Profilering DNA replikering Timing bruker sebrafisk som en In Vivo modellsystem

Summary

Sebrafisk ble sist brukt som et i vivo modellsystem for å studere DNA replikering timing under utvikling. Her er detaljert protokollene for bruker sebrafisk embryo til profil replikering timing. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for å studere replikering timing i mutanter, personlige celletyper, sykdom modeller og andre arter.

Abstract

DNA replikering timingen er en viktig mobilnettet karakteristiske, viser betydelige forbindelser med chromatin struktur, transkripsjon og DNA mutasjon priser. Endringer i replikering timing oppstå under utvikling og i kreft, men rollen replikering tidspunktet spiller i utvikling og sykdom er ikke kjent. Sebrafisk ble nylig etablert som et i vivo modellsystem å studere replikering timing. Her er detaljert protokollene for bruker sebrafisk for å avgjøre DNA replikering timing. Etter sortering celler fra embryo og voksen sebrafisk, kan høyoppløselig genomet hele DNA replikering timing mønstre konstrueres ved å bestemme DNA kopi tallet gjennom analyse av neste generasjons sekvensering data endres. Sebrafisk modell systemet tillater evaluering replikering timing endringer som oppstår i vivo gjennom utvikling, og kan også brukes til å vurdere endringer i enkelte celletyper, sykdom modeller eller mutant linjer. Disse metodene vil gjøre studier undersøke mekanismer og determinanter av replikering timing etableringen og vedlikeholdet under utvikling, rolle replikering tidspunktet spiller i mutasjoner tumorigenesis og effekten av perturbing replikering timing på utvikling og sykdom.

Introduction

For celler med hell dele, må de først nøyaktig og trofast gjenskape deres hele genom. Genomet duplisering oppstår i et gjentagende mønster, kjent som DNA replikering timing programmet¹. DNA replikering timing er korrelert med chromatin organisasjonen, epigenetic merker og gene expression^2,3. Endringer i replikering timing oppstår gjennom utvikling, og er vesentlig relatert til transcriptional programmer og endringer chromatin merker og organisasjon^4,5. Videre replikering timing er korrelert med mutational frekvenser, og endringer i timing er observert i ulike typer kreft^6,7,8. Til tross for disse observasjonene, mekanismer og determinanter av replikering timing etablering og regulering er fortsatt hovedsakelig ukjent, og rollen den spiller i utvikling og sykdom er ikke fastslått. I tillegg til nylig genomet hele replikering hadde timing endringer som skjer gjennom hele virveldyrenes utvikling bare blitt undersøkt i celle kultur modeller.

Sebrafisk, Danio rerio, er godt egnet til å studere replikering timing i vivo under utvikling, som en enkelt parring par kan gi hundrevis av embryo som utvikler raskt med mange likhetstrekk til pattedyr utvikling^{9, 10}. Videre gjennom sebrafisk utvikling er det endringer i cellen syklus, chromatin organisasjonen og transcriptional programmer deler relasjoner med DNA replikering timing¹¹. Sebrafisk er også en utmerket genetisk modell, som de er spesielt mottagelig for manipulering av transgenesis, mutagenese og målrettet mutasjoner, og genetisk skjermer har identifisert mange gener kreves for virveldyrenes utvikling¹². Sebrafisk kan derfor brukes til å identifisere tilblivelse involvert inne replikering timing etableringen og vedlikeholdet og observere effekten av deregulating replikering timing på virveldyrenes utvikling. Transgene linjer kan også brukes til å vurdere replikering timing fra personlige celletyper isolert på ulike utviklingsmessige timepoints eller sykdom forhold. Viktigere, finnes det ulike sebrafisk modeller for menneskelig sykdom som kan brukes til å undersøke hvilken rolle replikering timing i sykdom dannelse og progresjon^9,13,14.

Nylig ble første replikering timing profilene generert fra sebrafisk, etablere det som en modell å studere replikering timing i vivo¹⁵. Dette ble celler samlet fra sebrafisk embryo på flere stadier av utvikling og en celle type isolert fra voksen sebrafisk. Cellene ble deretter sortert etter FACS (fluorescens-aktivert celle sortering) basert på DNA innhold å isolere G1 og S fase bestander. Bruker G1 prøven som en kopi nummer, kopiere antall variasjoner i S fase bestander var bestemt og brukes til å antyde relative replikering timing¹⁶. Endringer i replikering timing kan deretter være direkte forhold mellom forskjellige utviklingsmessige prøver og celletyper og dette ble brukt til å angi endringer i replikering timing som oppstår i vivo gjennom virveldyrenes utvikling. Denne metoden gir flere fordeler sammenlignet med andre genomisk metoder, hovedsakelig at det ikke krever merking med thymidine analogs eller immunoprecipitation DNA^4,6.

