Profilering DNA Replication Timing med zebrafiskar som ett In Vivo -modellsystem

Summary

Zebrafiskar användes nyligen som ett in vivo -modellsystem för att studera DNA-replikering tidpunkten under utveckling. Här är detaljerad protokollen för zebrafiskar embryon profil replikering timing. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att studera replikering timing i mutanter, enskilda celltyper, sjukdomsmodeller och andra arter.

Abstract

DNA-replikering timing är en viktig cellulär egenskap, uppvisar betydande relationer med kromatinstruktur, transkription och DNA mutation priser. Förändringar i replikering tidpunkten inträffa under utveckling och i cancer, men roll replikering timingen spelar i utveckling och sjukdom är inte känd. Zebrafiskar var nyligen etablerade som en in-vivo modellsystem studera replikering timing. Här är detaljerad protokollen för att bestämma DNA-replikering timing med zebrafiskar. Efter sortering celler från embryon och vuxen zebrafiskar, kan högupplösta genome-wide DNA replication timing mönster konstrueras genom att fastställa förändringar i DNA kopienumret genom analys av nästa generations sekvensering data. Zebrafisk modellen systemet möjliggör utvärdering av replikering timing ändringar som uppstår i vivo hela utveckling, och kan också användas för att bedöma förändringar i enskilda celltyper, sjukdomsmodeller eller muterade linjer. Dessa metoder kommer att möjliggöra studier som undersöker mekanismerna och bestämningsfaktorerna för replikering timing inrättande och underhåll under utveckling, roll replikering timingen spelar i mutationer och uppkomst, och effekterna av störande replikering timing på utveckling och sjukdom.

Introduction

För cellerna att framgångsrikt dela, måste de först noggrant och troget replikera deras hela genomet. Genomet dubbelarbete uppstår i en reproducerbar mönster, som kallas DNA-replikering timing program¹. DNA-replikering timing är korrelerad med kromatin organisation, epigenetiska märken och gene expression^2,3. Förändringar i replikering timing under hela utvecklingen och är signifikant relaterade till transkriptionell program och ändringar av kromatin märken och organisation^4,5. Dessutom replikering timing är korrelerad med mutationsanalys frekvenser, och förändringar i timing observeras i olika typer av cancer^6,7,8. Trots dessa observationer, mekanismerna och bestämningsfaktorer replikering timing etableringsrätt och förordning är fortfarande till stor del okända, och rollen den spelar i utveckling och sjukdom är obestämd. Dessutom tills nyligen genome-wide replikering hade timing förändringar som sker i hela ryggradsdjur utveckling endast undersökts i cell kultur modeller.

Zebrafisk, Danio rerio, är väl lämpade att studera replikering timing i vivo under utveckling, som en enda parning par kan ge hundratals embryon som utvecklas snabbt med många likheter med däggdjur utveckling^{9, 10}. Det finns dessutom hela zebrafiskar utveckling, förändringar till cellcykeln, kromatin organisation och transkriptionell program som delar relationer med DNA-replikering timing¹¹. Zebrafisk är också en utmärkt genetisk modell, eftersom de är särskilt mottagliga för manipulation av genmodifiering, mutagenes och riktade mutationer, och genetiska skärmar har identifierat många gener krävs för ryggradsdjur utveckling¹². Zebrafiskar kan därför användas att identifiera genernas replikering timing inrättande och underhåll och observera effekterna av avreglera replikering timing på ryggradsdjur utveckling. Transgena linjerna kan också användas för att bedöma replikering timing från enskild celltyper isolerats vid olika utvecklande tidpunkter eller i sjukdomstillstånd. Ännu viktigare, finns det olika zebrafiskar modeller av mänskliga sjukdomar som kan användas för att undersöka betydelsen av replikering timing i sjukdom bildandet och progression^9,13,14.

Nyligen, de första replikeringen timing profilerna genererades från zebrafisk, etablerade den som modellsystem studera replikering timing i vivo¹⁵. För att åstadkomma detta, samlades celler från zebrafisk embryon på flera stadier av utveckling och i en celltyp som isolerats från vuxna zebrafiskar. Cellerna var sedan sorterade efter FACS (fluorescens-aktiverad cell sortering) baserat på DNA-innehåll att isolera G1 och S fas populationer. Använda G1 provet som en kopia nummer kontroll, kopiera antal variationer i S-fas populationer fastställdes och används för att härleda relativa replikering timing¹⁶. Förändringar i replikering timing kan sedan jämföras direkt mellan olika utvecklande prover och celltyper och detta användes för att fastställa förändringar i replikering timing som förekommer i vivo hela ryggradsdjur utveckling. Denna metod erbjuder flera fördelar jämfört med andra genomisk metoder, främst att det inte krävs märkning med tymidin analoger eller immunoprecipitation DNA^4,6.

