Summary
Wir präsentieren einen Workflow für die Segmentierung und Quantifizierung der trabekuläre Knochen für 2D und 3D Bilder basierend auf den Knochen äußere Begrenzung mit ImageJ-Plugin. Dieser Ansatz ist effizienter und genauer als der aktuelle manuelle Hand-Konturierung Ansatz und bietet Schicht für Schicht Quantifizierungen, die nicht im aktuellen kommerziellen Software verfügbar sind.
Abstract
Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) wird routinemäßig verwendet, um Knochen Menge und trabekuläre mikrostrukturelle Eigenschaften bei Kleintieren unter verschiedenen Knochen Bedingungen zu bewerten. Allerdings ist die Standardtherapie für die trabekuläre Analyse von Mikro-CT-Aufnahmen Stück durch Stück halbautomatisches Hand-Konturierung, arbeitsintensiv und fehleranfällig. Hier beschrieben ist eine effiziente Methode für die automatische Segmentierung der trabekulären Knochen nach den Knochen äußere Grenzen, wo trabekuläre Knochen identifiziert und mit Genauigkeit und weniger Betreiber Voreingenommenheit bei Bedarf automatisch segmentiert werden können Segmentierung parametriert werden. Um zufrieden stellende Segmentierung Parameter-Profil, wird ein Bildstapel Segmentierung Ergebnisse angezeigt, wo alle mögliche Kombinationen der Segmentierung Parameter sind geänderte einzeln nacheinander, und Segmentierung Ergebnisse mit zugeordneten Parametern können, einfach visuell überprüft werden. Als Qualitätskontrolle Feature des Plugins sind simulierte Standardobjekte quantifiziert wo die Messgrößen mit Sollwerten verglichen werden können. Schicht für Schicht Quantifizierung der trabekuläre Eigenschaften und trabekuläre dicken werden durch solch ein Plugin berichtet, und die Verteilung solcher Eigenschaften innerhalb der ausgewählten Regionen können leicht profiliert. Obwohl Schicht für Schicht Quantifizierung behält sich weitere Informationen über trabekulären Knochen und weitere statistische Analyse der strukturellen Veränderungen ermöglicht, sind solche Maßnahmen nicht verfügbar vom Ausgang des aktuellen Handelssoftware, wo nur eine einzige quantifizierte Wert für jeden Parameter wird für jede Probe berichtet. Die beschriebenen Abläufe sind daher bessere Ansätze für die Analyse der trabekulären Knochen mit Genauigkeit und Effizienz.
Introduction
Mikro-CT-Analyse der trabekulären Knochen ist die Standardtherapie für die Verfolgung von morphologischer Veränderungen der Knochen bei Kleintieren unter verschiedenen Knochen Verlust Bedingungen1,2,3, wo mehrere Variablen im Zusammenhang mit der Strukturen der Knochen sind ausgewiesene4. Aber solche Parameter sind nicht gleichmäßig verteilt in der Metaphyse der langen Röhrenknochen5und nur ein zusammengefasster oder einen gemittelten Wert für jede strukturelle Variable jeder Probe vom aktuellen kommerziellen Mikro-CT Maschinen6,7 gemeldet wird , obwohl ein einzelner Wert voll die Merkmale der gemessenen Parameter im Bereich Analyse darstellen kann. Schicht für Schicht Quantifizierung der trabekulären Knochen behält nicht nur mehr Informationen für jede Variable, sondern ermöglicht auch die Profilerstellung für die Verteilung der Variablen in der Analyse Region erleichtert spätere statistische Analyse der strukturellen Änderungen unter verschiedenen Bedingungen5. Daher ist das Ziel dieser Methode trabekuläre Knochen von Mikro-CT-Scans auf jeder Ebene der Scheibe, Quantifizierung, die derzeit nicht in jede handelsübliche Mikro-CT-Analyse-Paket verfügbar ist.
Automatische Segmentierung Methoden sind effizient Segment trabekulären Knochen Slice-durch-Slice wünschenswert. Die aktuellen Standardtechnik für Mikro-CT-Analyse basiert jedoch auf manuelle interaktive Konturierung gefolgt von halbautomatischen Interpolation trabekuläre Knochen aus den kortikalen Abteilen zu trennen ist arbeitsintensiv, fehleranfällig, und verbunden mit erheblichen Betreiber Bias8,9,10. Automatische Segmentierung Methoden11,12 wurden berichtet, aber solche Methoden sind nur optimal in Regionen mit guter Trennung zwischen trabekulären Knochen und kortikalen Knochen, aber nicht in Regionen ohne klare Trennungen. Darüber hinaus verschiedene Segmentierung Parameter sind erforderlich für verschiedene Proben12, und es ist mühsam, zufriedenstellende Segmentierung Parameter für Gruppen von Knochenproben manuell auswählen, indem Sie versuchen verschiedene Parameter-Kombinationen-12 Obwohl die Segmentierung automatisch geschieht, wenn alle zugehörigen Parameter eingestellt werden. Da die Knochen äußere Grenze den größten Kontrast mit dem Scan-Hintergrund hat und die Metaphysärer kortikalen Schalen der langen Knochen zeigen einige Änderungen in der gewählten Region, analysieren Segmentierung Methoden entsprechend der äußeren Grenze Kontur der langen Röhrenknochen kann trennen Sie zuverlässig und präzise trabekuläre Knochen von kortikalen Muscheln. Der Vorteil einer solchen Segmentierung Methode ist, dass die Segmentierung auf dem Unterschied zwischen dem Hintergrund und den Knochen äußere Grenze, aber nicht auf die Unterschiede zwischen den trabekulären und kortikalen Knochen6,12basiert, 13, daher ist es in der Regel leicht zu finden, die ausreichend für eine Gruppe von Knochenproben, zuverlässiger Analyse der trabekuläre Veränderungen zwischen verschiedenen Gruppen zu erleichtern ist eine Kombination aus Segmentierung Parameter.
