Summary
Bu makalede ekosistem bitkiler ve son derece kontrollü laboratuvar koşullarında bitki-mikrop etkileşimleri sağlayan aygıtlar (EcoFABs) imalatı için detaylı iletişim kurallarını açıklar.
Abstract
Faydalı bitki-mikrop etkileşimleri düşük-girdili gıda ve biyoenerji üretimi artırmak için potansiyeli ile sürdürülebilir bir biyolojik çözüm sunuyoruz. Bu karmaşık bitki-mikrop etkileşimler bir daha iyi mekanik anlayış soruşturma bitki-toprak-mikrop etkileşimler de performans temel ekolojik çalışmalar gibi bitki üretim geliştirmek için çok önemli olacak. Burada, ekosistem imalat için ayrıntılı bir açıklama, kontrollü laboratuvar yaşam alanları (EcoFABs) içinde özel bitki-mikrop etkileşimlerin mekanik Etütler çevre oluşturmak için yaygın olarak kullanılan 3D baskı teknolojilerini kullanarak sunulur koşullar. EcoFABs iki boyutları Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonve Panicum virgatumdahil olmak üzere çeşitli bitki türleri ile mikrobiyal etkileşim incelenmesi için uygun açıklanmıştır. Bu akış yoluyla cihazlar manipülasyon kontrollü ve kök microbiomes, kök kimya örnekleme yanı sıra için kök morfoloji ve mikrobiyal yerelleştirme görüntüleme izin. Bu iletişim kuralı steril koşullar içinde EcoFABs Bakımı ve EcoFABs üzerine bağımsız LED ışık sistemleri montaj ayrıntıları içerir. Medya, toprak, dahil olmak üzere farklı formları eklenmesi için detaylı yöntemleri kum ve sıvı büyüme medya Imaging'i kullanma bu sistemler karakterizasyonu birleştiğinde ve metabolomics açıklanmıştır. Birlikte, bu sistemlerin bitki ve bitki-mikrobiyal konsorsiyumlar izleme bitki büyüme, kök Morfoloji, çıktı kompozisyon, microbiome kompozisyon (dahil mutantlar), manipülasyon dahil olmak üzere dinamik ve detaylı incelenmesi etkinleştirmek ve mikrobiyal yerelleştirme kontrollü çevresel şartlar altında. Biz bu ayrıntılı iletişim kuralları ideal bitki-mikrop etkileşimleri soruşturma için deneysel standartlaştırılmış sistemleri oluşturmak yardımcı diğer araştırmacılar için önemli bir başlangıç noktası olarak hizmet verecek tahmin.
Introduction
Uygulama yararlı bitki mikroplar tarımda sürdürülebilir gıda ve büyüyen nüfus1,2,3,4için sağlamak için biyoyakıt üretimi artırmak için büyük bir potansiyel sunmaktadır. Önemli miktarda iş bitki microbiomes önemini bitki besin alımı, tolerans vurguluyor ve direnç hastalık5,6,7,8destekler. Ancak, bu mekanizmalar karmaşıklığı ve ilişkili irreproducibility ve tam microbiome kompozisyon ve genetik kontrolü için yetersizlik nedeniyle alan ekosistemlerinin bitki-mikrop etkileşimlerin araştırmak zordur (örn., kullanma mikrobiyal mutantlar)4,9,10.
Bir strateji tarafından kontrol, daha fazla alan10',11test edilebilir anlayışlar oluşturmak için bitki-mikrop etkileşimleri soruşturma çoğaltılmış laboratuvar deneyleri etkinleştirmek için Basitleştirilmiş model ekosistemler oluşturmaktır, 12. Bu kavram geleneksel yaklaşımlar toprak dolu kaplarda yetiştirilen bitkiler kullanarak veya agar plaka seralar veya KULUÇKA13içinde oluşturur. Bunlar büyük olasılıkla kalacak olmasına rağmen en yaygın kullanılan yaklaşımlar, onlar tam olarak izlemek ve bitki büyüme ortamlarda işlemek için yetenek eksikliği. Bu biter, rhizoboxes ve rhizotrons önemli bir gelişme zemin altındaki işlemler14,15çalışma yeteneğini gösterir ve ilk protokolleri rizosferde metabolitleri toprak16analiz etmek için yayınlandı. Daha yakın zamanlarda, yüksek üretilen iş analizi etkinleştirmek için gelişmiş mikrosıvısal aygıtları13,17 gibi bitki çip18,19, RootArray20ve RootChip21,-si olmak be bitki fenotipleme ile sıvı akışı orta küçük model bitki Arabidopsis thaliana erken büyüme dönemlerinde izlenecek mikrometre ölçekli Uzaysal çözünürlük için verimli araçlar olarak geliştirilmiştir. Son zamanlarda, bir iki katlı görüntüleme platformu sağlayan Arabidopsis thaliana kök saç görüntüleme fide aşamasında bir mikrosıvısal platformu22ile tanımlanmıştır.
Bitki mikrop etkileşimleri ve gösteri eğitimi için onlar çeşitli eğitim için kullanılabilir Arabidopsis thaliana, Brachypodium da dahil olmak üzere bitkiler, burada, kontrollü laboratuvar aygıtları (EcoFABs) oluşturmak için ayrıntılı iletişim kuralları sağlanır distachyon23, ekolojik önemli yabani yulaf Avena barbata ve biyoenerji kırpma Panicum virgatum (switchgrass). EcoFAB iki birincil bileşenleri içeren bir platformdur steril bitki büyüme: EcoFAB aygıt ve bitki ölçekli steril şeffaf kapsayıcı. Bir 3D Baskılı Plastik kalıp üretim süreci döküm PDMS içerir bir polydimethylsiloxane (PDMS) yapılmış aygıt EcoFAB katmanlar ve PDMS katmanları daha önce yöntemlerle mikroskop slayta bağ24,25 bildirdi . Cihaz imalat, sterilizasyon, tohum çimlenmesi, fide nakli, mikrop aşı/cocultivation, numune hazırlama ve analiz, gibi EcoFAB iş akışı ayrıntılı yordamlar bu Protokolü (şekil 1) açıklanmıştır. Daha fazla değişiklikler temel iş akışı açıklanmıştır, bilgisayar kurulumu dahil olmak üzere LED grow ışıklar ve düz yüzeylerde kullanımı kontrollü. Teknikleri kök Morfoloji araştırmak için Imaging kullanımı, kökleri, mikrobiyal kolonizasyon değiştirir ve kök exudates kitle spektroskopik görüntüleme açıklanmıştır. Biz laboratuvar bitki-microbiome çalışmalar standartlaştırılması hazır malzeme yanı sıra burada anlatılan ayrıntılı protokolleri göre basit, ucuz tasarım EcoFAB platformu bir topluluk kaynak dönecek tahmin.