Här är detaljerad protokollen till profil genome-wide DNA replication timing på högupplösta i zebrafiskar. Dessa protokoll har använts för att fastställa förhållandena med genetiska och epigenetiska funktioner i zebrafiskar genomet, samt profilering förändringar i dessa relationer som uppstår under hela utvecklingen. Dessa protokoll är även enkelt anpassas för att studera förändringar i replikering timing i mutant stammar av zebrafisk och i sjukdomsmodeller. Dessa metoder ger dessutom en foundation som kan utökas vid att studera replikering timing i specifika celltyper, genom första sortera ut de enskilda celltyper från zebrafiskar. Zebrafiskar kan fungera som en utmärkt i vivo modellsystem studera replikering timing och slutligen avslöja de biologiska funktionerna av denna viktiga epigenetiska drag.

Protocol

Alla djur har hanterats i strikt överensstämmelse med protokoll som godkänts av Oklahoma Medical Research Foundation institutionella Animal Care och användning kommittén.

1. ställa in adult zebrafiskar för avel

1. Använd en stor kohort av vuxna manliga och kvinnliga zebrafiskar av en enda stam för avel. Det finns små skillnader i den genetiska makeupen av zebrafisk av ens en enda stam, Använd en stor kohort att säkerställa att resultaten är representativa för den genetiska variabilityen av befolkningen och inte begränsas till en liten delmängd av befolkningen.
2. Kvällen innan embryon skall samlas in, placera dussintals avel vuxna i avel tankar, Använd ungefär lika många män och kvinnor. Använd någon av följande avel strategier beroende på experimentet.
   1. Avel strategi 1: placera några manliga och kvinnliga zebrafiskar i enskilda avel tankar, separera hanarna från honorna med en avdelare. Om detta tillvägagångssätt används, setup många olika avel tankar och pool embryon från var och en att säkerställa den biologiska variationen är representativ för befolkningen.
   2. Avel strategi 2: kombinera dussintals manliga och kvinnliga zebrafiskar i en stor avel tank. Använda denna strategi så länge det finns ett tillräckligt stort antal embryon, är det rimligt att anta att de kom från en mängd av grundarna och är därför genetiskt representativa för befolkningen.

2. tidsbestämda parningar - insamling, sortering och bostäder zebrafiskar embryon för experiment

1. Utföra tidsstyrd parningar, börjar så snart ljuset cykler som på morgonen. Kassera alla embryon som genereras under natten.
2. Låt fisken att häcka i grunt vatten (3-5 cm) under en period på 10 min, med en falsk botten för embryon att fly genom.
3. Efter 10 min, samla embryon genom att hälla genom en sil och sköljning till en 10-cm platta med en tvättflaska. Pool alla embryon som samlats in vid samma tidpunkt, markera dem med tid för samling och plats omedelbart i en inkubator på 28,5 ° C.
4. Hundratals embryon kan förväntas från en enda parning par i en dag. Ge vuxna att häcka i 10 min cykler tills antalet embryon erhållits är mindre än tjugo.
5. Cirka 1-1,5 h efter insamling, sortera embryon att ta bort döda och obefruktat embryon. Om du vill sortera embryon, bort från inkubator och Observera i dissekera Mikroskop.
   1. Antal embryon och sker på en täthet av 100 embryon per 10 cm platta.
   2. Tillsätt färska E3 medium (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄) och tillbaka embryon till 28,5 ° C inkubatorn.

3. Dechorionate, deyolk och fixa zebrafiskar embryon

Obs: Denna del av protokollet är utformat för embryon före 48 h efter befruktning (hpf). Det finns ingen anledning att ta bort chorions av embryon i senare stadier av utveckling (efter 48 hpf), som de ofta naturligt ramla av. Det finns ingen anledning att deyolk eller ta bort chorions fisk äldre de 5 dagarna efter befruktning (dpf).

