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Genetics

डीएनए प्रतिकृति एक Vivo में मॉडल प्रणाली के रूप में Zebrafish का उपयोग समय की रूपरेखा

Published: April 30, 2018 doi: 10.3791/57146
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Cell Cycle and Cancer Biology Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University

Summary

Zebrafish हाल ही में एक vivo मॉडल प्रणाली में विकास के दौरान डीएनए प्रतिकृति समय का अध्ययन करने के रूप में इस्तेमाल किया गया । यहां प्रोफ़ाइल प्रतिकृति समय zebrafish भ्रूण का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल विस्तृत है । इस प्रोटोकॉल को आसानी से म्यूटेंट, व्यक्तिगत कोशिका प्रकार, रोग मॉडल, और अंय प्रजातियों में पुनरावृत्ति समय का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Abstract

डीएनए प्रतिकृति समय एक महत्वपूर्ण सेलुलर विशेषता है, क्रोमेटिन संरचना, प्रतिलेखन, और डीएनए उत्परिवर्तन दरों के साथ महत्वपूर्ण संबंधों का प्रदर्शन । परिवर्तन प्रतिकृति समय में विकास और कैंसर के दौरान हो, लेकिन भूमिका प्रतिकृति समय में विकास और रोग ज्ञात नहीं है निभाता है । Zebrafish हाल ही में एक vivo मॉडल सिस्टम में प्रतिकृति समय का अध्ययन करने के रूप में स्थापित किया गया । डीएनए प्रतिकृति समय निर्धारित करने के लिए zebrafish का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल विस्तृत है । भ्रूण और वयस्क zebrafish से कोशिकाओं छंटाई के बाद, उच्च संकल्प जीनोम चौड़ा डीएनए प्रतिकृति समय पैटर्न अगली पीढ़ी sequencing डेटा के विश्लेषण के माध्यम से डीएनए कॉपी संख्या में परिवर्तन का निर्धारण करके निर्माण किया जा सकता है । zebrafish मॉडल प्रणाली के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है प्रतिकृति समय परिवर्तन है कि विकास के दौरान vivo में होते हैं, और भी व्यक्तिगत कोशिका प्रकार, रोग मॉडल, या उत्परिवर्ती लाइनों में परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन पद्धतियों प्रणाली और प्रतिकृति समय स्थापना और रखरखाव के निर्धारकों के विकास के दौरान, भूमिका प्रतिकृति समय उत्परिवर्तनों और tumorigenesis में खेलता है, और perturbing के प्रभाव की जांच के अध्ययन में सक्षम हो जाएगा विकास और रोग पर पुनरावृत्ति समय ।

Introduction

कोशिकाओं को सफलतापूर्वक विभाजित करने के लिए, वे पहले सही और ईमानदारी से अपने पूरे जीनोम दोहराने चाहिए । जीनोम दोहराव एक reproducible पैटर्न, डीएनए प्रतिकृति समय कार्यक्रम के रूप में जाना जाता है1में होता है । डीएनए प्रतिकृति समय क्रोमेटिन संगठन, epigenetic चिह्न, और जीन अभिव्यक्ति2,3के साथ संबंधित है । प्रतिकृति समय में परिवर्तन विकास भर में होते हैं, और काफी transcriptional प्रोग्राम और परिवर्तन करने के लिए क्रोमेटिन चिह्न और संगठन4,5से संबंधित हैं । इसके अलावा, प्रतिकृति समय उत्परिवर्तन आवृत्तियों के साथ संबंधित है, और समय में परिवर्तन कैंसर6,7,8के विभिंन प्रकार में मनाया जाता है । इन टिप्पणियों के बावजूद, तंत्र और प्रतिकृति समय स्थापना और विनियमन के निर्धारकों अभी भी काफी हद तक अनजान हैं, और भूमिका यह विकास और रोग में खेलता है अनिर्धारित है । इसके अलावा, हाल ही में जब तक जीनोम चौड़ा प्रतिकृति समय परिवर्तन हड्डीवाला विकास भर में होते है केवल सेल संस्कृति मॉडल में जांच की गई थी ।

Zebrafish, ढाणियो rerio, अच्छी तरह से विकास के दौरान vivo में प्रतिकृति समय का अध्ययन करने के लिए अनुकूल हैं, एक एकल संभोग जोड़ी के रूप में कई समानताएं के साथ तेजी से विकसित करने वाले भ्रूण के सैकड़ों की उपज कर सकते है स्तनधारी विकास9, 10. इसके अलावा, zebrafish के पूरे विकास में, कोशिका चक्र, क्रोमेटिन संगठन और transcriptional प्रोग्राम में परिवर्तन होते हैं, जो डीएनए प्रतिकृति के साथ संबंध साझा करते हैं11. Zebrafish भी एक उत्कृष्ट आनुवंशिक मॉडल हैं, क्योंकि वे विशेष रूप से transgenesis, mutagenesis द्वारा हेरफेर के लिए उत्तरदाई हैं, और लक्षित उत्परिवर्तनों, और आनुवंशिक स्क्रीन कई हड्डीवाला विकास के लिए आवश्यक जीन की पहचान की है12। इसलिए, zebrafish प्रतिकृति समय स्थापना और रखरखाव में शामिल जीन की पहचान करने के लिए और हड्डीवाला विकास पर प्रतिकृति समय को विनियमित करने के प्रभावों का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ट्रांसजेनिक रेखाओं का उपयोग अलग विकासात्मक timepoints या रोग स्थितियों में पृथक कक्ष प्रकारों से पुनरावृत्ति समय का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, वहां मानव रोग के विभिंन zebrafish मॉडल है कि रोग के गठन और प्रगति9,13,14में प्रतिकृति समय की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

हाल ही में, पहली प्रतिकृति समय प्रोफ़ाइल zebrafish से जनरेट किया गया, यह एक मॉडल सिस्टम vivo मेंप्रतिकृति समय का अध्ययन करने के लिए के रूप में स्थापित कर रहा है15. यह पूरा करने के लिए, कोशिकाओं zebrafish भ्रूण से विकास के कई चरणों में और एक वयस्क zebrafish से पृथक कक्ष प्रकार में एकत्र किए गए । सेल तो FACS (प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छंटाई) द्वारा डीएनए सामग्री के आधार पर G1 और एस चरण की आबादी को अलग करने के लिए क्रमबद्ध थे । एक प्रतिलिपि संख्या नियंत्रण के रूप में G1 नमूना का उपयोग करना, एस चरण आबादियों में संख्या भिंनता की प्रतिलिपि निर्धारित किया गया था और संबंधित प्रतिकृति समय16का अनुमान है । प्रतिकृति समय में परिवर्तन फिर सीधे विभिंन विकासात्मक नमूनों और कक्ष प्रकारों के बीच तुलना की जा सकती है और यह हड्डीवाला पूरे विकास में vivo में होने वाली प्रतिकृति समय में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया गया था । इस विधि अंय जीनोमिक तरीकों पर कई लाभ प्रदान करता है, मुख्य रूप से है कि यह thymidine अनुरूप या डीएनए4,6के immunoprecipitation के साथ लेबल की आवश्यकता नहीं है ।

