Summary
نقدم سير عمل لتجزئة والتحديد الكمي للعظام ترابيكولار لصور ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد استناداً إلى خط الحدود الخارجي للعظام باستخدام البرنامج المساعد إيماجيج. هذا النهج هو أكثر كفاءة ودقة من النهج الكنتوري اليد اليدوي الحالي، ويوفر طبقة من طبقة كوانتيفيكيشنز، التي لا تتوفر في البرامج التجارية الحالية.
Abstract
المحسوبة الدقيقة التصوير المقطعي (الصغرى-CT) يستخدم بشكل روتيني لتقييم كمية العظام وخصائص ميكروستروكتورال ترابيكولار في الحيوانات الصغيرة تحت ظروف فقدان العظام المختلفة. ومع ذلك، هو نهج موحد لتحليل ترابيكولار للصور المقطعية الصغرى شريحة بشريحة شبه التلقائي اليد-الكنتوري، وهو العمالة المكثفة، وعرضه للخطأ. ووصف هنا هو طريقة فعالة لتجزئة التلقائي من عظام trabecular وفقا للحدود الخارجية للعظام، حيث يمكن تحديد ترابيكولار العظام ومجزأة تلقائياً بدقة مع أقل تحيز المشغل عند الاقتضاء يتم تعيين المعلمات تجزئة. تعريف معلمات تجزئة مرضية، يتم عرض رصة صور لتقسيم النتائج، حيث كافة التركيبات الممكنة من المعلمات تجزئة واحدة تم تغييرها في التسلسل، ويمكن تقسيم النتائج مع معلمات مقترنة بسهولة يمكن التحقق بصريا. كميزة مراقبة الجودة للبرنامج المساعد، كمياً محاكاة كائنات القياسية حيث يمكن مقارنة بالكميات المقاسة بالقيم النظرية. طبقة بطبقة التحديد الكمي لخصائص ترابيكولار وسمك ترابيكولار بمثل هذا البرنامج المساعد، ويمكن أن يكون لمحة عن عمليات التوزيع هذه الخصائص داخل المناطق المحددة بسهولة. على الرغم من أن طبقة بطبقة القياس الكمي ليحتفظ بمزيد من المعلومات حول ترابيكولار العظام ويسهل كذلك التحليل الإحصائي للتغييرات الهيكلية، مثل هذه التدابير غير متوفرة من ناتج البرمجيات التجارية الحالية، حيث فقط واحدة يتم الإعلام عن قيمة الكمية لكل معلمة لكل عينة. ولذلك، يتم وصف مهام سير العمل أفضل نهج لتحليل ترابيكولار العظام بدقة وكفاءة.
Introduction
التحليل الجزئي-CT trabecular العظام هو نهج موحد لتعقب التغييرات الشكلية للعظام في الحيوانات الصغيرة تحت العظام المختلفة فقدان الشروط1،2،3، حيث تتصل بالعديد من المتغيرات هياكل العظام يتم الإبلاغ عنها4. ومع ذلك، هذه المعلمات لا توزع بالتساوي في ميتافيسيس من العظام الطويلة5، وذكر فقط قيمة ملخصة أو متوسط لكل متغير من متغيرات هيكلية لكل عينة من الحالية التجارية الصغرى-CT آلات6،7 ، وأن كانت قيمة واحدة لا يمكن أن تمثل تماما خصائص المعلمة المقاسة في منطقة تحليل. طبقة بطبقة التحديد الكمي للعظام ترابيكولار يحتفظ بمزيد من المعلومات لكل متغير من متغيرات، بل يتيح أيضا التنميط لعمليات التوزيع هذه المتغيرات في منطقة تحليل وتيسير التحليل الإحصائي لاحقة من الهيكلية تغييرات في ظل ظروف مختلفة5. ولذلك، والهدف من هذا الأسلوب هو التحديد الكمي للعظام ترابيكولار من الأشعة المقطعية الصغرى كل مستوى الشريحة، التي لا تتوفر في أي حزمة التحليل الجزئي-CT المتاحة تجارياً حاليا.
كفاءة الجزء trabecular العظام شريحة-من-شريحة، وأساليب التجزئة التلقائية من المستصوب. ومع ذلك، الأسلوب القياسي الحالي للتحليل الجزئي-CT يستند إلى دليل تفاعلي الكنتوري تليها شبه الاستيفاء لفصل العظام ترابيكولار من المقصورات القشرية، وهو العمل المكثف، عرضه للخطأ، و المرتبطة بعامل جوهري التحيز8،،من910. أبلغ عن تجزئة التلقائي أساليب11،12 ، ولكن هذه الأساليب الأمثل في المناطق مع فصل جيدة بين ترابيكولار العظام والعظام القشرية، ولكن ليس في المناطق بدون فواصل واضحة. وعلاوة على ذلك، المعلمات تجزئة مختلفة مطلوبة لعينات مختلفة12، وأنها مملة يدوياً تحديد معلمات تجزئة مرضية تنطبق على مجموعات من عينات العظام التي تحاول المعلمة مختلف تركيبات12، على الرغم من أن عملية تجزئة يتم تلقائياً عندما يتم تعيين كافة المعلمات ذات الصلة. كالعظام قد خط الحدود الخارجي على النقيض أكبر مع خلفية المسح وقذائف مشاشي القشرية للعظام الطويلة تظهر تغييرات قليلة في المختار تحليل المنطقة، أساليب تجزئة وفقا للمحيط الخارجي للحدود من العظام الطويلة يمكن أن موثوقية ودقة فصل العظام ترابيكولار من قذائف القشرية. وميزة هذه الطريقة تجزئة أن يقوم التجزئة على الفرق بين الخلفية والحدود الخارجية للعظام، ولكن ليس على الاختلافات بين ترابيكولار والقشرية عظام6،12، 13، ولذا فمن السهل عموما للعثور على مجموعة من المعلمات تجزئة مرضية لمجموعة من عينات العظام، وتيسير تحليل أكثر موثوقية لتغييرات ترابيكولار بين مختلف المجموعات.
