब के तहत प्रत्येक fluorophore के लिए STED लेजर शक्ति सेट, और या तो 592-एनएम या 660 एनएम STED लेजर लेजर शक्ति को समायोजित करने के लिए स्लाइडर पट्टी का उपयोग करें । GFP के लिए 592-एनएम कमी लेजर के लिए और Alexa Fluor 532 के लिए बिजली समायोजित करें । Alexa Fluor 568 के लिए 660 एनएम कमी लेजर के लिए बिजली समायोजित करें ।
  10. रिज़ॉल्यूशन बढ़ाने और पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए, सॉफ़्टवेयर के "प्राप्त करें" टैब के अंतर्गत "प्राप्ति" सेटिंग पर जाएं, प्रत्येक विकल्प के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू का उपयोग करके 1 से अधिक मान चुनकर पंक्ति और/
  11. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट "प्राप्त" टैब के अंतर्गत fluorophore के लिए गेटिंग विकल्प की जांच करके समय-gated STED का उपयोग कर संकेत प्राप्त है, और समय के लिए मूल्यों को निर्दिष्ट-गेटिंग (नीचे नोट देखें) । STED लेजर शक्ति बढ़ाने के लिए संकल्प बढ़ाने के लिए, हालांकि यह भी fluorophores के photobleaching में वृद्धि होगी ।
    नोट: गेटिंग समय माइक्रोस्कोप, नमूना के लिए अनुकूलित करने के लिए की आवश्यकता होगी, और fluorophores इस्तेमाल किया जा रहा. एक समय गेटिंग के लिए 0.3 से 6 ns की सिफारिश की है. निर्धारण के बाद, GFP उच्च लेजर शक्ति के लिए विशेष रूप से संवेदनशील है । GFP के photobleaching को कम करने के लिए समय गेटिंग लागू किया जाना चाहिए और STED लेजर पावर को कम किया जाना चाहिए ।
  12. 3d STED छवियों को कैप्चर करने के लिए, पॉइंट स्प्रेड फंक्शन (पीएसएफ) को "3d STED" में बदलने के लिए स्लाइडर का उपयोग करें ।
  13. reproducibility सुनिश्चित करने के लिए मैंयुअल रूप से एकाधिक छवियां प्राप्त करें । Deconvolve छवियों (देखें चित्रा 1) का उपयोग कर एक deconvolution सॉफ्टवेयर पैकेज41( सामग्री की तालिकादेखें).

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Representative Results

बी मैटीरियल विरोधी पर फैल कोशिकाओं के लिए ़, STED माइक्रोस्कोपी deconvolution सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया फोकल माइक्रोस्कोप की तुलना में cytoskeletal संरचनाओं के उच्च संकल्प छवियों प्रदान करता है. यह आंकड़ा 1में स्पष्ट है, जहां एफ actin नेटवर्क के ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर visualized था । एक ही नमूना के फोकल और STED सुपर संकल्प छवियों की तुलना से पता चलता है कि STED छवियों उच्च संकल्प के हैं और actin cytoskeleton (चित्रा 1) के अधिक विस्तृत संरचनाओं प्रकट करते हैं । यह आंकड़ा भी पता चलता है कि deconvolution उच्च गुणवत्ता STED छवियों जिसमें actin रेशा और अधिक स्पष्ट रूप से परिभाषित कर रहे है प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । हालांकि फोकल छवियों के deconvolution छवि के संकल्प में एक पर्याप्त सुधार पैदावार, deconvolved STED छवियों deconvolved फोकल छवियों से अधिक विस्तृत संरचनात्मक जानकारी प्रदान करते हैं । विशेष रूप से, परिधीय एफ-actin की अंगूठी के वृक्ष संरचना STED माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 और चित्रा 2) द्वारा अधिक से अधिक विस्तार से पता चला है । प्रतिजन संपर्क साइट पर microtubule नेटवर्क भी नमूना तैयारी और इमेजिंग प्रोटोकॉल (चित्रा 3) ऊपर वर्णित का उपयोग कर imaged था. Microtubules एक केंद्रीय बिंदु है, जो MTOC है से उत्पंन, और सेल की परिधि की ओर बाहर निकलती है । इस प्रयोग में, B कक्षों को एंटी-आइजी-लेपित coverslips पर 15 मिनट (आरेख 3), एक समय बिंदु पर फैलाने की अनुमति दी गई थी, जिस पर MTOC antigen संपर्क साइट17की ओर ले जाया गया है । microtubules के प्लस-सिरों को चिह्नित करने वाले CLIP-170-GFP क्लस्टर्स आरेख 3में दिखाए गए microtubules के सिरों पर देखे जा सकते हैं । जब नमूना तैयारी और STED इमेजिंग microtubule नेटवर्क इष्टतम है, सतत और विशिष्ट microtubules, क्लिप-170-GFP के साथ microtubules के साथ स्थानीयकृत या प्लस-समाप्त होता है (चित्रा 3) में मनाया जाता है । उप इष्टतम microtubule धुंधला है, जो देखा गया था जब धुंधला एंटीबॉडी या α के बैचों-tubulin एंटीबॉडी है कि एक साल से अधिक पुराने हैं, microtubules में निरंतर वर्गों है कि खराब हल कर रहे है के रूप में प्रदर्शित होने के कम सांद्रता का उपयोग deconvolution पर (चित्र बी; चित्रा 5C) भी देखें । हालांकि इन छवियों में क्लिप-170-GFP प्रतिदीप्ति के सभी α-tubulin-immunostained संरचनाओं के साथ जुड़ा हुआ है, एक भेद नहीं कर सकता कि क्लिप-170-GFP प्लस सिरों पर स्थित है, या microtubules की लंबाई के साथ, अधूरा धुंधला होने के कारण microtubules की । इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि α-tubulin निर्माता के तहत संग्रहित किया एंटीबॉडी भंडारण की स्थिति की सिफारिश की है और एक वर्ष के भीतर इस्तेमाल किया ।

