Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisere utgangen og Microtubule Cytoskeletons på B-celle immun Synapse med tilsvarende nedbryting (STED) mikroskopi

Published: April 9, 2018 doi: 10.3791/57028
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia

Summary

Vi presenterer en protokoll for bruk av STED mikroskopi samtidig bilde begrepsordbok strukturer, piskehale som henger og microtubule plus-end bindende proteiner i B-celler som har spredt på coverslips belagt med antistoffer mot B-celle reseptor, en modell for startfasen immun synapse-formasjonen.

Abstract

B-celler som binder til membran-bundet antigener (f.ekspå overflaten av et antigen-presentasjon celle) danner en immun synapse, en spesialisert cellestruktur som optimaliserer B-celle reseptor (BCR) signalering og BCR-mediert antigen oppkjøp. Begge remodeling begrepsordbok cytoskeleton og omleggingen av microtubule nettverket mot antigen kontakten nettstedet er avgjørende for immun synapse formasjon. Ombygging av utgangen cytoskeleton i en tett perifer ring av F-utgangen er ledsaget av polarisering av microtubule-organisere sentrum mot immun synapse. Microtubule plus-end bindende proteiner, samt kortikale plus-end fange proteiner megle fysiske interaksjonene mellom utgangen og microtubule cytoskeletons, som tillater dem å bli omorganisert på en koordinert måte. Klargjørende mekanismer som kontroll denne cellen cytoskjelett omorganisering, i tillegg til å forstå hvordan disse cellen cytoskjelett strukturer forme immun synapse dannelse og BCR signalnettverk, kan gi ny innsikt i B-celle aktivering. Dette har blitt hjulpet av utviklingen av super-oppløsning mikroskopi tilnærminger som avslører nye detaljer om cellen cytoskjelett nettverk organisasjon. Her beskriver vi en metode for å bruke tilsvarende nedbryting (STED) mikroskopi samtidig bilde begrepsordbok strukturer, piskehale som henger og transfekterte GFP-merket microtubule plus-end bindende proteiner i B-celler. For å modellere tidlige hendelser i immun synapse formasjon, tillater vi B celler å spre på coverslips belagt med anti-immunglobulin (anti-Ig) antistoffer, som starter BCR signalisering og cytoskjelett remodeling. Vi gir trinnvise protokoller for å uttrykke GFP fusion proteiner i A20 B-lymfom celler for anti-Ig-indusert celle spredning og for påfølgende celle fiksering, immunostai-, bildeopptak og bilde deconvolution trinnene. Høyoppløselige bilder innhentet ved hjelp av disse prosedyrene kan en samtidig visualisere begrepsordbok strukturer og piskehale som henger microtubule plus-end bindende proteiner som kan koble disse to cellen cytoskjelett nettverk.

Introduction

Når B-cellene binder seg til polarisert matriser av antigener (f.eksvises på overflaten av antigen presentere celler (APCs)), den resulterende B-celle reseptoren (BCR) signalering stasjoner dannelsen av en klassisk immun synapse struktur, som først ble beskrevet i T celler1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Først microclusters antigen-bundet BCRs skjemaet i periferien av B celle: APC kontakten nettstedet. Disse microclusters går mot midten av antigen kontakten nettstedet, hvor de koaliserer til en sentral supramolecular aktivisering-klynge (cSMAC) som er kjernen i immun synapse. Immun synapse formasjon optimaliserer BCR signalering og forenkler BCR-mediert antigen utvinning fra APC membran14. Antigen oppkjøpet, som er etterfulgt av BCR-mediert antigen internalisering og påfølgende antigen prosessering, lar B celler presentere peptid: MHC II komplekser T celler og framprovosere T celle hjelp14. Fordi immun synapse formasjon fremmer B celle aktivering, Klargjørende mekanismer som etablerer denne funksjonelle mønster av reseptor organisasjon kan gi ny er innsikt i hvordan humoral immunreaksjoner initiert og regulert.

Omorganisering av både utgangen og microtubule cytoskeletons er viktig for immun synapse formasjon. Lokaliserte BCR signalering stimulert av en romlig-polarisert rekke antigener induserer raske og dramatiske remodeling av utgangen cytoskjelett1,15. Dannelsen av dendrittiske begrepsordbok strukturer i utkanten av B-cellen utøver skyve styrker på plasma membranen og fremmer B celle spredning. Dette gjør B-cellen til å skanne et større område av antigen-bærende overflaten, og øker antallet BCRs som binder antigen og aktivere BCR signalnettverk trasé. Samtidig er MTOC og microtubule nettverket reorientert mot stedet antigen kontakt. Som MTOC tilnærminger antigen kontakten nettstedet, utvide piskehale som henger fra MTOC langs indre ansiktet av plasma membranen i grensesnittet mellom B-cellen og antigen-bærende overflaten16,-17. Disse juxtamembrane piskehale som henger så fungere som spor for dynein-mediert sentripetal bevegelsen av antigen-bundet BCR microclusters18, fører til dannelsen av en cSMAC.

Den nyorientering og polarisering av MTOC mot immun synapse krever intakt utgangen og microtubule cytoskeletons, og ofte avhenger av samspillet mellom kortikale begrepsordbok nettverks- og piskehale som henger16,17, 19,20. Kortikale begrepsordbok bindende proteiner, slik som IQGAP1, kan ta piskehale som henger av samspill med protein komplekser som dekorerer microtubule plus-ender21. Disse dynamiske komplekser plus-end bindende proteiner inkluderer EB1 og KLIPPET-170, som er kollektivt referert til som microtubule plus-end sporing proteiner (+ TIPs)21,22. + TIPs på endene av piskehale som henger kan binde proteiner som er tilknyttet plasma membranen eller kortikale begrepsordbok cytoskeleton. Dette tillater generering av force mekanismer (f.eksminus-slutten regissert av cortically-forankret dynein langs piskehale som henger) å utøve trekke styrker på piskehale som henger, og dermed endre plassering av MTOC. CLIP-170 kan binde til utgangen-assosiert stillas protein IQGAP123, og vi har vist at begge disse proteinene er nødvendig for BCR-indusert MTOC polarisering mot de immune synapse17. Dette IQGAP1-CLIP-170 samspillet kan spille en nøkkelrolle i koordineringen remodeling av utgangen cytoskeleton med reposisjonering av microtubule nettverket B-celle immun synapse.