Her er detaljert protokollene profil genomet hele DNA replikering beregner for høy oppløsning i sebrafisk. Disse protokollene har blitt brukt til å bestemme relasjoner med genomisk og epigenetic funksjoner i sebrafisk genomet, samt profilering endringer i disse forholdene som skjer gjennom hele utvikling. Disse protokollene er også tilpasset for å studere endringer i replikering timing mutant stammer av sebrafisk og sykdom modeller. I tillegg gir disse metodene et grunnlag som kan utvides ved for å studere replikering timing i spesifikke celletyper, av første sortering ut de individuelle celletyper fra sebrafisk. Sebrafisk kan tjene som et utmerket i vivo modellsystem å studere replikering timing og til slutt avslører biologiske funksjonene til denne viktige epigenetic personlighetstrekk.

Protocol

Alle dyrene ble behandlet i strengt samsvar med protokoller godkjent av Oklahoma medisinske Research Foundation institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.

1. sette opp voksen sebrafisk for formering

1. Bruk en stor kohort av voksne mannlige og kvinnelige sebrafisk enkelt belastning for formering. Det er små forskjeller i den genetiske sammensetningen av sebrafisk selv enkelt belastning, bruke en stor kohort for å sikre resultater er representative for genetisk variasjon av befolkningen og ikke begrenset til en liten del av befolkningen.
2. Natten før embryo samles, legger dusinvis av avl voksne i avl tanker, bruke omtrent lik antall menn og kvinner. Bruk en av følgende avl strategier avhengig av eksperimentet.
   1. Avl strategi 1: plasser noen mannlige og kvinnelige sebrafisk i enkelte avl tanker, skille menn fra kvinner med en skillelinje. Hvis denne tilnærmingen, setup mange forskjellige avl tanker og basseng embryoer fra hver slik biologisk variasjon er representative for befolkningen.
   2. Avl strategi 2: kombinere dusinvis av mannlige og kvinnelige sebrafisk i en stor avl tank. Bruke denne strategien så lenge det er nok mange embryoer, er det rimelig å anta at de kom fra en rekke grunnleggerne og er derfor genetisk representative for befolkningen.

2. tidsbestemt parring - innsamling, sortering og boliger sebrafisk embryo for eksperimenter

1. Utføre tidsbestemt parring, begynner så snart lyset sykluser i morgen. Forkaste alle embryoer generert over natten.
2. Tillat fisken å rase på grunt vann (3-5 cm) for en periode på 10 min, med en falsk bunn for embryoer å flykte gjennom.
3. Etter 10 min, samle embryo strømme gjennom en sil og skylling i en 10 cm plate med en. Bassenget alle embryoer samlet på samme tidspunkt, merke dem med tid på innsamling og sted umiddelbart i en inkubator på 28,5 ° C.
4. Hundrevis av embryo ventet fra ett enkelt parring par i dag. La voksne å rase i 10 min sykluser før embryo innhentet er mindre enn tjue.
5. Ca 1-1,5 timer etter samlingen, Sorter embryo fjerne døde og 5mas embryoer. Hvis du vil sortere embryo, Fjern fra inkubator og observere under dissecting mikroskop.
   1. Telle embryoer og plasser på en tetthet på 100 embryo per 10 cm plate.
   2. Legge fersk E3 medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄) og tilbake embryo til 28,5 ° C inkubator.

3. Dechorionate, deyolk og fikse sebrafisk embryo

Merk: Denne delen av protokollen er utformet for embryo før 48t innlegget befruktning (hpf). Det er ikke nødvendig å fjerne chorions av embryo ved senere stadier av utvikling (etter 48 hpf), som de ofte naturlig faller. Det er ikke nødvendig å deyolk eller fjerne chorions av fisk eldre 5 dager legge befruktning (dpf).

