Summary
אנו מציגים זרימת עבודה עבור הממיין וכימות עצמות trabecular לתמונות מימד מבוסס על הגבול החיצוני של העצם באמצעות תוסף ImageJ. גישה זו הוא יותר יעיל, מדויק יותר הגישה הנוכחית יד-עיצוב ידני ומספק שכבה-על quantifications, אשר אינן זמינות תוכנה מסחרית הנוכחי.
Abstract
מיקרו-שחושב טומוגרפיה (מיקרו-CT) משמש באופן שגרתי להעריך כמות העצם trabecular microstructural נכסים חיות קטנות בתנאים אובדן עצם שונה. עם זאת, הגישה סטנדרטיים לניתוח trabecular של מיקרו-CT תמונות הוא פרוסה-מאת-פרוסה חצי אוטומטי יד-יצירת מיתאר, שהוא עבודה אינטנסיבית, מועדת לשגיאות. המתוארים כאן היא שיטה יעילה עבור פילוח אוטומטית של עצמות trabecular על פי הגבולות החיצוניים של העצם, עצמות trabecular יכול להיות מזוהה ואיפה מחולקים באופן אוטומטי עם דיוק עם פחות הטיה מפעיל בעת הצורך פילוח פרמטרים מוגדרים. לעשות פרופיל פרמטרים פילוח משביע רצון, אוסף תמונות של פילוח התוצאות מוצגים, שבו כל השילובים האפשריים של הפרמטרים פילוח הם אחד שהשתנה אחד ברצף, פילוח תוצאות עם פרמטרים הקשורים בקלות באופן חזותי להיבדק. כתכונה בקרת איכות של התוסף, מדומה עצמים רגילים הם לכמת איפה בכמויות מדודות ניתן להשוואה עם ערכים תיאורטי. שכבה על כימות של מאפייני trabecular, עוביים trabecular מדווחים על ידי תוסף כזה, יכול להיות מתועדים חלוקות של מאפיינים כאלה בתוך האזורים שנבחרו בקלות. למרות שכבה-על כימות שומרת מידע נוסף אודות עצמות trabecular מקלה עוד יותר ניתוח סטטיסטי של שינויים מבניים, אמצעים כאלה אינן זמינות מהפלט של תוכנה מסחרית הנוכחי, שבו בודדת כימות ערך עבור כל פרמטר הוא דיווח עבור כל דגימה. לכן, זרימות העבודה המתוארים הם יותר גישות לניתוח עצמות trabecular עם יעילות ודיוק.
Introduction
ניתוח מיקרו-CT של עצמות trabecular הוא הגישה סטנדרטי עבור מעקב אחר שינויים מורפולוגיים של עצמות חיות קטנות תחת עצם שונה הפסד תנאים1,2,3, שבו מספר משתנים הקשורים מבנים של העצמות הן דווח על4. עם זאת, פרמטרים כגון אינם מופצים בצורה שווה, metaphysis של עצמות ארוכות5ודיווח רק ערך מסוכמים או בממוצע הוא עבור כל משתנה מבנית של כל מדגם הנוכחי מכונות מיקרו-CT מסחרי6,7 , על פי ערך בודד לא יכול לייצג באופן מלא את המאפיינים של פרמטר נמדד באזור וניתוח. שכבה על כימות של עצמות trabecular לא רק שומרת מידע נוסף עבור כל משתנה, אלא גם מאפשרת את בניית פרופיל של חלוקות של משתנים כגון באזור וניתוח, להקל על ניתוח סטטיסטי עוקבות של מבנה שינויים תחת תנאים שונים5. לכן, המטרה של שיטה זו הוא לכימות עצמות trabecular של מיקרו-CT סריקות ברמה כל פרוסה, אשר אינה זמינה בחבילה כל ניתוח מיקרו-CT הנמכרים כיום.
ביעילות קטע העצמות trabecular פרוסה-מאת-פרוסה, פילוח אוטומטי שיטות הם רצויים. עם זאת, הטכניקה הסטנדרטי הנוכחי עבור ניתוח מיקרו-CT מבוסס על עיצוב אינטראקטיבי ידנית ואחריו אוטומטי אינטרפולציה כדי להפריד בין עצמות trabecular של התאים בקליפת המוח, אשר עמל רב, מועדת לטעויות, ו משויך למפעיל ניכר הסטייה8,9,10. פילוח אוטומטי שיטות11,12 דווחו, אך שיטות כאלה הם רק אופטימלית באזורים עם הפרדה טובה בין עצמות trabecular ועצמות בקליפת המוח, אבל לא באזורים ללא הפרדות צבע ברור. יתר על כן, פילוח שונים הפרמטרים הנדרשים עבור מדגמים שונים12, זה מייגע לבחור באופן ידני את פילוח משביע רצון פרמטרים החלים על קבוצות של דגימות העצם על-ידי ניסיון שילובים שונים פרמטר12, אף-על-פי התהליך. פילוח הוא אוטומטי כאשר כל הפרמטרים הקשורים מוגדרות. הגבול החיצוני של עצם יש הניגוד הגדול עם רקע סריקה ולהציג הקליפות metaphyseal קורטיקלית של עצמות ארוכות כמה שינויים בבית הנבחרים ניתוח באזור, שיטות פילוח לפי קו המתאר החיצוני-גבולות של עצמות ארוכות יכולה אמינה ומדוייקת להפריד בין העצמות trabecular מן הפגזים קורטיקלית. היתרון של פילוח של השיטה היא כי פילוח מבוסס על ההבדל בין הרקע לבין הגבול החיצוני של העצם, אך לא על ההבדלים בין עצמות trabecular וקורטיקלית6,12, 13, לכן זה בדרך כלל קל למצוא שילוב של פרמטרים פילוח זה משביע רצון עבור קבוצה של עצם דגימות, הקלת ניתוח אמין יותר של שינויים trabecular בין קבוצות שונות.