Konvensjonelle fluorescens mikroskopi har avdekket dramatiske omorganiseringen av utgangen og microtubule cytoskeletons under B-celle immun synapse formasjon2. Men kan ikke denne tilnærmingen løse små cellular strukturer i detalj på grunn av Diffraksjon begrensning av lys, som, ifølge Abbe er lov, er avhengig av bølgelengden til lyset brukes til å belyse prøven og blenderåpning av målet24. Denne Diffraksjon grensen begrenser oppløsningen av konvensjonelle lys mikroskop 200-300 nm i laterale retning og 500-700 nm i aksial retning25. Derfor mindre subcellular strukturer, samt fine detaljer om utgangen og microtubule cytoskeletons, kan bare være observert med elektronmikroskop. Elektronmikroskop bildebehandling i cytoskeleton er tidkrevende, krever sterke utvalg fiksering og forberedelse protokoller som kan endre biologiske strukturer, og er begrenset til antistoff-mediert gjenkjenning. Evnen å immunostai og samtidig bilde flere proteiner eller cellular strukturer er en betydelig fordel av fluorescens mikroskopi. Videre uttrykke fluorescerende fusion proteiner i celler kan sanntid bildebehandling og er nyttig når effektiv antistoffer for immunostaining protein av interesse ikke er tilgjengelige.

Siste teknologiske fremskritt i super-oppløsning mikroskopi har overvinne Diffraksjon grensene av lys og lov visualisering av nanoskala cellulære strukturer24. En slik super-oppløsning mikroskopi teknikken kalles tilsvarende nedbryting (STED) mikroskopi. STED benytter to lasere, der en laser interesserer fluorophore og en andre laser med en smultring-formet mønster selektivt undertrykker fluorescens utslipp rundt på fluorophore. Dette reduserer spilltilbud funksjonen (tilsynelatende område) til en enkelt fluorescerende partikkel og gir en sub Diffraksjon grense fluorescerende bilde25,26. Bakken-state uttømming mikroskopi bruker også fluorescens-baserte teknikker for å hente super-oppløsning bilder. Imidlertid bilde oppkjøpet og gjenoppbygging tidene er lang, det er bare et begrenset antall fluorophores som kan brukes og samtidig med høy oppløsning avbilding av flere cellen cytoskjelett komponenter er teknisk utfordrende fordi opprettholde utgangen og microtubule strukturer krever ulike fiksering prosedyrer. Derfor STED har flere fordeler fremfor elektronmikroskop og andre super-oppløsning mikroskopi tilnærminger i at det tilbyr rask bildeopptak har minimal etterbehandling krav og benytter den samme fluorophores og flekker teknikker som brukes for konvensjonelle fluorescens mikroskopi fast prøver26.

Super-oppløsning mikroskopi er nå brukt til å visualisere begrepsordbok strukturer på immun synapse i naturlige killer (NK) celler og T celler26,27,28,29,30, 31. men super-oppløsning bildebehandling i microtubule cytoskeleton og koordinert omorganiseringen av utgangen og microtubule cytoskeletons under immun synapse formasjon, har nylig vært rapportert17. Vi brukte STED mikroskopi bilde B celler som hadde fått lov til å spre på coverslips belagt med anti-immunglobulin (anti-Ig) antistoffer, som stimulerer BCR signalering og starte cytoskjelett omorganisering. Når belagt på immobilisert anti-Ig-antistoffer, gjennomgår B-cellene dramatiske utgangen-avhengige spredning, som viser de innledende eventene under immun synapse formasjon. Viktigere, avslørte STED mikroskopi de fine detaljene av dendrittiske ringen av F-utgangen som former i periferien av immunsystemet synapse og viste at MTOC, samt piskehale som henger knyttet til det, hadde flyttet nær antigen kontakten nettstedet17. Disse piskehale som henger utvidet utover mot den ytre ringen av F-utgangen. Videre multi-farge STED imaging forskjellige kombinasjoner av F-utgangen, tubulin, IQGAP1, og GFP-merket CLIP-170 + TIPs viste at microtubule plus-ender preget av klipp-170-GFP var nært forbundet med eksterne begrepsordbok meshwork og IQGAP1, en kortikale fange protein17.

Her presenterer vi en detaljert protokoll for imaging utgangen og microtubule cytoskeletons på immun synapse bruker STED mikroskopi. Disse metodene er optimalisert ved hjelp av A20 murine B celle linjen, som har blitt viden ansatt for å studere BCR signalisering og immun synapse formasjon17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. fordi kommersielle antistoffer mot CLIP-170 ikke fungerer godt for immunostaining i forrige eksperimenter, vi beskrive i detalj uttrykk for GFP-merket CLIP-170 i A20 celler, sammen med Fargeprotokoller for å visualisere samtidig på opptil tre cellen cytoskjelett komponenter eller cytoskeleton-assosiert proteiner. Metoder for å bruke STED mikroskopi til bildet utgangen på NK celle immun synapser har vært beskrevet tidligere40. Her utvide vi dette til å erverve flere super fargeoppløsning bilder av både utgangen og microtubule cytoskeletons i B-celler.

