Summary

תלת מימדי עיבוד וניתוח של Immunolabeled, מובהר היפרדות villous חלקית וסקולרית הרשתות האנושיות

Published: March 29, 2018
doi:

Summary

מחקר זה מציג עבור הרקמה הפיך ניקוי, immunostaining, תלת-ממד עיבוד וניתוח רשתות כלי דם השליה האנושית הדגימות villi גודל 1-2 מ מ3פרוטוקול.

Abstract

חילופי מזין וגז בין האם והעובר מתרחשת הממשק בדם intervillous אמהית, רשת נרחבת נימי villous חלקית המרכיבה הרבה parenchyma של השליה האנושית. הרשת נימי villous חלקית דיסטלי נמצאת התחנה הסופית של אספקת הדם העוברי לאחר מספר דורות של הסתעפות של כלי המשתרעת החוצה חבל הטבור. רשת זו יש נדן הסלולר רציפים, השכבה מכשול syncytial trophoblast, אשר מונע את ערבוב של דם עוברי והדם אימהי שבו זה ללא הרף הוא טובל. עלבונות לשלמותו של הרשת נימי היפרדות, המתרחשים הפרעות כגון סכרת אימהית, יתר לחץ דם, השמנת יתר, יש השלכות את הסיכונים הבריאותיים רציני הנוכחי של העובר, התינוק, למבוגרים. כדי להגדיר טוב יותר את השפעות מבניות העלבונות הללו, פרוטוקול פותחה עבור מחקר זה הלוכד את מבנה הרשת נימי גודל 1-2 מ מ3 שבו אחד יכול לחקור את מאפייניה טופולוגי המורכבות שלה מלא. כדי לעשות זאת, גזור אשכולות של מסוף villi מן השליה, בשכבה trophoblast, את endothelia נימי immunolabeled. אלה דוגמאות לאשורן ואז עם טישו חדש ניקוי תהליך אשר מאפשר רכישת אוספי תמונות קונאפוקלית z-לעומק של ~ 1 מ מ. הדמיות תלת מימדי מערימות אלה ואז מעובדים ניתח ליצירת אמצעי רשת נימי בסיסיים כגון נפח, מספר סניפים נימי, ואת ענף נימי נקודות קצה, כמו אימות של ההתאמה של גישה זו עבור אפיון רשת הנימים.

Introduction

הבנתנו את השליה המתפתח, פתולוגיות שלה, במידה רבה, מוגבל כדי להסיק יחסים מרחביים בין villi סמוכים נימים כלולות נגזר ממקטעים היסטולוגית. במחקר זה, פתרנו בעיה זו על-ידי פיתוח אמצעי כדי ליצור הדמיות תלת מימדי (3D) של רשתות נימי היפרדות האנושי המתאימים ניתוחים של תכונות רשת נימי (למשל הסתעפות, אחידות). לעשות את זה שילבנו מכתים immunofluorescent עם שני המוצרים ניקוי רקמות מסחרי, Visikol-1 ו- Visikol-2 (המכונים להלן פתרון-1 ופתרון-2).

השליה האנושית הוא מתחם עצום של כלי הדם הממוקם בין הדם intervillous של האם ואת העובר המתפתח. הרחבת החוצה מן ההכנסה שלה המשקולת שליה, הטבור סניפים לרשת של העורקים והוורידים אשר ramify כדי לכסות את המשטח שליה עם רשת כלי הדם משוכלל. הקצוות שלהם ואז לחדור למטה לתוך הפנים או עומק של הדיסק היפרדות איפה הם עוברים מספר דורות יותר מסעף ולסיים את villi מסוף, רשתות נימי כלולות, האתר של חילופי גזים, חומרים מזינים, וחילוף פסולת בין הדם העוברי, אימהית.

