Summary
Este estudo apresenta um protocolo para o tecido reversível compensação, imunocoloração, renderização 3D e análise de redes vasculares em amostras de vilosidades da placenta humana na ordem de 1-2 mm3.
Abstract
Troca de nutrientes e gases entre mãe e feto ocorre na interface do sangue intervillous materno e a vasta rede de capilar das vilosidades que torna-se muito do parênquima da placenta humana. A rede capilar vilosa distal é o terminal da fonte de sangue fetal, depois de várias gerações de ramificação dos vasos que se estendem desde o cordão umbilical. Esta rede tem uma bainha celular contígua, a camada de barreira trofoblasto sincicial, que impede a mistura do sangue do feto e o sangue materno, no qual é continuamente banhado. Insultos à integridade da rede capilar placentária, ocorrendo em doenças como diabetes materna, hipertensão e obesidade, têm consequências que presentes sérios riscos de saúde para o feto, infantil e adulto. Para melhor definir os efeitos estruturais destes insultos, um protocolo foi desenvolvido para este estudo que capta a estrutura capilar rede na ordem de 1-2 mm3 onde um pode investigar suas características topológicas em sua total complexidade. Para realizar isto, clusters de terminais vilosidades da placenta são dissecados e a camada de trofoblasto e o endothelia capilar é immunolabeled. Estas amostras são então esclarecidas com um tecido novo, processo que torna possível adquirir pilhas imagem confocal para z-profundidades de ~ 1 mm de compensação. As renderizações tridimensionais dessas pilhas são então processadas e analisadas para gerar medidas básicas de rede capilar, tais como o volume, o número de ramificações capilares e pontos de extremidade do ramo capilar, como validação da adequação dessa abordagem para caracterização da rede capilar.
Introduction
Nosso entendimento de suas patologias e a placenta em desenvolvimento é, em grande medida, limitado para inferir relações espaciais entre vilosidades adjacentes e capilares contidos derivados de cortes histológicos. Neste estudo, abordámos esta questão ao desenvolver os meios para gerar os renderizações tridimensionais (3D) das redes de capilares placentários humanos que são adequados para análises das características da rede capilar (por exemplo, ramificação, solidez). Para fazer isso que combinamos coloração imunofluorescente com dois produtos de limpeza do tecido comercial, Visikol-1 e Visikol-2 (referido abaixo como solução-1 e 2 de solução).
A placenta humana é um vasto complexo de vasos sanguíneos localizados na interface entre o sangue da mãe intervillous e o desenvolvimento do feto. Estendendo-se para fora de sua inserção na placa coriônica, o cordão umbilical ramifica-se em uma rede de artérias e veias que ramify para cobrir a superfície coriônica com uma elaborada rede vascular. Suas extremidades então penetram para o interior ou a profundidade do disco placentário onde eles passam por várias gerações mais ramificação e terminam no terminal villi e suas redes capilares contidos, o site da troca de gases, nutrientes, e metabólica resíduos entre o sangue fetal e materno.
Insultos à rede capilar placentário durante o desenvolvimento tem consequências duradouras para a saúde do feto, recém-nascido e o adulto emergente 1,2,3. Tendo em conta as patologias relacionadas com a gravidez, como aborto, restrição de crescimento intra-uterino, diabetes pré-eclâmpsia e maternal 4,5,6 lá é um alto valor colocado no desenvolvimento de métodos de medição e caracterização de redes capilares das vilosidades da placenta. Um grande obstáculo é que redes vasculares placentárias abrangem uma vasta gama de escala. As redes de superfície vasculares podem ser tão grandes como 4-5 mm de diâmetro. Os capilares das vilosidades terminais são da ordem de 10 -20 µm de diâmetro; a placenta contém mais de 300 km de vasos sanguíneos 7. Presentemente, existem algumas técnicas de rápida e fácil de usar que podem capturar esses extremos da escala de navio. Até à data, apenas um pequeno número de vilosidades pode ser processado por microscopia. Por exemplo, Jirkovska et al enfoca as vilosidades da placenta no prazo, combinando a microscopia confocal com seriais seções óticas intervalos 1 µm obtidos de 120 µm de espessura seções; Não há dados sobre o número de amostras estudadas nem estatísticas foram fornecidos 8. Estruturas capilares foram identificadas, e contornos de vilosidades e capilares foram desenhados à mão, com traçados exportados para análise de imagem. Enquanto os autores discutem as implicações de suas descobertas para a "rede vascular vilosa crescente", tais conclusões são problemáticos, quando apenas "termo" (36 + semana idade gestacional) tecido é estudado. Da mesma forma, Mayo et uml. e. Pearce et al baseou-se no tecido da mesma idade, para suas simulações de transferência de fluxo e oxigênio do sangue, mas suas análises eram limitados a apenas algumas termo, vilosidades terminal 9,10 . Stereology também foi aplicada ao estudo da estrutura dos vasos das vilosidades. Mas, novamente, o foco tem sido geralmente em gravidezes posteriores entregando bebês nascidos vivos, com uma ou mais gravidez complicações 11,12.