यहां zebrafish में उच्च संकल्प प्रोफ़ाइल जीनोम चौड़ा डीएनए प्रतिकृति समय के लिए प्रोटोकॉल विस्तृत है । इन प्रोटोकॉल zebrafish जीनोम में जीनोमिक और epigenetic सुविधाओं के साथ संबंधों को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, साथ ही विकास के दौरान होने वाले इन संबंधों में परिवर्तन की रूपरेखा । इन प्रोटोकॉल भी आसानी से zebrafish के उत्परिवर्ती उपभेदों और रोग मॉडल में प्रतिकृति समय में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । साथ ही, इन पद्धतियों एक नींव है कि विशिष्ट कक्ष प्रकारों में प्रतिकृति समय का अध्ययन करने के लिए पर विस्तार किया जा सकता प्रदान करते हैं, पहले बाहर zebrafish से अलग कक्ष प्रकार छंटाई । zebrafish में एक उत्कृष्ट के रूप में सेवा कर सकते हैं vivo मॉडल सिस्टम प्रतिकृति समय का अध्ययन करने के लिए और अंत में इस महत्वपूर्ण epigenetic विशेषता के जैविक कार्यों को प्रकट करने के लिए.

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Protocol

सभी जानवरों को ओकलाहोमा मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ सख्त अनुसार संभाला गया था ।

1. प्रजनन के लिए वयस्क zebrafish की स्थापना

  1. प्रजनन के लिए एक एकल तनाव के वयस्क पुरुष और महिला zebrafish के एक बड़े पलटन का प्रयोग करें । वहां भी एक तनाव के zebrafish के आनुवंशिक श्रृंगार में छोटे मतभेद हैं, एक बड़े पलटन का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करने के परिणाम जनसंख्या की आनुवंशिक परिवर्तनशीलता के प्रतिनिधि है और आबादी का एक छोटा सबसेट तक ही सीमित नहीं है ।
  2. रात पहले भ्रूण एकत्र किया जाएगा, प्रजनन टैंक में प्रजनन वयस्कों के दर्जनों जगह, पुरुषों और महिलाओं के लगभग बराबर संख्या का उपयोग करें । प्रयोग के आधार पर, निंनलिखित प्रजनन रणनीतियों में से एक का उपयोग करें ।
    1. प्रजनन रणनीति 1: व्यक्तिगत प्रजनन टैंक में कुछ पुरुष और महिला zebrafish रखें, महिलाओं से एक डिवाइडर के साथ पुरुषों को अलग करें । यदि इस दृष्टिकोण का प्रयोग किया जाता है, तो सेटअप कई विभिंन प्रजनन टैंक और पूल प्रत्येक से भ्रूण जैविक परिवर्तनशीलता सुनिश्चित करने के लिए जनसंख्या का प्रतिनिधि है ।
    2. प्रजनन रणनीति 2: एक बड़े प्रजनन टैंक में पुरुष और महिला zebrafish के दर्जनों गठबंधन । इस रणनीति का प्रयोग करें जब तक वहां भ्रूण की एक पर्याप्त बड़ी संख्या में हैं, यह मान वे संस्थापकों की एक किस्म से आया है और इसलिए आनुवंशिक रूप से जनसंख्या के प्रतिनिधि है उचित है ।

2. समय पर संभोग-संग्रह, छंटाई, और आवास zebrafish भ्रूण प्रयोगों के लिए

  1. समय पर संभोग करते हैं, जैसे ही प्रकाश चक्र सुबह में किया जा रहा शुरुआत के रूप में । रातोंरात उत्पन्न होने वाले किसी भी भ्रूण को त्यागें.
  2. अनुमति दें मछली उथले पानी में नस्ल के लिए (3-5 सेमी) 10 मिनट की अवधि के लिए, भ्रूण के लिए एक झूठी नीचे के माध्यम से भागने के साथ ।
  3. 10 मिनट के बाद, एक छलनी के माध्यम से डालने और एक धोने की बोतल के साथ एक 10 सेमी की थाली में धोने के द्वारा भ्रूण इकट्ठा । पूल सभी भ्रूण एक ही समय बिंदु पर एकत्र, उंहें संग्रह के समय के साथ निशान, और एक मशीन में तुरंत जगह २८.५ ° c ।
  4. भ्रूण के सैकड़ों एक दिन में एक संभोग जोड़ी से उंमीद की जा सकती है । वयस्कों की अनुमति के लिए 10 मिनट चक्र में नस्ल को प्राप्त भ्रूण की संख्या बीस से कम है जब तक ।
  5. लगभग 1-1.5 एच के बाद संग्रह, प्रकार भ्रूण को हटाने के लिए मृत और निषेचित भ्रूण । भ्रूण को क्रमबद्ध करने के लिए, एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत मशीन से निकालें और निरीक्षण करें ।
    1. 10 सेमी प्लेट प्रति १०० भ्रूण के घनत्व पर भ्रूण और जगह गिनती ।
    2. ताजा E3 मध्यम जोड़ें (5 मिमी NaCl, ०.१७ मिमी KCl, ०.३३ मिमी CaCl2, ०.३३ मिमी MgSO4) और वापस २८.५ डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए भ्रूण.

3. Dechorionate, जर्दी, और ठीक zebrafish भ्रूण

नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड ४८ ज पोस्ट निषेचन (hpf) से पहले भ्रूण के लिए बनाया गया है । वहां कोई विकास के बाद के चरणों में भ्रूण की चोरियों को दूर करने की जरूरत है (४८ hpf के बाद), के रूप में वे अक्सर स्वाभाविक रूप से गिर जाते हैं । कोई ज़रूरत नहीं है या नहीं करने के लिए पुराने मछली की चोरियों को दूर 5 दिनों के बाद निषेचन (dpf) ।