في كل شريحة ترد ثنائي الأبعاد (2D) سمك ومحيط، مستوى ومجال لتحليل 2D، بينما حجم وسطح ثلاثي الأبعاد (3D) سمك في كوانتيفيكيشنز 3D. لا يتم عموما عن هذه المعلومات بأدوات تحليل الصورة الحالية، مشيراً إلى أنه يمكن تطبيق الإجراءات التي تم الإبلاغ عنها للصور العامة حيث يتم رغبت هذه المعلومات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الإجراءات التي تشمل مواضيع الحيوان أجريت وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (منشورات المعاهد الوطنية للصحة، الطبعة الثامنة، 2011)، وقد تم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لمدينة ووهان جامعة.
1-برامج التثبيت
- قم بتثبيت البرنامج إيماجيج. تحميل نسخة ويندوز من برنامج إيماجيج (الإصدار ف 1.51) المجمعة مع جافا 64 بت من https://imagej.nih.gov/ij/. استخراج البرامج التي تم تنزيلها إلى مجلد، سيتم في وقت لاحق يشار إليها كدليل "إيماجيج".
ملاحظة: تتطلب تحليل Trabecular الإضافات جافا 64-بت تشغيل الوقت (الإصدار 1.8) ونظام تشغيل windows 64 بت، يفضل أن يكون نظام تشغيل ويندوز 7 64 بت. - تثبيت الإضافات التحليل ترابيكولار. طلب الإضافات تحليل ترابيكولار من http://www.bomomics.com، وفك ضغط المحتويات إلى إيماجيج للإضافات الدليل، وهو "ImageJ الدليل/الإضافات".
ملاحظة: البرنامج المساعد يمكن الحصول على نسخة مجانية، حيث تحديد القياسات 5 شرائح متجاورة ويقال، أو كنسخة تجارية، حيث يمكن تحديد مجموعة من الشرائح وقياس.
2-إعداد Dataset ثلاثي الأبعاد لتحليل ترابيكولار
- مسح قصبة الفئران مع اتباع آلة الأشعة المقطعية الصغرى معيار المسح البروتوكول5 وقم بحفظ البيانات في تنسيق التي يمكن استيرادها في إيماجيج، على سبيل المثال، تنسيق tiff. إذا كان قد تم مسحها ضوئياً عينات العظام متعددة في وقت واحد في أنبوب عينة واحدة، أولاً باستيراد البيانات إلى إيماجيج، وثم فصل كل العظام الفردية عن طريق زراعة المحاصيل قبالة الأخرى العينات باستخدام أدوات معالجة الصور في إيماجيج. وفي وقت لاحق، حفظ الصورة الناتجة في تنسيق التي يمكن استيرادها إلى إيماجيج في وقت لاحق.
ملاحظة: يتم تضمين ملف صورة عينة تمثيلية المستخدمة في التحليل (تكميلية ملف 1). -
محاكاة كائنات القياسية في 2D و 3D.
- افتح برنامج إيماجيج. تحت الإضافات | بوموميكس | محاكاة الكائنات القائمة، انقر فوق الزر دائرة ، وأدخل 200 كالقطر في النافذة المنبثقة، ثم انقر فوق موافق لإنشاء محاكاة دائرة يبلغ قطرها 200 بكسل (الشكل 3ب). حفظ في الدائرة التي تم إنشاؤها في تنسيق tiff.
- افتح برنامج إيماجيج. تحت الإضافات | بوموميكس | محاكاة الكائنات القائمة، انقر فوق الزر مربع ، وأدخل 200 طول الجانب في النافذة المنبثقة، ثم انقر فوق موافق لإنشاء ساحة المحاكاة بطول جانب 200 بكسل (الشكل 3ب). حفظ الساحة التي تم إنشاؤها في تنسيق tiff.
- افتح برنامج إيماجيج. تحت الإضافات | بوموميكس | محاكاة الكائنات القائمة، انقر فوق الزر المستطيل ، وأدخل 200 العرض و 100 كالارتفاع في نافذة منبثقة، ثم انقر فوق موافق لإنشاء مستطيل محاكاة مع عرض 200 بكسل وارتفاع 100 بكسل (الرقم 3 ب). حفظ المستطيل الذي تم إنشاؤه في تنسيق tiff.
ملاحظة: دائرة (القطر: 200 بكسل)، مربع (طول الجانب: 200 بكسل)، ومستطيل (العرض: 200 بكسل؛ والارتفاع: 100 بكسل) يتم حفظها للتحاليل اللاحقة. - افتح برنامج إيماجيج. تحت الإضافات | بوموميكس | محاكاة الكائنات القائمة، انقر فوق الزر المكعب ، وأدخل 30 طول الجانب في النافذة المنبثقة، ثم انقر فوق موافق لإنشاء المكعب محاكاة. وأخيراً، انقر فوق الإضافات | 3D | حجم عارض عرض المكعب التي تم إنشاؤها وحفظها في تنسيق tiff (الشكل 3ج).