Até recentemente, microscopia confocal foi limitada a imagem para profundidades de tecido de 100-200 µm por causa da absorção de excitação e emissão de fluorescência pela tecido sobrejacente 13 . Apesar de tecido limpando e histologia 3D têm sido amplamente descritos na literatura e há inúmeros métodos para tecido limpar muitos são inadequados para uso com tecidos em geral, pois danificar irreversivelmente morfologia celular através do hyperhydration de proteínas ou remoção de lipídeos. Portanto, não é possível validar que estes resultados são indicativos do próprio tecido e não artefatos de processamento considerando nosso tecido em processo de compensação é uma técnica reversível que é capaz de validar contra histologia tradicional. Clareira de tecido geralmente envolve uma das três abordagens principais: 1) correspondência uniforme de índice de refração (RI) dos componentes do tecido por submersão em soluções correspondentes do RI, que remove o espalhamento de luz cumulativo causado da lente devido à contínua flutuação de baixo RI (citosol) e altas constituintes de RI (proteína/lipídios); 2) removendo componentes lipídicos por meio de incorporação em hidrogel e utilizando eletroforese/difusão para remover componentes lipídicos; 3) expansão/desnaturação da estrutura da proteína para permitir que o aumento da penetração dos solventes para incentivar a uniformidade do RI 13. Enquanto essas abordagens podem processar tecidos transparentes e permitem representações 3D de biomarcadores para ser gerado, essas representações 3D são de valor questionável clínico como é desafiador para determinar se estas imagens são indicativas de propriedades de tecido ou do tecido processo de compensação. Por outro lado, desde que nosso tecido de compensação é reversível padrão histológico e/ou imuno-histoquímica pode ser aplicado no mesmo tecido para avaliar se as alterações são clinicamente significativas.
Este estudo apresenta uma análise de 47 amostras das vilosidades distais obtido um total de 23 gravidezes clinicamente normais e electively encerrados entre 9-23 concluídas semanas gestação e duas entregas normais do termo. Imunofluorescência rotulagem do trofoblasto e endothelia permitiu uma análise quantitativa e automatizada de alterações nas redes de vascular vilosa e sua complexidade.
Com este protocolo, nós isolado e analisado villi terminal e suas redes capilares em uma escala não é possível anteriormente. Esta abordagem, quando aplicada ao desenvolvimento das vilosidades e capilar rede através de gestação irá identificar as propriedades que são a base para o nascimento de uma criança saudável. Quando aplicado a estudos de gravidezes complicadas, ele também esclarecer quando e como as patologias da placenta modificar as árvores das vilosidades e as redes de capilares que eles da bainha, e como estas afectem bem-estar fetal.
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes do Instituto Estadual de Nova York para a pesquisa básica no Comitê de ética de pesquisa humana inabilidades desenvolventes.
1. das vilosidades árvore dissecação
- Enxágue o formol fixada tecido de placenta com salina desbastado de fosfato (PBS)14 para remover o formol e coloque em um prato de Petri no palco de um microscópio de dissecação. Usar o bisturi e pinça fina para arreliar o tecido de placenta separados para localizar árvores das vilosidades (estruturas ramificação threadlike brancas). Dissecar pedaços de árvore das vilosidades (vários milímetros de comprimento) e transferir o tecido para um microtubo contendo PBS de ~ 1 mL.