  1. जब भ्रूण वांछित विकास आयु तक पहुंचने के लिए, "Zebrafish के भ्रूण विकास के चरणों" के अनुसार एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत विकास आकृति विज्ञान के उचित चरण की पुष्टि 17 ।
  2. १५०० अप करने के लिए स्थानांतरण भ्रूण एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब और धोने के लिए कई बार E3 के साथ ।
    1. E3 के 1 मिलीलीटर और Pronase समाधान के 20 µ एल जोड़ें (30 मिलीग्राम/एमएल) हर १०० भ्रूण के लिए और धीरे भंवर । अप करने के लिए १५०० भ्रूण के साथ एक ट्यूब में dechorionated जा सकता है 15 मिलीलीटर के E3 ।
    2. अपनी ओर ट्यूब करना और एक भी परत में भ्रूण की व्यवस्था करने के लिए मात्रा अनुपात को अधिकतम सतह सुनिश्चित करते हैं । धीरे आंदोलन ट्यूब हर 2-3 मिनट तक सभी चोरियों से भ्रूण के गिर गया है । कुल dechorionation समय Pronase गतिविधि के आधार पर भिंन होगा ।
  3. supernatant निकालें और धीरे से कुल्ला भ्रूण 3 बार के 10 मिलीलीटर के साथ E3 । बर्फ पर जगह भ्रूण प्रोटोकॉल के इस खंड के शेष के लिए ।
  4. E3 निकालें और नए सिरे से तैयार बर्फ ठंड की जर्दी बफर के साथ भ्रूण धोने (0.5 x Ginzburg मछली है घंटी समाधान, कैल्शियम के बिना: ५५ mm NaCl, १.८ mm KCl, १.२५ mm NaHCO3) ।
    1. ५०० भ्रूण के लिए बर्फ ठंड की जर्दी बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. एक P1000 का प्रयोग, धीरे पिपेट भ्रूण ऊपर और नीचे 5-10 बार जर्दी बोरी को बाधित करने के लिए ।
    3. एक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब के लिए 1 मिलीलीटर स्थानांतरण और 4 ° c पर केंद्रापसारक और 5 मिनट के लिए ५०० x जी ।
  5. supernatant निकालें और बर्फ के 1 मिलीलीटर ठंड 1x पंजाबियों (फॉस्फेट बफर खारा, पीएच ७.०) के साथ गोली धोने के लिए है घंटी समाधान हटा दें । 4 ° c और 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक ।
  6. 1x पंजाब के 1 मिलीलीटर में supernatant और पुनर्निलंबित कोशिकाओं को ध्यान से निकालें । बर्फ पर ट्यूब प्लेस ।
  7. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए बर्फ के 3 मिलीलीटर-शीत इथेनॉल (ेतोः) जोड़ें । ेतोः के भंवर ट्यूब धीरे कम सेटिंग पर ।
    1. एक P1000 का प्रयोग, धीरे (प्रति सेकंड 1 ड्रॉप) ड्रिप zebrafish भ्रूण सेल ेतोः में निलंबन जबकि धीरे भंवर ।
    2. ७५% ेतोः के अंतिम निर्धारण समाधान के लिए, भ्रूण कोशिका निलंबन की कुल 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  8. सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर के बाद जोड़ा गया है, धीरे से भंवर ट्यूब मिश्रण करने के लिए और जगह पर-20 डिग्री सेल्सियस के लिए न्यूनतम 1 ज. यह उनकी ओर ट्यूबों जगह के लिए मात्रा अनुपात को अधिकतम सतह को सुनिश्चित करने और भ्रूण और कोशिकाओं है कि एक साथ रहना की संख्या को कम करने की सिफारिश की है । 2-3 सप्ताह के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर भ्रूण कोशिकाओं ।

4. दाग डीएनए और FACS छंटाई भ्रूण

नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड में 1 dpf भ्रूण के लिए बनाया गया है ।

  1. से ेतोः-फिक्स्ड भ्रूण कोशिकाओं को दूर-20 डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट के लिए 4 ° c १५०० x g पर केंद्रापसारक ।
    1. बर्फ पर ट्यूब प्लेस और ध्यान से supernatant निकालें । एक P1000 का प्रयोग, धीरे हौसले से तैयार ठंड पंजाबियों की 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पुनः निलंबित-BSA (1x पंजाबियों, 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन) ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट और बर्फ पर जगह के लिए १५०० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
  2. propidium आयोडाइड (PI) धुंधला समाधान (५० µ g/एमएल pi, १०० µ g/एमएल RNase ए, पंजाब, पीएच ७.०), हर १००० भ्रूण के लिए २०० µ l का उपयोग करते हुए कोशिकाओं को supernatant और reसस्पेंड निकालें ।
    1. कोशिकाओं को बर्फ पर 30 मिनट के लिए PI समाधान में गर्मी की अनुमति दें, धीरे से हर 5 मिनट मिश्रण ।
    2. बर्फ पर एक ५० एमएल शंकु ट्यूब पर एक ४० µm नायलॉन सेल छलनी प्लेस । धीरे पिपेट कोशिकाओं मिश्रण और जाल के माध्यम से फिल्टर करने के लिए ।
      नोट: यदि एक ही timepoint से भ्रूण के कई ट्यूबों प्रोटोकॉल की धारा 3 में एकत्र किया गया, इस बिंदु पर इन भ्रूण गठबंधन इतना है कि वे सब एक साथ हल कर रहे हैं ।
    3. एक सिरिंज गोताख़ोर के फ्लैट के अंदर अंत का उपयोग करना, धीरे जाल पर कोशिकाओं के किसी भी शेष झुरमुट में खलल डालना.
    4. ठंडा पंजाबियों के ५०० µ एल के साथ फिल्टर के माध्यम से कुल्ला कोशिकाओं-हर १००० भ्रूण के लिए BSA ।
    5. बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब पर एक ४०-µm मेष प्लेस और सेल निलंबन से ५०-एमएल शंकु ट्यूब 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक दूसरी बार फिल्टर ।
  3. एक उपयुक्त कोशिका छँटाई साधन का उपयोग कर, propidium आयोडाइड का पता लगाने के लिए 610/20 करने के लिए ५६१-एनएम और उत्सर्जन का पता लगाने के लिए लेजर उत्तेजना सेट.
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर साधन में भंवर और जगह के द्वारा संक्षेप में सना हुआ कोशिकाओं के 15 मिलीलीटर ट्यूब मिक्स ।
    2. एक स्वच्छ सेल चक्र प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए और एस चरण जनसंख्या के साथ G1 या G2/एम कोशिकाओं मिश्रण से बचने के लिए, एक धीमी गति से प्रवाह दर पर कोशिकाओं को चलाने के लिए आदर्श रूप में १.० मिलीलीटर/।
    3. पहला, गेट फॉर FSC-a x SSC-a (फॉरवर्ड स्कैटर क्षेत्र द्वारा साइड स्कैटर क्षेत्र) मलबे को हटाने के लिए (चित्र 1a) ।
      नोट: भ्रूण से कोशिकाओं को मंच और सेल प्रकार के आधार पर आकार अलग किया जा सकता है । तटस्थ घनत्व (एन डी) फिल्टर वर्तमान कोशिकाओं के आकार के आधार पर १.० और १.५ के बीच स्विच करने की आवश्यकता हो सकती है । गेट एक बड़े क्षेत्र अधिकांश कोशिकाओं को इकट्ठा करने और मलबे को हटाने के लिए ।
    4. दूसरा, ssc के लिए गेट-एरिया (एसएससी-ए) द्वारा पीआई-एरिया (पीआई-ए), मलबा और सेल दोहरी (figure 1b) को हटाने के लिए.
    5. तीसरा, एसएससी के लिए गेट-ए द्वारा एसएससी-डब्ल्यू (चौड़ाई) किसी भी शेष कोशिका दोहरी (चित्रा 1C) को दूर करने के लिए ।
  4. x-अक्ष पर y-अक्ष और propidium आयोडाइड क्षेत्र (PI-a) पर कक्ष संख्या (count) के साथ हिस्टोग्राम पर gated आबादी प्रदर्शित करें । 24 hpf भ्रूण के लिए, यह चित्र 1 डीके रूप में एक टकसाली सेल चक्र प्रोफ़ाइल देना चाहिए ।
    1. एस चरण की आबादी को क्रमबद्ध करने के लिए, g1 चोटी के दाईं ओर से, g2 चोटी के बाईं ओर से गेट सेट g1 और G2 आबादी की केवल एक ंयूनतम राशि सहित । 24 hpf भ्रूण के लिए, यह आम तौर पर gated जनसंख्या का 10-15% के बारे में शामिल होगा ( चित्र 1 डीदेखें) ।
    2. g1 की आबादी को क्रमबद्ध करने के लिए, g1 चोटी के बाईं ओर के गेट को सेट करें, न कि चोटी के ऊपर से गुजरने के लिए । G1 गेट की चौड़ाई यथासंभव संकीर्ण रूप से समायोजित करें ( चित्र 1 d) देखें ।
    3. वापस गेट G1 और एस चरण आबादी उचित प्रारंभिक गेटिंग (चित्रा 1E) सुनिश्चित करने के लिए ।
  5. 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में G1 और एस चरण की आबादी को क्रमबद्ध करें पंजाब के 3 मिलीलीटर-BSA । लक्ष्य ५००,००० और १,०००,००० या अंश प्रति अधिक क्रमबद्ध कोशिकाओं के बीच प्राप्त करने के लिए होना चाहिए (G1 और एस चरण) ।
  6. छंटाई के बाद पूरा हो गया है, १५०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक ।
    नोट: छोटे सेल गोली देखने के लिए मुश्किल हो जाएगा और यह इसे बाधित से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, तो अधिमानतः एक निश्चित कोण रोटर पर एक झूलते बाल्टी रोटर का उपयोग करें ।
  7. ध्यान से निकालें supernatant और 1x पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ गोली reसस्पेंड । एक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण कोशिकाओं और 5 मिनट के लिए ६,००० x g और 4 ° c पर केंद्रापसारक ।
  8. ध्यान से सभी तरल ट्यूब से निकालें और सूखी गोली फ्रीज पर-20 ° c । 2-3 सप्ताह के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर गोली की दुकान ।

5. डीएनए अलगाव, RNase उपचार, और डीएनए शुद्धि

  1. -20 डिग्री सेल्सियस और बर्फ पर जगह से सेल गोली निकालें ।
    1. एसडीएस बफर (५० mM Tris-HCl (pH ८.०), 10 mm EDTA, 1 M NaCl, ०.५% एसडीएस) के ४०० µ l को गोली और reसस्पेंड करने के लिए जोड़ें ।
    2. संक्षेप में भंवर से ०.२ मिलीग्राम/एमएल और मिश्रण के एक अंतिम एकाग्रता के लिए proteinase कश्मीर जोड़ें ।
    3. 2 एच, भंवर हर 15 मिनट के लिए ५६ डिग्री सेल्सियस पर नमूने की मशीन ।
  2. 2 ज के बाद, phenol-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण प्रदर्शन phenol के ४०० µ एल जोड़कर-क्लोरोफॉर्म (phenol: क्लोरोफॉर्म: Isoamyl शराब 25:24:1, 10 मिमी Tris, पीएच ८.०, 1mM EDTA) के साथ संतृप्त ।
    1. 20 एस के लिए भंवर और 5 मिनट के लिए अलग चरणों के लिए १६,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक ।
    2. ध्यान से ऊपरी जलीय चरण (४०० µ एल) को हटाने और एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
  3. ४० 3m सोडियम एसीटेट (पीएच ५.२), ग्लाइकोजन के 2 µ एल, और ेतोः के 1 मिलीलीटर के µ एल जोड़कर ेतोः वर्षण प्रदर्शन ।
    1. भंवर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए और जगह-20 ° c रात भर डीएनए को हाला । नमूना भी-८० ° c या 1 एच के लिए सूखी बर्फ पर उपजी जा सकता है ।
    2. 4 ° c पर नमूना केंद्रापसारक और 30 गोली डीएनए को मिनट के लिए १६,००० x g ।
    3. त्यागें supernatant और धो गोली 1 मिलीलीटर ७०% ेतोः के साथ । 4 ° c और 5 मिनट के लिए १६,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    4. 2-3 मिनट के लिए परिवेश के तापमान पर supernatant और हवा सूखी गोली त्यागें ।
  4. autoclaved पानी की ९६ µ एल में गोली भंग, और RNase एक (2 मिलीग्राम/एमएल) के 4 µ एल जोड़ें ।
    1. 1 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर भंवर और मशीन द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
  5. १०० µ l को जोड़कर phenol-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण निष्पादित करें phenol-क्लोरोफॉर्म और चरणों में निम्न कार्यविधि 5.2.1-5.2.2.
  6. 3m सोडियम एसीटेट, 1 µ एल ग्लाइकोजन, और µ के २५० ेतोः एल के 10 µ एल जोड़कर ेतोः वर्षण प्रदर्शन और कदम 5.3.1-5.3.5 में प्रक्रिया का पालन ।
  7. ते बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ८.०), 10 मिमी EDTA (पीएच 8.0)) के ६० µ एल में गोली reसस्पेंड और एक मात्रात्मक प्रतिदीप्ति-आधारित विधि का उपयोग डीएनए एकाग्रता का निर्धारण । -20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए की दुकान ।
    नोट: यह प्रतिदीप्ति-आधारित डीएनए बंधन रंजक, या अंय यूवी स्पेक्ट्रोमीटर-आधारित तरीकों से अधिक विश्वसनीय साधन का उपयोग कर डीएनए यों तो महत्वपूर्ण है ।

6. डीएनए पुस्तकालयों और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण की तैयारी

नोट: प्रत्येक अनुक्रमण के लिए एक G1 प्रति संख्या संदर्भ नमूना के लिए आवश्यक है sequencing रन (यानी WT, उत्परिवर्ती, ट्रांसजेनिक, सेल लाइन, आदि) । समान G1 संदर्भ के लिए एक ही अनुक्रमण चलाने में एक ही जैविक स्रोत से सभी एस चरण नमूनों की तुलना करें । नमूने के बीच एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक नमूने के कम से दो जैविक प्रतिकृति चलाएं ।

  1. ५० µ एल के एक अंतिम मात्रा के लिए डीएनए के 1 µ जी पतला और sonication के लिए एक विशेष ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
  2. कतरनी जीनोमिक डीएनए एक लक्ष्य के लिए एक केंद्रित ultrasonicator में 250-300 बीपी, निर्माता के विनिर्देशों और प्रोटोकॉल के अनुसार ।
  3. निर्माता के विनिर्देशों और प्रोटोकॉल के अनुसार, एक स्वचालित ट्रो मशीन का उपयोग करके कतरनी जीनोमिक डीएनए की गुणवत्ता और आकार की पुष्टि करें । सुनिश्चित करें कि कतरनी जीनोमिक डीएनए के लिए ~ 250-300 bp की एक बड़ी चोटी है ।
  4. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार Illumina मंच पर sequencing के लिए मल्टीप्लेक्स ओलिगोस्पर्मिया के साथ एक डीएनए पुस्तकालय तैयारी किट का उपयोग कर अनुक्रमण पुस्तकालयों तैयार करते हैं ।
  5. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, स्वचालित ट्रो मशीन का उपयोग कर पुस्तकालय की तैयारी की गुणवत्ता की पुष्टि करें । सुनिश्चित करें कि वहां ~ 400-450 बीपी की एक बड़ी चोटी है, और वहां प्राइमर dimers (80-85 बीपी) और अनुकूलक dimers (~ १२० बीपी) के लिए ंयूनतम चोटियों हैं ।
  6. अगले पीढ़ी के डीएनए अनुक्रमण के लिए एक डीएनए लाइब्रेरी ठहराव किट का उपयोग कर पुस्तकालयों यों तो है, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ।
  7. 5 एनएम की एकाग्रता के लिए पुस्तकालय के 15 µ एल पतला और नमूना प्रति वांछित विशिष्ट मानचित्रण पढ़ने की गिनती को प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में मल्टीप्लेक्स पुस्तकालयों गठबंधन ।
    नोट: प्रति नमूना पढ़ता अनन्य रूप से मैपिंग की संख्या रिज़ॉल्यूशन निर्धारित करेगा । zebrafish जीनोम के लिए प्रतिकृति समय का आकलन करने के लिए ५,०००,००० मैप्ड पढ़ता के रूप में कुछ का उपयोग करें । यह 10-20 million पढ़ता के साथ शुरू की सिफारिश की है ।
  8. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक अगली पीढ़ी sequencing मंच पर नमूनों की युग्मित अंत १०० बीपी पूरे जीनोम डीएनए अनुक्रमण प्रदर्शन ।

7. अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण

नोट: इस खंड में दिए गए निर्देशों का विश्लेषण के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में अभिप्रेत है । अनुक्रमण संरेखण, फ़िल्टरिंग, संसाधन, आदि के लिए अतिरिक्त विधियों का उपयोग करें । प्रोटोकॉल का यह खंड इस काम में विश्लेषण की पसंदीदा विधि के साथ सौदा होगा । यदि अतिरिक्त तरीकों का उपयोग किया जाता है, उन उद्देश्यों के अनुरूप मापदंडों और कार्यों को समायोजित करें । नीचे दिए गए आदेश Ubutnu या मैक टर्मिनल में प्रवेश कर रहे हैं, उपयुक्त संकुल के साथ स्थापित ।

  1. zebrafish जीनोम के सबसे हाल के संस्करणों को प्राप्त (danRer10, के रूप में जब इस प्रोटोकॉल लिखा था) UCSC जीनोम ब्राउज़र से निंनलिखित आज्ञाओं का उपयोग:
    wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10. एफए. gz
    1. एफए. gz फ़ाइल निम्न आदेश के साथ विस्तृत करें:
      gunzip danRer10 gz
    2. निम्न आदेशों का उपयोग करके BWA-मेम का उपयोग कर जीनोम के लिए अनुक्रमण डेटा संरेखित करें:
      bwa मेम-t 8 danRer10. एफए read_1. fastq read_2. fastq > आउटपुट. sam
  2. निंन आदेश के साथ samtools का उपयोग कर. sam फ़ाइल में कनवर्ट करें ।
    samtools view-बीएस इनपुट. sam > आउटपुट. bam
    1. निम्न आदेश के साथ samtools का उपयोग कर संरेखित sequencing फ़ाइलें सॉर्ट करें:
      samtools सॉर्ट आउटपुट. bam > output_sorted. bam
    2. निंन आदेश के साथ samtools का उपयोग कर. bam फ़ाइल को अनुक्रमित करें:
      samtools index आउटपुट. bam
  3. Picard के साथ पीसीआर डुप्लिकेट मार्क निंनलिखित आज्ञाओं का उपयोग:
    जावा-Xmx2g-जार picard. जार MarkDuplicates \
    इनपुट = input. bam
    आउटपुट = आउटपुट. bam
    REMOVE_DUPLICATES = false
    METRICS_FILE = output_metrics. txt
  4. निंन कमांड का उपयोग करके प्रत्येक गुणसूत्र के लिए पढ़ता है पाठ (. txt) फ़ाइलें उत्पंन:
    i के लिए {१.२५} में; do CHROM = "chr" $i; इको $CHROM; samtools दृश्य इनपुट. bam $CHROM | कट-च 2, 4, 5, 7, 8, 9 > readsChr $ {i}. txt; किया
    नोट: परिणामी. txt फ़ाइल में स्तंभ ध्वज, स्थान, mapQ, युग्म chr, युग्म स्थान, और अंश आकार, क्रमशः हैं ।
  5. Matlab में txt फ़ाइलों (या किसी अंय समान सॉफ्टवेयर) textscan समारोह का उपयोग कर पढ़ें ।
    1. कम मैपिंग गुणवत्ता को फ़िल्टर 30 की एक mapQ थ्रेशोल्ड सेट करके पढ़ता है ।
    2. किसी भिंन गुणसूत्र में प्राथमिक संरेखण, पीसीआर डुप्लिकेट, या जोड़ी मैपिंग के लिए ध्वज के साथ पढ़ता निकालें ।
    3. फ़िल्टर २००० bp की दूरी सीमा से परे उनकी जोड़ी के साथ किसी भी पढ़ता है ।
    4. पढ़ने के आँकड़े, कवरेज, सम्मिलित आकार, और गुणवत्ता (चित्रा 2) की संख्या निर्धारित करने के लिए परिणामस्वरूप पढ़ता के आँकड़े का मूल्यांकन करें ।
  6. प्रत्येक गुणसूत्र की लंबाई भर में १०० bp अंतरालों में पढ़ता की संख्या की गणना करके प्रत्येक नमूने के लिए १०० बीपी फिक्स्ड विंडोज में पढ़ें कवरेज निर्धारित करें ।
    1. सभी खिड़कियों के लिए औसत पढ़ें गिनती की गणना ।
    2. औसत से 5 मानक विचलन से अधिक windows को निकाल कर उच्च कवरेज के क्षेत्रों को फ़िल्टर करें ।
  7. २०० के साथ प्रत्येक गुणसूत्र के साथ खंडों ढूंढने से G1 संदर्भ नमूनों में विश्लेषण के लिए क्षेत्रों को परिभाषित फिसलने खिड़कियों का उपयोग कर पढ़ता है ।
    1. s चरण की संख्या की गणना करके प्रत्येक एस चरण नमूने में पढ़ें गहराई का निर्धारण २०० में पढ़ता-पढ़ने गिनती windows के साथ G1 संदर्भ के लिए परिभाषित किया गया है ।
  8. सॉफ्टवेयर में csaps फंक्शन का उपयोग करते हुए रॉ डेटा को चिकना करें, एक प्रक्षेपक फैक्टर (p) के साथ 10-16।
  9. 0 और मानक विचलन 1 के माध्य से z-स्कोर करने के लिए स्मूथ्ड डेटा को सामान्य करें ।