Protocol
Dikkat: Bu protokol tehlikeli kimyasallar, keskin nesneler, elektrikli cihazlar, sıcak nesne ve yaralanmalara neden olabilir diğer tehlikeler kullanımını içerir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE, örn., kimyasal olarak dayanıklı eldiven, koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü, uzun elbise, kapalı parmaklı ayakkabılar, vb.) giyilmelidir ve uygun güvenlik prosedürleri (güvenlik eğitimi, bir duman başlık kullanımı vs.) takip edilmelidir.
1. EcoFAB cihaz imalat: PDMS katmanları (Şekil 2 ve şekil 3) döküm
- (Tasarım dosyaları kullanılabilir. 3D baskı teknikleri kullanarak EcoFAB kalıpları oluşturmak Her kalıp üç bölümü vardır: bir döküm çerçeve, bir seçme kalıp Bankası ve Şekil 2' de gösterildiği gibi bir ekleme. Kalıp Bankası yazdırmak ve 3D plastik yazıcı kullanarak katı opak photopolymers dışına yerleştirin. En az 100 µm çözünürlük kullanmak ve döküm çerçeve Akrilonitril bütadien stiren (ABS) ile yazdırın.
- Siloxane elastomer temel 40 mL tek kullanımlık bir 1 L kap içinde Ajan kür ile karıştırın. İstenen deneme (Adım 2,1 ve 2,2) bağlı olarak, elastomer Bankası kür/ajan (5:1, 15:1, ya da 30:1) farklı oranları (v/v) kullanın. Adımları 1.3-1.8 türlü karışımları için devam edin.
Dikkat: kimyasal olarak dayanıklı eldiven, koruyucu gözlük ve diğer PPEs giymek. - Hava kabarcıkları elastomer karışım kaldırmak en az 30 dakika için bir vakum odasında konteyner yerleştirin.
- Birleştirilmiş 3B Baskılı Plastik kalıp içine (şekil 3A) karışımı dökün ve kalıp Isıtma blokta 4 h (şekil 3B) için 85 ° C'de devam et.
Dikkat: yanık önlemek için KKE giymek. - Kalıp izin serin aşağı 5 min için. Kalıp gelen Ekle dışarı yavaşça çekin (şekil 3 c) ve sonra yavaş yavaş yeni bıçak döküm kare ve onları (şekil 2B) ayırmak için PDMS (katılaşmış elastomer karışımı) arasına ekleyin.
- Kalıp döküm çerçeve (şekil 3E) dışarı PDMS ile temel tuşuna basın. Yavaşça (şekil 3F) kenarlarında kalıp tabanından PDMS katman ayırmak için bir bıçak veya diğer araçları kullanın ve sonra yavaş yavaş bu kalıp yüzeyinden (şekil 3 g) soyulmak.
- Giriş oluşturmak ve çıkış kanalları ~1.6 mm delik bir 15 ile giriş ve çıkış bağlantı noktaları için yaparak PDMS katmanlardaki künt iğne (şekil 3 H, ben) ölçmek.
Not: wide-çıkış kalıp yalnızca giriş bağlantı noktası (şekil 3 H, ben) ihtiyacı standart kalıp bir giriş ve çıkış bağlantı noktası vardır. - PDMS katmanları. kenarlarını kesme makası kullanın
Not: ≥76 mm x 51 mm dikdörtgen küçük EcoFAB cihazlar için ve ≥102 mm x 83 mm dikdörtgenler büyük EcoFAB cihazlar için kesilmiş PDMS Katmanlar olmalıdır.
2. EcoFAB cihaz imalat: kimyasal olarak PDMS Ekleme Katmanlar mikroskop slaytlar (şekil 3 ve şekil 4)
- Kalıcı olarak mikroskop slaytlar PDMS katmanlara yapıştırma
- (15:1 elastomer Ajan karışımı kür için temel yapılmış) PDMS katman ve 7.6 × 5 cm mikroskop bağ tarafında metanol ile kaydırın ve sonra darbe durulama kuru basınçlı hava veya bir ultra-saf azot silah ile.
Dikkat: Metanol zehirlidir. Bir duman mahallede çalışma ve koruyucu kaplama, eldiven ve diğer PPEs. - Mikroskop slayt ve PDMS katman bir plazma temizleyici (şekil 3Jkadar) karşı karşıya bağ yan yana yerleştirin. Bir plazma temizleyici kullanılabilir değilse, 2.2 adıma atlayın.
- Odası ve plazma temizleyici Gaz havalandırma valfi kapatmak ve vakum ve 1 dk. için odası aşağı pompa açmak.
- Plazma jeneratör gücü üzerinde ve radyo frekansı (RF) düzeyi "Merhaba" için 1 dk geçin.
- Vakum pompası ve plazma güç devre dışı bırakmak ve atmosfer odasına delik.
- Mikroskop slayt ve PDMS katman plazma odasından alıp hızlı bir şekilde tüm dört kenarları düz baskı (şekil 3 L) ile slayda PDMS tabakasının tuşuna basın. Merkezi oval bölge PDMS tabakasının (kök odası) slayt dokunmatik değil emin olun.
- Kapalı EcoFAB aygıt 120 ° C Blok için mikroskop slayt PDMS katman arasındaki kalıcı bağ güvenliğini daha da artırmak 20 dk Isıtma yerleştirin.
- Cihazın izin için 5 dk. Trim ilave kenarları kapalı bir bıçakla PDMS tabakasının soğumasını.
- (15:1 elastomer Ajan karışımı kür için temel yapılmış) PDMS katman ve 7.6 × 5 cm mikroskop bağ tarafında metanol ile kaydırın ve sonra darbe durulama kuru basınçlı hava veya bir ultra-saf azot silah ile.
- Mikroskop slaytlar PDMS katmanlara tersinir fiziksel mühürleme
- Mühürleme tekniği tersinir bir dizi özel kelepçeler (basılı bir 3D plastik yazıcı veya içinde işlenmiş metal, çizimler ya da şekil 4' te gösterilir) kullanır.
- Şalter içine mikroskop slayt alt kelepçe tabağa yerleştirin ve sonra slayt üstünde tepe-in (5:1 elastomer tabanının Ajan karışımı kür için yapılan) PDMS katmanı hizalamak.
- Üst kelepçe plaka üzerinde PDMS katman yer. Birlikte dört onaltılı cap vidalar, böylece fındık üzerinde kelepçe üstten dişli vidalar yönlendirme kullanarak üst ve alt plaka güvenli.
- Mikroskop slaytlara doğrudan yapışan PDMS
- (Bir 30:1 elastomer taban Ajan karışımı kür için yapılan) PDMS katman bir mikroskop slayt üzerine getirin.