2. imunofluorescência coloração
- Com uma pipeta, remova a PBS e substitua com PBS fresco. Deixe descansar por 10 min com agitação ocasional. Repita mais uma vez.
Nota: Este passo e todas as outras medidas são feitas à temperatura ambiente exceto a incubação do anticorpo primário. - Utilizando uma pipeta, remova e substitua a PBS PBS 0,1% Triton-X100 + 2% de soro de cabra (PBS-T-GS) para permeabilize o tecido e bloco inespecificas de anticorpos secundários. Incube durante 30 min.
- Substituir o PBS-T-GS com PBS contendo 2% de soro de cabra, ambos do mouse monoclonal anti-CK7 e coelho anti-CK7.
- Incubar o tecido durante a noite a 4 ° C.
- Remova os anticorpos restantes por lavagem com PBS-GS por 10 minutos com agitação ocasional.
- Remova o PBS-GS e substitua com PBS-GS contendo ambos anti-rato cabra IgG juntamente com um verde emitindo (520 nm) fluoróforo e IgG de anticabra coelho acoplado a um emissor infravermelho (652 nm) fluoróforo.
- Remova os anticorpos, repetindo o passo 2.1.
- Armazene o tecido immunolabeled à temperatura ambiente no escuro.
3. clarificação do tecido
- Lave as amostras 3 vezes com PBS em intervalos de 10 minutos.
- Desidratar o tecido, removendo a PBS com uma pipeta e substituí-lo com 50% de etanol (metanol pode ser usado também). Incubar durante 10 min. Substitua fresco 50% etanol e incubar por 10 min. repetir isso mais uma vez para um total de 3 incubação do. Repita a incubação com 70%. Em seguida, substituir com 100% de etanol e incubar por 15 minutos (Alternativamente metanol pode ser usado).
- Com uma pinça de ponta fina, transferência de tecido para um microtubo fresco contendo ~ 1 mL de solução-1 para 4 h.
- Com pinça de ponta fina, transferir o tecido para um fresco microtubo contendo solução-2 para ~ 4h.
Nota: Quando armazenados no escuro, a imunofluorescência é estável à temperatura ambiente pelo menos 6 meses. - Não misture com qualquer solução aquosa, (por exemplo, o meio de montagem), pois a compensação será perdido.
4. montagem para microscopia
- Não monte o tecido entre uma lâmina de vidro padrão e uma lamela como o tecido é macio e facilmente deformado.
- Consulte a Figura 5B e montar o tecido em uma câmara de Sykes-Moore como segue;
- Com pinça de ponta fina coloca uma lamela redonda 25 mm na câmara de base.
- Com uma pinça de ponta fina, coloque a junta de borracha na base na lamela.
- Com uma pipeta, coloque uma gota (~ 40 µ l) de solução-2 no centro da lamela.
- Com a pinça de ponta fina transferi um pedaço de tecido de solução-2 para a gota no centro da lamela.
- Coloque uma segunda lamela na parte superior da junta.
- Rosqueie o anel de bloqueio na parte superior da base comprimindo as lamelas e Gaxeta até ficar firme.
Nota: Tenha cuidado para não apertar em excesso ou lamela se desintegrará. - Inserir uma agulha de calibre 22 na porta da base e através da gaxeta.
- Encher uma seringa de 3 mL com ~ 1,5 mL de solução-2.
- Monte uma agulha de calibre 25 na seringa.
- Insira a agulha da seringa na porta oposta e através da gaxeta.
- Certifique-se de que o ar na câmara é ventilação através da agulha de calibre 25 outra, delicadamente injetar solução-2and preenchimento da câmara.
- Retire a agulha e seringa e coloque a câmara sobre uma lâmina de vidro grande no palco microscópio confocal.
- Alternativamente, corte personalizados poços de folhas de silicone PDMS.
- Com uma tesoura, corte um 25,4 × 25,4 mm2 pedaço de folha de PDMS.