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Representative Results

प्रकाशित प्रतिकृति समय डेटा का उपयोग करते हुए, प्रतिनिधि प्रतिकृति समय प्रोफ़ाइल और गुणवत्ता नियंत्रण उपाय15प्रदान किए जाते हैं । प्रसंस्करण के प्रारंभिक चरण शामिल जीनोम के लिए अनुक्रमण डेटा संरेखित, लंबाई और जीनोम कवरेज आँकड़े पढ़ें की गणना, और कम गुणवत्ता छानने, ख़राब, और पीसीआर डुप्लिकेट पढ़ता है । पढ़ें आंकड़े एक ठेठ zebrafish अनुक्रमण नमूना के लिए चित्रा 2में दिखाए जाते हैं । छानने के बाद, पढ़ें गिनती चर आकार खिड़कियों में निर्धारित कर रहे हैं और डेटा सुचारू और सामान्यीकृत हैं. विशिष्ट स्मूथ्ड/सामान्यीकृत प्रतिकृति समय प्रोफ़ाइल जैविक प्रतिकृति के लिए एक प्रतिनिधि zebrafish गुणसूत्र के चित्र 3ए में दिखाए जाते हैं । जैविक और प्रयोगात्मक प्रतिकृति के लिए प्रोफाइल नेत्रहीन बहुत समान होना चाहिए ( चित्र 3ए देखें) और भी गुणसूत्र की लंबाई के साथ उच्च सहसंबंध प्रदर्शित (चित्र बी) । वे भी समय मूल्यों जीनोम चौड़ा (आंकड़ा 3सी) के बीच उच्च सहसंबंध प्रदर्शित करना चाहिए । सहसंबंध, पैटर्न निरंतरता का आकलन करने के लिए एक विधि, डेटा सेट (चित्रा 3d) में संरचना की डिग्री का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । संरचित परिपक्व समय के कार्यक्रमों के लिए परस्पर सहसंबंध कम दूरी पर उच्च होना चाहिए और धीरे से दूरी बढ़ जाती है के रूप में कम हो । नमूने जो उच्च reproducibility के बीच जैविक और प्रायोगिक प्रतिकृति और एक प्रबल सहसंबंध संकेत उच्च गुणवत्ता नमूने के रूप में माना जाना चाहिए और एक उच्च कवरेज नमूने प्राप्त करने के लिए संयोजित किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिकृति समय विश्लेषण के लिए zebrafish भ्रूण छंटाई । (a) सभी कक्षों की Gated जनसंख्या को एक ओर तितर-बितर क्षेत्र (FSC-a) के द्वारा क्रमबद्ध किया गया (SSC-a) । रंग लाल-से-हरे-नीले रंग से लेकर रंगों द्वारा प्रतिनिधित्व उच्च करने के लिए कम घनत्व के साथ डॉट साजिश में डिब्बे के घनत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं । (B) FSC x ssc Gated कक्षों की Gated जनसंख्या को एसएससी-a द्वारा propidium आयोडाइड क्षेत्र (PI-a) के लिए क्रमबद्ध किया गया है । (ग) ssc x PI Gated कक्षों की Gated जनसंख्या एसएससी-A द्वारा साइड स्कैटर चौड़ाई (एसएससी-डब्ल्यू) के लिए क्रमबद्ध । (D) एक बाहुबली कोशिका चक्र प्रोफ़ाइल प्रदर्शित करने वाली सभी gated की आबादी का हिस्टोग्राम । G1 और S चरण में कक्षों के लिए सॉर्ट करें gates काली रेखाओं के साथ धूसर छायांकित बॉक्स द्वारा प्रदर्शित किए जाते हैं । (ई) Backgated G1 और एस चरण की आबादी बताते है कि प्रारंभिक गेटिंग कोशिकाओं के बहुमत पर कब्जा कर लिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: sequencing एक ठेठ zebrafish नमूना के लिए आँकड़े पढ़ें. (क) mapQ मूल्यों के आँकड़ों से मानचित्रण गुणवत्ता काटना. (B) सभी अनुक्रमण के लिए संमिलित आकारों के वितरण का हिस्टोग्राम पढ़ता है । (C) कुल मैप किए गए पढ़ता के लिए आँकड़े पढ़ें, कम गुणवत्ता ध्वज युक्त पढ़ता है, एक अलग गुणसूत्र (जोड़ी रचनाकार chr) के लिए मानचित्रण जोड़े के साथ पढ़ता है, दूरी दहलीज (दूर जोड़ी) से परे जोड़ी के साथ पढ़ता है, और पीसीआर डुप्लिकेट. (D) कुल मैप किए गए, बिना मैप किए गए, और न की गई पढ़ता, कवरेज के प्रतिनिधि संख्याएं, और एक zebrafish नमूना के किसी विशिष्ट अनुक्रमण चलाने के लिए रिज़ॉल्यूशन पढ़ें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि zebrafish प्रतिकृति समय परिणाम और गुणवत्ता नियंत्रण उपाय. (a) 28 hpf भ्रूण (Siefert, २०१७) के दो जैविक प्रतिकृति के लिए एक प्रतिनिधि गुणसूत्र की लंबाई के साथ प्रतिकृति समय । (B) 2 Mb windows में प्रतिकृति समय मान के बीच सहसंबंध 28 hpf भ्रूण की प्रतिकृति के लिए एक प्रतिनिधि गुणसूत्र की लंबाई के साथ चित्रा 3एमें दिखाया गया है । (C) जैविक (rep1 और rep2) के लिए प्रतिकृति समय मानों के बीच जीनोम चौड़ा सहसंबंध और प्रायोगिक (rep3) 28 hpf भ्रूण की प्रतिकृति । रंग मैप पियरसन के सहसंबंध गुणांक का प्रतिनिधित्व करता है । (D) एक संरचित परिपक्व समय कार्यक्रम के लिए परस्पर सहसंबंध उन करीब दूरी पर उच्च सहसंबंध प्रदर्शित करता है जो धीरे से अधिक दूरी तक बढ़ जाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

Zebrafish एक नया और अद्वितीय vivo मॉडल प्रणाली में डीएनए प्रतिकृति समय का अध्ययन करने के लिए प्रदान करते हैं । जब समय पर सहवास इस प्रायोगिक प्रोटोकॉल में विस्तृत के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं, भ्रूण के हजारों प्रयोगों के लिए एक ही दिन में एकत्र किया जा सकता है. इन भ्रूण ठीक समय पर और स्पष्ट रूप से विकास की विशेषता चरणों के माध्यम से तुल्यकालिक विकसित । Zebrafish आसानी से और सही रूप से एक stereomicroscope का उपयोग कर आकृति विज्ञान द्वारा मंचन किया जा सकता है, Zebrafish भ्रूण बाह्य विकसित और ऑप्टिकली स्पष्ट कर रहे हैं के रूप में. इस प्रोटोकॉल zebrafish भ्रूण के उपयोग के लिए हड्डीवाला विकास भर में पुनरावृत्ति समय का अध्ययन विवरण ।