על כל פרוסה, אזור, היקף ורמת דו מימדי (2D) עובי מדווחים לניתוח דו-מימדית, בעוד אמצעי האחסון, משטח תלת מימדי (3D) עובי דווח בכלי quantifications תלת-ממד. מידע כזה הוא בדרך כלל שלא דווחו על ידי כלי ניתוח התמונה הנוכחית, המציין כי ההליכים שדווחו ניתן ליישם כללי תמונות שבו מידע כזה רצוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הליכים הכוללים נושאים בעלי חיים נערכו על פי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (NIH הפרסום, המהדורה השמינית, 2011), כבר נבדקו והם יהיו אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש של ווהאן האוניברסיטה.
1. התקנת תוכנה
- להתקין את התוכנה ImageJ. הורד את גירסת Windows התוכנה ImageJ (גירסה 1.51 p) יחד עם 64 סיביות Java של https://imagej.nih.gov/ij/. לחלץ את התוכנה שהורדת לתוך תיקיה, אשר לאחר מכן יכונו כספריית"ImageJ".
הערה: ניתוח Trabecular תוספים לדרוש java 64 סיביות לרוץ זמן (גירסה 1.8), מערכת הפעלה windows של 64-bit, רצוי 64 סיביות של Windows 7 מערכת הפעלה. - להתקין תוספים ניתוח trabecular. לבקש תוספים ניתוח trabecular מ- http://www.bomomics.com, לפתוח את התוכן לתוך ספריית תוספים של ImageJ, אשר הוא "מדריך ImageJ/תוספים".
הערה: התוסף ניתן להשיג גרסה חופשית, איפה המידות עבור 5 צוין סמוך פרוסות מדווחים, או כמו גרסה מסחרית, שבו מגוון של פרוסות ניתן שצוין, נמדד.
2. מכינים את הנתונים (dataset) 3D לניתוח Trabecular
- סריקת עצמות הירך עכברוש עם קהל מעריצים מיקרו-CT מכונת תקן סריקה פרוטוקול5 ולאחר מכן לשמור את הנתונים בתבנית שניתן לייבא לתוך ImageJ, לדוגמה, בתבנית tiff. אם מספר דוגמאות עצם נסרקו בו-זמנית בשפופרת מדגם יחיד, תחילה לייבא את הנתונים לתוך ImageJ ולאחר מכן להפריד כל עצם בודדים על-ידי חיתוך דגימות אחרות באמצעות עיבוד כלי התמונה של ImageJ. לאחר מכן לשמור את התמונה הנוצרת בתבנית שניתן לייבא לתוך ImageJ מאוחר יותר.
הערה: קובץ תמונה במדגם מייצג ניתוח כלולה (1 קובץ משלים). -
לדמות אובייקטים 2D and 3D סטנדרטי.
- פתח את תוכנת ImageJ. תחת התוספים | BoMomics | לדמות אובייקטים תפריט, לחץ על הלחצן מעגל , ואת הזן 200 בקוטר של החלון המוקפץ ולאחר מכן לחץ על אישור כדי ליצור את מעגל מדומה בקוטר של 200 פיקסלים (איור 3ב). לשמור את המעגל שנוצר בתבנית tiff.
- פתח את תוכנת ImageJ. תחת התוספים | BoMomics | לדמות אובייקטים תפריט, לחץ על כפתור מרובע , ואת הזן 200 כמו אורך צד בחלון מוקפץ, ולאחר מכן לחץ על אישור כדי ליצור את הכיכר מדומה באורך הצד של 200 פיקסלים (איור 3ב). להציל את הריבוע שנוצר בתבנית tiff.
- פתח את תוכנת ImageJ. תחת התוספים | BoMomics | לדמות אובייקטים תפריט, לחץ על הלחצן מלבן , ואת הזן 200 הרוחב, 100 גובה החלון המוקפץ ולאחר מכן לחץ על אישור כדי ליצור את המלבן מדומה עם רוחב של 200 פיקסלים, גובה 100 פיקסלים (איור 3 B). לשמור את המלבן שנוצר בתבנית tiff.
הערה: עיגול (קוטר: 200 פיקסלים), ריבוע (צד אורך: 200 פיקסלים), ומלבן (רוחב: 200 פיקסלים; גובה: 100 פיקסלים) נשמרים עבור הניתוחים עוקבות. - פתח את תוכנת ImageJ. תחת התוספים | BoMomics | לדמות אובייקטים תפריט, לחץ על הלחצן קוביה , ואת הזן 30 כמו אורך צד בחלון המוקפץ ולאחר מכן לחץ על אישור כדי ליצור את הקוביה מדומה. לבסוף, לחץ על של תוספים | 3D | נפח הצופה כדי להציג את הקוביה שנוצר ושמור אותו בתבנית tiff (איור 3ג').