1. Når embryoer når ønsket utviklingsmessige alder, kontroller riktig Utviklingsstadium morphologically under lys mikroskop etter "Stadier av embryonale utvikling av the sebrafisk"¹⁷.
2. Overføre opptil 1500 trinnvis embryo slik 15-mL koniske og vaske flere ganger med E3.
   1. Legge til 1 mL av E3 og 20 µL av Pronase løsning (30 mg/mL) for hver 100 embryoer og forsiktig virvel. Opp til 1500 embryo kan dechorionated i et enkelt rør med 15 mL E3.
   2. Sette rør på høykant og ordne embryo i et jevnt lag å sikre maksimal overflaten volumkontrollen. Forsiktig agitere tube hver 2-3 min før alle chorions har falt ut av embryoene. Den totale dechorionation vil variere avhengig av Pronase aktiviteten.
3. Fjern nedbryting og forsiktig rense embryo 3 ganger med 10 mL E3. Plasser embryoer på is for resten av denne delen av protokollen.
4. Fjerne E3 og vask embryo med nylagede iskalde deyolking buffer (0.5 x Ginzburg fisk Ringer i løsning, uten kalsium: 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 1,25 mM NaHCO₃).
   1. Legg 1 mL av iskalde deyolking bufferen for opptil 500 embryoer.
   2. Bruke en P1000, forsiktig Pipetter embryo opp og ned 5 - 10 ganger å forstyrre eggeplomme sekk.
   3. Overføre 1 mL til en 1,5 mL microfuge rør og sentrifuge 4 ° C og 500 x g for 5 min.
5. Fjern supernatant og vask pellets med 1 mL av iskalde 1 x PBS (fosfat bufret saltvann, pH 7.0) fjerne Ringer i løsningen. Sentrifuger på 4 ° C og 500 x g for 5 min.
6. Nøye fjerne nedbryting og resuspend celler i 1 mL 1 x PBS. Sett røret på is.
7. Legge til 3 mL iskald etanol (EtOH) i en 15-mL konisk rør. Vortex tube EtOH forsiktig på lav innstilling.
   1. Bruker en P1000, sakte (1 dråpe per sekund) drypp sebrafisk embryoet celle suspensjon i EtOH mens vortexing forsiktig.
   2. Legge til totalt 1 mL av embryoet celle suspensjon etter en siste fiksering løsning 75% EtOH.
8. Etter 1 mL av cellen er suspensjon lagt, forsiktig virvel tube å blande og plassere på-20 ° C i minst 1 time. Det anbefales å plassere rør på sin side å sikre maksimal overflaten volumkontrollen og redusere antall embryoer og celler som holde sammen. Lagre fosteret cellene på 20 ° C for 2-3 uker.

4. farging DNA og FACS sortering embryo

Merk: Denne delen av protokollen er utformet for embryoer på 1 dpf.

1. Fjerne EtOH-fast fosteret cellene fra 20 ° C og sentrifuge 4 ° C 1500 x g for 5 min.
   1. Sett røret på is og nøye fjerne nedbryting. Bruker en P1000, forsiktig resuspend celler i 1 mL av nylagde kaldt PBS-BSA (1 x PBS, 1% bovin serum albumin).
   2. Sentrifuge cellene på 4 ° C og 1500 x g i 5 min og sted på is.
2. Fjern nedbryting og resuspend celler i propidium iodide (PI) flekk løsning (50 µg/mL PI, 100 µg/mL RNase A, PBS, pH 7.0), bruker 200 µL for hver 1000 embryoer.
   1. Lar celler å ruge i PI løsning for 30 min på is, miksing forsiktig hver 5 min.
   2. Plass en 40 µm nylon celle sil på en 50-mL konisk rør på is. Pipetter forsiktig celler for å mikse og filtrere gjennom nettet.
      Merk: Hvis flere rør av embryoer fra den samme timepoint ble samlet i del 3 av protokollen, kombinere disse Foster på dette punktet slik at de sorteres alle sammen.
   3. Bruker flat i slutten av en sprøytestempelet, forsiktig avbryte alle gjenværende klumper av celler på nettet.
   4. Skyll celler gjennom filteret med 500 µL av kaldt PBS-BSA for hver 1000 embryoer.
   5. Plasser en 40-µm mesh over et 15-mL konisk rør på is og filtrere celle suspensjon fra 50-mL konisk røret en gang i 15-mL tube.
3. Bruker en aktuelle cellen sortering instrument, angi laser magnetisering gjenkjenning 561-nm og utslipp til 610/20 å oppdage propidium iodide.
   1. Mix-15 mL tube av farget celler kort av vortexing og sted i instrument på 4 ° C.
   2. Kjøre cellene på en langsom flow rate, ideelt 1,0 mL/min, for å få en ren celle syklus profil og unngå blande G1 eller G2/M celler med S fase befolkningen.
   3. Først gate for FSC-A x SSC-en (fremover scatter område av siden XY) å fjerne rusk (figur 1A).
      Merk: Celler fra embryoene kan være varierende størrelser avhengig scenen og celle. Nøytralfilter (ND) må være slått mellom 1.0 og 1.5 avhengig av celler. Gate et stort område for å samle de fleste celler og fjerne rusk.
   4. Andre, porten for SSC-området (SSC-A) av PI-området (PI-A), fjerne rusk og celle doublets (figur 1B).
   5. Tredje gate for SSC-A av SSC-B (bredde) å fjerne eventuelle gjenværende celle doublets (figur 1 c).
4. Vise gated befolkningen på et histogram med celle nummer (antall) på y-aksen og propidium iodide området (PI-A) på x-aksen. For 24 hpf embryoer, bør dette gi en stereotype celle syklus profil som i figur 1 d.
   1. Vil sortere befolkningen S fase, setter du porten fra høyre side av G1 toppen til venstre side av G2 toppen, inkludert bare en minimal mengde G1 og G2 befolkningen. For 24 hpf embryo, vil dette vanligvis utgjør ca 10-15% av befolkningen gated (se figur 1 d).
   2. Vil sortere befolkningen G1, angi porten på venstre side av G1 toppen, ikke å passere på toppen av fjellet. Justere bredden på G1 porten så smale som mulig (se figur 1 d).
   3. Tilbake gate G1 og S fase bestander å sikre riktig første gating (figur 1E).
5. Sorter G1 og S fase bestander i 15 mL konisk rør med 3 mL av PBS-BSA. Målet bør være å få mellom 500.000 og 1 million eller mer sorterte celler per brøkdel (G1 og S fase).
6. Etter sortering er fullført, rør sentrifuge på 1500 x g og 4 ° C i 10 min.
   Merk: Småcellet pellet vil være vanskelig å se, og det er viktig å unngå å forstyrre det, så bruk helst en svingende bøtte rotor over en bestemt vinkel rotor.
7. Nøye fjerne nedbryting og resuspend pellets med 1 mL 1 x PBS. Overføre cellene til en 1,5 mL microfuge rør og sentrifuge 6000 x g og 4 ° C for 5 min.
8. Nøye fjerne all væsken fra rør og fryse tørr pellet på 20 ° C. Lagre pellet på 20 ° C for 2-3 uker.