Auf jede Scheibe sind Ebene, Fläche, Umfang und zweidimensionale (2D) Dicke für 2D Analyse berichtet, während Volumen, Oberfläche und dreidimensionalen (3D) Dicke in 3D Quantifizierungen gemeldet werden. Diese Informationen wird in der Regel nicht gemeldet, vom aktuellen Bild-Analyse-Tools, die darauf hinweist, dass die gemeldeten Verfahren auf allgemeine Bilder angewendet werden können, wo solche Informationen erwünscht ist.
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Protocol
Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Probanden wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Publikation, 8. Auflage, 2011), durchgeführt und überprüft und genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Ausschuss von Wuhan Universität.
(1) Software-Installation
- Installieren Sie ImageJ-Software. Herunterladen Sie die Windows-Version der ImageJ (Version 1,51 p) Software gebündelt mit 64-Bit Java von https://imagej.nih.gov/ij/. Entpacken Sie die heruntergeladene Software in einen Ordner, der später als "ImageJ-Verzeichnis" bezeichnet wird.
Hinweis: Trabekuläre Analyse Plugins erfordern 64-Bit-Java laufen Zeit (Version 1.8) und ein 64-Bit-Windows-Betriebssystem, vorzugsweise eine 64-Bit Betriebssystem Windows 7. - Trabekuläre Analyse Plugins zu installieren. Fordern Sie trabekuläre Analyse Plugins von http://www.bomomics.com an, und entpacken Sie den Inhalt in ImageJs Plugins-Verzeichnis, "ImageJ Verzeichnis/Plugins".
Hinweis: Das Plugin erhalten Sie eine kostenlose Version, wo die Messungen für 5 angegeben, dass benachbarte Scheiben gemeldet werden, oder als eine kommerzielle Version, wo eine Reihe von Scheiben angegeben und gemessen werden kann.
2. bereiten Sie 3D Dataset für die trabekuläre Analyse
- Scannen Sie Ratte Oberschenkelknochen mit einer Mikro-CT-Maschine nach dem Standard Protokoll5 scannen und speichern Sie die Daten in ein Format, die in ImageJ, z.B., TIFF-Format importiert werden kann. Wenn mehrere Knochenproben gleichzeitig in einem einzigen Probenröhrchen gescannt wurden, importieren Sie die Daten zuerst in ImageJ und trennen Sie jeden einzelnen Knochen durch Zuschneiden aus anderen Proben mit ImageJ Bildverarbeitungs Tools. Anschließend speichern Sie das resultierende Bild in einem Format, die später in ImageJ importiert werden kann.
Hinweis: Eine repräsentative Stichprobe-Image-Datei in der Analyse verwendeten ist im Preis inbegriffen (ergänzende Datei 1). -
Standard-2D und 3D Objekte zu simulieren.
- ImageJ-Software zu öffnen. Unter der -Plugins | BoMomics | Objekte zu simulieren Menü, die Kreis -Taste, und geben Sie 200 als der Durchmesser in das Popup-Fenster klicken Sie auf "OK" , um den simulierten Kreis mit einem Durchmesser von 200 Pixel (Abbildung 3B) zu erzeugen. Speichern Sie die generierten Kreis im TIFF-Format.
- ImageJ-Software zu öffnen. Unter der -Plugins | BoMomics | Objekte zu simulieren Menü, die Quadrat -Taste, und geben Sie 200 als die Seitenlänge in das Popup-Fenster klicken Sie auf "OK" , um die simulierte Quadrat mit einer Seitenlänge von 200 Pixel (Abbildung 3B) zu erzeugen. Speichern Sie die generierten Platz im TIFF-Format.
- ImageJ-Software zu öffnen. Unter der -Plugins | BoMomics | Objekte zu simulieren Menü, klicken Sie auf die Schaltfläche " Rechteck " und geben Sie 200 als die Breite und 100 als die Höhe in das Popup-Fenster, dann klicken Sie auf "OK" , um das simulierte Rechteck mit einer Breite von 200 Pixel und einer Höhe von 100 Pixel (Abbildung 3 erstellen B). Speichern Sie die erzeugten Rechteck im TIFF-Format.