- افتح برنامج إيماجيج. تحت الإضافات | بوموميكس | محاكاة الكائنات القائمة، انقر فوق الزر متوازي المستطيلات ، وأدخل 80 طول، 40 كالعرض، و 30 كالارتفاع في النافذة المنبثقة، ثم انقر فوق موافق لإنشاء متوازي المستطيلات المحاكاة. وأخيراً، انقر فوق الإضافات | 3D | حجم عارض لعرض متوازي المستطيلات التي تم إنشاؤها وحفظها في تنسيق tiff (الشكل 3ج).
- افتح برنامج إيماجيج. تحت الإضافات | بوموميكس | محاكاة الكائنات القائمة، انقر فوق الزر مجال ، وأدخل 30 كالقطر في النافذة المنبثقة، ثم انقر فوق موافق لإنشاء مجال محاكاة. وأخيراً، انقر فوق الإضافات | 3D | حجم عارض عرض مجال العمل التي تم إنشاؤها وحفظها في تنسيق tiff (الشكل 3ج).
- افتح برنامج إيماجيج. تحت الإضافات | بوموميكس | محاكاة الكائنات القائمة، انقر فوق الزر الاسطوانة ، وأدخل 30 القطر و 100 كالارتفاع في نافذة منبثقة، ثم انقر فوق موافق لإنشاء محاكاة الاسطوانة. وأخيراً، انقر فوق الإضافات | 3D | حجم عارض لعرض الاسطوانة التي تم إنشاؤها وحفظها في تنسيق tiff (الشكل 3ج).
ملاحظة: مجال (القطر: 30 بكسل)، مكعب (طول الجانب: 30 بكسل)، متوازي المستطيلات (الطول: 80 بكسل؛ وعرض: 40 بكسل؛ والارتفاع: 30 بكسل)، واسطوانة (القطر: 30 بكسل؛ وارتفاع: 100 بكسل) يتم حفظها للتحاليل اللاحقة.
3-تحليل معلمات التنميط
- افتح برنامج إيماجيج وفتح أو استيراد صورة الممسوحة ضوئياً.
- حرك شريط التمرير أسفل اختيار شريحة واحدة، ثم انقر فوق صورة | ضبط | عتبة زر. في نافذة منبثقة العتبة، ضبط قيم الحد الأدنى والحد الأقصى بالتفتيش اليدوي التأكد من أن العظام مفصولة جيدا من الخلفية، وتسجيل قيمة عتبة الحد الأدنى كقيمة العتبة العظام القشرية.
ملاحظة: كاستخدام الشركات المصنعة المختلفة الصغرى-CT مختلف العوامل التحجيم لتخزين معاملات التوهين الأشعة السينية في الصور، قيمة العتبة الفعلية ينبغي تحديد تجريبيا أما عن طريق التفتيش اليدوي أو أثر معين للشركة المصنعة التوصيات. في ممارستنا، تعيين الحد الأدنى لملفات إيسك المنتجة بواسطة آلات الأشعة المقطعية الصغرى إلى 6,000-7000 يمكن موثوق بها فصل العظام عن خلفية المسح. - انقر فوق الوظائف الإضافية | بوموميكس | التنميط بارام تراب زر. في نافذة منبثقة، تعيين فهرس شريحة لموقف شريحة تمثيلية، وضبط القشرية عظم ("كورت") ومجموعة ("المجموعة")، والقيم خطوة ("الخطوة") لحساب مجموعة من العتبات القشرية للتنميط تجزئة المعلمات، حيث وتكتسب قيمة العتبة العظام القشرية بخطوة 3.2 (الشكل 1). نطاق القيم الافتراضية وخطوة عمل 000 2 و 400 لمعظم الصور المقطعية الصغرى. تعيين فهرس شريحة إلى 5 لمجموعة البيانات المثال، والحفاظ على القيم الافتراضية لإعدادات أخرى.
ملاحظة: "كورت العظام" هو الحد الأدنى للعظام القشرية، وقيمة العتبة المستخدمة للتغييرات المعلمة التنميط من قيمة عتبة أدنى إلى أعلى قيمة العتبة مع زيادة قيمة الخطوة، أين هي قيمة عتبة أدنى قيمة كورت العظام--النطاق، وأعلى قيمة العتبة هو كورت العظام + مجموعة. إذا كان من تعيين قيم كورت العظام، والنطاق، وخطوة 6,000، 000 1 و 500، على التوالي، ثم قيمة العتبة الدنيا للعظام القشرية 6,000-1، 000 = 5، 000، وهو أعلى قيمة عتبة 6، 000 + 1، 000 = 7، 000، والعتبات المستخدمة في التحليلات التي يتم 5,000، 5,500، 6,000، 6,500، و 000 7. - تعيين قطر الضوضاء (الضجيج ضياء "")، وخطوة ("الخطوة")، وتتراوح القيم ("المجموعة") لتحديد مجموعة من القيم الضوضاء في هذه التحليلات، وحفرة قطرها (ثقب ضياء "") وخطوة ("الخطوة")، والقيم ("المجموعة") لحساب مجموعة من القيم ثقب. وبصفة عامة، يعمل الإعداد الافتراضي لمعظم عينات العظام الأشعة المقطعية الصغرى، حيث الضوضاء والخطوة، والنطاق هي 5، 5، 2، على التوالي، وحفرة قطرها، خطوة، ومجموعة من 15، 5، 2، على التوالي. الاحتفاظ بالإعدادات الافتراضية لمجموعة البيانات المثال.