5. DNA isolasjon, RNase behandling og DNA rensing

1. Fjerne celle pellet fra 20 ° C og sted på is.
   1. Legge til 400 µL SDS bufferen (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5% SDS) pellets og resuspend.
   2. Legg proteinasen K til en siste konsentrasjon av 0,2 mg/mL og bland med vortexing kort.
   3. Inkuber eksempler på 56 ° C i 2 h, vortex hvert 15 min.
2. Etter 2 timer utføre fenol-kloroform utvinning ved å legge til 400 µL av fenol-kloroform (fenol: kloroform: Isoamyl alkohol 25:24:1, mettet med 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA).
   1. Vortex 20 s og sentrifuger eksempel 16.000 x g i 5 min å skille faser.
   2. Nøye fjerne øvre vandige fasen (400 µL) og overføring til en 1,5 mL tube.
3. Utføre EtOH nedbør ved å legge til 40 µL av 3M natrium acetate (pH 5.2), 2 µL av glykogen og 1 mL av EtOH.
   1. Vortex bland godt og plassere på 20 ° C over natten til å fremkalle DNA. Prøven kan også være igangsatte-80 ° C eller tørris 1t.
   2. Sentrifuger eksempel på 4 ° C og 16000 x g i 30 minutter til pellet DNA.
   3. Kast supernatant og vask pellets med 1 mL 70% EtOH. Sentrifuger på 4 ° C og 16000 x g for 5 min.
   4. Kaste supernatant og air-dry pellets ved omgivelsestemperatur for 2-3 minutter.
4. Oppløse pellet i 96 µL autoklaveres vann, og Legg 4 µL av RNase A (2 mg/mL).
   1. Bland godt vortexing og ruge ved 37 ° C i 1 time.
5. Utføre fenol-kloroform utvinning ved å legge til 100 µL av fenol-kloroform og fremgangsmåten i trinn 5.2.1 Oppgi - 5.2.2.
6. Utføre EtOH nedbør ved å legge 10 µL av 3M natrium acetate, 1 µL glykogen og 250 µL EtOH og følge fremgangsmåten i trinn 5.3.1 - 5.3.5.
7. Resuspend pellets i 60 µL av TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH8.0)) og bestemme DNA konsentrasjonen med en kvantitativ fluorescens-basert metode. Store DNA på 20 ° C.
   Merk: Det er viktig å kvantifisere DNA fluorescens-basert DNA bindende fargestoffer eller annen måte mer pålitelig enn UV spectrometer-baserte metoder.

6. forberedelse av DNA biblioteker og neste generasjons sekvensering

Merk: En G1 kopi nummer referanse prøve for hver biologiske kilde kreves for hver sekvensering kjøring (dvs. WT, mutant transgene, cellen linje, etc). Sammenlign alle S fase prøver fra samme biologiske kilde i den samme sekvensering kjøre til samme G1 referansen. Kjøre minst to biologiske gjenskapninger av hver prøve å sikre konsekvens mellom eksempler.

1. Fortynne 1 µg DNA til et siste volum av 50 µL og overføre til en spesialisert rør for sonication.
2. Skråstille genomisk DNA for et mål av 250-300 bp i en fokusert ultrasonicator, i henhold til produsentens spesifikasjoner og protokollen.
3. Kontrollere kvaliteten og størrelsen på skråstilte genomisk DNA ved å bruke en automatisert geleelektroforese maskin, i henhold til produsentens spesifikasjoner og protokollen. Sikre det er en stor topp ~ 250-300 bp for skråstilte genomisk DNA.
4. Forberede sekvensering biblioteker bruker en DNA biblioteket forberedelse kit med multiplex oligos for sekvensering på Illumina plattform, ifølge produsenten protokollen.
5. Kontroller kvalitet biblioteket prep ved hjelp av automatisert geleelektroforese maskin, ifølge produsenten protokollen. Sikre det er en stor topp i ~ 400-450 bp, og det er minimal topper primer dimers (80-85 bp) og kortet dimers (~ 120 bp).
6. Kvantifisere biblioteker bruker en DNA biblioteket kvantifisering kit for neste generasjons DNA sekvensering, ifølge produsenten protokollen.
7. Fortynne 15 µL av biblioteket til en konsentrasjon av 5 nM og kombinere multiplekset biblioteker som kreves for å oppnå ønsket unikt kartlegging lese teller per prøve.
   Merk: Antall unikt kartlegging leser per eksempel bestemmer oppløsningen. Bruk så lite som 5 millioner tilordnet leser for å vurdere replikering tidspunktet for sebrafisk genomet. Det anbefales å starte med 10-20 millioner leser.
8. Utføre sammen-end 100 bp hele genomet DNA sekvensering av eksempler på en neste generasjons sekvensering plattform, i henhold til produsentens instruksjoner.

7. analyse av sekvensering data

Merk: Instruksjonene i dette avsnittet er ment som en retningslinje for analyse. Bruke flere metoder for sekvensering justering, filtrering, behandling, etc. Denne delen av protokollen vil håndtere den foretrukne metoden for analyse i dette arbeidet. Hvis flere metoder brukes, justere parametere og funksjoner for disse formålene. Kommandoene nedenfor angis i Ubutnu eller Mac terminal, med de riktige pakkene installert.

1. Få de nyeste versjonene av sebrafisk genomet (danRer10, som når denne protokollen ble skrevet) fra UCSC genomet kikker benytter følgende kommandoer:
   wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz
   1. Dekomprimere filen fa.gz med følgende kommando:
      gunzip danRer10.fa.gz
   2. Justere sekvensering data til genomet bruker BWA-mem ved hjelp av følgende kommandoer:
      BWA mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
2. Konvertere Sam arkiv å .bam arkiv benytter samtools med følgende kommando:
   samtools Vis -bS input.sam > output.bam
   1. Sorter justert sekvensering filene ved å bruke samtools med følgende kommando:
      samtools sortere output.bam > output_sorted.bam
   2. Indeksere filen .bam med samtools med følgende kommando:
      samtools indeks output.bam
3. Mark PCR duplikater med Picard ved hjelp av følgende kommandoer:
   Java-Xmx2g-jar picard.jar MarkDuplicates \
   INPUT=input.Bam
   OUTPUT=output.Bam
   REMOVE_DUPLICATES = false
   METRICS_FILE=output_metrics.txt
4. Generere tekstfiler (txt) av leser for hver kromosom bruke følgende kommando:
   for i {1,25}. gjøre CHROM = "chr" $i; ekko $CHROM; samtools vise input.bam $CHROM | Cut -f 2,4,5,7,8,9 > readsChr$ {i} txt; gjort
   Merk: Kolonnene i txt filen er flagget, sted, mapQ, par chr, par sted og fragment størrelse, henholdsvis.
5. Les txt-filer i Matlab (eller andre lignende programvare) funksjonen tekster.
   1. Filtrere ut tilordning av lav kvalitet lyder ved å sette en mapQ terskel for 30.
   2. Fjerne leser med flagg for ikke-primære justering, PCR duplikater eller par tilordning til en annen kromosom.
   3. Filtrere ut noen leser med deres par utover en avstand terskel 2000 bp.
   4. Evaluere statistikk av resulterende antall lese statistikk, dekning, sett inn størrelse og kvalitet (figur 2).
6. Bestemme Les dekning i 100 bp fast Vinduer for hver prøve ved å telle antall leser i 100 bp intervaller over lengden på hver kromosom.
   1. Beregne medianen lese teller alle vinduer.
   2. Filtrere ut områder av høy dekning ved å fjerne windows større enn 5 standard avvik fra median.
7. Definere områder for analyse i G1 referanse utvalgene av finne segmenter langs hver kromosom med 200 leser bruker skyvevinduene.
   1. Bestemme Les dybden i hver S fase prøve ved å telle antall S fase leser i vinduene antall 200-leste definert for tilhørende G1 referansen.
8. Glatt rådata funksjonen csaps i programvaren med en interpolering faktor (p) på 10^-16.
9. Normalisere utjevnet data z-skåre med et gjennomsnitt på 0 og standardavvik på 1.

Representative Results

Bruker publiserte replikering tidsmålingsdata, leveres representant replikering timing profiler og kvalitet kontrolltiltak¹⁵. De første stegene behandling innebærer justere sekvensering dataene til Genova, Les lengde og genom dekning statistikk og filtrere lav kvalitet, unpaired, og PCR like leser. Lese statistikk for en typisk sebrafisk sekvensering prøve er vist i figur 2. Etter filtrering, lese teller fastsettes i variabel størrelse windows og dataene pusses og normalisert. Typisk glattet/normalisert replikering timing profiler av et representativt sebrafisk kromosom for biologiske gjentak vises i figur 3A. Profilene for biologiske og eksperimentelle gjentak bør være visuelt ligner (se figur 3A) og også vise høy korrelasjon langs kromosomet (figur 3B). De bør også vise høy korrelasjon mellom tidspunktet verdier genomet-wide (Figur 3 c). Autokorrelasjon, en metode for å vurdere mønster kontinuitet, skal brukes til å vurdere graden av strukturen i datasettet (figur 3D). Autokorrelasjon strukturert modne timing programmer bør være høy på korte avstander og gradvis redusere som avstanden øker. Eksempler som viser høy reproduserbarhet mellom biologiske og eksperimentelle replikerer og en sterk autokorrelasjon signal bør betraktes som høy kvalitet prøver og kan kombineres for å få en høyere dekning prøve.

Figur 1: sortering sebrafisk embryo for timing tilbakelegging. (A) Gated befolkning av alle celler sortert frem scatter området (FSC-A) ved siden xy (SSC-A). Fargene representerer tettheten av hyller i dot plottet med høy til lav tetthet representert av farger fra rød-til-green-til-blå. (B) Gated befolkningen FSC x SSC gated cellene sortert for SSC-A ved propidium iodide (PI-A). (C) Gated befolkningen i SSC x PI gated celler sortert for SSC-en side scatter bredde (SSC-W). (D) Histogram av alle gated befolkningsgrupper viser en stereotype celle syklus profil. Sorter portene boks for celler i G1 og S vises som grå skyggelagt med svarte linjer. (E) Backgated G1 og S fase bestander viser at den første gating fanget fleste cellene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: sekvensering lese statistikk for en typisk sebrafisk eksempel. (A) Reap kartlegging kvalitet fra statistikk mapQ verdier. (B) Histogram av fordelingen av sett inn størrelser for alle sekvensering leser. (C) lese statistikk for totalt tilordnet leser, leser inneholder lav kvalitet flagg, leser med par tilordning til en annen kromosom (par diff chr), leser med par utover avstanden terskelen (Fjern par) og PCR duplikater. (D) representant antall totalt tilordnet, ikke er tilordnet, og kort leser, dekning, og lese oppløsning for en typisk sekvensering kjøre i en sebrafisk utvalg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: representant sebrafisk replikering timing resultater og kvalitet kontrolltiltak. (A) replikering timing langs en representant kromosom for to biologiske gjentak av 28 hpf embryo (Siefert, 2017). (B) sammenheng mellom replikering timing verdier i 2 Mb langs en representant kromosom for biologisk gjentak av 28 hpf embryo vist i figur 3A. (C) genomet hele sammenheng mellom replikering beregner verdier for biologiske (rep1 og rep2) og eksperimentelle (rep3) gjenskapninger av 28 hpf embryoer. Farger representerer Pearsons korrelasjonskoeffisient. (D) autokorrelasjon for en strukturert modne timing program viser høy autokorrelasjon på nært hold som reduserer gradvis over stadig lengre avstander. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Sebrafisk gi et nytt og unikt i vivo modellsystem å studere DNA replikering timing. Når tidsbestemt parring utføres som beskrevet i denne eksperimentelle protokollen, tusenvis av embryo kan samles i en eneste dag for eksperimenter. Disse Foster utvikle synkront gjennom nøyaktig timet og tydelig preget stadier av utviklingen. Sebrafisk kan være enkelt og nøyaktig iscenesatt av morfologi bruker en stereomicroscope, som sebrafisk embryo utvikle eksternt og er optisk helt. Denne protokollen detaljer bruk av sebrafisk embryo å studere replikering timing gjennom virveldyrenes utvikling.

Protokollen som kan presentere problemer inkluderer sikre synkron utviklingen av sebrafisk embryoer, tap av celler under forberedelse, FACS sortering og biblioteket forberedelse. Tidspunktet for sebrafisk utvikling er temperatur avhengig, derfor bruk sebrafisk tilpasset lys/mørke sykluser og plassert på 28,5 ° C for eksperimenter. For å sikre synkron utvikling, utføre nøyaktig timet parring, og samle embryo i svært lite tid-windows (10 min eller mindre). Det er viktig å opprettholde embryoer på 28,5 ° C og sikre at de bruker minimal tid ved omgivelsestemperatur. Tidspunktet for sebrafisk utvikling er også svært avhengig av tettheten av embryo i et gitt område. Det er viktig å ikke huset embryoer på en tetthet høyere enn 100 embryo per 10 cm plate, eller de vil ikke utvikle riktig. Det optimale tidspunktet å fjerne døde og 5mas embryoer er når de har kommet til 4-16 celle scenen og kan lett identifiseres som befruktet (bruk "Stadier av embryonale utvikling av the sebrafisk"¹⁷ som guide). Død embryo vanligvis vises som svarte baller og 5mas embryo vises som 1-cellen. Arbeid så raskt som mulig å redusere tiden ved omgivelsestemperatur.

Når dechorionating embryoer, er det viktig å sikre alle chorions fjernes fra embryoene. Holde embryo i pronase løsning til de fleste chorions har kommet. Forkaste alle gjenstående embryo med chorions intakt eller fjerne deres chorions med tang. Pipetter embryo bruker en langsom og jevn bevegelse. Ikke Pipetter raskt som det vil underlagt cellene utilbørlig stress og resulterer i tap av celler. Det er også viktig ikke å bruke en P200 som dette kan føre til økt skjæring stress som resulterer i nedbrytning av celler. En plast overføring pipette har derimot ikke en liten nok bar eller gi nok skjæring stress tilstrekkelig forstyrre eggeplomme sekk og disaggregate celler. Alternative Pipetter kan brukes forutsatt bar og skjær skulle tilsvare den optimale P1000.

Når FACS sortering 28 hpf, hvis en stereotype celle syklus profil hentes ikke, justere spenningen på PI laser slik at G1 toppen er sentrert rundt 50K. Gevinster for FSC og SSC må også justeres slik at de gating og celle populasjonene lik figur 1. Hvis det er fortsatt problemer, ND filter skal byttes og FSC og SSC spenning justert for å sikre at fleste cellene er innenfor porten. Det burde være tydelig om det er PI flekker, som det vil være et område som tilnærmet dobler for PI-A. Histogrammet skal vise to klare topper, en stor peak på 2N DNA for G1 cellene og en mindre peak på dobbel intensiteten for 4N DNA innhold celleområde G2/M. Hvis dette ikke er fortsatt får det kan enten være lavt antall intakt celler, problemer med PI flekker eller problemer med fiksering og protokollen må optimaliseres tilsvarende.

Celler fra tidlig embryo (før 10 hpf) vil ikke gi typisk cellen syklus profiler, som en høy andel av disse cellene er i S fase. Disse prøvene kan være behandlet som S fase prøver, og sammenlignet med en G1 referanse fra 24 hpf embryoer. Embryo mellom 10 hpf og 24 hpf kan gi mellomliggende celle syklus profiler og kan sorteres hvis ønskelig. S-fase befolkningen kan også identifisert og sortert etter omfatter thymidine analogs som EDU (5-Ethynyl-2-deoxyuridine) eller BrdU (Bromodeoxyuridine) i korte pulser før fiksering, men dette er ikke nødvendig for nøyaktig bestemmelse av replikering timing.

Ideelt bør biblioteket utarbeidelse startes med 1 µg DNA. Teoretisk ~ 300.000 sorterte celler vil gi ca 1 µg DNA (estimere ~3.3 pg/kjernen), men det er alltid tap hele protokollen. 500 000 til 1 million sorterte celler bør gi mer enn 1 µg DNA. En typisk 24 hpf fosteret har omtrent 18.000 celler, 10-15% som vil være i S-fase. Embryo på tidligere stadier i utviklingen vil ha betydelig mindre celler, men får høyere prosentverdier celleområde i S-fase.

Nøyaktig rensing og størrelse utvalg med magnetiske perler er kritisk til å eliminere uønskede elementer fra biblioteket forberedelse. Følg produsentens instruksjoner nøye og ytterligere optimalisering kan være nødvendig. En liten mengde PCR dimers er vanligvis ikke et stort problem, men kortet dimers blinke sekvensielt svært effektivt så de bør minimaliseres. Dette kan oppnås ved å justere det opprinnelige kortet DNA forhold, og utfører nøyaktig størrelse utvalg under bibliotek forberedelse.

Single-end sekvensering kan også være passende for ulike eksperimentelle behov. Single-end er billigere og gir mest av de nødvendige opplysningene siden denne tilnærmingen er avhengig av teller leser; sammen-end gir en høyere muligheten til å fjerne PCR og optisk duplikater og løse gjentatte sekvenser og andre strukturelle varianter (som er vanlig i sebrafisk genomet). Delen analyse nedenfor vil bare håndtere sammen-end sekvensering leser. Kortere sekvensering leser kan også være riktige. Dette vil gi mange lyder til en lavere pris, men lest kan være vanskeligere å tilordne. Delen analyse nedenfor er optimalisert for 100 bp leser og justeringer kan være nødvendig hvis kortere Les lengde brukes.

Denne protokollen kan lett tilpasses for flere bruksområder av sebrafisk modell. Det er allerede brukt for analyse av sebrafisk høydepunktet fibroblaster (ZTF celler), en primær celle kultur linje isolert fra voksen sebrafisk høydepunktet. For å studere isolert celletyper fra sebrafisk, kan transgene indikatorer brukes til å identifisere og isolere personlige celletyper før farging og sortering for DNA innhold. Én potensielle strategi vil være å bruke en transgene linje uttrykke drevet av en vev-spesifikke promoter, og første merketråd fluorescerende isolert celler av FACS sortering, fulgte fiksering og sortering for DNA innhold. I tillegg kan bruken av cellen permeable DNA fargestoffer samtidige isolering enkelte celletyper samt G1 og S fase bestander. Disse tilpasninger til denne protokollen kan også aktivere replikering timing studier i andre i vivo -modeller.

En spennende mulighet for fremtidig bruk av denne protokollen er å studere rollen til replikering timing i sykdom. Det er flere kreft modeller i sebrafisk, noen spontan og andre induserbart, som kan brukes til å bestemme når endringer i replikering timing oppstår under oncogenesis. Dette vil tillate vurdering av rolle replikering tidspunktet spiller i tumorigenesis og sykdom progresjon. Videre sebrafisk er en utmerket modell for narkotikarelaterte screening og kan brukes til å identifisere medikamenter som påvirker replikering timing regulering, som har potensial for bruk i kreftbehandling.

Sebrafisk er en lovende ny modell å studere replikering timing. Denne protokollen vil gi mange andre muligheten til å utnytte denne modellen i å studere rollen til replikering timing i utvikling og sykdom. Denne protokollen kan tilpasses for bruk med andre i vivo utviklingsmessige modellsystemer, som Drosophila melanogaster Xenopus laevisog ser frem til fremtidige funn fra disse og andre organismer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
KCl	Fisher Scientific	P217-500
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
MgSO4	EMD Millipore	MMX00701
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-500
Pronase	Sigma	10165921001	protease solution
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	D1408
Ethanol (EtOH)	KOPTEC	V1016
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A9647-100G
Propidium Iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-500
EDTA	Sigma	E9844
SDS	Santa Cruz	sc-24950
Proteinase K	NEB	P8107S
Phenol:Chloroform	Sigma	P3803-100ML
Sodium acetate	J.T.Baker	3470
Glycogen	Ambion	AM9510
RNase A	Thermo Scientific	EN0531
Quanit-iT	Invitrogen	Q33130	Reagents for fluorescence-based DNA quantification
Covaris AFA microTUBE	Covaris	520045	specialized tube for sonication
Covaris E220 Sonicator	Covaris	E220	focused ultrasonicator
Agilent 4200 Tapestation	Agilent	G2991AA	automated electrophoresis machine
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582	Reagents for automated electrophoresis machine
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina	NEB	Cat#E7370L	DNA library preparation kit
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1)	NEB	Cat#E7335S	multiplex oligos for DNA library preparation kit
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2)	NEB	Cat#E7500S	additional multiplex oligos for DNA library preparation kit
NEBNext Library Quant Kit for Illumina	NEB	E7630L	quantification kit for library preparation
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63882	magnetic beads
Illumina HiSeq 2500	Illumina	SY–401–2501	next generation DNA sequencing platform
40 µm Falcon Nylon Cell Strainer	Fisher Scientific	08-771-1
VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm	VWR	89107-632
6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100	VWR	89078-446
Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color	Denville Scientific	C2170 (1001002)	Dnase/Rnase free
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Wash Bottles	VWR	16650-022	Low-Density Polyethylene, Wide Mouth
Strainer	VWR	470092-440	6.9 cm, fine mesh
Corssing tank	Aquaneering	ZHCT100	individual breeding tank
iSpawn	Techniplast	N/A	large breeding tank
FACSAria II	BD biosciences	N/A	cell sorting machine
Wild M5a steromicroscope	Wild Heerbrugg	N/A	dissecting microscope
Qubit 3 Fluorometer	Thermo Scientific	Q33216	quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration
Matlab	Mathworks	version 2017a
Matlab Statistics Toolbox	Mathworks	version 11.1
Matlab Curve Fitting Toolbox	Mathworks	version 3.5.5