1. När embryon når önskad utvecklingsmässiga ålder, verifiera lämpligt utvecklingsstadium morfologiskt under ett ljusmikroskop enligt ”stadier av embryonal utveckling av the zebrafiskar”¹⁷.
2. Överför upp till 1500 stegvis embryon till en 15 mL konisk slang och tvätta flera gånger med E3.
   1. Tillsätt 1 mL E3 och 20 µL av Pronase lösning (30 mg/mL) för varje 100 embryon och snurra försiktigt. Upp till 1500 embryon kan vara dechorionated i ett enda rör med 15 mL av E3.
   2. Lägg röret på dess sida och ordna embryon i ett jämnt lager att säkerställa maximal yta volym-förhållande. Skaka försiktigt tube varje 2-3 min tills alla chorions har fallit bort av embryon. Den totala dechorionation tid varierar beroende på aktiviteten Pronase.
3. Avlägsna supernatanten och skölj försiktigt embryon 3 gånger med 10 mL E3. Placera embryon på is under återstoden av detta avsnitt i protokollet.
4. Ta bort E3 och tvätta embryon med nylagade iskall deyolking buffert (0,5 x Ginzburg fisk Ringers lösning, utan kalcium: 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 1,25 mM NaHCO₃).
   1. Tillsätt 1 mL iskallt deyolking buffert för upp till 500 embryon.
   2. Använda en P1000, försiktigt Pipettera embryon upp och ned 5 - 10 gånger att störa äggula säck.
   3. Över 1 mL till en 1,5 mL mikrofugrör och centrifugera vid 4 ° C och 500 x g under 5 minuter.
5. Ta bort supernatanten och tvätta pelleten med 1 mL iskallt 1 x PBS (fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,0) för att avlägsna laktat lösning. Centrifugera vid 4 ° C och 500 x g i 5 min.
6. Försiktigt bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 mL 1 x PBS. Placera röret på is.
7. Tillsätt 3 mL iskallt etanol (EtOH) i en 15 mL koniska rör. Vortex tub EtOH försiktigt på låg inställning.
   1. Använda en P1000, långsamt (1 droppe per sekund) DROPP zebrafiskar embryo cellsuspension till EtOH medan vortexa försiktigt.
   2. Lägga till en summa av 1 mL cellsuspension embryo, för en sista fixering lösning 75% EtOH.
8. Efter cell 1 mL har suspension lagts, försiktigt virvel tube att blanda och placera vid-20 ° C i minst 1 h. Det rekommenderas att placera rören på deras sida för att säkerställa maximal yta att volymförhållandet och minska antalet embryon och celler som håller ihop. Lagra kycklingembryo vid-20 ° C i 2-3 veckor.

4. färgning DNA och FACS sortering embryon

Obs: Denna del av protokollet är utformat för embryon på 1 dpf.

1. Ta bort EtOH-fasta embryoceller från-20 ° C och centrifugera vid 4 ° C 1500 x g i 5 min.
   1. Placera röret på is och noggrant ta bort supernatanten. Använder en P1000, försiktigt att resuspendera cellerna i 1 mL nyberedd kalla PBS-BSA (1 x PBS, 1% bovint serumalbumin).
   2. Centrifugera celler vid 4 ° C och 1500 x g i 5 min och placera på is.
2. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i propidium jodid (PI) färgning lösning (50 µg/mL PI, 100 µg/mL RNase A, PBS, pH 7,0), använda 200 µL för varje 1000 embryon.
   1. Tillåta celler att ruva i PI lösning för 30 min på isen, försiktigt blanda varje 5 min.
   2. Placera en 40 µm nylon cell SIL på en 50 mL konisk slang på is. Pipettera försiktigt celler för att blanda och filtrera genom maskan.
      Obs: Om flera rör av embryon från den samma tidpunkt samlades i avsnitt 3 i protokollet, kombinera dessa embryon på denna punkt så att de sorteras alla tillsammans.
   3. Använder lägenheten i slutet av en sprutkolven, försiktigt att störa eventuella återstående klumpar av celler på mesh.
   4. Skölj celler genom filtret med 500 µL kallt PBS-BSA för varje 1000 embryon.
   5. Placera en 40 µm mesh över en 15 mL koniska rör på is och filtrera cellsuspensionen från 50 mL koniska röret en andra gång i 15 mL röret.
3. Använda en cell lämplig sortering instrument, in laser magnetiseringen till identifiering av 561-nm och utsläpp till 610/20 att upptäcka propidium jodid.
   1. Blanda 15 mL tub av färgade celler kort av vortexa och plats i instrumentet vid 4 ° C.
   2. Kör celler på en långsamt flöde Betygsätt, helst 1,0 mL/min, för att få en ren cellcykeln profil och undvika blandning G1 eller G2/M celler med S fas befolkningen.
   3. Först, utfärda utegångsförbud för FSC-A x SSC-A (framåt scatter område av side scatter området) att avlägsna skräp (figur 1A).
      Obs: Celler från embryon kan olika storlekar beroende på scenen och cell. Neutrala densitet (ND) filtret behöva bytas mellan 1,0 och 1,5 beroende på storleken på celler som finns. Utfärda utegångsförbud för ett stort område för att samla de flesta celler och ta bort skräp.
   4. Understödja, utfärda utegångsförbud för SSC-området (SSC-A) av PI-området (PI-A), ta bort skräp och cell dubletter (figur 1B).
   5. För det tredje, utfärda utegångsförbud för SSC-A av SSC-bredd (b) ta bort alla återstående midjekort jacka i cellen (figur 1 c).
4. Visa gated befolkningarna på ett histogram med cell nummer (antal) på y-axeln och propidium jodid (PI-A) på x-axeln. För 24 hpf embryon, bör detta ge en stereotypa cellcykeln profil som i figur 1 d.
   1. Vill sortera S fas befolkningen, ställa in porten från höger sida av G1 toppen på vänster sida av G2 toppen, inklusive endast en minimal mängd av G1 och G2 befolkningarna. 24 hpf embryon, kommer detta vanligtvis omfatta ca 10-15% av gated befolkningen (se figur 1 d).
   2. Om du vill sortera G1 befolkningen, ange porten på vänster sida av G1 toppen, inte för att passera upp i toppen. Justera bredden på G1 grinden så smal som möjligt (se figur 1 d).
   3. Tillbaka gate G1 och S fas populationer att säkerställa korrekt initial Usenets (figur 1E).
5. Sortera G1 och S fas befolkningarna i 15 mL koniska rör med 3 mL i PBS-BSA. Målet bör vara att få mellan 500 000 och 1 miljon eller mer sorterade celler per fraktion (G1 och S-fas).
6. Efter sorteringen är klar, rör Centrifugera vid 1500 x g och 4 ° C i 10 min.
   Obs: Små cellpelleten kommer vara svårt att se och det är viktigt att inte störa det, så Använd helst en svängande hink rotor över en fast vinkel rotor.
7. Försiktigt bort supernatanten och återsuspendera pelleten med 1 mL 1 x PBS. Överföring celler till en 1,5 mL mikrofugrör och centrifugera vid 6000 x g och 4 ° C i 5 min.
8. Försiktigt bort all vätska från röret och frysa torra pellets vid-20 ° C. Lagra pelleten vid-20 ° C i 2-3 veckor.