- Com um bisturi corte ~ 12.7 × 12.7 mm2 bem na peça.
- Pressione a peça firmemente sobre uma lâmina de microscópio.
- Encha o poço ao topo com solução-2.
- Transferi o pedaço de tecido do microtubo ao centro do poço.
- Com pinça de ponta fina Coloque uma lamela no topo do poço, tal que a parte inferior da lamela é umedecida com solução-2.
- Monte o conjunto de câmara de Sykes Moore com o tecido no palco microscópio confocal.
5. Confocal da microscopia
- Colocar o tecido na câmara em foco com um objectivo de 10x.
- Mova o palco do microscópio acima e para baixo através de plano focal para medir a distância entre a parte superior e inferior do tecido.
- Mova o palco em 2,5 µm passos para recolher um arquivo de imagem confocal contendo um conjunto de imagens através do tecido de cima para baixo.
6. inverter a clareira
- Reverta a clareira, transferindo o tecido para um microtubo contendo > 20 x o volume de 100% de etanol. Às 1h intervalos substituir com etanol a 70%, em seguida, etanol a 50% e, finalmente, PBS. Armazenar a 4 ° C, no escuro.
Nota: Agora processa o tecido para a incorporação de parafina padrão, histológico e corte ou coloração imuno-histoquímico.
7. deconvolução
Nota: Para as etapas seguintes, os comandos do software, abas e menus drop-down estão em itálico.
- Inicie o software de deconvolução e abra o arquivo de imagem.
- Digite os parâmetros listados na janela'Esumoy'.
- Para 'espaçamentos Insira o voxel x, y e z de dimensões em µm.
- Para cada canal de cor, selecione o corante fluorescente usado para a imunocoloração de menu drop-down.
- Para o 'modalidade ', selecione Laser Confocal de varredura a partir do menu drop-down.
- Para o 'objectiva ', selecione o menu drop-down x 10.
- Para o 'meio de imersão ', selecione ar a partir do menu drop-down.
- Clique sobre o 'aplicar ' botão.
- Clique na guia 'nDeconvolutio'.
- Clique em '3D deconvolução ' no menu drop-down.
- No '3D - deconvolução ' janela segurar que as configurações são: 1) adaptável às cegas PSF PSF 2) teórica, 3) uso (padrão adaptativo PSF, 10 iterações, ruído médio), nome de Base 4).
- Clique sobre o 'botão Check verde ' para iniciar o programa.
- Quando terminar, repita as etapas 7,3-7.6 para reiniciar o programa. Quando terminar reinicie-o para a terceira e última vez.
- No 'Data Manager' janela, clique no arquivo com o prefixo "10-10 - 10-".
- Clique sobre o 'arquivo ' tab e, em seguida, clique em 'Salvar como '.
- Na janela'Salvar As' selecione '8-bit inteiro não assinado ' da 'tipo de dados ' menu drop-down e clique ao salvar.
8. processamento de imagem
- Inicie o software de Fiji.
- Clique em 'arquivo ', clique em 'aberto ' e selecione o arquivo de imagem Deconvolved e clique no 'aberto ' botão no 'aberto ' janela.
- Clique em 'canais de imagem/cor/Split e converter a imagem de três cores de arquivo em três novos arquivos contendo apenas uma cor. Salve o arquivo de imagem vermelha que contém o conjunto de imagens capilar viloso de immunolabeled. Exclua os arquivos de imagem verde e azul.
- Subtrair a fluorescência de plano de fundo do arquivo de imagem vermelha com: 'fundo de processo/subtrair '.
- No menu drop-down define raio de bola de Rolling para 10 pixels.
- Deixe as opções do 4 menu desmarcada e clique em 'Okey '.
- Clique em 'Sim no menu de pilha do processo.
- Remover tecido inerente da fluorescência (autofluorescência) abrindo o 'Image/Adjust/brilho-contraste ' menu e ajustar as configurações do minimum, maximum, brilho e contraste. Tenha cuidado para não remover qualquer uma da imunofluorescência capilar.