ملاحظة: "ضياء الضوضاء" قطر لتصفية قمع الضوضاء، وهو "ضياء ثقب" القطر الثقوب داخل العظام القشرية. يمكن حساب القيم الضوضاء وثقب المستخدمة للمعلمة التنميط المثل كقيم العتبة القشرية الموصوفة أعلاه، باستخدام المحدد الضوضاء/ثقب ومجموعة القيم خطوة. بسبب الاختلافات في مسح معلمات عند اقتناء الصور، معلمات الضوضاء وثقب ينبغي أن يحدد تجريبيا وفقا لجودة الصورة، كما أية نطاقات عامة من الضوضاء وثقب المعلمات جيدة لجميع عمليات التفحص. يجب أن تكون أدنى قيمة للعتبة، والضوضاء، أو ثقوب أكبر من أو تساوي 0، وإذا كانت القيمة المحسوبة أقل سلبية باستخدام المعلمات المتوفرة، أدنى قيمة محددة يتم تعيين إلى 0. - انقر فوق موافق لإجراء التنميط المعلمة. بصريا التحقق من تجزئة النتائج في إطار نتائج التنميط المعلمة ، وحدد طبقة شريحة بحيث يرد خط الحدود الخارجي العظام تماما بدقة (الشكل 1ب). وفي وقت لاحق، استرداد المعلمات التنميط من الإدخال في جدول النتائج التنميط المعلمة المقابلة لطبقة شريحة المختار (الجدول 1).
4-ترابيكولار التحليل
-
تجزئة للعظام ترابيكولار
- افتح برنامج إيماجيج، ثم فتح أو استيراد صورة الممسوحة ضوئياً.
- انقر فوق الوظائف الإضافية | بوموميكس | تجزئة تراب زر، وملء المعلمات التحليل الملائمة. تعيين "بدء تشغيل"، "مخطط الحدود"، "تراب. العظام "،" ضياء خفض الضجيج "،" ضياء ملء الحفرة "، و" ضياء سمك القشرية "إلى 5، 7,200، 000 7، 6، 12 و 25، على التوالي.
ملاحظة: "ابدأ" و 'نهاية' حدد نطاق الشريحة المحددة لتجزئة trabecular العظام، "مخطط الحدود" هو المقابل للمعلمة "كورت العظام" لمحة عن، "ضياء خفض الضجيج" إلى "الضوضاء ضياء" معلمة، و "ثقب ملء ضياء" لمعلمة "ثقب ضياء". "سمك القشرية ضياء" هو سمك المحدد لاستثناء العظام القشرية الخارجية. "تراب. العظام "هو الحد الأدنى لاستخراج عظام ترابيكولار (الشكل 2)، حيث يتم تحديد الإعدادات استخدام تحليل التنميط معلمات الأوامر كما هو موضح في الخطوة 3، 5. - انقر فوق موافق لإجراء تجزئة ترابيكولار. بصريا تحقق نتائج تجزئة في إطار نتائج تجزئة تراب (الشكل 2ب). حفظ العظام trabecular المستخرجة سيظهر في نافذة العظام Trabecular مجزأة في تنسيق tiff (الشكل 2ب)، التي يمكن تحليل المزيد من البرامج الأخرى.
-
تحليل العظام ترابيكولار.
- افتح برنامج إيماجيج، ثم فتح أو استيراد صورة الممسوحة ضوئياً.
- انقر فوق الوظائف الإضافية | بوموميكس | تحليل تراب زر، وملء المعلمات التحليل المناسب، مثل "ابدأ"، "مخطط الحدود"، "تراب. العظام "،" ضياء خفض الضجيج "،" ضياء ملء الحفرة "، و" ضياء سمك القشرية "كالموصوفة أعلاه (الشكل 3أ)، حيث يتم تحديد الإعدادات باستخدام الأمر المعلمات تحليل التنميط كما هو موضح في الخطوة 3، 5. تعيين "بدء تشغيل"، "مخطط الحدود"، "تراب. العظام "،" ضياء خفض الضجيج "،" ضياء ملء الحفرة "، و" ضياء سمك القشرية "إلى 5، 7,200، 000 7، 6، 12 و 25، على التوالي.
ملاحظة: في النسخة المجانية من البرنامج المساعد، خمس شرائح المجاورة بدءاً من الفهرس المحدد بشريحة "ابدأ" هي المحدد للقياس، بينما في النسخة التجارية، عدد عشوائي من شرائح يمكن أن يكون المحدد من قبل المستخدم. - حدد واحد أو أكثر من خيارات في قسم الإبلاغ عن النتائج للمعلمات لقياسه، حيث حجم العظام trabecular (BV)، الحجم الإجمالي (التلفزيون) من المنطقة المحددة، وسمك قياس أما الإحداثيات (2D) أو ثريديمينسيونالي (3D) متوفرة للتحديد من خلال ثلاث خانات الاختيار، إلا وهي "BV التلفزيون فقط"، "2D"، و "3D". قم بتحديد خانات الاختيار "2D" و "3D"، ثم انقر فوق "موافق" لإجراء تحليل ترابيكولار (الشكل 3، الجدول 2).