En kritisk vurdering for super-oppløsning mikroskopi bruker riktig fiksering prosedyrer for å opprettholde cellulære strukturer og forebygge skader å fluorescerende proteiner. Fiksering og flekker metoder presenteres her har blitt optimalisert for å beholde GFP fluorescens og gi høyoppløselige bilder av utgangen og microtubule nettverk. Når uttrykke fluorescerende proteiner, bør det bemerkes at B-cellene er vanligvis vanskelig å transfect. Bruker denne protokollen, 20-50% av A20 celler uttrykke vanligvis transfekterte GFP fusion protein, og blant denne befolkning protein uttrykk er variabel. Likevel super-oppløsning imaging utgangen og piskehale som henger bruke prosedyrer beskriver vi er ganske robust og bilder av høy kvalitet er lett oppnådd. Tross sin lille størrelse i forhold til A20 celler viser vi at disse prosedyrene kan også brukes til bilde microtubule nettverket i primære B celler som har aktivert kort med lipopolysakkarid (LPS). Vi har vist at LPS-aktivert primære B celler kan være transfected med siRNAs med relativt høy effektivitet (dvs.slik at protein uttømming kan oppdages av immunoblotting), noe som gjør dem et godt alternativ til bruk av B-cellelinjer for noen studier 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble godkjent av University of British Columbia dyr omsorg komiteen.

1. uttrykke GFP-fusion proteiner i A20 B-lymfom celler

  1. Kultur A20 celler i fullføre RPMI medium (RPMI-1640 supplert med 10% inaktivert fosterets bovin serum (FBS), 50 µM 2-mercaptoethanol, 2 mM glutamin, 1 mM pyruvate, 50 U/mL penicillin og 50 µg/mL streptomycin) på 37 ° C i en vev kultur inkubator med 5 % CO2.
  2. Forberede transfection reagensen (se Tabell for materiale) i henhold til produsentens instruksjoner.
    Merk: Denne protokollen er optimalisert for bestemte reagenser og hva protokoll beskrevet i Tabellen for materiale. Andre transfection reagenser som vi har forsøkt har ikke gitt tilstrekkelig transfection effektivitet.
  3. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Sentrifuger 2.5 x 106 A20 celler (for hver transfection) for 5 min på 525 x g. Resuspend cellene i 100 µL av transfection reagensen som inneholder 1-2.5 µg av plasmider DNA. Bruke 2,5 µg per transfection DNA koding CLIP-170-GFP23. Bland forsiktig.
  4. Overføre cellene til et godt av en 6-vel plate, og juster volumet til 2 mL med forvarmes komplett RPMI medium. Kultur celler for 18 h på 37 ° C tillate protein uttrykk.

2. isolere hovedknappen på musen B celler og aktivere dem med LPS

  1. Bruke steriliserte kirurgiske verktøy for å fjerne milten fra mus, følgende protokoller godkjent av institusjonens dyr omsorg komiteen.
  2. I vev kultur panseret, plassere en steril 70-µm celle sil i en 35 mm vev kultur parabol med 3 mL romtemperatur sterilt PBS. Bruk gummidelen av stempelet fra en 5-ml sprøyte for å knuse milten gjennom cellen silen.
  3. Pipetter enkeltcelle suspensjon av splenoctyes i et sterilt 15-mL tube og sentrifuge 525 x g for 5 min.
  4. Bruk en magnetisk perle-baserte B celle isolasjon utstyr (se Tabell for materiale) for å få en høyanriket befolkning på B celler.
  5. Resuspend B-cellene til 3 x 106/mL i hele RPMI medium med 2,5 µg/mL LPS pluss 5 ng/mL B celle aktivering faktor (BAFF, en overlevelse cytokin).
  6. Kultur cellene for 6 t på 37 ° C.

3. coating Glass Coverslips med Anti-Ig antistoffer

  1. Forberede antistoff løsningen belegg på coverslips. Fortynne lager løsningen av geit-anti-mus Ig antistoffer i romtemperatur sterilt PBS å gjøre en 12,5 µg/mL løsning; 400 µL av antistoff løsning kreves for hver dekkglassvæske.
    Merk: Bruk geit anti-musen IgG for A20 celler. Bruk geit anti-musen IgM for primære B celler. Goat IgG-antistoffer binde ikke godt til musen Fc reseptorer. Men for å unngå en potensiell Fc reseptor binding, kan man bruke F(ab) eller F(ab')2 fragmenter av anti-musen IgG eller anti-musen IgM antistoffer.
  2. Dyppe en #1.5 18 mm runde glass dekkglassvæske i 100% metanol og la det tørke (~ 10 min).
  3. Ved hjelp av pinsett, plass den tørket dekkglassvæske i en 12-vel vev kultur plate og Pipetter 400 µL av 12.5 µg/mL antistoff løsningen (5 µg totalt; 2 µg/cm2) på dekkglassvæske slik at den danner en boble midt i dekkglassvæske og sprer seg til kantene.
  4. Pass på å dekke hele dekkglassvæske, men tillater ikke antistoff løsningen strekker seg utenfor kanten av glasset dekkglassvæske og på vev kultur plast. Inkuber ved romtemperatur for 30 min.
  5. Vask coverslips av pipettering 1 mL steril PBS i den godt og senere aspirating løsningen. Gjenta to ganger å fjerne ubundet antistoffer.
  6. Legge til 1 mL steril PBS den også inneholder antistoff-dekkglassvæske til celler er klare til å legges.
    Merk: Coverslips kan oppbevares i romtemperatur, dekket med PBS, for bruk på samme dag.