- Minimizar o restante fluorescência irrelevante, abrindo o 'Image/Adjust/limiar ' menu e ajuste os controles deslizantes, tal que a imunofluorescência capilar é realçada. Verifique o 'fundo escuro ' caixa e clique em 'aplicar '. Sobre o 'converter para binária suspensa ' seleção de menu o 'fundo preto ' caixa e clique em 'Okey '. Salve o arquivo de imagem preto e branco (binária) para análises abaixo.
9. análise
- Contagem de objeto e esqueletonização.
- Selecione o arquivo de imagem binária criado na etapa 8.1.8.
- Clique em 'analisar/Opções 3D OC e seleção apenas 'Volume' e 'loja resulta... ' caixas no menu drop-down. Certifique-se de que a caixa 'Mostrar números' está desmarcada. Clique sobre o 'Okey ' botão.
- CLIck na 'analisar/3D objetos contador '. No menu drop-down, defina 'tamanho filtro: min. ' a 5000. Garantir que o 'excluir objetos nas bordas caixa está desmarcada. Verifique que o 'objetosestatísticas e 'Resumo ' caixas são verificadas. Clique sobre o 'Okey ' botão.
Nota: Isto pode levar alguns minutos dependendo da configuração do arquivo de tamanho e computador. - Salve a tabela de estatísticas e o arquivo de mapa de objetos.
- Selecione o arquivo de mapa de objetos. Clique em 'Skeletonize/Plugins/esqueleto 2D-3D' de carnívoras a rede capilar no arquivo binário. Clique em 'arquivo/salvar como. Selecione 'Tiff... ' no menu drop-down. Na salvar como janela TIFF adicionar "Skel-" ao nome de arquivo de mapa de objeto e clique sobre o 'salvar ' botão.
- Clique em 'analisar/esqueleto/analisar esqueleto 2D-3D'. No menu drop-down, aceite as configurações padrão e clique sobre o 'Okey ' botão. Salvar a tabela de ramo 'informação' , a ' tabela deresultados e dois arquivos de saída (Skel-objetos-rotulados - esqueletos e Tagged esqueleto).
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Representative Results
Os renderings 3D gerados de capilares em clusters de vilosidades terminais na placenta humana da idade gestacional de 8 semanas para a entrega do termo foram contados como clusters individuais e esqueletizados para análise de rede. As unidades funcionais da placenta (Figura 1A) são as árvores de vilosidades que são uma extensão dos navios de superfície onde eles penetraram o parênquima de placenta (Figura 1Be alargada em 1C). Peças da porção distal da árvore dissecada (Figure1D e 1E) foram então immunolabeled para mostrar a camada do trofoblasto de vilosidades e seus capilares (Figura 2). Crucial para a renderização em 3D foi a capacidade de utilizar este sistema de limpeza de tecidos.
Com o sistema confocal usado para este estudo, imunofluorescência de tecido não compensada só pode ser adquirida em profundidades de ~ 100 µm ou menos(Figura 3). Em profundidades mais profundas, é absorvida pelo tecido sobrejacente. Em contraste, o tecido limpo (Figura 3B) permite a imagem a uma profundidade muito mais profunda.
O tecido limpo pode ser retornado para seu estado não compensado, fazendo as etapas de desidratação no sentido inverso e devolvê-lo à PBS. Para validar esta inversão, o tecido não compensado foi incorporado em parafina, seccionada e immunohistochemically manchadas com CK7(Figura 4)ou histologicamente corados com hematoxilina-eosina (H & E) (Figura 4C). Em ambos os casos, a coloração do tecido "não compensado" foi comparável ao convencionais seções manchadas com CK7 (Figura 4B ou H & E (Figura 4D) Validando aquela clareira não significativamente alterou o tecido.
Devido ao seu tamanho, montagem das amostras de tecido em um microscópio padrão com uma lamela resultou em achatamento inaceitável. Isto pode ser superado usando câmaras de Moore Sykes que acomodar peças até 4 mm de profundidade (Figura 5B), ou câmaras de vários tamanhos e profundidades feitas, perfurando poços em silicone cobertura da borracha (Figura 5A).