ملاحظة: عند "تلفزيون بي فقط" محدداً، بغض النظر عن حالات التحديد "2D" و "3D"، وترد تدابير الخام BV والتلفزيون، وكثافة، وتستخرج العظام trabecular مجزأة وعرضها في نافذة جديدة، والتي يمكن حفظها وكذلك تحليلها من قبل البعض البرمجيات. عندما يتم التحقق من "2D"، وترد تدابير الخام بي، والتلفزيون، وكثافة وسمك قياس الإحداثيات كل مستوى الشريحة باستخدام نموذج لوحة. إذا تم تحديد "3D"، يتم حساب سمك ثلاثي الأبعاد لكل فوكسل مباشرة دون أي افتراض نموذج، ثم الخام تدابير BV، التلفزيون وكثافة وسمك ثلاثية الأبعاد أخذ عينات كل مستوى شريحة ترد. ، إذا تم تحديد خانة الاختيار لا، ترابيكولار العظام هي مجزأة باستخدام مجموعة المعلمات المذكورة أعلاه ولكن يتم الإبلاغ عن لا قياس.
5-التحديد الكمي لمحاكاة الكائنات
- إيماجيج البرمجيات المفتوحة، ثم افتح صورة محاكاة. هنا، فتح مجال المحاكاة التي يبلغ قطرها 30 بكسل على سبيل مثال.
- حدد الإضافات | بوموميكس | تحليل تراب زر وملء المعلمات التحليل المناسب كما هو موضح سابقا. الحفاظ على القيم الافتراضية من أجل "ابدأ"، "إنهاء"، "مخطط الحدود"، "تراب. العظام "، ومجموعة" ضياء خفض الضجيج "،" ضياء خفض الضجيج "،" ضياء ملء الحفرة "، و" ضياء سمك القشرية "إلى 0 (الشكل 3).
ملاحظة: لمحاكاة الكائنات، هناك لا ضجيج إشارة غير مقصودة، وقد يكون هناك لا قذائف القشرية المقابلة. ولذلك، يجب تعيين المعلمات لهذه القيم على النحو المناسب (الإعدادات الافتراضية الصفر). كوانتيفيكاتيونس 3D، شرائح 30 قبل وبعد معالجة شريحة "ابدأ" المحدد باستخدام النسخة المجانية من البرنامج المساعد، في حين يتم تحليل الشرائح فقط في النطاق المحدد بواسطة شرائح "بدء" و "إنهاء" من النسخة التجارية من البرنامج المساعد. - في قسم الإبلاغ عن النتائج ، حدد "2D" و "3D" للمعلمات التي يمكن قياسها، وانقر فوق موافق لإجراء تحليل ترابيكولار لمحاكاة كائن (الجدول 3).
6-معايرة الإجراءات ترابيكولار والعرض التقديمي للبيانات: الشخصية توزيعات تدابير ترابيكولار في منطقة تحليل مختارة
- الحصول على معلومات معايرة من مجموعة البيانات الممسوحة ضوئياً، وفقا لتعليمات البائع الصغير-CT.
ملاحظة: التقارير فقط الخام التدابير BV، والتلفزيون، وكثافة وسمك البرنامج المساعد. للحصول على تدابير مماثلة للتقارير التي تم إنشاؤها بواسطة البرامج الأخرى، هو المطلوب نتيجة المعايرة. - فتح Microsoft Excel، ثم افتح الجدول النتائج المبلغ عنها. حساب معايرة حجم العظام (BV)، إجمالي حجم (التلفزيون) والعظام المعدنية المحتوى (BMC) وعظم حجم الكسر (BV والتلفزيون)، وكثافة المعادن في العظام (BMD) في الجديدة في excel الأعمدة باستخدام قيم بي، والتلفزيون، وكثافة الخام تم الإبلاغ عنها وفقا للتعابير التالية.
- ملاحظة: مسح القرار (القرار، ميكرومتر)، يمكن استخراج القياس الرمادي (تحجيم) ووحدات الكثافة (ملغ هكتار/سم3) وكثافة المنحدر (المنحدر) وكثافة الاعتراض (اعتراض) من الملفات الممسوحة ضوئياً الصغرى-CT الصورة أو ميتا، مثل الملف إيسك سانكو. ولذلك، والتدابير معايرة تحسب كما يلي:
افترض أن BV والتلفزيون وكثافة الخام التدابير، بيج والتلفزيونج هي قيم محسوبة، القرار، التحجيم، المنحدر، هي اعتراض من ملفات معايرة مايكرو-CT الصور.
BVج = بي × القرار3 [ميكرومتر]3[
تلفزيونج = التلفزيون × القرار3 [ميكرومتر]3[
بي/التلفزيون = BV ÷ التلفزيون
BMC = (÷ كثافة القياس × المنحدر-اعتراض × BV) القرار ×3 × 10-12 [مغ ها]
BMD-BMC ÷ التلفزيونج × 1012 [مغ هكتار/سم3] - إنشاء مؤامرة تخطيط س ص (مبعثر) لمعايرة تدابير (Y) ضد شريحة الطبقات (X) باستخدام برنامج Microsoft Excel (الشكل 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البرنامج المساعد ترابيكولار تحليل يهدف إلى الجزء تلقائياً وتحديد حجم العظام ترابيكولار بدقة. في البداية، يليه العظم الحدود الخارجي يتم الكشف عنها وتحديد عملية ملء الحفرة حيث يتم ملء أي ثقوب داخل قذائف العظام القشرية الخارجي. ثم تتم عملية تآكل لاستبعاد العظام القشرية الخارجي والحصول على عظام trabecular مجزأة. وأخيراً، تدابير للعظام ترابيكولار في منطقة مجزأة كمياً.