- Slayt PDMS katmana tuşuna basın. Yumuşak, çok yapışkan PDMS katman (30:1) bir kelepçe (şekil 3 L) kalıcı kimyasal bağ veya fiziksel basın olmadan su geçirmez kapağı oluşturma slayt için devam etmelisin.
- Mühürleme tekniği tersinir bir dizi özel kelepçeler (basılı bir 3D plastik yazıcı veya içinde işlenmiş metal, çizimler ya da şekil 4' te gösterilir) kullanır.
3. EcoFABs sterilizasyon
- EcoFAB cihazlar ultrasaf su ile durulayın.
- Bir EcoFAB aygıt bir EcoFAB kapsayıcısına getirin ve cihazın batık kadar % 70 etanol ekleyin. Konteyner kapağı kapatın ve içinde yüzeylerin etanol ile ıslak için hafifçe sallayın. Havasız bubbles veya aygıtı ile etanol ile çok az girilir EcoFAB kök büyüme odası emin olun.
- Oda sıcaklığında 30 dk kuluçka sonra % 70 etanol dökün ve % 100 etanol ile kuluçka 5 min için yineleyin.
- Etanol drenaj ve tamamen kurumasını sterilize EcoFAB laminar akış başlıklı 16 h için kuluçkaya. Varsa, sistem üzerinde UV ışık mahalle için 1S içinde çevirerek sterilize.
Uyarı: uygun KKE UV ışık ile çalışırken giyiyorum. - Steril EcoFABs steril bir başlık veya ileride kullanmak için autoclaved çanta saklayın.
4. EcoFABs LED ışıklar (şekil 5) büyümek
- LED bağlama EcoFAB konteynırları şeritler
- Mekanlar için 9 LED kırpmak EcoFAB kapsayıcısındaki dışarı işareti. İlk klibi alt kapsayıcı bir kenarı (şekil 5A) boyunca yukarı 120 mm ile başlayın ve küçük mekanlar konteyner, çevresinde bir sarmal içinde dışarı 10 mm bırakarak her sonraki klip ile işaretlemek için devam edin. İki kez kapsayıcı sarmak 1 m LED şerit sağlar bir sarmal 9 klip.
- Sıcak tutkal bir LED klip her pozisyon yanında müptela belgili tanımlık kırpmak montaj delikleri pozisyonla uyumlu konteyner, üzerine sıcak tutkal iki parmak izleri işaretlenmiş. Küçük delik bu iki parmak izleri-tutkal tuşuna basın, sonra tutkal delikleri üstüne başka bir kurulamak ekleyin. 9 klipleri bir sarmal (şekil 5B) oluşana kadar tüm küçük resimler için yordamı yineleyin.
Dikkat: yanık önlemek için sıcak tutkal ile çalışırken eldiven ve diğer KKE giymek. - Konteyner içine bakan LED LED şerit bir sarmal şeklinde klipler aracılığıyla konu. Şerit iki kez daire (şekil 5C).
- LED bağlantı denetleyicisi (şekil 5 d görüntüler bir EcoFAB odası ışıklı ışıklar, denetleyici programlama ile 4.3. adımda anlatılan) güç kaynağı için şeritler.
Uyarı: Elektrik Elektrik çarpma tehlikesi: güç kaynağı teller bağlanırken takılı olduğundan emin olun.- Güç kaynağının pozitif ve negatif terminalleri (5E biçim denetleyicisi kurulumu çizim bir şematik görüntüler) 2-telli kablo kullanarak denetleyicisi "giriş: V +" ve "giriş: V-" terminallerine bağlayın.
- Negatif kurşun çıplak bir erkek çıplak kablo sonundan itibaren bir "Çıkış" Kanal denetleyicisine bağlanın.
Not: O-ebilmek çekmek ilâ beş 1 m LED şeritler böylece bu protokol için kullanılan kumanda üzerindeki beş kanal vardır. - Tüm olumlu müşteri adaylarını kablolarının (birden fazla kanal gerekiyorsa) Bağlayıcısı'nın porno versiyonunu bir sıkıştır Bağlan ve bu bağlayıcı "çıkış V +" terminale denetleyicisinin bağlayın.
- Her LED kontrol edilebilir için kendi kanal sahiptir, bu nedenle her LED şerit kablolar, kadın ucunu takın. İstenirse, ulaşmak uzatmak için kadın erkek kablosu kullanın.
- Denetleyici için istenen bir ışık-siklet üreticinin yönergelerine uygun programı,
5. EcoFABs bitki yetiştirme
- Tohum sterilizasyon ve çimlenme
Not: Tohum sterilizasyon ve tüm aşağıdaki adımları fidan ile steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekir. Aşağıda açıklanan sterilizasyon işlemi Arabidopsis thaliana, Avena barbata, Brachypodium distachyonve Panicum virgatum tohumları için uygundur. Panicum virgatum tohumları % 60 sülfürik asit sterilizasyon işlemden önce 1 h için askıya. Bu EcoFAB aygıt, başına 1-2 tohum çimlenme oranı ve çimlenme polimerlerin dikkate alınarak hazırlamak için tavsiye edilir.- % 70 etanol için 2 dk içinde tohumları ıslatın.
- Bir pipet ile etanol kaldırın ve üç kez tohum steril su ile durulayın.
- Tohum % 10 çamaşır suyu çözüm 5 min için bırakın.
- Çamaşır suyu çözümü kaldırmak ve steril su kullanarak üç kez tohum iyice yıkayın.
- Tohumları için steril su ekleyip microcentrifuge tüp 4 ° C buzdolabı için 7 gün kuluçkaya.
- Eşit %0,6 phytagel ile 0.5 Murashige & Skoog (MS) ortamdaki Tohum yaymak ve plakalarının micropore bandı ile.
- 5 mm EcoFABs (şekil 6A) aktarmak için kök uzunluğu için bitkiler büyümek. Sunulan deneyler için burada, 22 ° C büyüme odası 16 h ışık/8 s karanlık aydınlatma rejiminde geçerli ve bitkiler kuluçkaya transfer EcoFAB (2 gün Avena barbata ve Brachypodium distachyon, Arabidopsis için 7 gün önce 2-7 d thaliana ve Panicum virgatum).
- Fidan EcoFABs sıvı orta (şekil 6) ile aktarılıyor.
- Steril enjektör veya micropipette kullanarak, bir EcoFAB cihazı steril su ile kök TMMOB için üç kez temizler ve sonra kök odası faiz, örneğin 0,5 MS orta (şekil 6B, adım 5.1.6) büyüme orta ile doldurun.
- Dikkatli bir şekilde tek bir fide EcoFAB aygıt (şekil 6C) bitki rezervuar yerleştirin.