עלבונות לרשת הנימים היפרדות במהלך הפיתוח להיות השלכות מתמשך על הבריאות של העובר, הרך הנולד ו-2,למבוגרים מתהווים 1,3. על רקע ההריון הקשורות פתולוגיות כגון הפלה, הגבלת גדילה תוך רחמי, סוכרת רעלת היריון אימהי 4,5,6 שם הוא ערך גבוה על פיתוח שיטות מדידה, אפיון של היפרדות רשתות נימי villous חלקית. מחסום הגדולות היא היפרדות רשתות כלי דם להקיף מגוון רחב של קנה מידה. הרשתות וסקולרית משטח יכול להיות גדול כמו 4-5 מ מ קוטר. הנימים villous חלקית מסוף הם גודל 10-20 מיקרומטר בקוטר; השליה מכילה יותר מ 300 ק מ של כלי הדם 7. כיום, ישנן מספר טכניקות קל לשימוש, מהיר ומדויק יכול ללכוד אלה הקצוות של הסקאלה כלי. עד כה, רק מספר קטן של villi שיכול להתבצע על ידי מיקרוסקופ. לדוגמה, Jirkovska. et al. התמקדו סיסי היפרדות-מונח, שילוב מיקרוסקופיה קונפוקלית עם טורי מקטעים אופטי במרווחים 1 מיקרומטר, המתקבל 120 חלקים עבה של מיקרומטר; אין נתונים על מספר דוגמאות למד ולא סטטיסטיקה נמסרו 8. מבנים נימי אותרו, קווי המתאר של villi של נימים היו מצוירת ביד, עם לשרטוטים מיוצא לניתוח תמונה. בעוד המחברים לדון על ההשלכות של הממצאים שלהם עבור “גדל villous חלקית וסקולרית הרשת”, מסקנות כאלה הם בעייתיים כאשר רק “המונח” (36 + שבוע הריון גיל) הרקמה הוא למד. באופן דומה, מאיו ואחל’, פירס. ואח הסתמכה על הרקמה של אותו הגיל, עבור שלהם סימולציות של העברת זרימה וחמצן דם, אבל את בדיקותיהם היו מוגבלים רק כמה המונח, 9,villi מסוף10 . Stereology גם הוחל במחקר של המבנה של כלי villous חלקית. אבל שוב, המוקד כבר בדרך כלל על הריונות מאוחר יותר אספקת liveborn תינוקות עם אחד או יותר ההריון סיבוכים 11,12.

עד לאחרונה, מיקרוסקופיה קונפוקלית הייתה מוגבלת לדימות רקמות לעומק של 100-200 מיקרומטר בשל ספיגת עירור פליטת קרינה פלואורסצנטית על ידי רקמת שמעליה 13 . למרות רקמות ניקוי, היסטולוגיה 3D נרחב תוארו בספרות ויש שיטות רבות בשביל לרקמות ניקוי רבים הם מתאימים לשימוש עם רקמות באופן כללי, כפי שהם נזק בלתי הפיך מורפולוגיה הסלולר דרך hyperhydration של חלבונים או הסרה של ליפידים. לכן, אין אפשרות לאמת כי תוצאות אלה הם המעידים של הרקמה עצמה, לא ממצאים עיבוד ואילו שלנו רקמות ניקוי תהליך היא טכניקה הפיך כי הוא מסוגל שמולן היסטולוגיה מסורתיים. בדרך כלל, ניקוי רקמות כרוך באחת משלוש גישות עיקריים: 1) התאמת אחיד של מדד השבירה (RI) של מרכיבי רקמת ידי ועלייתו RI התאמת פתרונות, אשר מסיר את פיזור אור המצטבר שנגרם כבידתי עקב רציפה התנודות של רי נמוך (ציטוזול) ומרכיבים RI (חלבון/שומנים) גבוהה; 2) הסרת מרכיבי השומנים דרך הטמעה לתוך הידרוג וניצול אלקטרופורזה/דיפוזיה להסיר את מרכיבי השומנים; 3) הרחבה/דנטורציה של חלבון מבנה כדי לאפשר חדירה מוגברת של ממיסים ולעודד אחידות של רי 13. בעוד גישות אלה ניתן לעיבוד רקמות שקוף, לאפשר ייצוגים תלת-ממד של סמנים ביולוגיים שיווצר, ייצוגים תלת-ממד אלה הם ערך קליני רב כמו זה מאתגר כדי לקבוע אם התמונות האלה מעידים על מאפייני הרקמה או של הרקמה תהליך ניקוי. מצד שני, מאז שלנו רקמות ניקוי הוא הפיך תקן היסטולוגית ו/או אימונוהיסטוכימיה ניתן ליישם את הרקמה זהה כדי להעריך אם התיקונים יש משמעות קלינית.

מחקר זה מציג ניתוח של 47 דוגמאות villous חלקית דיסטלי המתקבל סך של הריונות קלינית נורמלי, electively הסתיים 23 בין ההיריון של 9-23 שבועות השלים שני משלוחים מלא לטווח רגיל. Immunofluorescence תיוג של trophoblast ושל endothelia אפשרה ניתוח כמותי, אוטומטי של שינויים הרשתות וסקולרית villous חלקית את המורכבות שלהם.