كما صاخبة أصلاً الصور المقطعية الصغرى، الانقسامات استخدام معلمات التعسفي معرفة مسبقاً وكثيراً ما تفشل دقة تحديد الحدود الخارجية للعظام. ومن كثافة مملة وحزب العمل في محاولة الكثير من تركيبات معلمة لتحديد معلمات تجزئة مرضية. ولذلك، يتم توفيرها معلمة التنميط المساعد لتغيير المعلمات واحداً تلو الآخر في نطاق مجموعة تلقائياً للمساعدة في تحديد تركيبات معلمة مرضية، مما يسهل أيضا تحديد مجموعة مشتركة من المعلمات لمجموعة من العظام عينات. الشكل 1 أ يظهر الإعدادات المستخدمة للتنميط معلمات تجزئة جيدة. عندما لمحة عن المعلمات لعتبة العظام القشرية (كورت العظام)، مجموعة من العتبة لتكون (النطاق)، ويتم تحديد مقدار العلاوة لعتبة (الخطوة) في كل خطوة، يتم إنشاء سلسلة من عتبات تكون لمحة. فيما بعد، يتم إنشاء سلسلة من القيم الضوضاء وثقب المثل بتعيين معلمات المطابق. وأخيراً، هي مجزأة trabecular العظام عن طريق تغيير المعلمات واحد في وقت واحد لكافة التركيبات الممكنة المعلمة. الشكل 1 ب يبين نتائج تجزئة الممثل لتركيبات مختلفة من المعلمة. ومن الواضح أن بعض تركيبات المعلمة أفضل من غيرها في ترسيم الحدود الخارجية للعظام، والجمع بين معلمة واحدة أو أكثر تظهر نتائج مرضية تجزئة. بعد فحص نتائج تجزئة بصريا، يمكن استرداد قيم المعلمات للانقسامات مرضية من التنميط نتائج الجدول (الجدول 1).
لتحديد تدابير للعظام ترابيكولار، تتم تجزئة ترابيكولار والتحليل. الشكل 2 A يظهر مربع حوار الإعداد لتجزئة trabecular، مجزأة ترابيكولار العظام في المنطقة المحددة واستخراج (الشكل 2ب)، حيث يمكن التحقق من تجزئة نتائج المعلمات التي تم توفيرها باستخدام شريحة بشريحة بصريا. وفي وقت لاحق، يتم تحليل العظام ترابيكولار مع المعلمات مرضية (الشكل 3أ). اعتماداً على اختيار حالات الإبلاغ عن الخيارات، كوانتيفيكيشنز الخام لعظم حجم (BV) وإجمالي حجم (التلفزيون)، مجموع قيم الرمادي (كثافة)، وقياس سمك أما اثنين من الأبعاد أو ثلاثة الأبعاد (الجدول 2) وترد. أخيرا، معلومات المعايرة يستخرج من dataset الصغرى-CT الممسوحة ضوئياً ومعايرة تدابير BV، BMC BV والتلفزيون، التلفزيون، وتحسب BMD اتباعها بالتنميط توزيعهم في تحليل المنطقة الطبقة-من-الطبقة المحددة ضد الطبقة وظائف (الشكل 4).
كميزة مراقبة الجودة للبرنامج المساعد، معتمد من التحديد الكمي لمحاكاة الكائنات. تحدد كمياً محاكاة كائنات القياسية مع الأبعاد المعروفة بالبرنامج المساعد للمقارنة مع القيم النظرية أو تدابير من البرامج الأخرى، مثل البرمجيات التجارية المتوفرة مع الآلات الدقيقة-CT أو بني14، البرنامج المساعد حرة ومفتوحة المصدر لتحليل الصور العظام. لتحليل محاكاة الكائنات، يتم تعيين الإعدادات الضوضاء إلى الصفر، كما تعتبر محاكاة الصور صور ذات جودة عالية دون أي ضجيج. كانت محاكاة الكائنات ذات سمك مختلف وتظهر النتائج (الشكل 3، الجدول 3). لمحاكاة الكائنات 2D القياسية، مثل الدوائر والمربعات والمستطيلات، بالضبط القيم لمنطقة (التلفزيون أو BV) ويقال سمك (الجدول 3). للكائنات ثلاثية الأبعاد، وترد تدابير الضبط سمك لمكعبات، ومجالات، وكوبويدس، إلا أن سمك للاسطوانات ليست دقيقة فوكسيلس قرب الاسطوانة لكلا الطرفين، بينما سمك فوكسل في الشرائح المتوسطة من الاسطوانات بالضبط وتوقع. هذه هي ميزة خوارزمية قياس سمك الكامنة، وحيث يتحدد سمك فوكسل لكل كائن قطر مجال أكبر، أو طول الجانب المكعب الأكبر، الذي يتضمن هذا فوكسل والداخل تماما الكائن. ولذلك، سمك الأجسام المصنوعة من مختلف المجالات ومكعبات يمكن أن تقاس بدقة، بينما اسطوانات لا يمكن قياسها إلا بدقة في دائرة نصف قطرها--المسافة الشريحة المتوسطة في بعيداً عن طرفي.