Not: Kök tam kök odası içinde su yapışmasını çekimi ile sular altında. - 3 mL steril su EcoFAB aygıt kaçınarak konteyner içine ekleyin. Bu nem artırmak ve orta buharlaşma kök odasından azaltır.
- Konteyner kapatın ve kapak micropore teyp (şekil 6D) ile mühür.
- EcoFAB bir bitki kuluçka makinesi yerleştirin veya EcoFAB aydınlatma sistemi ısı kontrollü bir ortamda (Adım 4) anılan sıraya göre bitki büyümesi için uygun kullanmaktadır. Bu çalışma için odayı 24 ° C'ye ayarla.
- Düzenli olarak büyüme medya kök büyüme odası içinde Dolum ve su kapsayıcıya Ekle için EcoFAB kontrol edin. Steril koşullarda tüm adımları gerçekleştirin.
Not: erken bitki büyüme aşamalarına ilişkin kök büyüme odası dolumu her 5-7 gün gereklidir. Daha sonra büyüme aşamaları için bir stok yenileme her 2-3 gün gereklidir. İsterseniz, bir şırınga veya pipet kök çıktı çözüm kök büyüme Odaları bir microcentrifuge tüp içine toplamak ve-80 ° C dondurucuya depolamak için kullanın; Ayrıca, görüntü bir jel Imager veya mikroskop ile kök morfolojisi.
- Fidan ile düz yüzeylerde EcoFABs aktarma
- Eğer bir mikroskop slayt (şekil 3 K, şekil 4) eklemek için özel kelepçeler kümesi kullanarak elastomer kür aracıya temel 5:1 karışımı ile fabrikasyon kök Chambers'ı kullanın veya PDMS katman 30:1 PDMS katmanları slaytlara doğrudan (açıklandığı gibi adım 2.2) kalarak Eğer Ajan karışımı kür için temel yapılmış seçin.
- 3. adımda açıklandığı gibi EcoFAB chambers, sterilize.
- Dikkatle sterilize toprak/kum kök odasına ekleyin, PDMS katman ters çevirin ve substrat kök odasına ekleyin. Herhangi bir partikül sonbahar bu yapışma azaltacaktır bu yana mikroskop slayt ile temas halinde olacak alanı üzerinde kaçının.
- Mikroskop slayt PDMS katman üzerine yerleştirin ve tüm kenarları sıkıca bastırın. Böylece/kum yok toprak açmadan su düşüyor dikkatle EcoFAB aygıtı çevir.
Not: bir 5:1 / Ajan karışımı kür için temel yapılan EcoFAB cihazlar için mühür güvenliğini sağlamak için özel bir mengene kullanın. - Sıvı orta veya EcoFAB cihazın giriş veya çıkış kanalından su akışı ve bir fide 3.3 adımda anlatıldığı gibi onun bitki rezervuar aktarın.
- Mikroplar EcoFABs ekleme
- 8 mL LB suyu ile bir kuluçka tüp bir mikrobiyal koloni aktarmak ve OD 0,5 (yaklaşık 12 h) büyür.
- Kültür çözüm 15 mL santrifüj tüpüne aktarmak ve mikroplar cips için 3000 x g, 5 min için oda sıcaklığında santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırın ve hedef EcoFAB kullanılan bitki büyüme ortamının 8 mL ekleyin. Mikroplar Pelet askıya alma ve tüp 3000 x g de 5 min için oda sıcaklığında santrifüj kapasitesi.
- 5.4.3 arasındaki adımları yineleyin. iki kez tamamen herhangi bir LB besin izlerini silmek için.
- Optik yoğunluğu yaklaşık 0,5 600 kadar bitki büyüme orta yıkanmış mikrop Pelet eklemek nm.
- EcoFAB çıkış ile kök odaya içine mikrop çözüm 20 µL ekleyin. Bu yayında kullanılan suşların bitki kökleri 2-3 gün ve başlamış Sömürgeleşme kök yüzeyleri içinde gitti.
- Chemiluminescent mühendislik, luciferase ifade ikna etmek için bitki büyüme aracı olarak uyarıcı (1 mM IPTG) eklediğinizden emin olun.
6. kök Exudates EcoFABs üzerinden metaboliti profilleme
- Metabolomics analizi numune hazırlama LC/MS için dayalı
- EcoFABs bir lyophilizer toplanan kök exudates ile microcentrifuge tüpler koymak ve tüm su tüpleri kaldırmak için lyophilizer açın.
- LC-MS sınıf metanol 300 µL her tüpün içine ekleyin ve 30 dk için solüsyon içeren temizleyicide.
Dikkat: Metanol ile çalışırken KKE giymek. - Bir santrifüj tüpleri yerleştirin ve onları 3000 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant çözümleri yeni microcentrifuge tüpler içine aktarmak ve metanol içinde vakum yoğunlaştırıcı buharlaşır.
- Metanol ile 1 mM LC-MS kendi standartlarına 150 µL her tüpün içine ekleyin ve bir 4 ° C buzdolabı 12 h için tüplerde kuluçkaya.
- 3000 x g 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant 0,22 µm filtre tüpler içine aktarın.
- Filtre tüpler santrifüj kapasitesi ve filtre uygulanmış çözümleri 2.0 mL LC/MS şişeleri ile 200 µL ekler içine aktarın.
- Şişeleri LC/MS raf içinde yerleştirin ve LC/MS otomatik örnekleyici içinde raf yüklemek.
- Veri analizi
- Metaboliti Atlas ve özel Python komut dosyaları26 erişmek veya diğer veri analiz yazılımı kullanın.
- M üzerinde dayalı metabolitleri tanımlamak /z değerleri, tutma zamanı ve bileşik parçalanma kalıpları kullanarak metaboliti standartları bir kütüphane. 27
7. EcoFABs (Şekil 7) bitki köklerinin kitle spektroskopik görüntüleme
Not: 5:1 elastomer Ajan karışımı özel kelepçeler (şekil 7A) ile tedavi için temel yapılan EcoFAB cihazları kök nanostructure başlatıcı kütle spektrometresi (Lodd) cips,28,29,30 baskı için kullanılır PDMS katmanları reversely Lodd cips yüzeylere yapıştırılmış beri.
- 1s için UV ışığıyla Lodd çip yüzey sterilize.
- Bir EcoFAB kuluçka makinesi büyüyen bir bitki ile almak ve steril bir mahallede yerleştirin.
- EcoFAB konteyner açın ve kelepçe üst plaka çıkarın.
- Bitki içinde birlikte PDMS katmanı kaldırın ve dikkatle Lodd çip (şekil 7BD, E) üzerine bitki PDMS katmanla ekleyebilirsiniz.