- פתח את תוכנת ImageJ. תחת התוספים | BoMomics | לדמות אובייקטים תפריט, לחץ על לחצן תיבה , ואת הזן 80 כמו האורך, 40 כחלק הרוחב, ו- 30 כמו הגובה בחלון ' קופץ ', ולאחר מכן לחץ על אישור כדי ליצור את תיבה מדומה. לבסוף, לחץ על של תוספים | 3D | נפח הצופה כדי להציג את תיבה שנוצר ושמור אותו בתבנית tiff (איור 3ג').
- פתח את תוכנת ImageJ. תחת התוספים | BoMomics | לדמות אובייקטים תפריט, לחץ על לחצן כדור , ואת הזן 30 בקוטר של החלון המוקפץ ולאחר מכן לחץ על אישור כדי ליצור את הספרה מדומה. לבסוף, לחץ על של תוספים | 3D | נפח הצופה הצג את הספרה שנוצר ולשמור אותו בתבנית tiff (איור 3ג').
- פתח את תוכנת ImageJ. תחת התוספים | BoMomics | לדמות אובייקטים תפריט, לחץ על לחצן ' גליל ', ואת הזן 30 וגם את הקוטר 100 גובה החלון המוקפץ ולאחר מכן לחץ על אישור כדי ליצור את הצילינדר מדומה. לבסוף, לחץ על של תוספים | 3D | נפח הצופה הצג את הגליל שנוצר ולשמור אותו בתבנית tiff (איור 3ג').
הערה: כדור (קוטר: 30 פיקסלים), קוביה (צד אורך: 30 פיקסלים), cuboid (אורך: 80 פיקסלים; רוחב: 40 פיקסלים; גובה: 30 פיקסלים), וגליל (קוטר: 30 פיקסלים; גובה: 100 פיקסלים) נשמרים עבור הניתוחים הבאים.
3. יצירת פרופיל ניתוח הפרמטרים
- פתח את תוכנת ImageJ, פתח או לייבא תמונה סרוקה.
- שקופית הגלילה למטה לבחירת פרוסה אחת ולאחר מכן לחץ על את התמונה | התאם | סף לחצן. בחלון הסף ' קופץ ', התאימו את ערכי סף המינימום והמקסימום על ידי בדיקה ידנית על מנת להבטיח כי עצמות מופרדים היטב מהרקע, והקלטה של ערך מינימלי כערך סף עצם קורטיקלית.
הערה: כמו מיקרו-CT יצרנים שונים להשתמש גורמים קנה מידה שונים לאחסון. רנטגן הנחתה המקדמים של תמונות, ערך הסף בפועל צריך להיות נחוש מדעית או על ידי בדיקה ידנית או בעקבות ספציפיות של היצרן המלצות. במרפאה שלנו, הגדרת את הסף המינימלי עבור קבצים ISQ המיוצר על ידי מכונות מיקרו-CT כדי 6,000 – 7,000 יכול באופן אמין להפריד בין העצמות מהרקע סריקה. - לחץ על התוספים | BoMomics | יצירת פרופיל Param Trab לחצן. בחלון ' קופץ ', להגדיר אינדקס הפרוסה למיקום של הפרוסה נציג והגדר את איברי הפנימיים ("עצם קורט"), טווח ("טווח") וערכים צעד ("") עבור חישוב ערכה של סף קורטיקלית עבור פרופיל פרמטרים פילוח, איפה ערך הסף קליפת העצם שקצרנו נרכשת ע י שלב 3.2 (איור 1). ערכי ברירת המחדל טווח ועל שלב של עבודה 2000 ו- 400 עבור רוב התמונות מיקרו-CT. הגדרת אינדקס פרוסה 5 עבור ערכת הנתונים לדוגמה, ולשמור על ערכי ברירת המחדל עבור הגדרות אחרות.
הערה: "עצם קורט" הוא הסף עבור עצמות בקליפת המוח, את ערך הסף המשמש שינויים פרופיל פרמטר מהערך הנמוך ביותר סף הערך הסף הגבוה ביותר עם התוספת בערך השלב, שבו הערך הסף הנמוך ביותר הוא הערך של קורט עצם - טווח, ואת הערך הסף הגבוה ביותר הוא עצם קורט + טווח. אם הערכים הגדרת העצם קורט, טווח של שלב הם 6,000 1,000, 500, בהתאמה, ולאחר מכן ערך הסף הנמוך עצמות בקליפת המוח הוא 6,000-1, 000 = 5, 000, הערך הסף הגבוה ביותר הוא 6, 000 + 1, 000 = 7, 000 הסף בשימוש הניתוחים הם 5,000, 5,500, 6,000, 6,500 וכ-7,000. - להגדיר. הרעש קוטר ("רעש בקטרים"), צעד ("צעד"), טווח ערכים ("טווח") עבור ציון קבוצת ערכים רעש ב הניתוחים, קוטר חור ("חור בקטרים"), צעד (""), ואת טווח ("טווח") ערכים לחישוב קבוצת ערכים חור. באופן כללי, הגדרת ברירת המחדל פועלת עבור רוב דגימות מיקרו-CT העצם, שבו הרעש, שלב טווח הן 5, 5, 2, בהתאמה, קוטר חור, שלב טווח הן 15, 5, 2, בהתאמה. שמור את הגדרות ברירת המחדל ערכת נתונים לדוגמה.