इस प्रोटोकॉल, उच्च गुणवत्ता बहु रंग STED छवियों है कि संगठन और actin cytoskeleton और microtubule नेटवर्क की संरचना, साथ ही प्रोटीन जैसे IQGAP1 और क्लिप-170 कि इन दो cytoskeletons के साथ एसोसिएट के रूप में दिखाने का उपयोग कर17, हासिल किया जा सके । चित्रा 4 में STED छवियों वृक्ष actin के परिधीय अंगूठी दिखाने के लिए, साथ ही microtubules कि सेल में एक केंद्रीय स्थान से निर्गत जहां actin धुंधला बहुत कम घने है । CLIP-170-GFP इन microtubules के सिरों पर बारीकी से परिधीय एफ-actin के साथ जुड़ा हुआ है । इस प्रोटोकॉल एक प्रतिरक्षा synapse पर cytoskeletal संरचनाओं कल्पना करने के लिए या तो एकल रंग STED इमेजिंग (चित्रा 2) या बहुरंगा STED इमेजिंग (चित्रा 3 और चित्रा 4) का उपयोग करने की अनुमति देता है । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सिंगल कलर STED इमेजिंग (figure 2) actin संरचनाओं के बेहतर रिज़ॉल्यूशन की उपज हो सकती है और बहु-रंग STED (चित्रा 4) की तुलना में बी कोशिकाओं में microtubules । यह अलग fluorophores के लिए अनुक्रमिक STED छवि अधिग्रहण के कारण photobleaching के कारण हो सकता है । सबसे अच्छा सुपर संकल्प छवियों, fluorophores और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के संयोजन का चयन प्राप्त करने के लिए, साथ ही अनुक्रम जिसमें वे उत्तेजना और कमी पराबैंगनीकिरण का उपयोग कर रहे हैं, नमूने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से । फिर भी, बहु रंग STED इमेजिंग पारंपरिक फोकल माइक्रोस्कोपी से इन cytoskeletal संरचनाओं के उच्च संकल्प छवियों प्रदान करता है । साथ ही, एकल-रंग STED पूरे B कक्ष actin या microtubule नेटवर्क (चलचित्र 1) के 3-आयामी सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।