Not: bir kez kök Lodd çip yüzeyine dokunduğundan, bu taşınması gereken değil. Bu "kök metabolitleri bulaşması" engeller. - Kökleri tamamen Lodd yüzey temas kadar yavaşça PDMS katmanı yoluyla kökleri üzerinde bastırın. Kökleri 20 dk Lodd yüzeye çıkarma.
- Tekrar kök Lodd yüzey üzerinde hareket kaçınarak Lodd çip fabrikadan da dahil olmak üzere PDMS katman kapalı kaldırın. Bitki kelepçe için istenirse geri.
- Lodd çipi üzerine özel bir maldı plaka ve plaka maldı Spektrometre için Imaging (şekil 7C) kitle yüklemek.
- Kök metabolitleri (Şekil 7 d-G)31Lodd görüntü oluşturmak için OpenMSI programını kullanın.
Representative Results
Bir EcoFAB aygıt her EcoFAB sistemi içerir ve bir bitki şeffaf plastik konteyner ölçekli. Bir EcoFAB aygıt bitki su deposu, bir kök büyüme odası, 1.6 mm akış giriş ve standart EcoFAB device (şekil 2B & şekil 3 H) için 1,6 mm çıkış veya geniş çıkış EcoFAB aygıt (şekil 2F & şekil 3I için 10 mm çıkış vardır ). Bitki rezervuar 6 mm üst açıklıklı ve 3 mm alt açıklıklı olan bir Trapez şeklinde tasarlanmıştır ve bu tasarım sırasında sıvı enjeksiyon akım kaçağı riskini azaltır ve ayrıca bitki büyüme için yeterli alan sağlar. Kök büyüme odası ile 2 mm derinlik şekil 2C ve Egösterildiği gibi birçok model bitki kök sistemleri, uygun bir oval şekil benimser. Böylece besin çözümler EcoFAB konteyner açmadan kök büyüme odasına akabilir giriş ve çıkış kanalları bir standart EcoFAB cihazın PTFE boru ile bağlanabilir. Wide-çıkış EcoFAB aygıt büyük ölçüde çıkış akış direnci azaltır ve tercihen karmaşık kök sistemleri bitkilerden elde edilen sonra büyüyen bitkiler kalın kök sistemleri veya düzenli olarak toplama kök exudates kullanılır.
PDMS katmanları EcoFAB cihazların imalatı için döküm kalıpları tasarım yazılımı içinde oluşturulur ve sonra 3D Şekil 2 ve şekil 3' te gösterildiği gibi katı opak photopolymers basılmış. Bitkiler EcoFABs içinde doğrudan steril ortam (şekil 8A, Ek dosya 1) büyümek sağlanması uzun iş uzaktan kullanarak bir mikroskopla görülebilir. EcoFAB cihazlar ile bitkileri de daha yüksek kararlılık düşsel etkileşimlerin bitki-mikrop (8B rakam, Ek dosya 2) sağlayan bir yüksek çözünürlüklü mikroskop sahneye sığdırabilirim. Kısırlık bu ortamda korunmaz ve yüksek çözünürlüklü görüntü bu nedenle yalnızca bitiş noktası ölçümleri için uygundur.
EcoFABs bitkilerin morfolojisi, metabolizmaları ve mikrobiyal topluluklar gibi sistematik çalışmalar onların farklı büyüme aşamalarında kendi yaşam döngüsü etkinleştirmek için tasarlanmıştır. Burada, EcoFABs bitki türleri çeşitli eğitim için genel bir platform olarak incelenmiş. Şekil 8 c -E göster 7 - gün eski Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonve EcoFABs içinde büyüyen Panicum virgatum . Tüm üç bitkiler üzerinde bir ay için de EcoFAB içinde büyümeye bulundu. Hem dicot, Arabidopsis thaliana ve monocot, Brachypodium distachyon EcoFABs onların üreme dönemlerinde getiremeyip bulunmuştur.
Sistem mühürleme tersinir katı yüzeyler kullanımına izin verir (örn., toprak) EcoFABs (Adım 2.2) içinde. Yaklaşım mühürleme bu Tersinir katı yüzeyler yükleme kök büyüme odaları içine sağlar ve ayrıca belirli bölgelerde örnek topluluğu kök rhizospheres sağlar. Şekil 8F -h 14 - gün eski Brachypodium distachyon büyüyen hydroponic orta, yanı sıra kum ve toprak hydroponic orta (kum) ve su (toprak) ile desteklenmiş bir grup göster. Kök büyüme Odaları ince katı substrat katmanda aracılığıyla kök sistemleri mikroskobik görüntüleme için nüfuz için ışık sağlar.
Kök Morfoloji kayma yapılandırma ve bir bitki kök sisteminin dağılımı olarak tanımlanır ve besin veya su durumu32,33gibi çeşitli büyüme ortamlar bir temel fizyolojisi tepki olarak kabul gördü, 34. EcoFABs zaman içinde veya farklı besin koşullar altında bitki morfolojisi okuyan uygun bir yaklaşım sağlar. Şekil 9A-F Brachypodium distachyon , kök türleri Morfoloji ilk üç hafta içinde izlemek için EcoFABs kullanarak bir örnek göster. Brachypodium distachyon fide EcoFAB cihazın içine transfer oldu ve kök yapısı bir biyo-RAD jel Imager içinde bir kamera tarafından kaydedildi. Görüntü J, python ve matlab, gibi görüntü işleme programı daha fazla zaman içinde veya farklı orta ortamlar, kök türleri Morfoloji değişiklikleri ölçmek için uygulanır. Üç hafta boyunca toplam kök alan miktar erken aşamada aşamalı bir artış gösterdi (< 1 hafta) şekil 9Giçinde gösterildiği gibi üç hafta sonunda bir doğrusal büyüme trendi takip.
Bitki-mikrop etkileşimleri araştırmak için EcoFAB oluşturmak için birincil bir motivasyon olduğunu. 5.4. adımda açıklandığı gibi mikroorganizmaların kök büyüme odaları giriş kanalı aracılığıyla EcoFAB cihazların içine aktarılır. Şekil 10 gösterir, Pseudomonas simea (eski adıfluorescens) WCS417 içeren bir EcoFAB (WCS417), rhizobacteria chemiluminescent etiketlerle teşvik bir bitki büyüme bir konsantrasyon ile bitki kök sistemlerine eklendi bitki başına 106 hücre. WCS417 sinyal WCS417 mikroplar kök büyüme odalarında ayrı bir kayma dağıtımını belirtilen bir jel Imager ile tespit edilmiştir. Her iki MS sıvı ortamı ve kum katı substrat olmadan, WCS417 mikroplar tüm kök sistemleri yüzeylerin kök ipuçları (şekil 10G etkin besin üretimi nedeniyle kök ipucu alanların etrafında yoğunlaşmış mikroplar ile kolonize & H)35. Öte yandan, toprak substrat WCS417 mikroplar kök ipuçları (şekil 10ben) yerine bitki rezervuar bölgenin etrafında birikmiş. Mikrop çıkış kanalı ile eklenmiş gibi mikroplar da toprak substrat taşımak mümkün, ama kök, sıvı ortamda veya kum olmadan gözlemlediği gibi birikir yok. Bu toprak yeterli bir besin kaynağıdır ve mikrop bitki havzanın en uygun solunum koşulları için göç gösterebilir.