الشكل 1 : نتائج تمثيلية للمعلمة التنميط التحليل. (أ) معايير إعداد الصفحة. (ب) نتائج الممثل للمعلمة التنميط التحليل. بعض تركيبات المعلمة أفضل من غيرها للكشف عن الحدود الخارجية للعظام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الممثل نتائج التحليل تجزئة ترابيكولار. (أ) معايير إعداد الصفحة. (ب) نتائج تجزئة الممثل ترابيكولار العظام في طبقات مختلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تحليل ترابيكولار- (أ) معايير إعداد الصفحة. (ب) نتائج تمثيلية لمحاكاة الكائنات 2D. (ج) نتائج تمثيلية لمحاكاة كائنات ثلاثية الأبعاد تصور بعارض حجم ثلاثي الأبعاد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : توزيعات تدابير ترابيكولار العظام في منطقة تحليل المحدد. ويمثل المحور الأفقي المسافة النسبية لطبقة شريحة البدء في منطقة تحليل. تكون القيم في المحور الصادي معايرة تدابير ترابيكولار في منطقة تحليل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| شريحة | حدود المخطط | ضياء خفض الضجيج | ضياء سد ثقب |
| 4 | 5200 | 0 | 10 |
| 147 | 5200 | 2 | 20 |
| 361 | 7200 | 6 | 16 |
| 539 | 8000 | 10 | 20 |
الجدول 1: نتائج الممثل للمعلمة التنميط التحليل.
الجدول 2: الممثل نتائج التحليل ترابيكولار.
| الكائن | البعد | حجمب | سطحج | سمك |
| ساحة | 200 × 200 | 40000 | 796 | 200 |
| مستطيل | 200 × 100 | 20000 | 596 | 100 |
| دائرة | ضياء: 200 | 31428 | 796 | 200 |
| مكعب | 30 X 30 X 30 | 27000 | 5048 | 30 |
| متوازي المستطيلات | 80 × 40 × 30 | 96000 | 13008 | 30 |
| المجال | ضياء: 30 | 14328 | 3944 | 30 |
| اسطوانةد | Dia:30؛ H: 100 | 71600 | 12800 | 27.84 |
| اسطوانةه | Dia:30؛ H: 100 | 51552 | 9552 | 30 |
| ج: النتائج في فوكسيلس الخام. ضياء: القطر؛ H: الارتفاع. | ||||
| باء: "وحدة التخزين" (3D) أو منطقة (2D). | ||||
| c: السطح (3D) أو محيط (2D). | ||||
| د ميسورس من شريحة 1 شريحة 100 تستخدم للتحليل. | ||||
| هاء: وتستخدم ميسورس من 15 شريحة إلى الشريحة 85 للتحليل. | ||||
الجدول 3: نتائج التقدير الكمي لمحاكاة الكائنات.
التكميلية الملف 1. عينة من العظام- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف هذه الدراسة البرنامج المساعد إيماجيج لتحليل العظام ترابيكولار، والتلقائية، والكفاءة، وسهلة الاستعمال. يمكن أيضا استخدام البرنامج المساعد لتحديد أي كائن 2D أو 3D لتدابير طبقة بطبقة من مجالات ووحدات التخزين، وسمك. حاليا، هو الإبلاغ عن قيمة قياس واحد فقط لكل معلمة ترابيكولار لكل عينة بالتحليل الصغرى-CT القياسية، التي لا تمثل تماما خصائص الكيان المقاسة في منطقة تحليل المحدد. البرنامج المساعد وصفت تقارير كميات طبقة بطبقة لكل معلمة لكل عينة، الذي يحتفظ بالكامل توزيع معلومات المعلمة المقاسة في منطقة تحليل مختارة، وذلك أكثر تقدما وتراعي الإحصائية نهج قابلة للتطبيق لتحليل هذه البيانات.
مع القياسية، وشبه التلقائي الكنتوري اليد تجزئة الأسلوب، لوحظ اختلاف كبير بين مختلف شرائح الكنتوري اليد مع المشغل التحيز8،،من910، تسوغ موحد أكثر والطريقة التلقائية لتجزئة ترابيكولار. كما على النقيض القصوى بين خلفية المسح والحدود الخارجية العظام، تجزئة trabecular ساعد الخارجي للحدود يؤديها المساعد، حيث يمكن تلقائياً كشف الحدود الخارجية للعظام بدقة عند الاقتضاء يتم توفير العتبة، والضوضاء، وإعدادات ثقب. لتسهيل تحديد معلمات تجزئة، طائفة من المعلمة تركيبات لمحة واحدة تلو الأخرى باستخدام شريحة تمثيلية من منطقة تحليل، ويتم فحص نتائج مرضية تجزئة بصريا. وفي وقت لاحق، يتم تحليل العظام ترابيكولار مع المعلمات لمحة. عندما يتم تعيين المعلمات المناسبة تجزئة، وطبق البرنامج المساعد بنجاح لتحليل العظام ترابيكولار من الفئران قصبة القاصي تعامل مع العظام مختلف العوامل الابتنائية5، سجلت النتائج استنساخه لنفس الصورة دون تحيز للمشغل.
حاليا البرنامج المساعد يمكن معالجة عينة واحدة في وقت واحد. إذا كانت عينات متعددة موجودة في الصورة، كمياً جميع العينات ككائن مفرد دون تمييز. ولذلك، تجهيزها مطلوب إذا كان يتم فحص عينات متعددة في وقت واحد في أنبوب عينة واحدة. النواتج الكمي هي تدابير الخام من التهم بكسل أو قيم الرمادي، التي ينبغي أن تكون معايرة يدوياً باستخدام معلومات المعايرة المناسبة.
أن الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو تحديد المعلمات المناسبة لتحليل ترابيكولار. عموما، يتم تحليل مجموعات من عينات العظام باستخدام معلمات تجزئة مطابقة لجعل النتائج قابلة للمقارنة. في هذه حالة، ينبغي الحرص على كفالة أن تقسيم النتائج لجميع العينات يتم فحص بصريا للأخطاء المحتملة قبل أن يتم إجراء المزيد من التحاليل.
قيداً رئيسيا لهذا الأسلوب أن يتم تطبيق الإعدادات الحد من الضوضاء للعظام القشرية فقط لنحت خط الحدود الخارجي للعظام، ولكن ليس على العظام trabecular المستخرجة. كما كانت مختلف الاستراتيجيات تصفية المبلغ عنها15 المثلى لتحليل ترابيكولار تحت ظروف مختلفة، لا يوجد مرشح واحد جيد لجميع عينات صورة. ولذلك، ليس هناك أي خطوة الترشيح المضمن قبل التحديد الكمي للعظام ترابيكولار. لتكون متوافقة مع الإنتاج عن طريق البرامج مع تصفيات الصورة المضمنة، المستخرج من عظام ترابيكولار يمكن أن يكون المثل الأول المجهزة باستخدام مختلف أدوات التصوير، ثم استيرادها إلى إيماجيج وكمياً بالبرنامج المساعد في وقت لاحق. وعلاوة على ذلك، تنسيقات الصورة مختلفة يتم إنشاؤها بواسطة مختلف مايكرو-CT البائعين، ومعظمهم لا يمكن استيرادها أو فتح طريق ImageJ مباشرة، وبالتالي المرغوب فيها وحدات لاستيراد مختلف الصور إلى إيماجيج لمزيد من التحليل. ثمة قيد آخر هو أن سمك 3D في شرائح قرب ينتهي نطاق التحديد لا تكون دقيقة إذا كان جزء من الكائنات خارج التحديد النطاق، الذي ينطبق أيضا على أية حزم الكمي 3D المتاحة، ولذلك، أكبر مجموعة من الشرائح ينبغي أن يكون كمياً، وينبغي أن تستخدم فقط في الجزء الأوسط من الشرائح المحددة لمزيد من التحليل. يمكن أن يكون هذا نهج المتاحة فقط عند قياس الكميات المبلغ عنها من طبقة بطبقة كما هو موضح في هذا البرنامج المساعد، ولكن ليس للقياسات ويقال أن قيمة واحدة فقط لكل معلمة كمياً في نطاق التحديد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد رفعت براءة الخوارزمية الأساسية لقياس سماكة الكائن. المؤلفون وتعاونت مع الآخرين المسجلين bomomics.com موقع استضافة مجانية الإصدار الإضافات، حيث تقدم الاستشارات والتحديد الكمي لخدمات تحليل الصور عند الطلب.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل جزئيا منحة NFSC 81170806. المؤلف يود أن يشكر مرفق الأساسية الصغرى-ط م من كلية طب الأسنان، جامعة ووهان للمساعدة في فحص وتحليل قصبة الفئران.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ | NIH | imagej | Any version with a java 1.8 run time |
| trabecular analysis plugin | Bomomics | bomomics | free or commercial version |
| Micro CT scanner | Scanco | μ-50 | micro CT from any vendor |
| Computer System | Lenovo | any brand | |
| Windows Operating System | Microsoft | Windows 7 x64 | any 64-bit Windows operating system |
| Office Software | Microsoft | Office 2010 | any speadsheet software that has xy chart function |
References
- Ruegsegger, P., Koller, B., Muller, R. A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcif Tissue Int. 58 (1), 24-29 (1996).
- Muller, R., Ruegsegger, P. Micro-tomographic imaging for the nondestructive evaluation of trabecular bone architecture. Stud Health Technol Inform. 40, 61-79 (1997).
- Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Phys Med. 30 (6), 619-634 (2014).
- Bart, Z., Wallace, J. Microcomputed Tomography Applications in Bone and Mineral Research. Advances in Computed Tomography. 2, 121-127 (2013).
- Ji, Y., Ke, Y., Gao, S. Intermittent activation of notch signaling promotes bone formation. Am J Transl Res. 9 (6), 2933-2944 (2017).
- Jiang, Y., Zhao, J., White, D. L., Genant, H. K. Micro CT and Micro MR imaging of 3D architecture of animal skeleton. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (1), 45-51 (2000).
- Laib, A., et al. 3D micro-computed tomography of trabecular and cortical bone architecture with application to a rat model of immobilisation osteoporosis. Med Biol Eng Comput. 38 (3), 326-332 (2000).
- Cole, H. A., Ichikawa, J., Colvin, D. C., O'Rear, L., Schoenecker, J. G. Quantifying intra-osseous growth of osteosarcoma in a murine model with radiographic analysis. J Orthop Res. 29 (12), 1957-1962 (2011).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Med Imaging. 8, 16 (2008).
- Soviero, V. M., Leal, S. C., Silva, R. C., Azevedo, R. B. Validity of MicroCT for in vitro detection of proximal carious lesions in primary molars. J Dent. 40 (1), 35-40 (2012).
- Kohler, T., Stauber, M., Donahue, L. R., Muller, R. Automated compartmental analysis for high-throughput skeletal phenotyping in femora of genetic mouse models. Bone. 41 (4), 659-667 (2007).
- Buie, H. R., Campbell, G. M., Klinck, R. J., MacNeil, J. A., Boyd, S. K. Automatic segmentation of cortical and trabecular compartments based on a dual threshold technique for in vivo micro-CT bone analysis. Bone. 41 (4), 505-515 (2007).
- Dougherty, G. Quantitative CT in the measurement of bone quantity and bone quality for assessing osteoporosis. Med Eng Phys. 18 (7), 557-568 (1996).
- Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47 (6), 1076-1079 (2010).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