जब फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन के साथ transfected कोशिकाओं का उपयोग कर, इष्टतम अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने और व्यक्त करने के कारण कलाकृतियों से परहेज महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं । उन कक्षों में जहां क्लिप-170-GFP है, क्लिप-170-GFP के बड़े समुच्चय (चित्र 5 ए) का गठन कर रहे हैं । क्लिप के इस स्थानीयकरण के अलावा-170-GFP, इस सेल में microtubule नेटवर्क का केवल एक हिस्सा फोकल विमान के भीतर coverslip (चित्रा 5B) के करीब था । यह पता चलता है कि क्लिप-170 एक्सप्रेस भी BCR प्रेरित MTOC ध्रुवीकरण ख़राब हो सकता है । इसके विपरीत, क्योंकि मजबूत प्रतिदीप्ति संकेतों आम तौर पर उच्च गुणवत्ता STED छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं, इस तरह के क्लिप के रूप में फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की कम अभिव्यक्ति-170-GFP (चित्रा 5C) गरीब गुणवत्ता छवियों में परिणाम । इसलिए, जब कोशिकाओं है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ transfected गया है का उपयोग कर, यह छवि के लिए महत्वपूर्ण है केवल फ्यूजन प्रोटीन अभिव्यक्ति के इष्टतम स्तर के साथ उन कोशिकाओं । यह भी ध्यान रखें कि अभिकर्मक प्रोटोकॉल A20 कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया गया था कि महत्वपूर्ण है ( सामग्री की तालिकादेखें)) आमतौर पर transfected प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के 20-50% में परिणाम. प्लाज्मिड डीएनए के लिए (के रूप में siRNAs का विरोध किया), प्राथमिक बी कोशिकाओं के लिए अभिकर्मक आवृत्तियों अक्सर बहुत A20 कोशिकाओं के लिए की तुलना में कम कर रहे हैं, बी सेल लाइनों के उपयोग की आवश्यकता. फिर भी, untransfected प्राथमिक बी कोशिकाओं में cytoskeletal तत्वों के उच्च गुणवत्ता STED छवियों इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 6) ।

Figure 1
चित्र 1: F-actin की फोकल और STED इमेजिंग की तुलना. फोकल छवियां (ऊपर) और STED छवियां (नीचे) एक A20 कोशिका है कि विरोधी पर फैल गया था आईजीजी-लेपित coverslips 15 मिनट के लिए पहले Alexa Fluor 532-संयुग्मित phalloidin के साथ दाग जा रहा है । फोकल STED माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, एक ही सेल फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पहले छवि और फिर STED द्वारा किया गया था । प्रारंभिक फोकल और STED छवियों को दिखाया गया है, साथ ही फोकल और deconvolution के बाद STED छवियों के साथ । स्केल बार: 5 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 2
आरेख 2: antigen संपर्क साइट पर actin cytoskeleton. A20 कोशिकाओं है कि विरोधी पर फैल आईजीजी-लेपित coverslips 15 मिनट के लिए अनुमति दी गई थी Alexa Fluor 568-संयुग्मित phalloidin और STED माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged के साथ दाग थे । प्रारंभिक STED छवियों deconvolved थे । पैनलों A-B और पैनलों C-E दो अलग कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियां दिखाओ । पैनल ई पैनल सीमें सफेद बॉक्स में क्षेत्र के एक 3x इज़ाफ़ा दिखाता है । पैनलों के लिए स्केल बार A-D: 5 µm. स्केल बार पैनल के लिए ई: 1 µm. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: microtubule नेटवर्क और क्लिप के STED छवियों-170-GFP । A20 क्लिप-170-GFP व्यक्त कोशिकाओं को विरोधी पर प्रसार की अनुमति दी गई पहले 15 मिनट के लिए आईजीजी लेपित coverslips तय किया जा रहा है और एक immunostained-α tubulin प्लस एक Alexa एंटीबॉडी 532-Fluor माध्यमिक संयुग्मित के साथ एंटीबॉडी । (एक) प्रतिनिधि छवि microtubule नेटवर्क के immunostaining दिखा रहा है, क्लिप के साथ-170-GFP microtubules के प्लस सिरों पर मुख्य रूप से स्थित है । (ख) उप इष्टतम धुंधला और α-tubulin एंटीबॉडी के एक पुराने स्टॉक के उपयोग के कारण microtubules के संकल्प । स्केल बार्स: 5 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: actin और microtubule cytoskeletons की STED छवियां. A20 क्लिप एक्सप्रेस-170-GFP विरोधी पर प्रसार की अनुमति दी गई-आईजीजी-लेपित coverslips 15 मिनट से पहले तय किया जा रहा है और Alexa Fluor के साथ सना हुआ 568-संयुग्मित phalloidin एफ actin कल्पना करने के लिए, और एक α-tubulin एंटीबॉडी प्लस के साथ एक Alexa Fluor 532-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी कल्पना microtubules. पैनलों A-D और पैनलों E-F दो विभिंन कक्षों के प्रतिनिधि छवियां दिखाएं । पैनल D पैनल Cमें सफेद बॉक्स में इस क्षेत्र का 3.5 x इज़ाफ़ा है । स्केल बार्स: 5 पैनलों के लिए µm A-C और E-F; पैनल Dके लिए 1 µm । पैनल में छवि एक ही चित्र 3 ए में इस्तेमाल किया छवि है, लेकिन एफ actin चैनल के ओवरले भी शामिल है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: खराब गुणवत्ता STED के उदाहरण या GFP फ्यूजन प्रोटीन की अपर्याप्त अभिव्यक्ति के कारण छवियों । A20 क्लिप-170-GFP व्यक्त कोशिकाओं को विरोधी पर प्रसार की अनुमति दी गई 15 मिनट के लिए आईजीजी लेपित coverslips से पहले तय किया जा रहा है और चित्रा 4के रूप में सना हुआ । (A, B) clip-170-GFP-क्लिप के बड़े, असामान्य समुच्चय में परिणाम-170-GFP (ए) और प्रतिजन संपर्क साइट (बी)की ओर बिगड़ा MTOC ध्रुवीकरण । (ग) खराब गुणवत्ता STED छवियों में लेजर शक्ति परिणाम में वृद्धि करके क्लिप-170-GFP की अपर्याप्त अभिव्यक्ति के लिए क्षतिपूर्ति । स्केल बार्स: 5 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: प्राथमिक B कक्षों में microtubule cytoskeleton की STED छवि. प्राथमिक प्लीहा बी कोशिकाओं के लिए 5 एनजी/µ एल बैफ प्लस 2.5 µ g/एमएल एलपीएस के साथ 6 ज के लिए, और फिर coverslips है कि विरोधी आईजीएम एंटीबॉडी के साथ लेपित किया गया था पर 15 मिनट के लिए प्रसार की अनुमति के साथ संस्कृति थे । कोशिकाओं को फिर स्थिर और एक α-tubulin एंटीबॉडी प्लस एक Alexa Fluor 568-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी microtubules कल्पना के साथ दाग थे । एक प्रतिनिधि छवि दिखाया गया है । स्केल बार: 5 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Movie 1
चलचित्र 1: B सेल microtubule नेटवर्क का 3d पुनर्निर्माण । A20 कोशिकाओं को विरोधी पर फैल आईजीजी-लेपित coverslips 15 मिनट से पहले तय किया जा रहा है और एक α के साथ immunostained-tubulin एंटीबॉडी प्लस एक Alexa Fluor 488-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी की अनुमति दी गई । Z-स्लाइस 37 फ्रेम की कुल के लिए 0.2 µm कदम आकार पर कब्जा कर लिया गया था । 3 डी पुनर्निर्माण STED माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