Hinweis: Ein Kreis (Durchmesser: 200 Pixel), ein Quadrat (Seitenlänge: 200 Pixel), und ein Rechteck (Breite: 200 Pixel, Höhe: 100 Pixel) für die späteren Analysen gespeichert werden. - ImageJ-Software zu öffnen. Unter der -Plugins | BoMomics | Objekte zu simulieren Menü, klicken Sie auf die Schaltfläche " Cube " und geben Sie 30 als die Seitenlänge in das Popup-Fenster, dann klicken Sie auf "OK" , um den simulierten Cube zu erstellen. Klicken Sie zum Schluss die Plugins | 3D | Volumen-Viewer generierten Cube anzeigen und speichern Sie sie im TIFF-Format (Abb. 3C).
- ImageJ-Software zu öffnen. Unter der -Plugins | BoMomics | Objekte zu simulieren Menü, klicken Sie auf die Schaltfläche " Quader " und geben Sie 80 als die Länge, 40 wie die Breite und 30 als die Höhe in das Popup-Fenster, und klicken Sie auf "OK" um den simulierten Quader zu generieren. Klicken Sie zum Schluss die Plugins | 3D | Volumen-Viewer erzeugten Quader anzeigen und speichern Sie sie im TIFF-Format (Abb. 3C).
- ImageJ-Software zu öffnen. Unter der -Plugins | BoMomics | Objekte zu simulieren Menü, klicken Sie auf die Schaltfläche " Kugel " und geben Sie 30 als der Durchmesser in das Popup-Fenster, dann klicken Sie auf "OK" , um die simulierte Kugel zu erzeugen. Klicken Sie zum Schluss die Plugins | 3D | Volumen-Viewer generierten Bereich anzeigen und speichern Sie sie im TIFF-Format (Abb. 3C).
- ImageJ-Software zu öffnen. Unter der -Plugins | BoMomics | Objekte zu simulieren Menü, klicken Sie auf die Schaltfläche " Zylinder " und geben Sie 30 als die Durchmesser und 100 als die Höhe in das Popup-Fenster, und klicken Sie dann "OK" , um den simulierten Zylinder erzeugen. Klicken Sie zum Schluss die Plugins | 3D | Volumen-Viewer erzeugten Zylinder anzeigen und speichern Sie sie im TIFF-Format (Abb. 3C).
Hinweis: Eine Kugel (Durchmesser: 30 Pixel), einen Würfel (Seitenlänge: 30 Pixel), ein Quader (Länge: 80 Pixel; Breite: 40 Pixel, Höhe: 30 Pixel), und einen Zylinder (Durchmesser: 30 Pixel, Höhe: 100 Pixel) für die späteren Analysen gespeichert werden.
(3) Profilerstellung Analyseparameter
- Öffnen Sie ImageJ-Software und öffnen Sie oder importieren Sie ein gescanntes Bild.
- Schieben Sie die Bildlaufleiste unten wählen Sie eine Scheibe, dann klicken Sie auf das Bild | Anpassen | Schwelle Taste. Einstellen Sie im Fenster Popup-Schwelle der minimalen und maximalen Grenzwerte durch manuelle Inspektion um sicherzustellen, dass die Knochen gut vom Hintergrund getrennt sind, und zeichnen Sie der minimalen Grenzwert als Schwellenwert Kortikalis auf.
Hinweis: Da verschiedener Mikro-CT-Hersteller unterschiedliche Skalierungsfaktoren zum Speichern von x-ray Dämpfung Koeffizienten in den Bildern verwenden, sollte der tatsächliche Grenzwert empirisch entweder durch manuelle Inspektion oder nach der jeweiligen Herstellers bestimmt werden Empfehlungen. In unserer Praxis kann Einstellung der Mindestgrenze ISQ Dateien produziert von Mikro-CT Maschinen bis 6.000-7.000 zuverlässig Knochen vom Scan Hintergrund zu trennen. - Klicken Sie auf die Plugins | BoMomics | Trab Param Profiling Taste. Im Popup-Fenster, Slice-Index auf die Position des repräsentativen Slice festlegen und Kortikalis ("Cort Bone"), Bereich ("Bereich") und ("Schritt") Werte für die Berechnung einer Reihe von kortikalen Schwellenwerte für die Profilerstellung Segmentierung Parameter einstellen wo die Kortikalis Schwellenwert wird durch Schritt 3.2 (Abbildung 1) erworben. Die Reichweite und Schritt Standardwerte von 2.000 und 400 für die meisten Mikro-CT-Bilder. Legen Sie die Scheibe Index auf 5 für das Beispiel-Dataset, und behalten Sie die Standardwerte für andere Einstellungen.