4. B celle spredning på Anti-Ig-belagt Coverslips

  1. Forberede endret HEPES-bufret saltvann (mHBS): 25 mM HEPES, pH 7.2, 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM Na2HPO4, 0,5 mM MgSO4, 1 mg/mL druesukker, 2 mM glutamin, 1 mM natrium pyruvate, og 50 µM 2-mercaptoethanol). Filteret sterilisere denne løsningen og lagre på 4 ° C.
  2. På dagen for eksperimentet, gjøre 50 mL av mHBS med 2% FBS (mHBS-FBS) ved å legge til 1 mL av inaktivert FBS 50 mL mHBS. Varme mHBS-FBS 37 ° c før bruk.
  3. Sentrifuge transfekterte A20 cellene eller primære B celler som hadde vært kultivert med BAFF pluss LPS 525 x g i 5 min.
  4. Resuspend cellene i 1 mL av mHBS-FBS, telle celler ved hjelp av en hemocytometer og fortynne cellene til 2 x 105 celler/mL i mHBS-FBS.
  5. Ved hjelp av pinsett, overføre dekkglassvæske fra vev kultur plate til et stykke parafin film.
  6. Legge til 250 µL av B-celler (5 x 104 celler) i hver dekkglassvæske.
  7. Inkuber coverslips på 37 ° C i 15 min i mørket tillate B-cellene til å spre over anti-IgG-belagt overflaten.

5. fastsettelse og immunostai-cellene

  1. Forberede fiksering løsningen ved å fortynne 16% paraformaldehyde lager løsningen og 50% glutaraldehyde lager løsningen i romtemperatur destillert vann å gi endelige konsentrasjoner av 3% paraformaldehyde og 0,1% glutaraldehyde. Forberede fiksering løsningen på dagen det er å bli brukt og kaste overflødig.
    FORSIKTIG: Paraformaldehyde og glutaraldehyde lager løsninger bør bare brukes på kjemiske avtrekksvifte. Følg instruksjonene på sikkerhetsdatabladet (MSDS).
  2. Forberede permeabilization/blokkerer bufferen (3% BSA og 0,1% Triton X-100 utvannet i PBS). Filteret sterilisere denne løsningen og lagre på 4 ° C. På dagen for eksperimentet, varme den nødvendige mengden til romtemperatur.
  3. Forberede flekker bufferen (1% BSA og 0,1% saponin i PBS). Sterilisere denne løsningen bruker filtere 0,2 µm og lagre på 4 ° C. På dagen for eksperimentet, varme den nødvendige mengden til romtemperatur.
  4. Pipetter 350 µL av fiksering løsningen på hver dekkglassvæske, sikre at overflaten er helt dekket. Inkuber ved romtemperatur for 10 min i mørket.
  5. Fjerne fiksering løsningen fra dekkglassvæske ved nøye aspirating fra kanten av dekkglassvæske med en micropipet.
    FORSIKTIG: Fiksering løsningen bør forkastes som farlig kjemisk avfall.
  6. Vask coverslips gang med 500 µL permeabilization/blokkerer bufferen. Pipetter av væske.
  7. Permeabilize og blokkere cellene ved å legge til 250 µL permeabilization/blokkerer bufferen i hver dekkglassvæske og rugende i 10 min ved romtemperatur i mørket.
  8. Fortynne 1: 100 kanin av anti-tubulin antistoffer i flekker buffer.
  9. Sug opp av permeabilization/blokkerer buffer fra coverslips, og legge til 50 µL av utvannet anti-tubulin antistoff løsningen i hver dekkglassvæske. Inkuber ved romtemperatur for 30 min i mørket.
  10. Forberede den sekundære antistoff/begrepsordbok flekk løsningen fortynne både Alexa Fluor 532-konjugerte geit anti-kanin IgG sekundære antistoff og Alexa Fluor 568-konjugerte phalloidin 1: 100 i flekker buffer.
  11. Vaske coverslips 3 ganger for å fjerne overflødig primære antistoff ved å legge 500 µL av flekker buffer og så aspirating det.
  12. Legg 50 µL av sekundær antistoff/begrepsordbok flekken løsningen til hver dekkglassvæske, og ruge i 30 min ved romtemperatur i mørket.
  13. Vaske coverslips 3 ganger for å fjerne overflødig sekundære antistoff ved å legge 500 µL av flekker buffer og så aspirating det.
  14. Legge til 10 µL av montering reagensen i et mikroskop lysbilde. Montere dekkglassvæske inn i mikroskopet lysbildet med cellen side ned.
    Merk: Et "Antifade" montering medium (se Tabell for materiale) anbefales å bevare fluorescens intensiteten av GFP fusion proteiner. Unngå bruk av montering reagenser som inneholder DAPI, som kan forstyrre avbilding av fluorophores ved STED laser.
  15. At lysbildene til tørr overnatting i mørket. Bilde lysbildene neste dag.
    Merk: Imaging lysbildene etter at dekkglassvæske er tørr anbefales, som GFP fluorescens vil avta over tid.

6. bildevisning STED mikroskopet

Merk: Vær oppmerksom på at alle programvare trinnene beskrevet nedenfor er spesifikk for mikroskop og programvare vi brukte (se Tabell for materiale). Trinnene og innstillinger må justeres hvis avbildning utføres ved hjelp av en annen mikroskop/programvare.