cytoskeletal संरचनाओं की विस्तृत छवियों STED सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, जो सैद्धांतिक रूप से 50 एनएम के एक संकल्प प्राप्त कर सकते हैं, पारंपरिक फोकल माइक्रोस्कोप की तुलना में, जिसके लिए विवर्तन-सीमित संकल्प ~ 200 एनएम है 24. महीन संरचनाओं को हल करने की क्षमता आगे मनाया "धुंधला" प्रतिदीप्ति संकेत से मूल प्रकाश स्रोत की सबसे अधिक संभावना की स्थिति की गणना करने के लिए deconvolution सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बढ़ाया है. इस प्रोटोकॉल actin और microtubule cytoskeletons, साथ ही साथ cytoskeleton-जुड़े प्रोटीन छवि के लिए STED का उपयोग करने के लिए तरीकों का वर्णन ।

बी सेल सक्रियकरण दोनों actin cytoskeleton और microtubule नेटवर्क, दो cytoskeletons के समंवित विनियमन के साथ प्रतिरक्षा synapse गठन17,42के लिए महत्वपूर्ण होने के remodeling लाती है । विधि हम वर्तमान एक साथ इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया गया है actin और microtubule cytoskeletons प्रतिजन संपर्क साइट पर बहु रंग STED का उपयोग कर, लेकिन समान रूप से एकल रंग STED के लिए लागू है । पिछले अध्ययन हम बी सेल cytoskeleton पर प्रकाश डाला कि STED कैसे सेलुलर संरचनाओं का आयोजन कर रहे है और कैसे वे एक दूसरे के साथ बातचीत में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । फोकल और कुल आंतरिक प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, हमने देखा था कि microtubules की अंगूठी से संपर्क करें actin की परिधि में antigen संपर्क साइट17। STED माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर, हम दिखाने के लिए कि प्लस microtubules के सिरों कि + टिप क्लिप-170 सेल परिधि में वृक्ष actin नेटवर्क के साथ बारीकी से संबद्ध थे ( चित्रा 4देखें) में सक्षम थे.