Metaboliti bitki kök exudates yanı sıra metaboliti alımını profil oluşturma çalışma ve bitki-mikrop etkileşimleri serbest bırakmak için kök büyüme odaları çıktı çözümlerinden toplanan çeşitli EcoFABs bitkilerde büyüme aşamalarında arasında. 6. adımda açıklandığı gibi çıktı örnekleri sonra LC-MS analiz için ayıklanır. Bu yöntemi kullanarak, bir dizi tarafından bitki exuded ve mikroplar tarafından tüketilen metabolitleri algılandı ve kök exudates ve mikroplar kolonizasyon olmadan ilgili metaboliti profilleme halen araştırılmaktadır.
Şekil 1: EcoFAB iş akışı. Bitki plaka üzerinde germinated ve mikroplar eklenebilir sterilize EcoFAB için transfer. Geri dönüşlü örnekleme: örneklenmiş ve görüntüsü kök exudates ve kök Morfoloji görüntülenir. Yıkıcı örnekleme ayrıntılı olarak analiz mikrop, kök ve sürgün parametreleri sağlar.
Şekil 2: 3D bileşenleri için EcoFAB cihaz imalat kalıplar basılmış. (A) üst ve eğik bir döküm çerçeve kez izlendi. (B) üst ve eğik sayısı INSERT. (C) Top ve bir standart kalıp tabanının eğik görünümler. (E) üst ve eğik wide-çıkış kalıp Bankası kez izlendi. (D, F) EcoFAB cihazlar, standart ve geniş çıkış sırasıyla imalatı için birleştirilmiş kalıpları. 51 mm x 34 mm için küçük EcoFAB kalıp ve 76 mm x 62 mm büyük EcoFAB kalıp için oval boyutlardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: EcoFAB cihaz imalat. (A) elastomer temel ve kür Ajan karışımı kalıba dökme. (B) 4 ekleme kalıp çıkarmadan h. (C) için 85 ° C'de karışımı ile kalıp Isıtma. (D) PDMS döküm çerçevelemek--dan ayıran. (E) kalıp döküm çerçeve dışında temel bastırıyor. (F) kenarları boyunca kalıp PDMS ayırmak için bir bıçak kullanarak. (G) yavaş yavaş kalıp üsten PDMS katman peeling. (H) Poking delik standart PDMS katmanın giriş ve çıkış kanallar için. (I) bir delik çapında çıkış PDMS katmanın giriş kanalı için alay. (J) PDMS Katmanı (15:1 elastomer Ajan karışımı kür için temel yapılmış) ve mikroskop slayt durulanır ve bir plazma temizleyici bağ için transfer. (K) kullanma mikroskop slayt (5:1 elastomer tabanının Ajan karışımı kür için yapılan) PDMS katman tutmak için kıskaç. (L) (bir 30:1 elastomer taban Ajan karışımı kür için yapılan) PDMS katman doğrudan bir mikroskop slayt basarak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: özel kelepçeler tasarımını. (A) üst ve eğik sayısı bir üst plaka kelepçe. (B) üst ve eğik sayısı bir alt plaka kelepçe. (C) Top ve birleştirilmiş kelepçe eğik sayısı dört setleri onaltılık kapak vidaları ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: yükleme LED ışıklar büyümek. (A) 9 LED klipler EcoFAB konteyner çevresinde bir sarmal içinde konumlarını dışarı işaretleme. (B) LED klipler EcoFAB kapsayıcıya bağlı. (C) bu klip ile LED şerit venden gönderiyorum. (D) LED şerit 24V güç kaynağı ile kablolu bir denetleyicisine bağlanma. (E) Tel bağlantıları denetleyicisine şematik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: Fidan EcoFABs transfer. (a) Brachypodium distachyon 2 gündür 0.5 MS plaka üzerinde yetiştirilen bitkiler. (B) kök odası ile bitki büyüme orta yerine. (C) dikkatle kök bitki rezervuar eklemek için bir cımbız kullanma. (D) micropore bantlı EcoFAB konteyner konteyner alt 3 mL su eklendikten sonra kapatılıyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: Lodd görüntüleme bitkinin kökleri EcoFABs içinde. (A) steril bir EcoFAB büyüyen bir Brachypodium distachyon . (B) bitki Lodd küçük parça için özel bir maldı plaka üzerine Lodd çipi için 20 dk. (C) kullanma bakır bant üzerine PDMS katmanla ekleyerek ve bir maldı Kütle Spektrometre yükleme. (D-G) 7 - gün eski bir Imaging Lodd için bir 20 - gün eski Brachypodium distachyon tesisleri (D, E) ve (F, G) karşılık gelen Lodd görüntüleri. Baskın iyonları kırmızı, yeşil ve mavi vurgulanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: EcoFABs genel uygulamalar. (A) doğrudan Brachypodium distachyon bir EcoFAB bir uzun iş mesafe mikroskop kurulum ile kök büyüme yakalayan. (B) doğrudan bir yüksek çözünürlüklü mikroskop kurulum ile kök-mikrop etkileşimleri gözlemleyerek. (C-E) 7 - gün eski Arabidopsis thaliana (C), Brachypodium distachyon (D) ve Panicum virgatum (E) 0.5 MS hydroponic orta, 0.5 MS suda (F), (G) kum ve toprak (H) yetiştirilen (F-H) 14 - gün eski Brachypodium distachyon alt katman 0,5 MS orta ve su ile sırasıyla birlikte. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9: kök Morfoloji çalışmaya EcoFABs kullanarak. (A-F) Brachypodium distachyon EcoFABs içinde büyüyen kök geliştirme dolu ile 0.5 MS orta ilk üç hafta içinde: (A) 2 gün, (B) 4 gün, (C) 7 gün, (D) 11 gün, (E) 14 gün, büyüme (F) 21 gün. (G) ortalama kök yüzey alanlarını ImageJ yazılım tahmin edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 10: kök-mikrop etkileşimleri çalışmaya EcoFABs kullanarak. (A, B, C) 15 - gün eski Brachypodium distachyon Pseudomonas fluorescens WCS417 medya-MS sıvı çözüm, kum ve toprak yüzeylerde farklı formları ile kolonize bir grup. (D, E, F) Kök sistemlerini parlak alan resimleri. (G, H, I) Bu kök sistemleri sonra 14 gün eş ekimi karşılık gelen chemiluminescent görüntüleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek dosya 1. Kök büyüme yakalamak için EcoFAB kullanarak. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Ek dosyası 2. Kök-mikroplar etkileşimleri yakalamak için EcoFAB kullanarak. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Discussion
İletişim kuralları oluşturmak için ekosistem imalat kullanmak için EcoFABs topluluk kaynakları için sistematik bitki Biyoloji çalışmalar son derece kontrollü laboratuvar koşullarında sağlar rapor burada. 3D baskı gelişmeler oluşturmak ve yinelemeli olarak rafine EcoFAB tasarımları yaygın olarak erişilebilen teknolojiler sağlar. Burada sunulan kök odası mikroskobu görüntüleme ve kısırlık, bitki-mikrop etkileşimleri araştırmak için mikroplar kontrollü yanı sıra etkinleştirme bakımı için de uygun olduğu bulunmuştur. EcoFAB, çeşitli bitki türleri ile uyumlu bir platformdur. Öyle ki ek deneyler doğal ortamlarda büyüyen bitkiler için bulgular genelleştirmek için gerekli dar kök odası içinde bitki yetiştirme fizyolojik etkileri tanımak önemlidir.