הערה: "רעש בקטרים" הוא הקוטר למסנן דיכוי רעש, "חור בקטרים" הוא בקוטר עבור חורים בתוך העצמות קורטיקלית. ניתן לחשב את ערכי הרעש, חור המשמש עבור פרמטר פרופיל באופן דומה כמו ערכי הסף בקליפת המוח שתוארו לעיל, באמצעות רעש שצוין/חור, בטווח, ולאחר שלב ערכים. עקב הווריאציות סריקה פרמטרים בעת רכישת התמונות, רעש, חור פרמטרים צריך להיות נחוש מדעית על פי איכות התמונה, כפי אין כללי טווחים של רעש, חור פרמטרים טובים עבור כל הסריקות. הערך הנמוך ביותר על הסף, רעש או חורים חייב להיות גדול או שווה ל- 0, אם הערך הנמוך ביותר מחושב שלילי באמצעות הפרמטרים שסופקו, הערך הנמוך ביותר מסוים נקבע על 0. - לחץ על אישור כדי לבצע פרמטר פרופיל. מבחינה ויזואלית בדקו את פילוח התוצאות בחלון תוצאות פרופיל פרמטר ובחרו שכבה פרוסה כך הגבול החיצוני של עצם המותווה בצורה מדויקת למדי (איור 1B). לאחר מכן, לאחזר את הפרמטרים פרופיל מהערך שבטבלה פרמטר פרופיל תוצאות התואמות השכבה פרוסה שבחרת (טבלה 1).
4. ניתוח trabecular
-
פילוח של עצמות trabecular
- פתח את תוכנת ImageJ, ולאחר מכן פתח או לייבא תמונה סרוקה.
- לחץ על התוספים | BoMomics | פילוח Trab כפתור ומלא את הפרמטרים המתאימים לניתוח. הגדר "התחל", "חלוקה לרמות גבול", "Trab. עצמות","רעש הפחתת דייה","חור מילוי בקטרים"ו-"קורטיקלית עובי בקטרים"5, 7,200, 7,000, 6, 12, 25, בהתאמה.
הערה: "התחל", "סיום" ציין את טווח פרוסה שנבחרו עבור פילוח של עצמות trabecular, "גבולות החלוקה לרמות" היא המתאימה את הפרמטר "קורט עצם" צדודית, "רעש הפחתת בקטרים" כדי "רעש בקטרים" פרמטר, "חור מילוי בקטרים" לפרמטר "חור דייה". "התורשתי בקטרים" הוא עובי מסוים להוצאת עצמות בקליפת המוח החיצונית. "Trab. עצמות "הסף לחילוץ עצמות trabecular (איור 2), שם ההגדרות נקבעות באמצעות פרופיל ניתוח פרמטרים הפקודה כפי שמתואר בשלב 3.5. - לחץ על אישור כדי לבצע פילוח trabecular. בדיקה חזותית את פילוח התוצאות בחלון Trab פילוח תוצאות (איור 2B). שמור את העצמות trabecular שחולצו שמוצג בחלון מקוטע עצמות Trabecular בתבנית tiff (איור 2B), אשר ניתן לנתח עוד יותר על ידי תוכנות אחרות.
-
ניתוח של עצמות trabecular.
- פתח את תוכנת ImageJ, ולאחר מכן פתח או לייבא תמונה סרוקה.
- לחץ על התוספים | BoMomics | Trab ניתוח כפתור ומלא את הניתוח המתאים פרמטרים, כגון "התחל", "גבולות החלוקה", "Trab. עצמות","רעש הפחתת דייה","חור מילוי דייה", ו"קורטיקלית עובי בקטרים"כמו שתוארו לעיל (איור 3א), שבו נקבע את ההגדרות באמצעות הפקודה פרמטרים ניתוח פרופיל כשלב שמתואר 3.5. הגדר "התחל", "חלוקה לרמות גבול", "Trab. עצמות","רעש הפחתת דייה","חור מילוי בקטרים"ו-"קורטיקלית עובי בקטרים"5, 7,200, 7,000, 6, 12, 25, בהתאמה.
הערה: בגירסא החינמית של התוסף, חמש סמוך פרוסות החל מ- "התחל" פרוסה האינדקס המוגדר נבחרו למדידה, ואילו בגרסה מסחרית, מספר שרירותי של פרוסות יכולה להיות מוגדרת על-ידי המשתמש. - בחר אפשרויות אחד או יותר במקטע דיווח תוצאות עבור הפרמטרים למדוד, איפה נפח העצם trabecular (BV), הנפח הכולל (טלוויזיה) של אזור שנבחר, וכן עוביים נמדד גם two-dimensionally (2D) או three-dimensionally (3D) זמינים עבור בחירת דרך שלוש תיבות סימון, כלומר "BV טלוויזיה רק", "דו", ו "3D". בחר בתיבות הסימון "2D" ו- "3D", ואז לחץ על "אישור" כדי לבצע ניתוח trabecular (איור 3, בטבלה 2).
הערה: כאשר 'טלוויזיה BV בלבד' מסומנת, בין המצבים בחירה של "2D" ו- "3D", אמצעים raw BV, טלוויזיה ואת עוצמת מדווחים, העצמות trabecular מקוטע שחולצו ומוצג בחלון חדש, אשר ניתן לשמור בהמשך נותחו על ידי אחרים תוכנה. כאשר "2D" מסומנת, ידווחו אמצעים raw של BV, טלוויזיה, עוצמת עוביים נמדד two-dimensionally בכל רמה פרוסה באמצעות מודל צלחת. אם "3D" מסומנת, עובי תלת-ממדי עבור כל voxel מחושב ישירות ללא כל הנחה דגם, ואז raw מדדי BV, טלוויזיה, בעוצמה, עוביים תלת מימדי שנדגם בכל רמה פרוסה מדווחים. עם זאת, אם תיבת הסימון לא נבחרה, עצמות trabecular הם מחולקים באמצעות קבוצת הפרמטרים לעיל, אך מידה לא מדווח.
5. לכימות אובייקטים מדומה
- פתח את תוכנת ImageJ, ולאחר מכן פתחו תמונה מדומה. . הנה, פתח לספרה מדומה בקוטר של 30 פיקסלים כדוגמה.
- בחר את התוספים | BoMomics | Trab ניתוח כפתור ומלא המתאים ניתוח הפרמטרים כפי שתואר לעיל. לשמור על ערכי ברירת המחדל עבור "התחל", "סיום", "חלוקה לרמות גבול", "Trab. עצמות", קבע"רעש הפחתת דייה","רעש הפחתת דייה","חור מילוי בקטרים"ו"קורטיקלית עובי בקטרים"ל- 0 (איור 3).
הערה: עבור אובייקטי מדומה, אין רעש אות לא מכוונות ולאחר ייתכנו קליעים קורטיקלית המתאימים. לכן, פרמטרים עבור ערכים כאלה צריכה להיות מוגדרת כראוי (הגדרות ברירת המחדל הן לאפס). עבור quantifications תלת-ממד, 30 פרוסות לפני ואחרי הפרוסה "התחל" שצוין מעובדות באמצעות הגרסה החינמית של התוסף, ואילו פרוסות היחיד בטווח שצוין על-ידי "התחל", "End" פרוסות מנותחים על-ידי הגירסה המסחרית של התוסף. - במקטע תוצאות דיווח , בחר "2D" ואת "3D" עבור הפרמטרים שברצונך למדוד ולחץ על אישור כדי לבצע ניתוח trabecular של אובייקט מדומה (טבלה 3).
6. כיול של האמצעים Trabecular והצגת נתונים: פרופיל חלוקות של האמצעים Trabecular באזור שנבחר ניתוח
- לקבל את המידע כיול ערכת הנתונים סרוקים, לפי הוראות הספק מיקרו-CT.
הערה: רק raw מדדי BV, טלוויזיה, בעוצמה, עוביים מדווחים על ידי התוסף. כדי להשיג אמצעים להשוות דוחות שנוצרו על-ידי תוכנות אחרות, כיול תוצאה רצויה. - פתח את Microsoft Excel, פתח את הטבלה התוצאות המדווחות. לחישוב נפח עצם (BV) מכויל, סה כ נפח (טלוויזיה), עצם מינרלים (BMC), שבר נפח עצם (BV/טלוויזיה), צפיפות המינרלים של העצם (BMD) ב חדש excel עמודות באמצעות דיווח raw BV, טלוויזיה, עוצמת הערכים לפי הביטויים הבאים.
- הערה: סריקת הרזולוציה (רזולוציה, מיקרומטר), דרוג אפור (שינוי קנה מידה), צפיפות יחידות (HA/ס מ3מ ג), צפיפות השיפוע (שיפוע), וחיתוך צפיפות (חיתוך) ניתן לחלץ מקבצי סרוקים מיקרו-CT תמונה או meta, כגון קובץ Scanco ISQ. לכן, האמצעים מכוילת מחושבים כדלהלן:
נניח BV, טלוויזיה, עוצמת הם אמצעי raw, BVc והם טלוויזיהc ערכים מכויל, רזולוציה, שינוי קנה מידה, מדרון, החיתוך הם מ כיול קבצים של מיקרו - CT תמונות.
BVc = BV × רזולוציה3 [μm3]
טלוויזיהc = טלוויזיה × רזולוציה3 [μm3]
BV / טלוויזיה = BV ÷ טלוויזיה
BMC = (בעוצמה ÷ דרוג × במדרון - BV × intercept) רזולוציה ×3 × 10-12 [mg HA]
BMD - BMC ÷ טלוויזיהג' × 1012 [מ"ג חה / ס מ3] - ליצור עלילה של XY (פיזור) אמצעים מכויל (Y) נגד פרוסה שכבות (X) באמצעות תוכנת Microsoft Excel (איור 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוסף ניתוח trabecular מיועדת לפלח ולכמת באופן אוטומטי עצמות trabecular עם דיוק. בתחילה, עצם הגבול החיצוני מזוהה, מאפשרת ואחריו פעולת מילוי הבור שבו מלאים חורים בתוך עצם קורטיקלית פגזים החיצוני. ואז פעולת שחיקה מתבצע כדי לא לכלול את העצמות בקליפת המוח החיצונית ולקבל את העצמות trabecular מקוטע. לבסוף, אמצעים של עצמות trabecular באזור מקוטע לכמת.