  1. Slå på mikroskopet STED, aktivere lasere og epifluorescence belysning lampen og starte programmet mikroskop.
  2. Angi parametere for STED uttømming lasere.
    Merk: Dette avhenger bestemt mikroskopet brukes og lasere som den er utstyrt med. Noen anbefalte innstillingene er hvitt lys (WLL) 70%. 592 nm laser 80%. 660 nm laser 80%.
  3. Aktivere innstillingen STED og justere STED laserstråler bruker 100 X målet.
  4. Bruker i okularet, fokuserer prøven og velger en celle med moderat GFP uttrykk.
    Merk: Lav GFP uttrykk vises ikke fordi STED reduserer utslippsintensiteten. Omvendt, høy uttrykk for CLIP-170-GFP induserer spontane dannelsen av store, som ikke reflekterer den normale microtubule plus-end protein kompleks morfologi og distribusjon. Å merke en celle med moderat GFP uttrykk er viktig for nøyaktig imaging cellen cytoskjelett strukturer på antigen kontakten nettstedet.
  5. Zoome inn i den merkede cellen og velg regionen rundt til å avbildes. Juster fokus slik at x-y flyet av B-cellen som er nærmest dekkglassvæske er i fokus.
    1. Vil flytte målet stadig nærmere til dekkglassvæske slik at B-celle cellen cytoskjelett strukturer komme i fokus og så gå ut. Deretter flytte gradvis målet i motsatt retning til B-cellen cellen cytoskjelett strukturer først kommer tilbake i fokus.
  6. Optimalisere innstillingene inkludert laser makt, eksitasjon stråle og merker området. Start med innstillingene produsentens instruksjoner. Deretter foreta justeringer for å optimalisere signalet for prøvene. Bilde alle prøver å være i forhold til hverandre med like innstillinger.
  7. Under kategorien "kjøpe" av programvaren satt bilde oppkjøpet til sekvensielle ramme oppkjøpet i nedre venstre "Sekvensiell Scan" panel ved å merke alternativet "mellom".
  8. Angi oppkjøpet sekvensen.
    Merk: Vi erverve GFP fluorescens først for å unngå nedbrytning av GFP.
    Avhengig av en kombinasjon av fluorophores som brukes i tillegg til GFP, kan imaging lengre bølgelengde fluorescens signalet første gi bedre resultater. Men skal rekkefølgen som fluorophores eller fluorescerende proteiner er utsatt for tilsvarende uttømming og fotografert være optimalisert for å få den sterkeste fluorescens signalene og beste oppløsningen.
  9. Velg sette STED laser makt for hvert fluorophore under kategorien "Hent" av programvare og Bruk glidebryteren for 592-nm eller 660-nm STED laser justere laser makt. Justere strøm til 592-nm uttømming laser for GFP og Alexa Fluor 532. Juster strøm til 660-nm uttømming laser for Alexa Fluor 568.
  10. Hvis du vil øke oppløsningen og redusere bakgrunnen signalet, gå til "Erverv" innstillinger under kategorien "Hent" i programvaren, øke linje og/eller ramme snitt ved å velge en verdi større enn 1 ved hjelp av rullegardinmenyen for hvert alternativ.
  11. Også anskaffe fluorescerende signalet bruker tid-gated STED ved å merke alternativet gating for fluorophore under kategorien "Hent", og angi verdier for tid-gating (se merknaden nedenfor). Øke STED laser makt til å forbedre oppløsningen, men dette vil også øke photobleaching av fluorophores.
    Merk: Gating tiden må være optimalisert for mikroskop, prøve og fluorophores brukes. En gang gating 0,3 til 6 ns anbefales. Etter fiksering er GFP spesielt følsomme for høy laser makt. For å redusere photobleaching av GFP, tid gating bør brukes og STED laser makt skal reduseres.
  12. Fange 3D STED bilder, Bruk glidebryteren til å endre punktet spredt funksjon (PSF) til "3D STED".
  13. Manuelt hente flere bilder for å sikre reproduserbarhet. Deconvolve bilder (se figur 1) bruker en deconvolution programvare pakke41(se Tabell for materiale).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

B celler sprer seg på immobilisert anti-Ig, gir STED mikroskopi brukes sammen med deconvolution programvare høyere oppløsning av cellen cytoskjelett strukturer enn AC confocal mikroskopi. Dette er tydelig i figur 1, der F-utgangen nettverket var visualisert ved hjelp av protokollen som beskrevet ovenfor. En sammenligning av AC confocal STED super-oppløsning bilder av samme prøve viser at STED bildene er av høyere oppløsning og avslører mer av utgangen cytoskeleton (figur 1). Denne illustrasjonen viser også at deconvolution er avgjørende for å oppnå høy kvalitet STED bilder i hvilke begrepsordbok filamenter defineres tydeligere. Selv om deconvolution AC confocal bilder gir en betydelig forbedring i oppløsningen til bildet, gir deconvolved STED bilder mer detaljert strukturinformasjon enn deconvolved AC confocal bilder. Spesielt er dendrittiske strukturen av eksterne F-utgangen ringen avslørt i større detalj av STED mikroskopi (figur 1 og figur 2). Microtubule nettverket antigen kontakten nettstedet ble også avbildet med eksempel utarbeidelsen og imaging protokoll beskrevet ovenfor (Figur 3). Piskehale som henger kommer fra et sentralt punkt, som er MTOC, og kommer ut mot periferien av cellen. I dette eksperimentet, var B-cellene tillatt å spre på anti-Ig-belagt coverslips i 15 min (Figur 3), et punkt der MTOC har flyttet mot antigen kontakten nettstedet17. CLIP-170-GFP klynger som markerer plus-endene av piskehale som henger kan sees på endene av piskehale som henger vises i Figur 3. Når prøven forberedelse og STED avbildning av microtubule nettverket er optimal, kontinuerlig og tydelig observert piskehale som henger med CLIP-170-GFP lokalisert langs de piskehale som henger eller i pluss-endene (figur 3A). Sub-optimale microtubule flekker, som ble observert ved lave konsentrasjoner av flekker antistoffer eller grupper av α-tubulin antistoffer som er mer enn ett år gamle, resulterer i piskehale som henger vises som usammenhengende delene som er dårlig løst på deconvolution (figur 3B; se også figur 5C). Selv om alle CLIP-170-GFP fluorescens i disse bildene er forbundet med α-tubulin-immunostained strukturer, skille man ikke om CLIP-170-GFP ligger i pluss endene eller langs de piskehale som henger, på grunn av den ufullstendige flekker de piskehale som henger. Derfor er det viktig at α-tubulin antistoffer lagres under produsenten anbefalte lagringsforhold og brukt innen ett år.