Hinweis: "Cort Knochen" ist der Schwellenwert für kortikale Knochen und der Schwellenwert zur Profilerstellung Parameteränderungen aus der niedrigste Schwellenwert für den höchsten Schwellenwert mit die Schrittweite der Schrittwert, wo der niedrigste Schwellenwert ist der Wert von Cort Knochen - Palette und der höchsten Schwellenwert ist Cort Knochen + Range. Wenn die eingestellten Werte für Cort Knochen, Reichweite und Schritt 6.000, 1.000, 500, bzw. sind, dann der niedrigste Schwellenwert für kortikale Knochen 6.000: 1, 000 = 5, 000 ist, der höchsten Schwellenwert 6, 000, 000 = 7, 000 + 1 ist und die Schwellenwerte in verwendet sind die Analysen 5.000, 5.500, 6.000 6.500 und 7.000. - Geben Sie Lärm Durchmesser ("Lärm-Durchmesser"), Schritt ("") und reichen ("Range") Werte für die Angabe einer Reihe von Geräuschwerte in die Analysen und den Bohrungsdurchmesser ("Loch ø") ("Schritt") und Wertebereiche ("Range") für die Berechnung einer Reihe von Loch Werten. In der Regel funktioniert die Standardeinstellung für die meisten Mikro-CT Knochenproben, Lärm, Schritt und Reichweite 5, 5, 2 sind, wobei Lochdurchmesser, Step und Reichweite 15, 5, 2 sind. Behalten Sie die Standardeinstellungen für das Beispiel-Dataset.
Hinweis: "Dia." Lärm"ist der Durchmesser der Rauschfilter Unterdrückung und das"Loch ø"ist der Durchmesser für Löcher in den kortikalen Knochen. Der Lärm und Loch Werte für die Parameter Profilerstellung verwendet können ebenso als kortikale Schwellenwerte oben beschrieben, mit den angegebenen Lärm/Loch, Reichweite und Schritt Werte berechnet werden. Aufgrund der Schwankungen im Scan-Parameter beim Erwerb der Bilder sollte Lärm und Loch Parameter empirisch nach der Bildqualität, bestimmt werden, da keine allgemeine Bereiche der Parameter "Lärm" und Loch gut für alle Scans. Der niedrigste Wert für Schwelle, Lärm oder Löcher muss größer als oder gleich 0 sein, und wenn der berechnete niedrigsten Wert negativ mit den angegebenen Parametern ist, die bestimmte niedrigsten Wert auf 0 festgelegt ist. - Klicken Sie auf "OK" , um Parameter profiling durchzuführen. Visuell überprüfen Sie die Segmentierung Ergebnisse im Fenster Parameter Profiling Ergebnisse , und wählen Sie einen Slice-Layer, so dass die Knochen äußere Grenze ziemlich genau beschrieben wird (Abbildung 1B). Anschließend rufen Sie die Profilerstellung Parameter aus dem Eintrag in der Tabelle Parameter Profiling Ergebnisse entsprechend der gewählten Segmentebene (Tabelle 1 ab).
4. trabekuläre Analyse
-
Segmentierung der trabekulären Knochen
- Öffnen Sie ImageJ-Software, dann öffnen Sie oder importieren Sie ein gescanntes Bild.
- Klicken Sie auf die Plugins | BoMomics | Trab-Segmentierung Taste, und geben Sie entsprechende Analyseparameter. Stellen Sie "Start", "Gliederung Grenze", "Trab. Knochen","Lärm-Reduzierung ø","Loch füllen ø"und"Kortikale Dicke ø"5, 7.200, 7.000, 6, 12 und 25, beziehungsweise.
Hinweis: "Start" und "Ende" geben Sie den ausgewählte Slice-Bereich für die Segmentierung der trabekulären Knochen, "Gliederung Grenze" entspricht den profilierten "Cort Bone" Parameter "Noise Reduzierung ø", "Dia." Lärm" Parameter und "Loch füllen Dia." ""Loch ø"Parameter. "Kortikale Dicke" ø"ist die angegebene Dicke für den Ausschluss der äußeren kortikalen Knochen. "Trab. Knochen "ist der Schwellenwert für die Gewinnung von trabekulären Knochen (Abbildung 2), wo die Einstellungen bestimmt sind Befehl Profilerstellung Analyse Parameter wie beschrieben im Schritt 3.5. - Klicken Sie auf "OK" , um trabekuläre Segmentierung durchzuführen. Eine Sichtkontrolle der Segmentierung Ergebnisse im Trab Segmentierung Ergebnisfenster (Abbildung 2B). Speichern Sie die extrahierten trabekulären Knochen im Segmentierten trabekulären Knochen Fenster angezeigt in einem TIFF-Format (Abbildung 2B), die von anderer Software weiter analysiert werden kann.
-
Analyse der trabekulären Knochen.
- Öffnen Sie ImageJ-Software, dann öffnen Sie oder importieren Sie ein gescanntes Bild.
- Klicken Sie auf die Plugins | BoMomics | Trab-Analyse button und füllen Sie in entsprechende Analyseparameter, z. B. "Start", "Umriss Grenze", "Trab. "Bones", "Lärm-Reduzierung ø", "Loch füllen ø" und "Kortikale Dicke ø" als beschriebenen (Bild 3A), wo die Einstellungen bestimmt sind den Befehl Profilerstellung Analyse Parameter wie in beschrieben Schritt 3.5. Stellen Sie "Start", "Gliederung Grenze", "Trab. Knochen","Lärm-Reduzierung ø","Loch füllen ø"und"Kortikale Dicke ø"5, 7.200, 7.000, 6, 12 und 25, beziehungsweise.