5. DNA isolering, RNase behandling och DNA-rening

1. Ta bort cellpelleten från-20 ° C och placera på is.
   1. Tillsätt 400 µL av SDS buffert (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5% SDS) pellet och resuspendera.
   2. Lägg till proteinas K till en slutlig koncentration av 0,2 mg/mL och blanda genom vortexa kort.
   3. Inkubera prover vid 56 ° C i 2 h, vortex varje 15 min.
2. Efter 2 h, utföra fenol-kloroform extraktion genom att lägga till 400 µL fenol-kloroform (fenol: kloroform: isopentanol 25:24:1, mättad med 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA).
   1. Virvel för 20 s och centrifugera provet vid 16 000 x g i 5 min för att separera faserna.
   2. Ta försiktigt bort den övre vattenfasen (400 µL) och överföring till en 1,5 mL tub.
3. Utföra EtOH nederbörd genom att lägga till 40 µL 3M natriumacetat (pH 5.2), 2 µL av glykogen, och 1 mL EtOH.
   1. Vortex att blanda noggrant och placera vid-20 ° C över natten för att fälla ut DNA. Provet kan också utlösas vid-80 ° C eller på torris för 1 h.
   2. Centrifugera provet vid 4 ° C och 16 000 x g för 30 min till pellet DNA.
   3. Kassera supernatanten och tvätta pelleten med 1 mL 70% EtOH. Centrifugera vid 4 ° C och 16 000 x g i 5 min.
   4. Kassera supernatanten och lufttorka pelleten vid omgivningstemperatur för 2-3 min.
4. Lös pelleten i 96 µL av Ånghärdad vatten och tillsätt 4 µL RNase A (2 mg/mL).
   1. Blanda väl genom vortexa och inkubera vid 37 ° C i 1 h.
5. Utföra fenol-kloroform extraktion genom att lägga till 100 µL av fenol-kloroform och följande procedur i steg 5.2.1 - 5.2.2.
6. Utföra EtOH nederbörd genom att lägga till 10 µL av 3M natriumacetat, 1 µL glykogen och 250 µL EtOH och följa proceduren i steg 5.3.1 - 5.3.5.
7. Återsuspendera pelleten i 60 µL av TE buffert (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH8.0)) och bestämma DNA-koncentration med en kvantitativ fluorescens-baserad metod. Butiken DNA vid-20 ° C.
   Obs: Det är viktigt att kvantifiera DNA med hjälp av fluorescens-baserade DNA-bindning färgämnen eller andra medel som är mer tillförlitliga än UV spektrometer-baserade metoder.

6. beredning av DNA bibliotek och nästa generations sekvensering

Obs: Ett G1 kopia nummer referensprov för varje biologisk källa krävs för varje sekvensering körning (dvs WT, mutant, transgena, cellinje, etc). Jämför alla S fas prover från samma biologiska källa i samma sekvensering kör till samma G1 referens. Köra minst två biologiska replikat för varje prov att säkerställa överensstämmelse mellan prover.