Bruker denne protokollen, høykvalitets multi-farge STED bilder som viser organisasjonen og strukturen til utgangen cytoskeleton og den microtubule nettverk, samt proteiner som IQGAP1 og KLIPPET-170 knytte til disse to cytoskeletons17, kan skaffes. STED bildene i Figur 4 viser den ytre ringen av dendrittiske begrepsordbok, samt piskehale som henger som stråler ut fra en sentral beliggenhet i cellen der den begrepsordbok flekker er mye mindre tett. CLIP-170-GFP på endene av disse piskehale som henger er nært forbundet med den eksterne F-utgangen. Denne protokollen gjør det mulig å visualisere cellen cytoskjelett strukturer på immun synapse én farge STED imaging (figur 2) eller flerfarget STED imaging (Figur 3 og Figur 4). Det bør imidlertid bemerkes at én farge STED imaging (figur 2) kan gi bedre oppløsning av utgangen strukturer og piskehale som henger i B celler enn multi-farge STED (Figur 4). Dette kan skyldes photobleaching forårsaket av sekvensiell STED bildeopptak for de ulike fluorophores. For å få de beste super oppløsning, kombinasjonen av fluorophores og fluorescerende proteiner valgt, samt rekkefølgen som de er fotografert ved hjelp av eksitasjon og uttømming lasere, skal være optimalisert for prøven. Likevel, multi-farge STED imaging gir høyere oppløsning av disse cellen cytoskjelett strukturer enn konvensjonelle AC confocal mikroskopi. I tillegg benyttes én farge STED å kjøpe 3-dimensjonale super-oppløsning bilder av hele B-cellen utgangen eller microtubule nettverket (film 1).

Når benytter celler transfekterte med fluorescerende fusion proteiner, er oppnå optimal uttrykk nivåer og unngå gjenstander på grunn av overuttrykte betydelige hensyn. I celler der CLIP-170-GFP er overexpressed, store mengder av klipp-170-GFP er dannet (figur 5A). I tillegg til denne mislocalization av klipp-170-GFP var bare en del av microtubule nettverket i denne cellen i fokalplanet nærmest til dekkglassvæske (figur 5B). Dette tyder på at CLIP-170 overuttrykte kan også svekke BCR-indusert MTOC polarisering. Omvendt, fordi sterk fluorescens signaler er vanligvis nødvendig for å skaffe STED bilder av høy kvalitet, lav uttrykk for fluorescerende fusion proteiner som CLIP-170-GFP (figur 5C) resulterer i dårlig kvalitet bilder. Derfor når du bruker celler som har vært transfekterte med fluorescerende proteiner, er det viktig å image bare i celler med optimale nivåer av fusion protein uttrykk. Det er også viktig å merke seg at transfection protokollen som ble brukt til A20 celler (se Tabell for materiale) vanligvis resulterer i 20-50% av celler uttrykke transfekterte protein. For plasmider DNA (i motsetning til siRNAs), hva frekvenser for primære B-celler er ofte mye lavere enn for A20 celler, krever bruk av B-cellelinjer. Likevel kan høy kvalitet STED bilder av cellen cytoskjelett elementer i untransfected primære B celler oppnås ved hjelp av denne protokollen (figur 6).

Figure 1
Figur 1: sammenligning av AC confocal og STED bildebehandling for F-utgangen. AC confocal bilder (øverst) og STED bilder (nederst) av en A20 celle som hadde spredt på anti-IgG-belagt coverslips i 15 min før å være farget med Alexa Fluor 532-konjugerte phalloidin. Bruke AC confocal STED mikroskopet, ble samme celle avbildet først ved AC confocal mikroskopi og deretter STED. Den første AC confocal og STED bilder vises, sammen med samme AC confocal og STED bilder etter deconvolution. Skala bar: 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: utgangen cytoskeleton på antigen kontakten nettstedet. A20 celler som hadde fått lov til å spre på anti-IgG-belagt coverslips i 15 min var farget med Alexa Fluor 568-konjugerte phalloidin og fotografert av STED mikroskopi. Første STED bildene var deconvolved. Paneler A-B og paneler C-E viser representant bilder av to forskjellige celler. Panelet E viser en 3 X utvidelse av regionen i den hvite boksen i C-panelet. Skala bar for paneler Ad: 5 µm. skala bar for E-panel: 1 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: STED bilder av microtubule nettverk og klipp-170-GFP. A20 celler uttrykke CLIP-170-GFP kunne spre på anti-IgG-belagt coverslips i 15 min før løst og immunostained med et α-tubulin antistoff pluss en Alexa Fluor 532-konjugerte sekundære antistoff. (A) representativt bilde viser immunostaining av microtubule nettverket, med CLIP-170-GFP ligger hovedsakelig i pluss-endene av piskehale som henger. (B) sub-optimal flekker og oppløsning av piskehale som henger på grunn av bruk av en foreldet lager α-tubulin antistoff. Skalere barer: 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: STED bilder av utgangen og microtubule cytoskeletons. A20 celler uttrykke CLIP-170-GFP kunne spre på anti-IgG-belagt coverslips i 15 min før å være fast og farget med Alexa Fluor 568-konjugerte phalloidin å visualisere F-utgangen, og med et α-tubulin antistoff pluss en Alexa Fluor 532-konjugerte sekundær antistoff å visualisere piskehale som henger. Paneler A-D og paneler E-F viser representant bilder av to forskjellige celler. Panelet D er en 3,5 X utvidelse av regionen i den hvite boksen i C-panelet. Skalere barer: 5 µm for paneler - Vekselstrøm og E-F; 1 µm panel D. Bildet i panelet A er det samme bildet brukes i figur 3A men inkluderer overlegg for kanalen som F-utgangen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: eksempler på dårlig kvalitet STED bilder på grunn av overuttrykte eller utilstrekkelig uttrykk for GFP fusion protein. A20 celler uttrykke CLIP-170-GFP kunne spre på anti-IgG-belagt coverslips i 15 min før å være fast og farget i Figur 4. (A, B) CLIP-170-GFP overuttrykte resulterer i store, unormal aggregater av klipp-170-GFP (A) og svekket MTOC polarisering mot antigen kontakten nettstedet (B). (C) kompenserer for utilstrekkelig uttrykk for CLIP-170-GFP ved å øke laser makt resultatene i dårlig kvalitet STED bilder. Skalere barer: 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: STED bildet av microtubule cytoskjelett i primære B celler. Primære splenic B-cellene var kultivert for 6 h med 5 ng/µL BAFF pluss 2,5 µg/mL LPS, og deretter kan spres i 15 min på coverslips som hadde vært belagt med anti-IgM antistoffer. Cellene ble deretter fast og farget med et α-tubulin antistoff pluss en Alexa Fluor 568-konjugerte sekundære antistoff å visualisere piskehale som henger. Et representativt bilde vises. Skala bar: 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Movie 1
Film 1: 3D rekonstruksjon av B celle microtubule nettverket. A20 celler ble tillatt å spre på anti-IgG-belagt coverslips i 15 min før løst og immunostained med et α-tubulin antistoff pluss en Alexa Fluor 488-konjugerte sekundære antistoff. Z-stykker ble tatt på 0,2 µm trinn størrelser for totalt av 37 rammer. 3D rekonstruksjon ble gjort av STED mikroskopet bildebehandlingsprogrammer. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detaljerte bilder av cellen cytoskjelett strukturer kan oppnås ved hjelp av STED super-oppløsning mikroskopi, som kan teoretisk sett oppnå en oppløsning på 50 nm, sammenlignet med konvensjonelle AC confocal mikroskopi, som Diffraksjon-begrenset oppløsningen er ~ 200 nm 24. muligheten til å løse mindre strukturer er fremme forsterket med deconvolution programvare for å beregne sannsynligvis plasseringen av den opprinnelige lyskilden fra observerte "uklare" fluorescens signalet. Denne protokollen beskriver metoder for å bruke STED for å image utgangen og microtubule cytoskeletons, i tillegg til cytoskjelett-assosiert proteiner.