Hinweis: In der kostenlosen Version des Plugins, fünf benachbarte Slices beginnend am angegebenen Index für "Start" Slice ausgewählt für die Messung, während in der kommerziellen Version, eine beliebige Anzahl von Scheiben vorgegeben werden durch den Benutzer. - Wählen Sie eine oder mehrere Optionen im Abschnitt Ergebnisse Reporting , für die Parameter gemessen werden, wo die trabekulären Knochen Volume (BV), Gesamtvolumen (TV) der ausgewählten Region und dicken entweder zweidimensional gemessen (2D) oder dreidimensional (3D) stehen zur Auswahl durch drei Checkboxen, nämlich "BV nur TV", "2D" und "3D". Wählen Sie die Kontrollkästchen "2D" und "3D", und klicken Sie dann auf "OK", um die trabekuläre Analysen (Abbildung 3, Tabelle 2).
Hinweis: Wenn "BV TV nur" aktiviert ist, unabhängig von der Auswahl-Status der "2D" und "3D", rohe Maßnahmen der BV, TV und Intensität werden gemeldet, und die segmentierten trabekulären Knochen sind extrahiert und angezeigt in einem neuen Fenster, die gespeichert und von anderen weiter analysiert werden können Software. Wenn "2D" aktiviert ist, werden rohe Maßnahmen BV, TV, Intensität und dicken gemessen zweidimensional auf jeder Scheibe-Ebene mit dem Schalenmodell gemeldet. Wenn "3D" aktiviert ist, werden dreidimensionale Dicke für jedes Voxel direkt ohne jede Modell Annahme, dann roh Maßnahmen der BV, errechnet TV, Intensität und dreidimensionale dicken Stichprobe auf jeder Scheibe Ebene gemeldet. Wenn kein Kontrollkästchen aktiviert ist, trabekuläre Knochen sind segmentiert, mit den oben genannten Satz von Parametern, jedoch keine Messung wird berichtet.
(5) Quantifizierung der simulierte Objekten
- Öffnen Sie ImageJ-Software zu, dann öffnen Sie eine simulierte Bild. Hier öffnen Sie die simulierte Kugel mit einem Durchmesser von 30 Pixeln als Vorbild.
- Wählen Sie die -Plugins | BoMomics | Trab-Analyse button und füllen Sie geeignete Analyseparameter wie zuvor beschrieben. Halten Sie die Default-Werte für "Start", "Ende", "Gliederung Grenze", "Trab. Knochen", und Set"Lärm-Reduzierung ø","Lärm-Reduzierung ø","Loch füllen ø"und"Kortikale Dicke ø"auf 0 (Abbildung 3).
Hinweis: Für simulierte Objekte gibt es keine unbeabsichtigten Signalrauschen und möglicherweise gibt es keine entsprechenden kortikalen Muscheln. Daher sollten Parameter für solche Werte entsprechend eingestellt werden (Standard-Einstellungen sind auf Null). Für 3D Quantifizierungen Scheiben 30 vor und nach der angegebenen "Start" Slice verarbeitet sind, mit der kostenlosen Version des Plugins, während nur Scheiben im Bereich von "Start" und "End" Scheiben durch die kommerzielle Version des Plugins analysiert werden. - Wählen Sie im Abschnitt Ergebnisse Berichterstattung "2D" und "3D" für den Parameter gemessen werden soll, und klicken Sie auf "OK" , um die trabekuläre Analysen für das simulierte Objekt (Tabelle 3).
6. Kalibrierung des trabekulären Maßnahmen und Darstellung der Daten: Profil die Verteilungen der trabekuläre Maßnahmen in der Analyse der ausgewählten Region
- Erhalten Sie die Kalibrierungsinformationen aus dem gescannten Dataset gemäß den Anweisungen des Herstellers der Mikro-CT.
Hinweis: Nur rohe Maßnahmen BV, TV, Intensität und dicken sind durch das Plugin berichtet. Um Maßnahmen vergleichbar mit Berichten, die von anderer Software zu erhalten, ist Ergebnis Kalibrierung gewünscht. - Öffnen Sie Microsoft Excel, und öffnen Sie die berichteten Ergebnistabelle. Berechnen Sie kalibriert Knochenvolumen (BV), total Volume (TV), Bone Mineral Content (BMC), Knochen-Volumenanteil (BV/TV) und Knochenmineraldichte (BMD) in neue excel-Spalten mithilfe der gemeldeten BV, TV und Intensität Rohwerte entsprechend den folgenden ausdrücken.
- Hinweis: Scannen Auflösung (Auflösung, µm), graue scaling (Skalierung), Dichteeinheiten (mg HA/cm3) Dichte Steigung (Steigung) und Dichte abfangen (Achsenabschnitt) extrahiert werden können aus den gescannten Mikro-CT Bild- oder Meta-Dateien, z. B. die Scanco ISQ-Datei. Die kalibrierten Maßnahmen sind daher wie folgt berechnet:
Angenommen, BV, TV und Intensität sind roh Maßnahmen, BVc und TVc kalibrierten Werte, Auflösung, skalieren, Steigung, Achsenabschnitt sind aus Kalibrierdateien von Mikro - CT Bilder.