Os renderings 3D de pilhas de confocal (Figura 6A) foram usados para separar as redes capilares, (Figura 6B) identificar as vilosidades aglomerados (objetos, Figura 6C), contar os clusters de vilosidades e carnívoras as redes capilares (Figura 6D). Renderings 3D animados destes estão incluídos na lista de animação /Video/Figures.
Nossa capacidade de imagem utilmente para profundidades de ~ 1 mm é vista nos renderings 3D mostrados nos quatro arquivos mp4 (consulte os materiais suplementares). A imagem definida usada teve um volume de 1,47 mm3 (10 x largura de campo objetiva ao quadrado vezes a profundidade-z ou 1,25 mm2 × 0,94 mm). Os arquivos de mp4, mostram que o tecido das vilosidades do immunostained original é distribuído ao longo de toda a profundidade do volume (original.mp4), como era o tecido capilar viloso distribuído da mesma forma (red.mp4), o correspondente capilar objetos do objeto contando suas redes esqueletizadas (skeleton.mp4) e análise (objects.mp4). Esta distribuição de volume e tecido são típicas para nossa imagem confocal de moda. Por exemplo, os z-profundidades para os conjuntos de imagem usados para Figura 7 são 0,95 mm para 8 semanas, 1,045 mm para 14 semanas, 1,242 mm para 17 semanas, 1,092 mm para 22 semanas e 0,94 mm para o termo (a largura do campo é o mesmo para todos).
Os resultados na tabela 1 demonstram a adequação de aplicar análises de rede para os renderings 3D de redes vasculares das vilosidades. Por completo este estudo analisou as redes capilares das vilosidades de 47 pilhas de imagem que contém clusters de vilosidades ~ 900 em amostras que variam de 8 a idade gestacional de 36 semanas. A Figura 7 demonstra como as redes de vasos alterar entre a idade gestacional. Cada pilha continha um conjunto de imagens de ~ 400 englobando uma Z-profundidade de ~ 1000 µm. Os resultados estão resumidos na tabela 1. Os volumes são o volume total médio dos clusters das vilosidades na pilha. As outras 3 colunas mostram os resultados para três medidas de rede obtidos para os objetos esqueletizados. Estas são medidas simples, básicas e poderiam ser facilmente expandidas em medidas mais abrangentes e complexas.
Figura 1 . Macroscópica para vistas microscópicas de redes vasculares da placenta humanas. (A) vista na superfície da placa coriônica de uma placenta humana normal. Ele mostra a rede de vasos superficiais, irradiando para fora a partir da inserção do cordão umbilical. (B), um pedaço de placenta deve ser usado para dissecação. A placa coriônica é para a direita e subjacente parênquima placenta está à esquerda com as árvores das vilosidades (tubos brancos) e as vilosidades terminais rosadas, densamente. (C) uma visão ampliada de (B) destacando as árvores brancas das vilosidades. (D) A imagem de 20x de alguns terminais vilosidades e seus capilares. (E) a porção distal de uma árvore de vilosidades onde ele termina nos clusters de vilosidades terminais. Alguns dos capilares contendo eritrócitos fetais são visíveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Exemplo típico de vilosidades da placenta immunolabeled. A camada exterior trofoblasto é em verde e capilares (interiores) estão em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Vistas ortogonais ([1] de xy, xz [2], yz [3]) do tecido da placenta. (A) antes e (B) depois da clareira. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Comparação de coloração de cortes de tecido convencional e reverso tecido limpo. Coloração imunohistoquímica convencional de uma secção de tecido de placenta de termo com CK7 (A). CK7 manchada tecido após a clareira foi revertida (B). Convencional histológica coloração de uma seção de placenta com H & E (C). H & E mancha immunohistochemically após compensação é invertida (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Duas opções para a montagem de tecido para a microscopia confocal. (A) de borracha de Silicone folha (B) Moore Sykes de câmara. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Máximos projeções do processamento e análise de pilhas de imagem confocal. Conjunto de imagem confocal Original (A). (B) separada canal vermelho. (C) mapa de objetos contados. (D) restos de objetos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 . Representante máximos projeções de pilhas confocal adquiridas em várias idades gestacional. (A), 8 semanas, (B), 14 semanas, (C) 17 semanas, (D) 22 semanas e (E) 36 semanas , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| GA (semanas) | Quer dizer Volume (mm ^ 3) | STD dev. Volume (mm ^ 3) | Quer dizer ramos | STD dev. Ramos | Quer dizer ramos / mm ^ 3 | STD dev. Ramos/mm ^ 3 | Quer dizer ramo comprimento (mm) | STD dev. ramo comprimento (mm) |