1. Späd 1 µg av DNA till en slutlig volym av 50 µL och överföring till en specialiserad tube för ultraljudsbehandling.
2. Skeva genomiskt DNA för ett mål av 250-300 bp i en fokuserad ultrasonicator, enligt tillverkarens specifikationer och protokoll.
3. Kontrollera kvaliteten och storleken på klippt genomiskt DNA med hjälp av en automatiserad elektrofores maskin, enligt tillverkarens specifikationer och protokoll. Se till att det finns en stor topp på ~ 250-300 bp för klippt genomisk DNA.
4. Förbereda sekvensering bibliotek med ett DNA bibliotek förberedelser kit med multiplex oligos för sekvensering på Illumina-plattformen, enligt tillverkarens protokollet.
5. Kontrollera kvaliteten på biblioteket prep använder automatiserade elektrofores maskin, enligt tillverkarens protokollet. Se till att det finns en stor topp på ~ 400-450 bp, och det finns minimal toppar för primer dimerer (80-85 bp) och adapter dimerer (~ 120 bp).
6. Kvantifiera bibliotek med hjälp av ett DNA bibliotek kvantifiering kit för nästa generations DNA-sekvensering, enligt tillverkarens protokollet.
7. Utspädd 15 µL av biblioteket till en koncentration av 5 nM och kombinera multiplexed bibliotek som krävs för att uppnå önskad unikt kartläggning Läs räknas per prov.
   Anmärkning: Antalet unikt mappning läsningar per prov kommer att avgöra upplösningen. Använd så få som 5 miljoner mappas läser för att bedöma replikering timing för zebrafiskar genomet. Det rekommenderas att börja med 10-20 miljoner läsningar.
8. Utföra Parade-end 100 bp hela arvsmassan DNA-sekvensering av prover på en nästa generations sekvensering plattform, enligt tillverkarens instruktioner.

7. analys av sekvensering data

Obs: Instruktionerna i detta avsnitt är avsedda som riktlinjer för analys. Använda ytterligare metoder för sekvensering justering, filtrering, bearbetning, etc. Detta avsnitt av protokollet kommer att behandla den föredragna metoden för analys i detta arbete. Om ytterligare metoder används, justera parametrar och funktioner för alla dessa ändamål. Kommandona nedan anges i Ubutnu eller Mac terminal, med de lämpliga paket installerat.

1. Få de senaste versionerna av zebrafisk genomet (danRer10, från och med när detta protokoll skrevs) från UCSC genomet webbläsare med följande kommandon:
   wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz
   1. Packa upp filen fa.gz med följande kommando:
      gunzip danRer10.fa.gz
   2. Justera sekvensering data genomet använder BWA-mem med följande kommandon:
      BWA mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
2. Konvertera .sam fil till .bam fil med samtools med följande kommando:
   samtools Visa -bS input.sam > output.bam
   1. Sortera filerna justerad sekvensering med samtools med följande kommando:
      samtools sortera output.bam > output_sorted.bam
   2. Index för .bam filen med samtools med följande kommando:
      samtools index output.bam
3. Mark PCR dubbletter med Picard med följande kommandon:
   Java-Xmx2g-jar picard.jar MarkDuplicates \
   INPUT=input.BAM
   OUTPUT=output.BAM
   REMOVE_DUPLICATES = false
   METRICS_FILE=output_metrics.txt
4. Generera textfiler (.txt) av läser för varje kromosom med följande kommando:
   för jag i {1,25}; gör CHROM = ”chr” $i; ECHO $CHROM; samtools Visa input.bam $CHROM | skär -f 2,4,5,7,8,9 > readsChr$ {i} .txt; gjort
   Obs: Kolumnerna i den resulterande .txt-filen är flagga, läge, mapQ, para ihop chr, par läge och fragment storlek, respektive.
5. Läs txt-filer i Matlab (eller annan liknande programvara) med funktionen textscan.
   1. Filtrera ut låg mappning kvalitet läser genom att ange ett mapQ tröskelvärde på 30.
   2. Ta bort läsningar med flaggor för inte primära justering, PCR dubbletter eller par mappning till en annan kromosom.
   3. Filtrera bort alla läsningar med sina par över ett avstånd tröskel av 2000 bp.
   4. Utvärdera statistik av resulterande läser att avgöra antalet Läs statistik, täckning, infoga storlek och kvalitet (figur 2).
6. Bestämma Läs täckning i 100 bp fast windows för varje prov genom att räkna antalet läsningar i 100 bp mellanrum över hela längden av varje kromosom.
   1. Beräkna median-läsningar för alla fönster.
   2. Filtrera bort regioner av hög täckning genom att ta bort windows större än 5 standardavvikelser från medianen.
7. Definiera områden för analys i G1 referensprover genom att hitta segment längs varje kromosom med 200 läsningar med skjutbara fönster.
   1. Bestämma Läs djup i varje prov för S-fas genom att räkna antalet S fas läsningar i 200-Läs count windows definieras för medföljande G1 referens.
8. Slät raw-data med hjälp av csaps-funktionen i programvaran med en interpolation faktor (p) 10^-16.
9. Normalisera utjämnade data till z-poäng med ett medelvärde på 0 och standardavvikelse 1.