B-celle aktivering induserer ombygging av både begrepsordbok cytoskeleton og microtubule nettverk, med koordinerte regulering av de to cytoskeletons blir viktig for immun synapse formasjon17,42. Metoden presenterer vi er optimalisert for samtidig imaging utgangen og microtubule cytoskeletons på antigen kontakten nettstedet bruker multi-farge STED, men er like gjeldende for én farge STED. Tidligere studier vi gjennomførte B-cellen cytoskjelett merking som STED kan gi ny innsikt i hvordan cellular strukturer er organisert og hvordan de samhandler med hverandre. Bruke AC confocal og total intern fluorescens (TIRF) mikroskopi, hadde vi observert at piskehale som henger kontakter ringen av F-utgangen på utkanten av antigen kontakten nettstedet17. Bruker STED mikroskopi, vi kunne vise at pluss endene av piskehale som henger som var preget av den + tips Hefte-170 knytte tett dendrittiske begrepsordbok nettverket celle periferien (se Figur 4).

Flere faktorer påvirker hvilke tenkelig teknikk som er mest egnet for en bestemt program. Disse inkluderer oppløsningen som kreves, strukturer til å avbildes, merking teknikken og signal-til-støy-forhold (dvs., kontrast), anskaffet, prøve forberedelse og reproduserbarhet. Eksempel forberedelse til STED er ikke vesentlig annerledes enn for AC confocal mikroskopi, og det kombinerer høy oppløsning med rask bildeopptak. En stor fordel av STED er at det er en optisk prosess der bildet direkte anskaffes fra utvalget og oppløsningen kan justeres ved å endre makten av STED laser24. I motsetning til bakken staten uttømming super-oppløsning mikroskopi, som rekonstruerer bilder fra tusenvis av påfølgende bildet fanger, omfattende beregningsorientert behandling kreves ikke for STED og innføring av gjenoppbygging bilderester unngås 24. imidlertid kontrasten i STED bilder er ofte lav24, i hvilket tilfelle etter bildebehandling bruker programvare som ImageJ kan være nødvendig å øke kontrasten. Dette er spesielt viktig for bilder med tett strukturer, for eksempel et dendrittiske begrepsordbok nettverk. En kan redusere nedbryting laser makt og/eller bruke linje eller ramme snitt for å forbedre kontrasten i bildet under bildeopptak. Tid-gated STED, som fanger fotoner etter en bruker-angitt tidsforsinkelse, kan øke oppløsningen ved å redusere området som fotoner er samlet24,43. Vi anbefaler at du optimaliserer STED avbilding av cellen cytoskjelett strukturer på immun synapse ved hjelp av en kombinasjon av disse metodene til å forbedre kontrast og oppløsning.

Foreløpig ikke alle fluorophores er optimale for bildebehandling med STED, og ikke alle fluorophore er egnet for å få flere STED fargebilder. Forsiktig justering av gjenkjenning områdene er viktig for å sikre minimal gjennomslag for fluorophores i nærliggende kanaler. Kombinasjonen av fluorophores brukes i denne protokollen (dvs., GFP, Alexa Fluor 532 og Alexa Fluor 568) er optimal for multicolor STED super-oppløsning bildebehandling. Sammenlignet med strukturert belysning mikroskopi (SIM) og enkelt-molekylet lokalisering metoder (SMLM), som Foto-aktivert lokalisering mikroskopi (PALM) STED er ikke vanligvis ideelt for multi-farge bildebehandling. Men vi vise her som liten over metning av fluorophore, sammen med enkel bildebehandling verktøy, levere høy oppløsning multi-farge bilder av utgangen og microtubule cytoskeletons.