עם פרוטוקול זה, אנו מבודדים, ניתח villi מסוף ורשתות נימי שלהם בקנה מידה בלתי אפשרי בעבר. גישה זו, כאשר חל פיתוח רשת נימי villous חלקית לאורך ההיריון יהיה לזהות מאפיינים אלה, המהווים הבסיס בלידת ילד בריא. כאשר מוחל על מחקרים של הריונות מסובך, זה נבאר גם כאשר, כיצד פתולוגיות היפרדות לשנות העצים villous חלקית של הרשתות הנימים הם נדן, וכיצד אלה לפגוע בעובר רווחה.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר הקווים המנחים של מכון מדינת ניו יורק למחקר בסיסי בועדת האתיקה האנושית מחקר התפתחותיות. 1. חיתוך עץ villous חלקית לשטוף פורמלין קבוע רקמת השליה עם פוספט צחצח חזק מלוחים (PBS)14 כדי להסיר את פורמלין ומניחים בצלחת פטרי על השלב של מיקרוסקופ לנתיח…

Representative Results

הדמיות 3D שנוצר של הנימים אשכולות של מסוף villi בשליה האדם מגיל 8 שבועות הריון לשם משלוח המונח נספר כ אשכולות נפרדים, skeletonized לניתוח רשת. היחידות פונקציונלי של השליה (איור 1א’) הם העצים סיסי הם הרחבה של קיבול שבו הם יש שחדר parenchyma השליה (איור 1</…

Discussion

ועדת הבדיקה מוסדיים אישרה את האוסף של היפרדות רקמות villous חלקית עבור פורמלין קיבעון של הריונות שהופסקו electively. לפני ההליכים בוצעו, סקירה קצרה של הרשומה הרפואית ציין גיל אימהי, זוגיות, ואישר את העדר כל רפואי המשמש כבסיס (כגוןיתר לחץ דם, סוכרת, לופוס) או עוברית (מבנית או כרומוזומליות חריגות…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המשרד מדינת ניו יורק עבור אנשים עם נכויות התפתחותיות היפרדות Analytics LLC, רושל, ניו יורק.

Materials

10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer Macron Fine Chemicals H-121-08 General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic
Scalpel blades ThermoFisher Scientific 08-916-5B No. 11
Scalpel ThermoFisher Scientific 08-913-5
Fine forceps Electron Microscopy Services 78354-119
Micro Tube (1.7 mL) PGC Scientifics 505-201
Phosphate buffered saline Sigma D8537 PBS
Pipette VWR 52947-948 disposable, 3ml transfer pipette
Triton X-100 Boehriner Mannheim 789 704 Dilute to 0.1% from stock
Goat Serum Gibco 16210-064 Dilute to 2% in PBS solution
Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) ThermoFisher Scientific MS-1352-RQ
Rabbit Anti-CD31 antibody Abcam ab28364
green emitting (520 nm) fluorochrome  Invitrogen A11017 Alexa-Fluor 488
infrared emitting (652 nm) fluorochrome Invitrogen A21072 Alexa Fluor 633
Ethanol alcohol 200 proof Pharmco-Aaper 111000200 Dilute down to lower concentrations using PBS as needed
Solution-1 Visikol Inc. Visikol Histo-1
Solution-2 Visikol Inc. Visikol Histo-2
Skyes-Moore chambers BellCo Glass Inc. P/N 1943-11111
25 gauge needle ThermoFisher Scientific 14-826AA BD Precision Glide Needes
3 mL syringe ThermoFisher Scientific 14-823-40 BD disposable syringe
PDMS silicon sheets McMaster-Carr P/N 578T31
confocal microscope Nikon Inc. Nikon C1 Confocal Microscope
Deconvolution software Media Cybernetics AutoQuant X22
Fiji image processing software free, Open source  software available at https://fiji.sc
Hematoxylin Leica Biosystems 3801570 Component 1 of SelecTech H&E staining system
Alcoholic Eosin Leica Biosystems 3801615 Component 2 of SelecTech H&E staining system
Blue Buffer Leica Biosystems 3802918 Component 3 of SelecTech H&E staining system
Aqua Define MCX Leica Biosystems 3803598 Component 4 of SelecTech H&E staining system
Immunohistochemistry detection system ThermoFisher Scientific TL-125-QHD UltraVision Quanto Detection System HRP DAB

References

  1. Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, 47-53 (2016).
  2. Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
  3. Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
  4. Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
  5. Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
  6. Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
  7. Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
  8. Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
  9. Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
  10. Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
  11. Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
  12. Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
  15. Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
  16. Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).

Play Video

Cite This Article
Merz, G., Schwenk, V., Shah, R., Salafia, C., Necaise, P., Joyce, M., Villani, T., Johnson, M., Crider, N. Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks. J. Vis. Exp. (133), e57099, doi:10.3791/57099 (2018).

View Video