Representative Results

Representativa replikering timing profiler och åtgärder för kvalitetskontroll finns använder publicerade replikeringsdata timing,¹⁵. De första stegen i behandlingen involverar justera sekvensering data till genomet, beräkna Läs längd och genomet täckning statistik och filtrering av låg kvalitet, oparade, och PCR dubblerade läsningar. Läs statistik för en typisk zebrafiskar sekvensering prov visas i figur 2. Efter filtrering, Läs räknas bestäms i variabel storlek windows och data är jämnas och normaliserade. Typiska jämnas/normaliserade replikering timing profiler av en representativ zebrafiskar kromosom för biologiska replikat visas i figur 3A. Profilerna för biologiska och experimentell replikat bör vara visuellt mycket liknande (se figur 3A) och också Visa hög korrelation längs med kromosomen (figur 3B). De bör också Visa hög korrelation mellan timing värden genome-wide (figur 3 c). Autokorrelation, en metod för att bedöma mönster kontinuitet, bör användas för att utvärdera graden av struktur i datauppsättningen (figur 3D). Autokorrelation för strukturerad mogen timing program bör vara hög på korta avstånd och gradvis minska avståndet ökar. Prover som visar hög reproducerbarhet mellan biologiska och experimentell replikerar och en stark autokorrelation signal bör betraktas som hög kvalitet prover och kan kombineras för att få en högre täckning urval.

Figur 1: sortering zebrafiskar embryon för replikering timing analys. (A) Gated befolkningen av alla celler sorterade för framåt scatter område (FSC-A) av side scatter område (SSC-A). Färgerna representerar densiteten av lagerplatserna i dot tomten med hög till låg densitet representeras av färger från röd-till-grön-till-blå. (B) Gated befolkningen av FSC x SSC gated cellerna sorteras för SSC-A genom propidium jodid område (PI-A). (C) Gated befolkningen av vetenskapliga Styrkommittén x PI gated celler sorteras för SSC-A av side scatter bredd (SSC-W). (D) Histogram över alla gated populationer visar en stereotypa cellcykeln profil. Sortera grindar boxed för celler i G1 och S fas visas av den grå skuggade med svarta linjer. (E) Backgated G1 och S fas populationer visar att de inledande gating fångade flertalet celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: sekvensering läsa statistik för en typisk zebrafiskar provet. (A) Reap mappning kvalitet från statistiken av mapQ värden. (B) Histogram över fördelningen av Infoga storlekar för alla sekvensering läser. (C) Läs statistik för totalt mappade läser, läser som innehåller låg kvalitet flagga, läser med par mappning till en annan kromosom (par diff chr), läser med par bortom avstånd tröskel (avlägsna par) och PCR-dubbletter. (D) representanten numrerar av totalt kartlade, omappade och oparade läsningar, täckning, och läsa upplösning för en typisk sekvensering kör provvikt zebrafiskar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: representant zebrafiskar replikering timing resultat och åtgärder för kvalitetskontroll. (A) replikering timing längs längden av en representant kromosom för två biologiska replikat av 28 hpf embryon (Siefert, 2017). (B) korrelation mellan replikering timing värden i 2 Mb windows längs längden av en representativ kromosom för biologiska replikerar 28 hpf embryon visas i figur 3A. (C) Genome-wide korrelation mellan replikering timing värdena för biologiska (rep1 och rep2) och experimentell (rep3) replikerar 28 hpf embryon. Färgkarta representerar Pearsons korrelationskoefficient. (D) autokorrelation för ett strukturerat mogen timing program visar hög autokorrelation på nära avstånd som minskar successivt allt längre sträckor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Zebrafiskar ger en ny och unik i vivo modellsystem studera DNA replication timing. När tidsinställd parningar utförs som beskrivs i detta experimentellt protokoll, tusentals embryon kan samlas i en enda dag för experiment. Dessa embryon utvecklas synkront genom just tidsinställda och distinkt kännetecknas stadier av utveckling. Zebrafiskar kan vara enkelt och korrekt iscensatt av morfologi med ett stereomikroskop, som zebrafisk embryon utveckla externt och är optiskt klart. Detta protokoll Detaljer användningen av zebrafisk embryon att studera replikering timing i hela ryggradsdjur utveckling.

Det protokoll som kan orsaka problem bland annat säkerställer synkron utveckling av zebrafisk embryon, förlust av celler under förberedelse, FACS sortering och bibliotek förberedelse. Tidpunkten för zebrafiskar utveckling är temperaturberoende, därför användning zebrafiskar anpassas till ljus och mörker cykler och inrymt på 28,5 ° C för experiment. För att säkerställa synkron utveckling, utföra just tidsinställda parningar och samla in embryon i mycket liten tid-windows (10 min eller mindre). Det är viktigt att upprätthålla embryon på 28,5 ° C och säkerställa de tillbringa minimal tid i rumstemperatur. Tidpunkten för zebrafiskar utveckling är också starkt beroende av densiteten av embryon i ett visst område. Det är viktigt att inte huset embryon på en densitet som är högre än 100 embryon per 10 cm platta, eller de inte kommer att utvecklas ordentligt. Den optimala tiden att ta bort döda och obefruktat embryon är när de har nått 4-16 cellen scenen och kan enkelt identifieras som befruktade (Använd ”stadier av embryonal utveckling av the zebrafiskar”¹⁷ som guide). Döda embryon normalt visas som svarta bollar och obefruktat embryon som 1-cell. Arbeta så snabbt som möjligt för att minska tiden vid rumstemperatur.

När dechorionating embryon, är det viktigt att se till alla chorions tas bort från embryon. Förvara embryon i pronase lösning tills de flesta chorions har kommit. Kassera alla resterande embryon med chorions intakt eller ta bort deras chorions med pincett. Pipett embryon med en långsam och jämn rörelse. Pipettera inte snabbt som det kommer att utsätta celler för onödig stress och leda till förlust av celler. Det är också viktigt att inte använda en P200 eftersom detta kan orsaka ökad skjuvspänning som resulterar i brott på celler. Däremot kanske inte plast överföring pipett en liten nog tråka ut eller ger tillräckligt skjuvning stress för att på ett adekvat sätt störa äggula säcken och dela upp celler. Alternativa pipetter kunde användas förutsatt hålet och skjuvning skulle motsvara den optimala P1000.

När FACS sortering 28 hpf, om en stereotypa cell cykel profil erhålls inte, justera spänningen på PI laser så att G1 peak är centrerad runt 50K. Vinsterna för FSC och SSC kan också behöva justeras så att de gating och cell populationer liknande figur 1. Om det är fortfarande svårt, ND-filter bör stängas och FSC och SSC spänningar för att säkerställa flertalet celler är inom grinden. Det borde vara uppenbart huruvida det finns PI färgning, så det kommer finnas ett utbud som approximerar dubbel för den PI-A. Histogrammet bör visa två tydliga toppar, en stor topp vid 2N DNA för G1 celler och en mindre topp dubbel med intensitet för 4N DNA innehållet i G2/M celler. Om detta fortfarande inte erhålls kan antingen det låga antalet intakta celler, problem med PI färgningen, eller problem med fixering och protokollet kommer att behöva optimeras med detta.

Celler från tidiga embryon (före 10 hpf) kommer inte att ge typiska cellcykeln profiler, eftersom en hög andel av dessa celler i S-fas. Dessa prover kan behandlas som S fas prover, och jämfört med G1 referens från 24 hpf embryon. Embryon mellan 10 hpf och 24 hpf kan ge mellanliggande cellcykeln profiler och kan sorteras om så önskas. S-fas befolkningen kan också identifieras och sorterade genom att införliva tymidin analoger såsom EDU (5-Ethynyl-2'-deoxiuridin) eller BrdU (Bromdeoxiuridin) i korta pulser före fixering, detta är dock inte nödvändigt för noggrann bestämning av replikering timing.

Bibliotek preparatet bör helst inledas med 1 µg av DNA. Teoretiskt ~ 300.000 sorterade celler skulle ge ca 1 µg av DNA (uppskatta ~3.3 pg/nucleus), dock finns det alltid förlust i hela protokollet. 500 000 till 1 miljon sorterade celler bör ge mer än 1 µg av DNA. En typisk 24 hpf embryot kommer att ha cirka 18.000 celler, 10-15% som kommer att vara i S-fas. Embryon i tidigare stadier av utveckling kommer att ha betydligt mindre celler, men kommer att ha högre andelen celler i S-fas.

Utför noggranna rening och storlek urval använder magnetiska pärlor är kritisk till att eliminera oönskade element från biblioteket förberedelse. Följ tillverkarens instruktioner noggrant och ytterligare optimering kan krävas. En liten mängd av PCR-dimerer är normalt inte ett stort problem, men adaptern dimerer kommer sekvens mycket effektivt så de bör minimeras. Detta kan uppnås genom att justera den första adaptern till DNA förhållande och utför korrekt storlek urval under bibliotek beredning.