Denne protokollen for STED avbildning av cellen cytoskjelett strukturer har avsløRT nye detaljer av cellen cytoskjelett arkitektur på B celle immun synapse. Selv om vi optimalisert denne protokollen for imaging utgangen og microtubule cytoskeletons på webområdet antigen-kontakt i B-celler, bør metodene være gjelder for andre celletyper, spesielt immunceller (T-celler, NK celler, mastceller, etc.) som immun synapser. Videre kan nytten av denne protokollen bli utvidet til belegg coverslips med andre ligander eller selvklebende underlag. Det er imidlertid viktig å optimalisere protokollen og oppkjøp bildeinnstillingene for hvilken celle og den eksperimentelle set-up.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker UBC Life Sciences Institute (LSI) Imaging anlegg for støtte og vedlikeholde STED mikroskopet. Dette arbeidet ble finansiert av stipend #68865 fra kanadiske institutter for helseforskning (til M.R.G.). Vi takker Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya University, Nagoya, Japan) for CLIP-170-GFP plasmider.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
A20 mouse B-lymphoma cells ATCC TIB-208 Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface
RPMI-1640 Thermo Fisher Scientific  R0883
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 12483020 Heat inactivate at 56 oC for 30 min
2-mercaptoethanol Millipore Sigma M3148
Glutamine Millipore Sigma G5763
Sodium pyruvate Millipore Sigma P5280
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Liquid, 10,000 units
Additional materials for primary B cells
70-µm cell strainer Corning 352350
Magnetic bead-based B cell isolation kit Stemcell Technologies 19854 EasySep Mouse B cell Isolation kit
Lipopolysaccharide (LPS) Millipore Sigma L4391 LPS from E. coli 0111:B4
B cell-activating factor (BAFF) R&D Systems 2106-BF-010
Name Company Catalog Number Comments
Transfection
Plasmid encoding CLIP-170-GFP Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002
Recommended transfection reagents and equipment
Amaxa Nucleofection kit V Lonza VCA-1003 Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA
Amaxa Nucleofector model 2b Lonza AAB-1001 Program L-013 used
Falcon 6-well plates, TC treated, sterile Corning 353046
Name Company Catalog Number Comments
Coating coverslips
18-mm diameter round #1.5 cover glasses Thomas Scientific 1217N81 Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580
Forceps Fisher Scientific 1381242 Dissecting extra fine splinter forceps
Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate Corning 353043
100% methanol Fisher Scientific A412-4
Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Thermo Fisher Scientific 10010049
Goat-anti-mouse IgG antibody Jackson ImmunoResearch 115-005-008 For A20 cells
Goat-anti-mouse IgM antibody Jackson ImmunoResearch 115-005-020 For primary mouse B cells
Name Company Catalog Number Comments
Staining
Paraformaldehyde (16% stock solution) Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute with PBS to working concentration
Glutaraldehyde (50% stock solution) Millipore Sigma 340855 Dilute with PBS to working concentration
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Saponin Millipore Sigma S2149
Bovine serum albumin (BSA), Fraction V Millipore Sigma 10735094001
Rabbit anti-tubulin antibody Abcam ab52866 1:250 dilution recommended but should be optimized
Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11009 1:100 dilution recommended but should be optimized
Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin Thermo Fisher Scientific A12380 1:100 dilution recommneded but should be optimized
Prolong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970 Without DAPI
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Name Company Catalog Number Comments
Materials
Parafilm VWR P1150-2
HEPES Millipore Sigma H3375
NaCl Fisher Scientific BP358
KCl Millipore Sigma P9333
CaCl2 Millipore Sigma C1016
Na2HPO4 Fisher Scientific S374-500
MgSO4 Fisher Scientific M63
Dextrose Fisher Scientific D16-500
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy
Leica SP8 TCS STED microscope Leica
Huygens deconvolution software Scientific Voume Imaging See https://svi.nl/HuygensProducts

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).
  2. Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
  3. Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
  4. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
  5. Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
  6. Dustin, M. L. Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses. Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).
  7. Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).
  8. Dustin, M. L. Modular design of immunological synapses and kinapses. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).
  9. Dustin, M. L. Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses. Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).
  10. Dustin, M. L. Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).
  11. Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).
  12. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  13. Monks, C. R., et al. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  14. Yuseff, M. I., et al. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).
  15. Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).
  16. Kuhn, J. R., Poenie, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).
  17. Wang, J. C., et al. The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).
  18. Schnyder, T., et al. B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster. Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).
  19. Nath, S., et al. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).
  20. Combs, J., et al. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).
  21. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
  22. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  23. Fukata, M., et al. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109 (7), 873-885 (2002).
  24. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
  25. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
  26. Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
  27. Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).
  28. Tamarit, B., et al. Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells. J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).
  29. Brown, A. C., et al. Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins. Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).
  30. Dupre, L., et al. T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors. Front Immunol. 6, 586 (2015).
  31. Rak, G. D., et al. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
  32. Lin, K. B., et al. The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas. Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).
  33. Lin, K. B., et al. The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands. Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).
  34. McLeod, S. J., et al. The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes. J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).
  35. Christian, S. L., et al. Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation. J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).
  36. Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
  37. Treanor, B., et al. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).
  38. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  39. Yuseff, M. -I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
  40. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
  41. Russ, J. C. The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , CRC Press. (2011).
  42. Stinchcombe, J. C., et al. Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse. Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).
  43. Vicidomini, G., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 134 immunologi B-celler immun synapse begrepsordbok piskehale som henger microtubule-organisere center (MTOC) pluss-ende-sporing proteiner super-oppløsning mikroskopi tilsvarende nedbryting (STED) mikroskopi
Visualisere utgangen og Microtubule Cytoskeletons på B-celle immun Synapse med tilsvarende nedbryting (STED) mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, J. C., Bolger-Munro, M., Gold, … More

Wang, J. C., Bolger-Munro, M., Gold, M. R. Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57028, doi:10.3791/57028 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter