Summary
Nous présentons un workflow pour segmenter et quantifier l’OS trabéculaires des images 2D et 3D basés sur la limite extérieure de l’OS en utilisant un plugin ImageJ. Cette approche est plus efficace et plus précise que l’approche actuelle de main-contournement manuel et fournit des analyses quantitatives de couche par couche, qui ne sont pas disponibles dans les logiciels commerciaux actuels.
Abstract
Micro-la tomodensitométrie (micro-CT) est régulièrement utilisée pour évaluer la quantité d’os et des propriétés microstructurales trabéculaires chez de petits animaux dans des conditions de perte osseuse différente. Toutefois, l’approche standard pour l’analyse d’images micro-CT trabéculaire tranche par tranche semi-automatique main-contournement, qui est forte intensité de main de œuvre et source d’erreurs. Décrite ici est une méthode efficace de segmentation automatique de l’OS trabéculaires selon les limites extérieures de l’OS, où l’OS trabéculaires peuvent être identifiés et segmentés automatiquement avec précision avec le moins de biais opérateur lorsque cela est approprié les paramètres de segmentation sont définis. Pour définir les paramètres de segmentation satisfaisante, une pile d’image des résultats de la segmentation s’affiche, où toutes les combinaisons possibles des paramètres de segmentation sont modifiées successivement dans l’ordre, et résultats de segmentation avec les paramètres associés peuvent facilement être vérifié visuellement. Comme une fonctionnalité de contrôle de la qualité du plugin, simulé des articles courants sont quantifiées où les grandeurs mesurées peuvent être comparées avec les valeurs théoriques. Quantification de couche par couche des propriétés trabéculaires et trabéculaires épaisseurs sont signalées par un tel plugin, et la répartition de ces biens au sein des régions sélectionnées peut être profilée facilement. Bien que la quantification de calque par calque conserve plus d’informations sur l’OS trabéculaires et facilite également l’analyse statistique des changements structurels, de telles mesures sont indisponibles à partir de la sortie d’un logiciel commercial actuel, où un seul une valeur chiffrée pour chaque paramètre est signalée pour chaque échantillon. Par conséquent, les flux de travail décrites est meilleures approches pour analyser l’OS trabéculaires avec précision et efficacité.
Introduction
L’analyse micro-CT de l’OS trabéculaires est l’approche standard pour le suivi des modifications morphologiques des os de petits animaux sous différents OS perte conditions1,2,3, où plusieurs variables liées à la les structures des os sont déclarés4. Cependant, ces paramètres ne sont pas réparties uniformément dans la métaphyse des os longs de5, et seulement une valeur résumée ou moyenne est signalée pour chaque variable structurelle de chaque échantillon par actuelles machines commerciales de micro-CT6,7 , même si une seule valeur ne peut pas représenter pleinement les caractéristiques du paramètre mesuré dans la région de l’analyse. Quantification de la couche par couche d’os trabéculaires non seulement conserve plus d’informations pour chaque variable, mais permet aussi la détermination des caractéristiques des distributions de variables telles la région analyse, faciliter l’analyse statistique ultérieure de structural changements sous différentes conditions5. Par conséquent, l’objectif de cette méthode est quantifier OS trabéculaires du micro-tomographie par ordinateur à chaque niveau de la tranche, qui n’est pas actuellement disponible dans n’importe quel paquet de l’analyse micro-CT disponible dans le commerce.
Pour efficacement segment OS trabéculaire tranche par tranche, les méthodes de segmentation automatique sont souhaitables. Cependant, la technique standard actuelle pour l’analyse micro-CT est issue des manuel de contournage interactive suivie d’interpolation semi-automatique pour séparer l’OS trabéculaires des compartiments corticales, main-d'oeuvre, est sujette aux erreurs, et associé exploitant substantielle biais8,9,10. Segmentation automatique méthodes11,,12 ont été signalés, mais ces méthodes ne sont optimales dans les régions avec une bonne séparation entre l’OS trabéculaires et l’OS corticales, mais non dans les régions sans séparations claires. En outre, segmentation différents paramètres sont requis pour différents échantillons12, et il est fastidieux de sélectionner manuellement les paramètres de segmentation satisfaisante applicables aux groupes de spécimens osseux en essayant divers paramètre combinaisons12, même si le processus de segmentation est automatique lorsque tous les paramètres connexes sont définies. Comme la limite extérieure de l’OS est le plus grand contraste avec le fond de balayage et les coquilles de métaphysaire corticale des os longs montrent peu de changements sur le choisi analyse région, méthodes de segmentation selon le contour de la limite extérieure des os longs peut avec fiabilité et précision séparer OS trabéculaires des coquilles corticales. L’avantage d’une telle méthode de segmentation est que la segmentation est basée sur la différence entre le fond et la bordure extérieure de l’OS, mais pas sur les différences entre l’OS trabéculaire et corticale6,12, 13, par conséquent, il est généralement facile de trouver une combinaison de paramètres de segmentation qui est satisfaisante pour un groupe d’échantillons d’os, facilitant l’analyse plus fiable des changements trabéculaires entre différents groupes.
À chaque tranche niveau, surface, périmètre et à deux dimensions (2D) épaisseur sont rapportés pour analyse 2D, tandis que le volume, surface et en trois dimensions (3D) épaisseur sont signalés en 3D quantitatives. Ces informations ne sont généralement pas signalées par des outils d’analyse image actuelle, indiquant que les procédures déclarées peuvent être appliquées aux images générales où cette information est requise.