| 8 | 0.00059 | 0,0125 | 113.44 | 192.74 | 304321.3 | 15465.9 | 0.0451 | 0.0178 |
| 10 | 0.00074 | 0.016 | 182.09 | 349.61 | 346849 | 21884.81 | 0,0325 | 0.0132 |
| 12 | 0.00103 | 0,044 | 226.56 | 788.53 | 306438.7 | 17924.66 | 0.0434 | 0.0835 |
| 14 | 0.00108 | 0.0219 | 233.59 | 430.54 | 344598.1 | 19680.42 | 0,031 | 0.016 |
| 16 | 0.00065 | 0.0106 | 180.81 | 265.26 | 392412 | 25007.06 | 0.0271 | 0.0049 |
| 18 | 0.00056 | 0.0124 | 154.43 | 313.7 | 355264 | 25370.6 | 0.0283 | 0.0041 |
| 22 | 0.00089 | 0.0229 | 161.95 | 494.21 | 290176 | 21602.3 | 0.0383 | 0,013 |
Tabela 1. Resultados representativos da análise de amostras de vilosidades apuradas em diferentes idades gestacional rede. A tabela mostra as médias do volume, número de ramos, ramos por unidade de volume e ramo comprimento para desalfandegadas amostras de vilosidades na idade gestacional de 8 a 22 semanas de gestação.
Materiais complementares: figuras de animação/vídeo mostrando renderings 3D de pilhas de confocal em Figura 6.
R. pilha confocal Original. (Original.mp4). Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
B. separada Red Channel (Red.mp4) por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
C. objetos identificados (Objects.mp4) por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
D. Skeletonized objetos (Skeleton.mp4) por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
O Conselho de revisão institucional aprovado a coleção de tecidos das vilosidades da placenta para fixação de formol de gravidezes electively rescindidos. Antes que as cirurgias foram realizadas, uma breve revisão do registro médico observou idade materna, paridade e confirmada a ausência de médicos subjacente (por exemplo, hipertensão, diabetes e lúpus) ou do feto (anomalias cromossômicas ou estruturais, realizou-se um crescimento anormal). Folha de dados e quaisquer espécimes coletados foram rotulados apenas com um estudo de identificação. Assim, todos os espécimes foram identificados eliminação antes de partir a sala de operações. Vilosidades foram recolhidas por um observador treinado (CMS); decídua e placa coriônica foram removidos, e só livre flutuante das vilosidades aglomerados foram coletados.
Ao limpar os tecidos com técnicas baseadas em solvente, existem várias considerações importantes. Em primeiro lugar, os tecidos devem ser suficientemente desidratados para limpar, para que os tecidos devem ser lavados através de um gradiente de etanol (ou metanol) para 100%. Ao usar o etanol, é fundamental usar "etanol grau reagente seco, que contém sem água. Também é importante usar um volume suficiente de desidratação solução em cada etapa; cerca de 10-20 volume x do tecido é necessário para desidratação de sucesso. Desidratação incompleta dos tecidos irá resultar em uma aparência turva após limpeza. Outra consideração importante é a concentração do anticorpo utilizado para coloração. O anticorpo excessivo pode causar inespecificas e incompleta penetração nos tecidos devido ao bloqueio dos canais de difusão. Uma concentração suficiente de anticorpos de menos irá resultar em coloração incompleto como o anticorpo é esgotado antes de atingir o centro do tecido. Concentração de anticorpos deve ser otimizada em pequenos pedaços de tecido antes de intensificação para amostras grandes. Embora haja muito pouco autofluorescência na placenta unfixed fresco pode ser um problema significativo em tecidos fixos, especialmente depois de longos períodos no fixador. Em níveis excessivos, autofluorescência pode mascarar os sinais fluorescentes com o fundo. Enquanto proeminente em 543 e 488 nm, é muito menor em comprimentos de onda maiores como 633 nm. A melhor maneira de evitar a autofluorescência é executar todas as etapas, à temperatura ambiente ou abaixo.