BVc = BV × Auflösung3 [μm3]
TVc = TV-Auflösung ×3 [μm3]
BV / TV = BV ÷ TV
BMC = (Intensität ÷ × Steigung - BV × abfangen Skalierung) × Auflösung3 × 10-12 [mg HA]
BMD - BMC ÷ TVc × 1012 [mg HA / cm3] - Erstellen Sie einen XY (Scatter) Plot für kalibrierte Maßnahmen (Y) gegen Slice Schichten (X) mit Microsoft Excel-Software (Abbildung 4).
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Representative Results
Die trabekuläre Analyse-Plugin soll automatisch zu segmentieren und trabekuläre Knochen mit Genauigkeit zu quantifizieren. Zunächst Knochen äußere Begrenzung erkannt und abgegrenzt ist gefolgt von einer Loch-Füllung-Operation, wo keine Löcher im äußeren kortikalen Knochen Schalen gefüllt. Dann ist eine Erosion-Operation durchgeführt, um die äußeren kortikalen Knochen auszuschließen und die segmentierten trabekulären Knochen. Schließlich werden Maßnahmen der trabekulären Knochen in der segmentierten Region quantifiziert.
Mikro-CT-Aufnahmen von Natur aus laut, Segmentierungen mit vordefinierten beliebige Parameter oft sind nicht die Knochen äußere Grenzen genau zu identifizieren. Es ist mühsam und arbeitsintensiv, viele Parameterkombinationen für die Auswahl zufriedenstellend Segmentierung Parameter versuchen. Daher ist ein profiling-Plugin-Parameter vorgesehenen Änderung der Parameter eins nach dem anderen im eingestellten Bereich automatisch zu helfen bei der Auswahl zufrieden stellend Parameterkombinationen, der erleichtert auch die Auswahl eines gemeinsamen Satzes von Parametern für eine Gruppe von Knochen Proben. Abbildung 1 A zeigt die Einstellungen für die Profilerstellung gute Segmentierung Parameter verwendet. Wenn die Parameter für die Kortikalis Schwelle (Cort Knochen), Auswahl der Schwellenwert auf profiliert (Range) und Inkrement Betrag für den Schwellenwert (Schritt) bei jedem Schritt angegeben sind, werden eine Reihe von Schwellenwerten profiliert werden generiert. Anschließend eine Reihe von Lärm- und Loch Werte werden in ähnlicher Weise durch die Einstellung der entsprechenden Parameter generiert. Zu guter Letzt sind trabekuläre Knochen durch Veränderung der Parameter eine zu einem Zeitpunkt für alle möglichen Parameterkombinationen segmentiert. Abbildung 1 B zeigt die repräsentative Segmentierung Ergebnisse für unterschiedliche Parameterkombinationen. Natürlich, einige Parameterkombinationen sind besser als andere äußere Grenzziehungen des Knochens, und mehrere Parameterkombination zeigt zufriedenstellende Segmentierung Ergebnisse. Nach der Segmentierung Ergebnisse visuell zu überprüfen, können Parameterwerte für zufrieden stellende Segmentierungen aus der Profilerstellung Ergebnistabelle (Tabelle 1) abgerufen werden.
Um Maßnahmen der trabekulären Knochen zu quantifizieren, trabekuläre Segmentierung und Analyse durchgeführt. Abbildung 2 A zeigt die Einstellung Dialog für die trabekuläre Segmentierung, wo trabekuläre Knochen in der gewählten Region sind segmentiert (Abbildung 2B) extrahiert und Segmentierung Ergebnisse mit den angegebenen Parametern können überprüft werden Stück um Stück visuell. Anschließend sind trabekuläre Knochen mit zufriedenstellenden Parametern(Abbildung 3)analysiert. Je nach der Auswahl Status reporting-Möglichkeiten, roh Quantifizierungen der Knochenvolumen (BV), Gesamtvolumen (TV), Summe der Grauwerte (Intensität) und dicken gemessen entweder zwei dimensional oder drei dimensional (Tabelle 2) werden gemeldet. Zu guter Letzt Kalibrierungsinformationen aus gescannten Mikro-CT-Datensatz extrahiert und Maßnahmen der BV, TV, BMC, BV/TV kalibriert und BMD berechnet gefolgt durch Profilierung ihrer Verteilungen in der ausgewählten Analyse Region--schichtweise gegen die Schicht Positionen (Abbildung 4).