Dalga boyu, şiddeti ve süresi, bitki büyüme ve paralel ilgili fizyolojik parametreler de dahil olmak üzere çeşitli ışık koşullarında etkilerinin incelenmesi steril Odalar ve LED grow ışık kullanımı sağlar. Tersine çevrilebilir Bono kök odaları düz yüzeylerde de dağınık şekilde biyokimyasal ve genetik analizi için sağlam örnekler toplamak olarak kullanılmasına izin. Katı yüzeyler, toprak, kum ve kuvars boncuk, gibi uygulamaları daha ekolojik ilgili laboratuvar ekosistem oluşturmak için EcoFABs kullanarak olanaklar sunmaktadır. Ancak, burada daha fazla kullanım çoğu toprak ve doğru bir yansıması değildir doymuş sıvı (hydroponic kültürleri) için önemli olacaktır sunulan tüm sistemleri daha iyi temsil ettikleri öyle ki hava cepleri toprak içinde korumak için bu tasarımları rafine doğal toprak.
Kullanımı basit kameralar ve mikroskoplar hücresel düzeyleri için her iki toplu görüntü kök sistemi Morfoloji geliştirme için tanımlanır. Bu uygunluk izleme kök Morfoloji görüntüleme ve miktar için büyük olasılıkla bitki fizyolojik ve moleküler sinyaller bitki büyüme koşullarına genotypic adaptasyonlar tarafından tetiklenen düzenleyici mekanizmaları anlamak için yardımcı olabilir. Ancak, fizyolojik kök geliştirme eğitim için bir EcoFAB aygıt geçerli yatay yerleşimini kısıtlamadır. Doğal ortamlarda, kökleri gravitropic yanıt ağırlıklı olarak dikey bir kök sistemi gelişimine yol açar. Böylece, yatay sistem büyük olasılıkla burada sunulan bazı faktörler doğal ortamından farklıdır ve EcoFAB sistemleri imalatı, kök odasının dikey yerleşim ile gelecekteki EcoFAB sürümleri için arzu edilen bir hedeftir. Geçerli EcoFAB cihazlar yatay olarak yerleştirilir, kök Morfoloji parametreleri çeşitli koşullar veya yanıt olarak mikroplar, analizi mümkündür. Yüksek kararlılık düşsel kök kolonizasyon dinamikleri tek yalıtır veya topluluklar, hangi bitki hakkında parçalar çeşitli besin yeterli ve eksik koşullarda kolonize bilgilerinizi yakalamak için uygulanabilir. Bu tür çalışmalar nasıl bitki microbiomes monte edilir ve nasıl bu dinamikler zaman içinde değişim önemli yeni görüşler sağlayacaktır tahmin edilmektedir, örneğin kökleri olarak geliştirmek.
Görüntüleme çok genç bitkilerin mikrosıvısal aygıtları etkinleştirmek ve genellikle toplanan metabolit miktarı LCMS analiz için yeterli değildir. Rhizotrons gibi toprak tabanlı sistemler kök Morfoloji görüntüleme izin ya da bitkiler chemiluminescent yapı (Glo-kök) veya NMR tabanlı yöntemleri33,34ile dönüştürülür. Metaboliti çekimi bu sistemlerden örnekleri büyük miktarda nedeniyle zaman alıcı vardır. EcoFABs her ikisinin kombinasyonu vardır: fabrikasyon mikrosıvısal cihazlara benzerdir. EcoFABs basit ve ucuz çoğaltmak için tasarlanmıştır ancak büyüklük odası ile küçük veya büyük kök sistemleri, onların üreme aşamaları kadar bitkiler büyümek için ayarlanabilir. Kök Morfoloji değişiklikleri ve kök reaksiyon eş zamanlı gözlemler mümkündür. Belirli mikroplar kontrollü yanı sıra etkinleştirme sistem sterildir.
EcoFABs kontrollü giriş ve örnekleme mikroplar ve metabolitleri etkinleştirmek için tasarlanmıştır. Özellikle, kök büyüme odaları toplanan örnekleri kitle spektroskopik metaboliti profil oluşturma için yeterli görülmüştür. Kütle spektrometresi görüntüleme entegrasyonu (örn., burada sunulan Lodd tekniği) metaboliti kayma dağıtımları kök sistemleri eğitimi non-yıkıcı bir yaklaşım sağlar. Bu teknik-ecek beğenmek var olmak yararlı gelecekte kararlı izotop izleme deneyleri ve eşleme mikrobiyal yerelleştirme belirli metabolitleri36. Bu iletişim kuralı tek yalıtır üzerinde odaklanmıştır, aynı tasarım kesinlikle daha karmaşık toplulukları için kullanılabilir. Örnek birimleri ve biyokütle EcoFABs içinde DNA sıralama teknolojileri ile daha fazla entegrasyon için daha--dan yeterli, karakterize ve mikrobiyal toplum yapısı ve gen ifade izleme ile önemli olacağı aşikardır.
Sonuç olarak, bu iletişim kuralını bitki-mikrop etkileşimleri, kolay uygulanan ve araştırmacılar tarafından genişletilmiş basit ve erişilebilir yöntemleri üzerinde durularak incelenmesi için tasarlanmış laboratuvar ekosistemler imalatı detayları Dünya. Öyle ki her EcoFAB bağımsız olarak ışık ve sıcaklık kontrollü tekrarlanabilirlik labs ve sıcaklık kontrol sistemi entegrasyonu arasında gösteren şimdiki çabalar hedefleniyor. Sistemin daha fazla bir ilerleme otomatik örnekleme bütünleştirilmesi ve EcoFAB kök Odalar ve ilgili bitki microbiomes EcoFABs içinde kurmak için tekrarlanabilir protokolleri gelişimi dolumu olacak.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı ABD Enerji Bakanlığı Sözleşme No altında Office, bilimi tarafından desteklenen laboratuvar yönelik araştırma ve geliştirme (LDRD) programı tarafından desteklenen DE-AC02-05CH11231 ve UC Berkeley ABD enerji Office, Bilimi Bölümü bir ödülü DE-SC0014079. İş yerinde moleküler dökümhane ABD bölümü, enerji Sözleşme No altında desteklenmiştir DE-AC02-05CH11231. Biz de Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen ve Benjamin J. Cole Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı yardımları için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
| Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
| 15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
| 5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
| 3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
| 1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
| 4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
| 4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| 3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
| Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
| PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Bleach | |||
| Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
| Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
| Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
| Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
| Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
| Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
| Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
| LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
| Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
| SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
| Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
| NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
| MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
| Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
| Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
| TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
| Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
| Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
| Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
| Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
| 20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
| WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |
References
- Morrissey, J. P., Dow, J. M., Mark, G. L., O'Gara, F. Are microbes at the root of a solution to world food production. EMBO Rep. 5 (10), 922-926 (2004).
- Farrar, K., Bryant, D., Cope-Selby, N. Understanding and engineering beneficial plant-microbe interactions: plant growth promotion in energy crops. Plant Biotechnol J. 12 (9), 1193-1206 (2014).
- Singh, J. S., Abhilash, P. C., Gupta, V. K. Agriculturally Important Microbes in Sustainable Food Production. Trends Biotechnol. 34 (10), 773-775 (2016).
- Dubey, R. K., Tripathi, V., Dubey, P. K., Singh, H. B., Abhilash, P. C. Exploring rhizospheric interactions for agricultural sustainability: the need of integrative research on multi-trophic interactions. J Clean Prod. 115, 362-365 (2016).
- Hunter, P. Plant microbiomes and sustainable agriculture. EMBO Rep. 17 (12), 1696-1699 (2016).
- van der Heijden, M. G. A., Hartmann, M. Networking in the Plant Microbiome. PLoS Biol. 14 (2), e1002378 (2016).
- Vessey, J. K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant Soil. 255 (2), 571-586 (2003).
- Yang, J., Kloepper, J. W., Ryu, C. -M. Rhizosphere bacteria help plants tolerate abiotic stress. Trends Plant Sci. 14 (1), 1-4 (2009).
- Reynolds, H. L., Packer, A., Bever, J. D., Clay, K. GRASSROOTS ECOLOGY: PLANT-MICROBE-SOIL INTERACTIONS AS DRIVERS OF PLANT COMMUNITY STRUCTURE AND DYNAMICS. Ecology. 84 (9), 2281-2291 (2003).
- Finkel, O. M., Castrillo, G., Herrera Paredes, S., Salas González, I., Dangl, J. L. Understanding and exploiting plant beneficial microbes. Curr Opin Plant Biol. 38, 155-163 (2017).
- Northen, T. R., Zhang, Z., Gao, J., Swenson, T., Yoshikuni, Y. Advancing Our Understanding of the Chemistry of Soil Microbiomes. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. 2017. The Chemistry of Microbiomes: Proceedings of a Seminar Series. , The National Academies Press. Washington, DC. (2017).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLOS Biology. 15 (3), e2001793 (2017).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab Chip. 14 (17), 3262-3274 (2014).
- Oburger, E., et al. Evaluation of a novel tool for sampling root exudates from soil-grown plants compared to conventional techniques. Environ Exp Bot. 87, 235-247 (2013).
- Van Der Krift, T. A. J., Berendse, F. Root life spans of four grass species from habitats differing in nutrient availability. Funct Ecol. 16 (2), 198-203 (2002).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl. Acad. Sci. USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Sanati Nezhad, A., Naghavi, M., Packirisamy, M., Bhat, R., Geitmann, A. Quantification of cellular penetrative forces using lab-on-a-chip technology and finite element modeling. P Natl. Acad. Sci. USA. 110 (20), 8093-8098 (2013).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281-1293 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98 (26), 263703 (2011).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Aufrecht, J. A., Ryan, J. M., Hasim, S., Allison, D. P., Nebenführ, A., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (126), (2017).
- Garvin, D. F., et al. Development of Genetic and Genomic Research Resources for Brachypodium distachyon, a New Model System for Grass Crop Research. Crop Sci. 48 (Supplement_1), S69-S84 (2008).
- Lisensky, G. C., et al. Replication and Compression of Surface Structures with Polydimethylsiloxane Elastomer. J. Chem. Educ. 76 (4), 537 (1999).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Yao, Y., et al. Analysis of Metabolomics Datasets with High-Performance Computing and Metabolite Atlases. Metabolites. 5 (3), 431-442 (2015).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis Chemical Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI). Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
- Gao, J., de Raad, M., Bowen, B. P., Zuckermann, R. N., Northen, T. R. Application of Black Silicon for Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 88 (3), 1625-1630 (2016).
- Gao, J., et al. Morphology-Driven Control of Metabolite Selectivity Using Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 89 (12), 6521-6526 (2017).
- Woo, H. -K., Northen, T. R., Yanes, O., Siuzdak, G. Nanostructure-initiator mass spectrometry: a protocol for preparing and applying NIMS surfaces for high-sensitivity mass analysis. Nat. Protoc. 3 (8), 1341-1349 (2008).
- Rübel, O., et al. OpenMSI: A High-Performance Web-Based Platform for Mass Spectrometry Imaging. Anal. Chem. 85 (21), 10354-10361 (2013).
- López-Bucio, J., Cruz-Ramı́rez, A., Herrera-Estrella, L. The role of nutrient availability in regulating root architecture. Curr Opin Plant Biol. 6 (3), 280-287 (2003).
- Lynch, J. P. Steep, cheap and deep: an ideotype to optimize water and N acquisition by maize root systems. Ann. Bot. 112 (2), 347-357 (2013).
- Rellán-Álvarez, R., et al. GLO-Roots: an imaging platform enabling multidimensional characterization of soil-grown root systems. eLife. 4, e07597 (2015).
- Kamilova, F., Validov, S., Azarova, T., Mulders, I., Lugtenberg, B. Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria. Environ. Microbiol. 7 (11), 1809-1817 (2005).
- Klitgaard, A., Nielsen, J. B., Frandsen, R. J. N., Andersen, M. R., Nielsen, K. F. Combining Stable Isotope Labeling and Molecular Networking for Biosynthetic Pathway Characterization. Anal. Chem. 87 (13), 6520-6526 (2015).