Placenta é um tecido muito macio, aberto em que todos os capilares das vilosidades são separados do espaço de sangue materno pela membrana fina trofoblasto. Assim, a penetração dos anticorpos o tecido soluções de compensação relativamente rápida e são óptimos com incubação durante a noite. Aplicação do protocolo para tecidos sólidos, tais como cérebro, rins exigirá incubação significativamente mais vezes que devem ser determinados empiricamente.
Embora a capacidade de clara desmarcada tecido e mancha com procedimentos padrão histológicos permitiu-nos validar o processo de compensação é limitada em que ainda não é possível combinar uma parte manchada do tecido não compensada com sua correspondente "fatia" no conjunto de imagem confocal. Essa correspondência será necessária se quisermos ser capaz de relacionar as alterações na rede capilar específicos encontradas nos renderings 3D com suas contrapartes no padrão cortes histológicos.
Nesta aplicação, o tecido em processo de compensação é limitado a z-profundidades de ~ 1 mm além do qual a absorção da excitação e emissão aumenta até que estejam completamente perdidos. Isto pode ser parcialmente compensado com o plugin de Fiji ajuste de contraste pilha. Esta perda é parte devido o sistema confocal de 12 anos de idade e os objectivos de ar que foram usados para a imagem latente. Os objectivos de ar que foram usados para geração de imagens tem uma incompatibilidade de RI com a alta do RI de solução-2 (RI = 1,52) que provoca uma perda em profundidade de imagem. Qualquer um dos muitos sistemas atualmente disponíveis (microscopia de folha convencional, luz, imagem de dois fotões poderia fornecer z-profundidades melhorou significativamente, a qualidade de imagem e a gama de imunofluorescência e gestão de autofluorescência quando combinado com o mais alto RI correspondido objectivos mergulhando.
Todas as pilhas foram coletadas com um objetivo de 10 x (at = 0,30, distância de trabalho (WD) = 16 mm) que colocar sem restrições sobre os tamanhos de amostra. Um objectivo de 20 x foi usado ocasionalmente com um WD de 1 mm. Em ampliações superiores isto o WD diminui tal que ele se opõe a volumes maiores que um único das vilosidades.
Este protocolo permite agora a coleção de conjuntos de imagens com volumes que são de 5-10 dobras superiores anteriormente obtidas. Nesta escala, a rede vascular coletivo de centenas de vilosidades terminais pode ser investigado.
Isto por sua vez levará a modelos novos e melhorados de tais recursos críticos como intere a difusão de oxigênio intravillous baseados na geometria intracapillary como feito anteriormente em 2D em amostras de histologia de rotina em 10-20 x 15 e outros fizeram muito menor amostras de 8,16. Além disso, as pilhas geradas usando esse protocolo devem ajudar na modelagem da geometria intervillous. A nível das amostras utilizadas neste estudo, intervillous fluxo é muito lento para ser visualizado por Doppler ou outras técnicas. No entanto, se intervillous geometria permite uma exposição uniforme de todas as superfícies das vilosidades (e seus capilares subjacentes) para fluxo materno, ou se um espaço de intervillous muito esparso ou cheio demais processa transferência materno-fetal menos eficiente ainda está para ser examinados.
No futuro, o presente protocolo será usado para definir melhor o desenvolvimento da vascularização da placenta durante o desenvolvimento e para determinar as trajetórias de alterações na rede vascular em toda gestação normal. Então essas trajetórias podem ser medidas em gravidezes patológicas para fornecer informações sobre quando na gravidez gestação complicações começam a vascularização das vilosidades distal da placenta, e como esses desvios alteram a função de impacto.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Secretaria de estado de New York para povos com inabilidades desenvolventes e placentária Analytics LLC, New Rochelle, NY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
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