कई कारकों को प्रभावित जो इमेजिंग तकनीक सबसे एक के विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए उपयुक्त है । ये संकल्प है कि आवश्यक है, संरचनाओं छवि, लेबलिंग तकनीक और इसके संकेत करने वाली शोर अनुपात (यानी, इसके विपरीत), अधिग्रहण समय, नमूना तैयार करने में आसानी, और reproducibility शामिल हैं । STED के लिए नमूना तैयारी फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए की तुलना में काफी अलग नहीं है, और यह तेजी से छवि अधिग्रहण के साथ उच्च संकल्प को जोड़ती है । STED का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह एक ऑप्टिकल प्रक्रिया है जिसमें छवि सीधे नमूने से हासिल की गई है और संकल्प STED लेजर की शक्ति को बदलकर समायोजित किया जा सकता है24. जमीनी राज्य कमी सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी, जो लगातार छवि कब्जा के हजारों से छवियों को खंगाला के विपरीत, व्यापक गणना प्रसंस्करण STED के लिए आवश्यक नहीं है, और छवि पुनर्निर्माण कलाकृतियों की शुरूआत से बचा है 24. हालांकि, STED छवियों में इसके विपरीत अक्सर कम24है, जिसमें मामले के बाद छवि ImageJ के रूप में सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रसंस्करण के लिए इसके विपरीत बढ़ाने की जरूरत हो सकती है । इस तरह के एक वृक्ष actin नेटवर्क के रूप में घने संरचनाओं, के साथ छवियों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । छवि अधिग्रहण के दौरान छवि कंट्रास्ट में सुधार करने के लिए, एक घट लेजर शक्ति को कम करने और/या लाइन या फ्रेम औसत लागू कर सकते हैं । समय-gated STED, जो उपयोगकर्ता-निर्धारित समय की देरी के बाद फोटॉनों पर कब्जा कर लेते हैं, उस क्षेत्र को कम करके संकल्प को बढ़ा सकते हैं जिसमें से फोटॉनों२४,४३एकत्र किए जाते हैं. हम अनुशंसा करते हैं STED इमेजिंग cytoskeletal संरचनाओं के प्रतिरक्षा synapse पर इन विधियों का एक संयोजन का उपयोग करके कंट्रास्ट और समाधान में सुधार करने के लिए ऑप्टिमाइज़ करना ।

वर्तमान में, नहीं सभी fluorophores STED के साथ इमेजिंग के लिए इष्टतम हैं, और नहीं सभी fluorophore संयोजन बहु रंग STED छवियों को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त हैं । पता लगाने पर्वतमाला के सावधान समायोजन fluorophores के निकटवर्ती चैनलों में न्यूनतम खून-के माध्यम से सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रोटोकॉल (जैसे, GFP, alexa Fluor 532, और alexa Fluor 568) में प्रयुक्त fluorophores का संयोजन बहुरंगा STED सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए इष्टतम है । संरचित दीप्ति माइक्रोस्कोपी (सिम) और एकल-अणु स्थानीयकरण तरीकों (SMLM), जैसे फोटो-सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) के लिए की तुलना में, STED बहु रंग इमेजिंग के लिए आम तौर पर आदर्श नहीं है । लेकिन, हम यहां है कि थोड़ा अधिक fluorophore का पता लगाने के संतृप्ति, सरल छवि प्रसंस्करण उपकरण के साथ बनती दिखाने के लिए, उच्च संकल्प बहु actin और microtubule cytoskeletons के रंग छवियों उद्धार कर सकते हैं ।

cytoskeletal संरचनाओं के STED इमेजिंग के लिए इस प्रोटोकॉल बी सेल प्रतिरक्षा synapse में cytoskeletal वास्तुकला के नए विवरण से पता चला है । यद्यपि हम इमेजिंग के लिए इस प्रोटोकॉल actin और microtubule cytoskeletons में प्रतिजन-बी कोशिकाओं में संपर्क साइट पर अनुकूलित, इन तरीकों अंय प्रकार के सेल के लिए लागू किया जाना चाहिए, विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं (टी कोशिकाओं, NK कोशिकाओं, मस्तूल कोशिकाओं, आदि.) कि फार्म प्रतिरक्षा synapses. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता अंय लाइगैंडों या चिपकने वाले सब्सट्रेट के साथ coverslips कोटिंग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । हालांकि, यह प्रोटोकॉल और कक्ष प्रकार और प्रयोगात्मक सेट-अप के लिए छवि प्राप्ति सेटिंग्स ऑप्टिमाइज़ करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम समर्थन और STED माइक्रोस्कोप को बनाए रखने के लिए UBC जीवन विज्ञान संस्थान (LSI) इमेजिंग सुविधा का शुक्र है । यह काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों से अनुदान #68865 द्वारा वित्त पोषित किया गया (M.R.G.) । हम Dr. Kozo Kaibuchi (नागोया विश्वविद्यालय, नागोया, जापान) क्लिप के लिए धंयवाद-170-GFP प्लाज्मिड ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
A20 mouse B-lymphoma cells ATCC TIB-208 Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface
RPMI-1640 Thermo Fisher Scientific  R0883
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 12483020 Heat inactivate at 56 oC for 30 min
2-mercaptoethanol Millipore Sigma M3148
Glutamine Millipore Sigma G5763
Sodium pyruvate Millipore Sigma P5280
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Liquid, 10,000 units
Additional materials for primary B cells
70-µm cell strainer Corning 352350
Magnetic bead-based B cell isolation kit Stemcell Technologies 19854 EasySep Mouse B cell Isolation kit
Lipopolysaccharide (LPS) Millipore Sigma L4391 LPS from E. coli 0111:B4
B cell-activating factor (BAFF) R&D Systems 2106-BF-010
Name Company Catalog Number Comments
Transfection
Plasmid encoding CLIP-170-GFP Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002
Recommended transfection reagents and equipment
Amaxa Nucleofection kit V Lonza VCA-1003 Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA
Amaxa Nucleofector model 2b Lonza AAB-1001 Program L-013 used
Falcon 6-well plates, TC treated, sterile Corning 353046
Name Company Catalog Number Comments
Coating coverslips
18-mm diameter round #1.5 cover glasses Thomas Scientific 1217N81 Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580
Forceps Fisher Scientific 1381242 Dissecting extra fine splinter forceps
Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate Corning 353043
100% methanol Fisher Scientific A412-4
Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Thermo Fisher Scientific 10010049
Goat-anti-mouse IgG antibody Jackson ImmunoResearch 115-005-008 For A20 cells
Goat-anti-mouse IgM antibody Jackson ImmunoResearch 115-005-020 For primary mouse B cells
Name Company Catalog Number Comments
Staining
Paraformaldehyde (16% stock solution) Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute with PBS to working concentration
Glutaraldehyde (50% stock solution) Millipore Sigma 340855 Dilute with PBS to working concentration
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Saponin Millipore Sigma S2149
Bovine serum albumin (BSA), Fraction V Millipore Sigma 10735094001
Rabbit anti-tubulin antibody Abcam ab52866 1:250 dilution recommended but should be optimized
Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11009 1:100 dilution recommended but should be optimized
Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin Thermo Fisher Scientific A12380 1:100 dilution recommneded but should be optimized
Prolong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970 Without DAPI
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Name Company Catalog Number Comments
Materials
Parafilm VWR P1150-2
HEPES Millipore Sigma H3375
NaCl Fisher Scientific BP358
KCl Millipore Sigma P9333
CaCl2 Millipore Sigma C1016
Na2HPO4 Fisher Scientific S374-500
MgSO4 Fisher Scientific M63
Dextrose Fisher Scientific D16-500
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy
Leica SP8 TCS STED microscope Leica
Huygens deconvolution software Scientific Voume Imaging See https://svi.nl/HuygensProducts

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References

  1. Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).
  2. Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
  3. Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
  4. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
  5. Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 134 इम्यूनोलॉजी बी कोशिकाओं प्रतिरक्षा synapse actin microtubules microtubule-आयोजन केंद्र (MTOC) प्लस अंत ट्रैकिंग प्रोटीन सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी उत्सर्जित उत्सर्जन घट (STED) माइक्रोस्कोपी
बी सेल प्रतिरक्षा Synapse में Actin और Microtubule Cytoskeletons visualizing प्रेरित उत्सर्जन घट (STED) माइक्रोस्कोपी का उपयोग
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Wang, J. C., Bolger-Munro, M., Gold, … More

Wang, J. C., Bolger-Munro, M., Gold, M. R. Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57028, doi:10.3791/57028 (2018).

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