प्रोटोकॉल है कि समस्याओं को पेश कर सकते है के क्षेत्रों zebrafish भ्रूण की तुल्यकालिक विकास सुनिश्चित करने, तैयार करने के दौरान कोशिकाओं की हानि, FACS छंटाई, और पुस्तकालय की तैयारी शामिल हैं । zebrafish विकास के समय तापमान निर्भर है, इसलिए उपयोग zebrafish प्रकाश/अंधेरे चक्र के लिए अनुकूलित और प्रयोगों के लिए २८.५ डिग्री सेल्सियस पर स्थित है । तुल्यकालिक विकास सुनिश्चित करने के लिए, ठीक समय पर संभोग प्रदर्शन, और बहुत छोटे समय में भ्रूण इकट्ठा-windows (10 मिनट या उससे कम) । यह २८.५ डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है और सुनिश्चित करें कि वे परिवेश के तापमान पर ंयूनतम समय खर्च करते हैं । zebrafish विकास के समय भी एक दिए गए क्षेत्र में भ्रूण के घनत्व पर अत्यधिक निर्भर है । यह 10 सेमी प्लेट प्रति १०० भ्रूण से अधिक एक घनत्व उच्च पर घर भ्रूण नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है, या वे ठीक से विकसित नहीं होगा । इष्टतम समय मृत और निषेचित भ्रूण को हटाने के लिए है जब वे 4-16 सेल चरण में प्रगति की है और आसानी से निषेचित के रूप में पहचाना जा सकता है (उपयोग "Zebrafish" के भ्रूण विकास के चरणों "17 एक गाइड के रूप में) । मृत भ्रूण आमतौर पर काले गेंदों और निषेचित भ्रूण के रूप में दिखाई 1-सेल के रूप में दिखाई देते हैं । परिवेश के तापमान पर समय को कम करने के लिए यथासंभव शीघ्रता से कार्य करें ।

जब dechorionating भ्रूण, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है सभी चोरियों भ्रूण से निकाल दिया जाता है । जब तक अधिकांश चोरियों पर काबू न आ जाए तब तक भ्रूण को pronase समाधान में रखें । संदंश के साथ अपनी चोरियों को बरकरार रखने या हटाने के साथ शेष बचे भ्रूण को त्यागें । पिपेट एक धीमी और चिकनी गति का उपयोग कर भ्रूण । तेजी से मत पिपेट के रूप में यह कोशिकाओं के विषय में तनाव अनुचित और कोशिकाओं के नुकसान में परिणाम होगा । यह भी महत्वपूर्ण है के रूप में एक P200 का उपयोग नहीं यह वृद्धि कतरनी तनाव पैदा कर सकता है कि कोशिकाओं के टूटना में परिणाम है । इसके विपरीत, एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट एक छोटे से पर्याप्त बोर नहीं हो सकता है या पर्याप्त कतरनी तनाव प्रदान करने की जर्दी बोरी को बाधित करने और कोशिकाओं को समग्र । वैकल्पिक पिपेट इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान की बोर और कतरनी इष्टतम P1000 के बराबर होगा ।

जब FACS छंटाई 28 hpf, अगर एक टकसाली सेल चक्र प्रोफ़ाइल प्राप्त नहीं है, तो PI लेजर पर वोल्टेज समायोजित करें ताकि G1 पीक 50K के आसपास केंद्रित है । FSC और एसएससी के लिए लाभ भी इस तरह समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है कि गेटिंग और कोशिका की आबादी चित्रा 1के समान दिखाई देते हैं । यदि अभी भी कठिनाई है, तो एन डी फ़िल्टर बंद किया जाना चाहिए, और FSC और एसएससी वोल्टेज कोशिकाओं के बहुमत को सुनिश्चित करने के लिए समायोजित गेट के भीतर कर रहे हैं. यह स्पष्ट किया जाना चाहिए कि वहां है pi धुंधला, के रूप में वहां एक सीमा है कि संरा pi-a के लिए डबल्स होगा । हिस्टोग्राम दो स्पष्ट चोटियों, G1 कोशिकाओं के लिए 2N डीएनए में एक बड़ी चोटी पर दिखाने चाहिए, और G2 के 4N डीएनए सामग्री के लिए तीव्रता डबल पर एक छोटे शिखर/ यदि यह अभी भी प्राप्त नहीं है वहां या तो बरकरार कोशिकाओं की संख्या कम हो सकता है, PI धुंधला के साथ समस्याओं, या निर्धारण के साथ समस्याओं और प्रोटोकॉल के अनुसार अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी ।

प्रारंभिक भ्रूण से कोशिकाओं (से पहले 10 hpf) ठेठ सेल चक्र प्रोफाइल नहीं देना होगा, इन कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत के रूप में एस चरण में हैं । इन नमूनों एस चरण नमूनों के रूप में इलाज किया जा सकता है, और 24 hpf भ्रूण से एक G1 संदर्भ की तुलना में । 10 hpf और 24 hpf के बीच भ्रूण मध्यवर्ती सेल चक्र प्रोफाइल दे सकता है और अगर वांछित हल किया जा सकता है । S-चरण जनसंख्या निर्धारण से पहले संक्षिप्त दालों में thymidine सादृश्यों जैसे EDU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) या BrdU (Bromodeoxyuridine) को शामिल करके भी पहचाना और क्रमबद्ध किया जा सकता है, तथापि, यह सटीक निर्धारण के लिए आवश्यक नहीं है पुनरावृत्ति समय ।

आदर्श रूप में पुस्तकालय की तैयारी डीएनए के 1 µ जी के साथ शुरू किया जाना चाहिए । सैद्धांतिक रूप से ~ ३००,००० हल कोशिकाओं डीएनए के बारे में 1 µ जी निकलेगा (अनुमान ~ ३.३ स्नातकोत्तर/नाभिक), तथापि, वहां हमेशा प्रोटोकॉल भर में नुकसान है । ५००,००० करने के लिए १,०००,००० क्रमबद्ध कोशिकाओं डीएनए के 1 से अधिक µ जी देना चाहिए. एक ठेठ 24 hpf भ्रूण लगभग १८,००० कोशिकाओं होगा, जिनमें से 10-15% S-चरण में किया जाएगा । विकास के पहले के चरणों में भ्रूण काफी कम कोशिकाओं होगा, लेकिन एस चरण में कोशिकाओं के उच्च प्रतिशत होगा ।

चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर सटीक शुद्धिकरण और आकार चयन प्रदर्शन पुस्तकालय की तैयारी से अवांछित तत्वों को नष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है । निर्माता के निर्देशों का सावधानीपूर्वक पालन करें और अतिरिक्त ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता हो सकती है । पीसीआर dimers की एक छोटी राशि आम तौर पर एक बड़ी समस्या नहीं है, लेकिन एडेप्टर dimers बहुत कुशलता से अनुक्रम ताकि वे कम किया जाना चाहिए होगा । यह डीएनए अनुपात करने के लिए प्रारंभिक अनुकूलक समायोजित करके प्राप्त किया जा सकता है, और पुस्तकालय की तैयारी के दौरान सही आकार चयन प्रदर्शन.