Als Qualitätskontrolle Feature des Plugins ist Quantifizierung der simulierten Objekten unterstützt. Simulierte Standardobjekte mit bekannten Dimensionen sind durch das Plugin für den Vergleich mit den theoretischen Werten oder Maßnahmen von anderer Software, wie kommerzielle Software mitgeliefert Mikro-CT Maschinen oder BoneJ14, ein freies open-Source-Plugin quantifiziert. für die Knochen Bildanalyse. Für die Analyse von simulierter Objekten, die Lärm-Einstellungen auf Null gesetzt, da simulierte Bilder als qualitativ hochwertige Bilder ohne Lärm gelten. Objekte mit verschiedenen dicken wurden simuliert und die Ergebnisse werden angezeigt (Abbildung 3, Tabelle 3). Für simulierte standard 2D Objekte wie Kreise, Quadrate und Rechtecke, exakte Werte für Bereich (TV oder BV) und Dicke gemeldet werden (Tabelle 3). Für 3D-Objekte genaue Dicke Maßnahmen für Würfel, Kugeln und Quader werden gemeldet, die dicken für Zylinder sind jedoch nicht für Voxel in der Nähe von beiden Enden des Zylinders genau während der Voxel-dicken in den mittleren Scheiben der Zylinder genau wie sind vorhergesagt. Dies ist ein Feature des zugrunde liegenden Dicke Messung Algorithmus, wobei die Voxel Dicke für jedes Objekt wird durch den Durchmesser der größte Kugel oder die Seitenlänge des größten Cubes, die diese Voxel enthält und ist völlig innen bestimmt die Objekt. Daher stärken von Objekten aus verschiedenen Bereichen und Würfel genau gemessen werden können, während der Zylinder nur in der mittleren Scheibe Radius-Entfernung von beiden Enden genau gemessen werden können.
Abbildung 1 : Repräsentative Ergebnisse des Parameters Profilerstellung Analyse. (A) die Parameter-Einstellung Seite. (B) repräsentative Ergebnisse des Parameters Profilerstellung Analyse. Einige Parameterkombinationen sind besser als andere für die äußeren Grenzen der Knochen zu erkennen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Repräsentative Ergebnisse der trabekuläre Segmentierung Analyse. (A) die Parameter-Einstellung Seite. (B) repräsentative Segmentierung Ergebnisse der trabekulären Knochen auf verschiedenen Layern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Trabekuläre Analyse. (A) die Parameter-Einstellung Seite. (B) repräsentative Ergebnisse der simulierten 2D Objekte. (C) repräsentative Ergebnisse der simulierten 3D-Objekte von 3D-Volumen Viewer visualisiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Verteilung der trabekulären Knochen Maßnahmen in der gewählten Analyse Region. Die horizontale Achse stellt die relative Entfernung zum Ausgangspunkt Segmentebene im Großraum analysieren. Werte in der Y-Achse sind kalibrierte trabekuläre Maßnahmen im Bereich Analyse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Slice | Umriss-Grenze | Lärm-Reduzierung ø | Durchmesser Loch füllen. |
| 4 | 5200 | 0 | 10 |
| 147 | 5200 | 2 | 20 |
| 361 | 7200 | 6 | 16 |
| 539 | 8000 | 10 | 20 |
Tabelle 1: Repräsentative Ergebnisse des Parameters Profilerstellung Analyse.
Tabelle 2: Repräsentative Ergebnisse der trabekuläre Analyse.
| Objekt | Dimension | Bandb | Oberflächec | Dicke |
| Platz | 200 X 200 | 40000 | 796 | 200 |
| Rechteck | 200 X 100 | 20000 | 596 | 100 |
| Kreis | Dia: 200 | 31428 | 796 | 200 |
| Cube | 30 X 30 X 30 | 27000 | 5048 | 30 |
| Quader | 80 X 40 X 30 | 96000 | 13008 | 30 |
| Kugel | Dia: 30 | 14328 | 3944 | 30 |
| Zylinderd | Dia:30; H: 100 | 71600 | 12800 | 27.84 |
| Zylinder-e | Dia:30; H: 100 | 51552 | 9552 | 30 |
| a: Ergebnisse sind in rohen Voxel. Durchmesser: Durchmesser; H: Höhe. | ||||
| b: Volumen (3D) oder Fläche (2D). | ||||
| c: Oberfläche (3D) oder Perimeter (2D). | ||||
| d: Measurs Scheibe 1, 100 Stück werden für die Analyse verwendet. | ||||
| e: Measurs Scheibe 15 Slice 85 sind für die Analyse verwendet. | ||||
Tabelle 3: Quantifizierung Ergebnisse für simulierte Objekte.
Ergänzende Datei 1. Probieren Sie Knochen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Diese Studie beschreibt eine ImageJ-Plugin für die Analyse der trabekulären Knochen, die automatische, effiziente, und benutzerfreundlich. Das Plugin kann auch verwendet werden, um jedes 2D oder 3D Objekt Schicht für Schicht Maßnahmen der Flächen, Volumen und dicken zu quantifizieren. Derzeit wird nur einen einzigen Messwert für jeden trabekuläre Parameter für jede Probe von Mikro-CT Standardanalyse, berichtet die voll nicht die Merkmale der gemessenen Entität in der gewählten Analyse Region darstellen kann. Die beschriebenen Plugin meldet Schicht für Schicht Mengen der einzelnen Parameter für jede Probe, die voll und ganz die Verteilungsinformationen von der gemessenen Parameter in der gewählten Analyse Region und daher weiter fortgeschritten und empfindlichen statistische behält Ansätze sind für die Analyse solcher Daten anwendbar.