כמו מיקרו-CT תמונות הם רועש מטבעו, segmentations באמצעות פרמטרים מוגדרים מראש שרירותי לעיתים קרובות להיכשל לזהות במדויק את הגבולות החיצוניים של העצם. זה מייגע ודיני אינטנסיבית כדי לנסות הרבה שילובים פרמטר עבור בחירת הפרמטרים פילוח משביע רצון. לכן, פרמטר פרופיל תוסף מסופק עבור שינוי הפרמטרים אחד בטווח קבע באופן אוטומטי כדי לסייע בבחירת שילובי פרמטר משביע רצון, אשר מקלה גם על בחירת סט משותף של פרמטרים עבור קבוצה של העצם דוגמאות. איור 1 א מציג את ההגדרות המשמשות עבור פרופיל פרמטרים פילוח טוב. כאשר הפרמטרים עבור בשתל קליפת העצם שקצרנו הסף (קורט העצם), מגוון של הסף להיות פרופיל (טווח), כמות קבועה על הסף (שלב) בכל שלב שצוינו, סדרה של ספי כדי להיות מתועדים נוצרים. לאחר מכן, סדרה של ערכי הרעש, חור נוצרות באופן דומה על-ידי הגדרת הפרמטרים המתאימים. לבסוף, עצמות trabecular הם מחולקים על-ידי שינוי הפרמטרים אחד בכל פעם על כל הצירופים פרמטר אפשרי. איור 1 B מראה את התוצאות פילוח נציג עבור שילובי פרמטרים שונים. ללא ספק, שילובים מסוימים פרמטר טובים יותר מאחרים-בהתוויית הגבולות החיצוניים של עצם ומראה שילוב פרמטר אחד או יותר משביע רצון פילוח התוצאות. לאחר בדיקת ויזואלית את פילוח התוצאות, ניתן יהיה לאחזר ערכי פרמטרים עבור segmentations משביע רצון מתוך טבלת תוצאות פרופיל (טבלה 1).
כדי לכמת מדדים של עצמות trabecular, מבוצעות פילוח trabecular וניתוח. איור 2 A מציג את תיבת הדו-שיח של הגדרת פילוח trabecular, שבו trabecular עצמות באזור שנבחר מקוטע, חילוץ (איור 2B), ניתן לבדוק תוצאות פילוח באמצעות הפרמטרים שסופקו הפרוסה על ידי-פרוסות מבחינה ויזואלית. לאחר מכן, עצמות trabecular הם ניתחו משביע רצון פרמטרים (איור 3א). בהתאם המצבים מבחר של אפשרויות, raw quantifications נפח עצם (BV), דיווח נפח (טלוויזיה), סכום ערכי אפור (עוצמה), כולל, עוביים נמדד גם דו ממדית או שלושה ממדית (טבלה 2) מדווחים. לבסוף, כיול המידע מופק את ערכת הנתונים מיקרו-CT סרוקים המכויל למדידת BV, טלוויזיה, BMC, BV/טלוויזיה ו BMD מחושבות שהופעלו על-ידי יצירת פרופיל שלהם התפלגויות של ניתוח אזור שכבת-על ידי-השכבה שנבחרה נגד השכבה עמדות (איור 4).
כתכונה בקרת איכות של התוסף, כימות של אובייקטים מדומה נתמך. מדומה אובייקטים סטנדרטי עם ממדים ידועים הם לכמת על ידי התוסף להשוואה עם ערכים תיאורטי או אמצעים של תוכנות אחרות, כגון תוכנה מסחרית שסופק עם מכונות מיקרו-CT או BoneJ14, תוסף קוד פתוח לניתוח תמונה העצם. לניתוח אובייקטים מדומה, ההגדרות רעש מוגדרים לאפס, כמו הולוגרמות נחשבים תמונות באיכות גבוהה ללא כל רעש. אובייקטים עם חומרי גלם בעוביים שונים היו מדומים, התוצאות יוצגו (איור 3, טבלה 3). עבור אובייקטים 2D סטנדרטי מדומים, כגון עיגולים, ריבועים ומלבנים, ליתר דיוק ערכים עבור אזור (טלוויזיה או BV) ואת עובי מדווחים (טבלה 3). עצמים תלת-ממדיים, אמצעי עובי המדויק עבור קוביות, כדורים, לפיבולה מדווחים, עם זאת, עוביים של צילינדרים אינן מדויקות עבור voxels ליד בשני הקצוות של גליל, ואילו עוביים voxel בפרוסות האמצעי של הגלילים הם בדיוק כמו חזה. זוהי תכונה של האלגוריתם מדידת עובי המשמש כבסיס, שבה עובי של voxel עבור כל אובייקט של נקבעת לפי הקוטר של הספרה הגדולה, או אורך צד של הקוביה הגדולה, אשר מכיל voxel הזה והוא לגמרי מבפנים אובייקט. לכן, עוביים של אובייקטים עשוי מישורים שונים, קוביות ניתן למדוד במדויק, בעוד צילינדרים ניתן רק למדוד במדויק הרדיוס-המרחק של הפרוסה האמצעי בשני הקצוות.
איור 1 : תוצאות נציג של פרמטר פרופיל ניתוח. (א) הפרמטרים הגדרת עמוד. (B) התוצאות נציג של פרמטר פרופיל ניתוח. שילובים מסוימים פרמטר טובים יותר מאחרים לגילוי את הגבולות החיצוניים של עצמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : נציג התוצאות של הניתוח פילוח trabecular. (א) הפרמטרים הגדרת עמוד. (B) נציג פילוח התוצאות של עצמות trabecular-שכבות שונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : ניתוח trabecular. (א) הפרמטרים הגדרת עמוד. (B) התוצאות נציג של אובייקטים 2D מדומה. (ג) התוצאות נציג של עצמים תלת-ממדיים מדומה דמיינו ידי תלת-ממדי מציג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : הפצות של עצם trabecular אמצעים באזור וניתוח שנבחר. הציר האופקי מייצג את המרחק היחסי על השכבה פרוסה מתחיל באזור וניתוח. ערכי ה-y הם אמצעים trabecular מכויל באזור וניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פרוסה | גבולות החלוקה לרמות | רעש הפחתת דייה | חור מילוי דייה |
| 4 | 5200 | 0 | 10 |
| 147 | 5200 | 2 | 20 |
| 361 | 7200 | 6 | 16 |
| 539 | 8000 | 10 | 20 |
טבלה 1: התוצאות נציג של פרמטר פרופיל ניתוח.
טבלה 2: התוצאות נציג של ניתוח trabecular.
| אובייקט | ממד | כרךב' | פני שטחc | עובי |
| כיכר | 200 X 200 | 40000 | 796 | 200 |
| מלבן | 200 X 100 | 20000 | 596 | 100 |
| מעגל | דיה: 200 | 31428 | 796 | 200 |
| קוביה | 30 X 30 X 30 | 27000 | 5048 | 30 |
| תיבה | 80 X 40 X 30 | 96000 | 13008 | 30 |
| כדור | דיה: 30 | 14328 | 3944 | 30 |
| גלילd | Dia:30; ח': 100 | 71600 | 12800 | 27.84 |
| צילינדרe | Dia:30; ח': 100 | 51552 | 9552 | 30 |
| ת: התוצאות הן ב- raw voxels. דיה: קוטר; ח': גובה. | ||||
| ב': נפח (3D) או אזור (2D). | ||||
| c: השטח (3D) או היקפית (2D). | ||||
| d: Measurs מ פרוסה 1 פרוסה 100 משמשים לצורך ניתוח. | ||||
| ה': Measurs מפרוסה 15 פרוסה 85 משמשים לצורך ניתוח. | ||||
טבלה 3: כמת תוצאות עבור אובייקטים מדומה.
קובץ משלים 1. לטעום עצם. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר זה מתאר תוסף ImageJ עבור ניתוח עצמות trabecular, אשר הוא אוטומטי, יעיל, ידידותי למשתמש. התוסף יכול לשמש גם כדי לכמת כל אובייקט דו-ממדי או תלת-אמצעים שכבה אחרי שכבה של אזורים, אמצעי אחסון, עוביים. כיום, נמדד ערך בודד עבור כל פרמטר trabecular הוא דיווח עבור כל דגימה על-ידי ניתוח מיקרו-CT רגיל, אשר לא יכול לייצג באופן מלא את מאפייני הישות שנמדד באזור וניתוח שנבחרו. התוסף שתואר מדווח שכבה-על כמויות של כל פרמטר עבור כל דגימה, אשר שומר באופן מלא את המידע הפצה של פרמטר נמדד ב וניתוח האזור הנבחר, לכן מתקדמות יותר ואני רגיש סטטיסטי גישות הינם ישימים עבור ניתוח נתונים כאלה.
בשיטת רגיל, חצי-אוטומטי עיצוב-יד פילוח, וריאציה משמעותי בין הפרוסות יד-עיצוב שונה נצפו עם אופרטור הסטייה8,9,10, המצדיקים מדים יותר בשיטה האוטומטית עבור פילוח trabecular. כמו הניגוד הוא מקסימלי בין הרקע סריקה על הגבול החיצוני של העצם, פילוח trabecular בסיוע החיצוני-גבולות מתבצע על ידי התוסף, איפה הגבול החיצוני של העצם יכול להיות באופן אוטומטי מזוהה עם הדיוק בעת הצורך סף, רעש והגדרות חור הינם מסופקים. כדי להקל על הקביעה של פילוח פרמטרים, מגוון של פרמטר צירופי פרופיל אחד אחרי השני בעזרת פרוסה נציג מאזור וניתוח, משביע רצון פילוח התוצאות נבדקות באופן חזותי. לאחר מכן, עצמות trabecular הם ניתחו עם הפרמטרים טרפזי. כאשר פילוח המתאים פרמטרים מוגדרים, התוסף יושם בהצלחה לנתח עצמות trabecular של עכברוש עצמות הירך דיסטלי מטופלים עם עצם שונה סוכנים anabolic5, תוצאות לשחזור מדווחים על התמונה ללא הטיה אופרטור.
התוסף כעת יכול לעבד רק דוגמא אחת בכל פעם. אם מספר דוגמאות קיימות בתמונה, כל דוגמאות לכמת כאובייקט יחיד ללא אפליה. לכן, preprocessing נדרש אם מספר דוגמאות נסרקים בעת ובעונה אחת בשפופרת מדגם יחיד. כימות התוצרים הם אמצעים raw של ספירות פיקסל או ערכי אפור, אשר צריך להיות מכוילים באופן ידני באמצעות כיול המתאימה מידע.
השלב הקריטי ביותר של פרוטוקול זה, שמאוחזרים פרמטרים מתאימים לניתוח trabecular. באופן כללי, קבוצות של עצם דגימות מאבחנים באמצעות פילוח זהים פרמטרים כדי להפוך את התוצאות דומות. במקרה כזה, כדאי לשים לב כדי להבטיח כי פילוח תוצאות עבור כל הדגימות נבדקות באופן חזותי עבור שגיאות פוטנציאליות לפני נוספים נערכים ניתוחים.