Single-end sekvensering kan också vara lämpliga för olika experimentella behov. Single-end är billigare och tillhandahåller det mesta av informationen som krävs eftersom detta tillvägagångssätt bygger på räknar läsningar; parat-slutet ger en högre förmåga att ta bort PCR och optiska dubbletter och lösa områden av repetitiva sekvenser och andra strukturella variationer (som är vanliga i zebrafiskar genomet). Analys delen nedan kommer endast behandla Parade-end sekvensering läsningar. Kortare sekvensering läsningar kan också vara lämpligt. Detta ger ett högre antal läsningar till en lägre kostnad, men läser kan vara svårare att kartlägga. Analys delen nedan är optimerad för 100 bp läsningar och justeringar kan krävas om kortare Läs längd används.

Detta protokoll kan också enkelt anpassas för ytterligare användningsområden av zebrafisk modellen. Det har redan använts för analys av zebrafisk tailfin fibroblaster (ZTF celler), en primär cell kultur linje isolerade från vuxna zebrafiskar tailfin. För att studera isolerade celltyper från zebrafisk, kan transgena markörer användas för att identifiera och isolera enskilda celltyper före färgning och sortering för DNA-innehåll. En potentiell strategi skulle vara att använda en transgena linje som uttrycker en fluorescerande markör drivs av en vävnad-specifika promotorn, och till första isolerade celler av FACS sortering, följt fixering och sortering för DNA-innehåll. Dessutom kan användningen av cell genomsläpplig DNA färgämnen för samtidiga isolering av enskilda celltyper samt G1 och S fas populationer. Dessa anpassningar till detta protokoll kan också aktivera replikering timing studier i andra in-vivo -modeller.

En spännande möjlighet för framtida användning av detta protokoll är att studera rollen av replikering timing vid sjukdom. I området i närheten finns det flera cancer-modeller i zebrafiskar, några spontana och andra inducerbara, som kan användas för att avgöra när förändringar i replikering tidpunkten inträffar under Onkogenes. Detta gör att bedömningen av roll replikering timingen spelar i uppkomst och sjukdom progression. Dessutom Sebrafisken är en utmärkt modell för drogkontroll och kan användas för att identifiera läkemedel som påverkar replikering timing förordning, som har potential för användning i behandling av cancer.

Zebrafiskar är en lovande ny modell att studera replikering timing. Detta protokoll kommer att ge många andra möjlighet att utnyttja denna modell i studerar roll för replikering timing i utveckling och sjukdom. Detta protokoll kan anpassas för användning med andra i vivo utvecklingsmässiga modellsystem, såsom Drosophila melanogaster Xenopus laevisoch ser fram emot framtida resultaten från dessa och andra organismer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
KCl	Fisher Scientific	P217-500
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
MgSO4	EMD Millipore	MMX00701
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-500
Pronase	Sigma	10165921001	protease solution
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	D1408
Ethanol (EtOH)	KOPTEC	V1016
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A9647-100G
Propidium Iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-500
EDTA	Sigma	E9844
SDS	Santa Cruz	sc-24950
Proteinase K	NEB	P8107S
Phenol:Chloroform	Sigma	P3803-100ML
Sodium acetate	J.T.Baker	3470
Glycogen	Ambion	AM9510
RNase A	Thermo Scientific	EN0531
Quanit-iT	Invitrogen	Q33130	Reagents for fluorescence-based DNA quantification
Covaris AFA microTUBE	Covaris	520045	specialized tube for sonication
Covaris E220 Sonicator	Covaris	E220	focused ultrasonicator
Agilent 4200 Tapestation	Agilent	G2991AA	automated electrophoresis machine
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582	Reagents for automated electrophoresis machine
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina	NEB	Cat#E7370L	DNA library preparation kit
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1)	NEB	Cat#E7335S	multiplex oligos for DNA library preparation kit
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2)	NEB	Cat#E7500S	additional multiplex oligos for DNA library preparation kit
NEBNext Library Quant Kit for Illumina	NEB	E7630L	quantification kit for library preparation
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63882	magnetic beads
Illumina HiSeq 2500	Illumina	SY–401–2501	next generation DNA sequencing platform
40 µm Falcon Nylon Cell Strainer	Fisher Scientific	08-771-1
VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm	VWR	89107-632
6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100	VWR	89078-446
Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color	Denville Scientific	C2170 (1001002)	Dnase/Rnase free
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Wash Bottles	VWR	16650-022	Low-Density Polyethylene, Wide Mouth
Strainer	VWR	470092-440	6.9 cm, fine mesh
Corssing tank	Aquaneering	ZHCT100	individual breeding tank
iSpawn	Techniplast	N/A	large breeding tank
FACSAria II	BD biosciences	N/A	cell sorting machine
Wild M5a steromicroscope	Wild Heerbrugg	N/A	dissecting microscope
Qubit 3 Fluorometer	Thermo Scientific	Q33216	quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration
Matlab	Mathworks	version 2017a
Matlab Statistics Toolbox	Mathworks	version 11.1
Matlab Curve Fitting Toolbox	Mathworks	version 3.5.5