एकल अंत अनुक्रमण भी अलग प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के लिए उपयुक्त हो सकता है । एकल अंत सस्ता है और आवश्यक जानकारी के सबसे प्रदान करता है के बाद से इस दृष्टिकोण गिनती पर निर्भर पढ़ता है; युग्मित-अंत पीसीआर और ऑप्टिकल डुप्लिकेट को हटाने और दोहराव दृश्यों और अन्य संरचनात्मक रूपांतरों (जो zebrafish जीनोम में आम हैं) के क्षेत्रों को हल करने के लिए एक उच्च क्षमता प्रदान करता है । नीचे विश्लेषण भाग केवल युग्मित-अंत sequencing के साथ डील करेगा पढ़ता है । छोटा sequencing पढ़ता भी उपयुक्त हो सकता है । यह एक कम कीमत पर पढ़ता है की एक उच्च संख्या प्रदान करेगा, लेकिन पढ़ता है और नक्शे के लिए मुश्किल हो सकता है । विश्लेषण भाग के नीचे १०० bp पढ़ता के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है, और कम पढ़ें लंबाई उपयोग किया जाता है, तो समायोजन आवश्यक हो सकता है ।

इस प्रोटोकॉल भी आसानी से zebrafish मॉडल के अतिरिक्त उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यह पहले से ही zebrafish tailfin fibroblasts (ZTF कोशिकाओं), एक प्राथमिक कोशिका संस्कृति वयस्क zebrafish tailfin से पृथक रेखा के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है । zebrafish से अलग कोशिका प्रकार का अध्ययन करने के लिए, ट्रांसजेनिक मार्करों की पहचान करने और दाग और डीएनए सामग्री के लिए छंटाई से पहले व्यक्तिगत कोशिका प्रकार को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक संभावित रणनीति के लिए एक ट्रांसजेनिक एक फ्लोरोसेंट एक ऊतक विशिष्ट प्रमोटर से प्रेरित मार्कर व्यक्त लाइन का उपयोग होगा, और FACS छंटाई द्वारा पहले अलग कोशिकाओं के लिए, निर्धारण और डीएनए सामग्री के लिए छंटाई पीछा किया । इसके अतिरिक्त, सेल पारगंय डीएनए रंजक का उपयोग व्यक्तिगत सेल प्रकार के साथ ही G1 और एस चरण आबादी के एक साथ अलगाव के लिए अनुमति दे सकता है । इन एडेप्टर इस प्रोटोकॉल के लिए भी प्रतिकृति समय अध्ययनों में अंय में vivo मॉडल को सक्षम कर सका ।

इस प्रोटोकॉल के भविष्य के उपयोग के लिए एक रोमांचक संभावना रोग में प्रतिकृति समय की भूमिका का अध्ययन करने के लिए है । zebrafish में कई कैंसर मॉडल, कुछ सहज और अंय inducible, कि जब प्रतिकृति समय में परिवर्तन oncogenesis के दौरान हो निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह tumorigenesis और रोग प्रगति में भूमिका प्रतिकृति समय नाटकों के आकलन की अनुमति देगा । इसके अलावा, zebrafish दवा स्क्रीनिंग के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है और दवाओं है कि प्रतिकृति समय विनियमन है, जो कैंसर के इलाज में उपयोग के लिए क्षमता है को प्रभावित की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

zebrafish प्रतिकृति समय का अध्ययन करने के लिए एक होनहार नया मॉडल है । इस प्रोटोकॉल कई दूसरों के विकास और रोग में पुनरावृत्ति समय की भूमिका का अध्ययन करने में इस मॉडल का उपयोग करने का अवसर देना होगा । इस प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है vivo विकासात्मक मॉडल सिस्टम, जैसे Drosophila melanogaster और Xenopus laevis, और इन और अंय जीवों से भविष्य के निष्कर्षों के लिए तत्पर हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के जनरल चिकित्सा विज्ञान के नेशनल इंस्टीट्यूट द्वारा अनुदान 5P20GM103636 के माध्यम से समर्थित किया गया था-02 (प्रवाह Cytometry कोर समर्थन सहित) और 1R01GM121703, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वयस्क स्टेम सेल के लिए ओकलाहोमा सेंटर से पुरस्कार अनुसंधान.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific BP358-10
KCl Fisher Scientific P217-500
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
MgSO4 EMD Millipore MMX00701
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-500
Pronase Sigma 10165921001 protease solution
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma D1408
Ethanol (EtOH) KOPTEC V1016
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A9647-100G
Propidium Iodide (PI) Invitrogen P3566
Tris-HCl Fisher Scientific BP153-500
EDTA Sigma E9844
SDS Santa Cruz sc-24950
Proteinase K NEB P8107S
Phenol:Chloroform Sigma P3803-100ML
Sodium acetate J.T.Baker 3470
Glycogen Ambion AM9510
RNase A Thermo Scientific EN0531
Quanit-iT Invitrogen Q33130 Reagents for fluorescence-based DNA quantification
Covaris AFA microTUBE Covaris 520045 specialized tube for sonication
Covaris E220 Sonicator Covaris E220 focused ultrasonicator
Agilent 4200 Tapestation Agilent G2991AA automated electrophoresis machine
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582 Reagents for automated electrophoresis machine
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NEB Cat#E7370L DNA library preparation kit
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) NEB Cat#E7335S multiplex oligos for DNA library preparation kit
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) NEB Cat#E7500S additional multiplex oligos for DNA library preparation kit
NEBNext Library Quant Kit for Illumina NEB E7630L quantification kit for library preparation
Agencourt AMPure XP beads Beckman Coulter A63882 magnetic beads
Illumina HiSeq 2500 Illumina SY–401–2501 next generation DNA sequencing platform
40 µm Falcon Nylon Cell Strainer Fisher Scientific 08-771-1
VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm VWR 89107-632
6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 VWR 89078-446
Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color Denville Scientific C2170 (1001002) Dnase/Rnase free
Vortex Genie 2 Scientific Industries SI-0236
Wash Bottles VWR 16650-022 Low-Density Polyethylene, Wide Mouth
Strainer VWR 470092-440 6.9 cm, fine mesh
Corssing tank Aquaneering ZHCT100 individual breeding tank
iSpawn Techniplast N/A large breeding tank
FACSAria II BD biosciences N/A cell sorting machine
Wild M5a steromicroscope Wild Heerbrugg N/A dissecting microscope
Qubit 3 Fluorometer Thermo Scientific Q33216 quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration
Matlab Mathworks version 2017a
Matlab Statistics Toolbox Mathworks version 11.1
Matlab Curve Fitting Toolbox Mathworks version 3.5.5

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References

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डीएनए प्रतिकृति एक <em>Vivo में</em> मॉडल प्रणाली के रूप में Zebrafish का उपयोग समय की रूपरेखा
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Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Goins, D., Koren, A., Sansam, C. L. Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System. J. Vis. Exp. (134), e57146, doi:10.3791/57146 (2018).

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