מגבלה משמעותית של טכניקה זו היא כי ההגדרות הפחתת רעש מוחלים על העצמות קורטיקלית רק עבור יצירת מיתאר הגבול החיצוני של עצם, אך לא על חילוץ עצמות trabecular. כפי אסטרטגיות סינון שונות כבר דווח על15 כמו האופטימלי לניתוח trabecular בתנאים שונים, לא מסנן יחיד הוא טוב עבור כל תמונה דוגמאות. לכן, אין שום שלב סינון מובנה, לפני כימות של עצמות trabecular. כך שיהיה תואם הפלט באמצעות תוכנת סינון מובנים תמונה, חילוץ עצמות trabecular יכול להיות מעובד באופן דומה שימוש כלי דימות שונים המיובאים לתוך ImageJ ואז לכמת על ידי התוסף לאחר מכן. יתר על כן, פורמטים שונים של תמונות מופקים על ידי ספקים שונים מיקרו-CT, רובם ניתן לייבא או נפתח על ידי ImageJ ישירות, ובכך מודולים עבור ייבוא תבניות תמונה שונים לתוך ImageJ לצורך ניתוח נוסף הם הרצויה. מגבלה נוספת היא עוביים 3D פרוסות בקרבת קצות טווח הבחירה אינם מדויקים אם חלק מהאובייקטים נמצאים מחוץ הבחירה לטווח, שהוא גם נכון לגבי כל חבילות הזמינים כימות תלת-ממד, לכן, טווח גדול יותר של פרוסות צריך ניתן לכמת, יש להשתמש רק החלק האמצעי של פרוסות שנבחרו לצורך ניתוח נוסף. גישה כזו ניתן זמינים רק כאשר בכמויות מדודות המדווחת--שכבה על כפי שמוצג בתוסף זה, אך לא עבור המידות ערך בודד הוא דיווח עבור כל פרמטר כימות בטווח הנבחר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
הוגש פטנט על האלגוריתם הבסיסי לכמת אובייקט עובי. המחברים שיתף פעולה עם אחרים רשומים באתר bomomics.com מארחים את התוספים הגרסה החינמית, איפה ייעוץ וכימות שירותי ניתוח תמונות הינם זמינים לפי בקשה.
Acknowledgments
עבודה זו מומן בחלקו על ידי מענק NFSC 81170806. המחברים רוצה להודות המתקן מיקרו-CT הליבה של בית הספר של רפואת שיניים, אוניברסיטת ווחאן שעזרת לסרוק ולנתח את עצמות הירך חולדה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ | NIH | imagej | Any version with a java 1.8 run time |
| trabecular analysis plugin | Bomomics | bomomics | free or commercial version |
| Micro CT scanner | Scanco | μ-50 | micro CT from any vendor |
| Computer System | Lenovo | any brand | |
| Windows Operating System | Microsoft | Windows 7 x64 | any 64-bit Windows operating system |
| Office Software | Microsoft | Office 2010 | any speadsheet software that has xy chart function |
References
- Ruegsegger, P., Koller, B., Muller, R. A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcif Tissue Int. 58 (1), 24-29 (1996).
- Muller, R., Ruegsegger, P. Micro-tomographic imaging for the nondestructive evaluation of trabecular bone architecture. Stud Health Technol Inform. 40, 61-79 (1997).
- Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Phys Med. 30 (6), 619-634 (2014).
- Bart, Z., Wallace, J. Microcomputed Tomography Applications in Bone and Mineral Research. Advances in Computed Tomography. 2, 121-127 (2013).
- Ji, Y., Ke, Y., Gao, S. Intermittent activation of notch signaling promotes bone formation. Am J Transl Res. 9 (6), 2933-2944 (2017).
- Jiang, Y., Zhao, J., White, D. L., Genant, H. K. Micro CT and Micro MR imaging of 3D architecture of animal skeleton. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (1), 45-51 (2000).
- Laib, A., et al. 3D micro-computed tomography of trabecular and cortical bone architecture with application to a rat model of immobilisation osteoporosis. Med Biol Eng Comput. 38 (3), 326-332 (2000).
- Cole, H. A., Ichikawa, J., Colvin, D. C., O'Rear, L., Schoenecker, J. G. Quantifying intra-osseous growth of osteosarcoma in a murine model with radiographic analysis. J Orthop Res. 29 (12), 1957-1962 (2011).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Med Imaging. 8, 16 (2008).
- Soviero, V. M., Leal, S. C., Silva, R. C., Azevedo, R. B. Validity of MicroCT for in vitro detection of proximal carious lesions in primary molars. J Dent. 40 (1), 35-40 (2012).
- Kohler, T., Stauber, M., Donahue, L. R., Muller, R. Automated compartmental analysis for high-throughput skeletal phenotyping in femora of genetic mouse models. Bone. 41 (4), 659-667 (2007).
- Buie, H. R., Campbell, G. M., Klinck, R. J., MacNeil, J. A., Boyd, S. K. Automatic segmentation of cortical and trabecular compartments based on a dual threshold technique for in vivo micro-CT bone analysis. Bone. 41 (4), 505-515 (2007).
- Dougherty, G. Quantitative CT in the measurement of bone quantity and bone quality for assessing osteoporosis. Med Eng Phys. 18 (7), 557-568 (1996).
- Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47 (6), 1076-1079 (2010).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