Mit der standard, halbautomatische Hand Konturierung Segmentierung Methode wurden erhebliche Unterschiede zwischen verschiedenen Hand-Konturierung Scheiben mit Operator Bias8,9,10, rechtfertigt eine einheitlichere beobachtet und automatische Methode für die trabekuläre Segmentierung. Wie der Kontrast zwischen dem Scan Hintergrund und die Knochen äußere Begrenzung maximal ist, äußere Begrenzung assistierten trabekuläre Segmentierung erfolgt durch die das Plugin, wo der Knochen äußere Begrenzung mit Genauigkeit bei Bedarf automatisch erkannt werden können Schwelle, Lärm und Loch-Einstellungen stehen zur Verfügung. Zur Erleichterung der Bestimmung der Segmentierung Parameter verschiedener Parameter, die Kombinationen sind profiliert eins nach dem anderen mit einer repräsentativen Scheibe aus der Analyse Region, und zufriedenstellende Segmentierung Ergebnisse werden visuell überprüft. Anschließend werden die trabekuläre Knochen mit den profilierten Parametern analysiert. Wenn entsprechende Segmentierung Parameter eingestellt werden und das Plugin erfolgreich eingesetzt hat, um trabekulären Knochen von Ratte distalen Oberschenkelknochen mit verschiedenen Knochen Anabolika5behandelt zu analysieren, sind reproduzierbare Ergebnisse für das gleiche Bild berichtet. unvoreingenommen Operator.
Das Plugin kann derzeit nur eine Probe gleichzeitig verarbeiten. Wenn mehrere Muster im Bild vorhanden sind, werden alle Proben als ein einzelnes Objekt ohne Diskriminierung quantifiziert. Daher ist die Vorverarbeitung erforderlich, wenn mehrere Proben gleichzeitig in einem einzigen Probenröhrchen gescannt werden. Die Quantifizierung Ausgänge sind roh Maßnahmen der Pixel zählt oder Grauwerte, die manuell mit entsprechenden Kalibrierungsinformationen kalibriert werden sollte.
Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist das geeignete Parameter für die trabekuläre Analyse auswählen. In der Regel werden Gruppen von Knochenproben analysiert mit identischen Segmentierung Parametern, um die Ergebnisse vergleichbar zu machen. In einem solchen Fall sollte darauf geachtet werden, um sicherzustellen, dass die Segmentierung Ergebnisse für alle Proben visuell auf mögliche Fehler geprüft werden, bevor weitere Analysen durchgeführt werden.
Eine große Einschränkung dieser Technik ist, dass die Rauschunterdrückung Einstellungen auf kortikale Knochen nur für Konturierung einen Knochen äußere Grenze, aber nicht auf extrahierten trabekulären Knochen angewendet werden. Wie verschiedene filternde Strategien gemeldeten15 als optimal für die trabekuläre Analyse unter verschiedenen Bedingungen gewesen sein, ist kein einziger Filter gut für alle Bildbeispiele. Daher gibt es keine eingebaute Filtrationsschritt vor der Quantifizierung der trabekulären Knochen. Mit der Ausgabe von Software mit integrierten Bild Filtrationen kompatibel sein soll, können extrahierte trabekuläre Knochen verarbeiteten ebenso erste mit verschiedenen imaging-Tools, und dann in ImageJ importiert und anschließend durch das Plugin quantifiziert. Darüber hinaus verschiedene Bildformate werden von unterschiedlichen Anbietern von Mikro-CT, generiert und die meisten von ihnen können nicht importiert oder direkt von ImageJ geöffnet, damit Module für verschiedene Bildformate in ImageJ zur weiteren Analyse importieren sind erwünscht. Eine weitere Einschränkung ist, dass die 3D dicken Scheiben nahe den Enden des Auswahlbereichs nicht genau sind, wenn Teil der Objekte befinden sich außerhalb der Auswahlbereich, das auch gilt für alle verfügbaren 3D Quantifizierung Pakete, also einen größeren Bereich von Scheiben quantifiziert werden sollte, und nur der mittlere Teil des ausgewählten Scheiben sollte zur weiteren Analyse verwendet werden. Ein solcher Ansatz ist nur verfügbar, wenn Messgrößen sind gemeldeten Schicht für Schicht, wie in diesem Plugin, aber nicht für Messungen gezeigt, dass nur ein einziger Wert für jeden quantifizierte Parameter in den Auswahlbereich gemeldet wird.
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Disclosures
Ein Patent für den zugrunde liegenden Algorithmus zur Quantifizierung Objekt Dicke wurde eingereicht. Die Autoren in Zusammenarbeit mit anderen registriert die bomomics.com Website-Hosting-die kostenlose Version Plugins, wo Beratung und Dienstleistungen der Bildanalyse Quantifizierung auf Anfrage bereitgestellt werden.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch Grant NFSC 81170806 unterstützt. Die Autoren möchten danken, der Mikro-CT-zentrale Einrichtung der Schule der Stomatologie, Wuhan Universität für Scannen und analysieren die Ratte Oberschenkelknochen zu helfen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ | NIH | imagej | Any version with a java 1.8 run time |
| trabecular analysis plugin | Bomomics | bomomics | free or commercial version |
| Micro CT scanner | Scanco | μ-50 | micro CT from any vendor |
| Computer System | Lenovo | any brand | |
| Windows Operating System | Microsoft | Windows 7 x64 | any 64-bit Windows operating system |
| Office Software | Microsoft | Office 2010 | any speadsheet software that has xy chart function |
References
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