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Protocol
Procédures impliquant des sujets animaux ont été menées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (publication NIH, 8e édition, 2011) et ont évaluées et approuvées par le Comité emploi de Wuhan et d’institutionnels animalier Université.
1. Installation du logiciel
- Installez le logiciel ImageJ. Télécharger la version Windows du logiciel ImageJ (version 1,51 p) avec Java 64 bits de https://imagej.nih.gov/ij/. Extraire le logiciel téléchargé dans un dossier, qui sera par la suite dénommé « Répertoire ImageJ ».
Remarque : Analyse trabéculaire plugins nécessitent des temps d’exécution de java 64 bits (version 1.8) et un système d’exploitation de windows 64-bit, préférablement un système d’exploitation 64 bits Windows 7. - Installer les plugins analyse trabéculaire. Sollicitez l’analyse trabéculaire plugins http://www.bomomics.com et décompressez le contenu dans le répertoire plugins de ImageJ, qui est « ImageJ répertoire/plugins ».
Nota : Le plugin peut être obtenu soit comme une version gratuite, où les mesures pour 5 spécifié tranches adjacentes sont signalés, une version commerciale, où une série de tranches peut être précisée et mesurée.
2. préparer le Dataset 3D pour l’analyse trabéculaire
- Scan des fémurs de rat avec une suite de machine micro-CT la norme d’analyse de protocole5 et puis enregistrez les données dans un format pouvant être importé dans ImageJ, par exemple, le format tiff. Si plusieurs échantillons d’os ont été scannés simultanément dans un tube à essais simples, tout d’abord importer les données dans ImageJ et puis séparez chaque os individuels en culture hors autres échantillons à l’aide des outils de traitement d’image de ImageJ. Par la suite, enregistrez l’image qui en résulte dans un format pouvant être importé dans ImageJ plus tard.
Remarque : Un fichier d’image échantillon représentatif utilisé dans l’analyse est inclus (supplémentaire 1 fichier). -
Simuler des objets 2D et 3D standard.
- Ouvrez le logiciel ImageJ. Sous les Plugins | BoMomics | Simuler des objets menu, cliquez sur le bouton cercle , entrez 200 comme le diamètre dans la fenêtre pop-up, puis cliquez sur OK pour générer le cercle simulé avec un diamètre de 200 pixels (Figure 3B). Enregistrez le cercle généré au format tiff.
- Ouvrez le logiciel ImageJ. Sous les Plugins | BoMomics | Simuler des objets menu, cliquez sur le bouton carré , entrez 200 comme la longueur de côté dans la fenêtre pop-up, puis cliquez sur OK pour générer la place simulée avec une longueur de côté de 200 pixels (Figure 3B). Enregistrez la place générée au format tiff.
- Ouvrez le logiciel ImageJ. Sous les Plugins | BoMomics | Simuler des objets menu, cliquez sur le bouton Rectangle , entrez 200 comme la largeur et 100 comme la hauteur dans la fenêtre pop-up, puis cliquez sur OK pour générer le rectangle simulé avec une largeur de 200 pixels et une hauteur de 100 pixels (Figure 3 B). Enregistrez le rectangle généré au format tiff.
Remarque : Un cercle (diamètre : 200 pixels), un carré (longueur côté : 200 pixels) et un rectangle (largeur : 200 pixels ; Hauteur : 100 pixels) sont enregistrés pour les analyses suivantes. - Ouvrez le logiciel ImageJ. Sous les Plugins | BoMomics | Simuler des objets menu, cliquez sur le bouton Cube , entrez 30 la longueur de côté dans la fenêtre pop-up, puis cliquez sur OK pour générer le cube simulé. Enfin, cliquez sur le Plugins | 3D | Visionneuse de volume pour afficher le cube généré et enregistrez-le au format tiff (Figure 3C).
- Ouvrez le logiciel ImageJ. Sous les Plugins | BoMomics | Simuler des objets menu, cliquez sur le bouton du cuboïde et entrez 80 longueur 40 comme la largeur et 30 comme la hauteur de la fenêtre popup, puis cliquez sur OK pour générer le cuboïde simulée. Enfin, cliquez sur le Plugins | 3D | Visionneuse de volume pour afficher le cuboïde généré et enregistrez-le au format tiff (Figure 3C).
- Ouvrez le logiciel ImageJ. Sous les Plugins | BoMomics | Simuler des objets menu, cliquez sur le bouton de la sphère , entrez 30 dans le diamètre dans la fenêtre pop-up, puis cliquez sur OK pour générer la sphère simulée. Enfin, cliquez sur le Plugins | 3D | Visionneuse de volume pour visualiser la sphère générée et enregistrez-le au format tiff (Figure 3C).
- Ouvrez le logiciel ImageJ. Sous les Plugins | BoMomics | Simuler des objets menu, cliquez sur le bouton de cylindre , entrez 30 comme le diamètre et 100 comme la hauteur dans la fenêtre pop-up, puis cliquez sur OK pour générer le cylindre simulé. Enfin, cliquez sur le Plugins | 3D | Visionneuse de volume pour afficher le cylindre généré et enregistrez-le au format tiff (Figure 3C).
Remarque : Une sphère (diamètre : 30 pixels), un cube (longueur côté : 30 pixels), un parallélépipède rectangle (longueur : 80 pixels ; width : 40 pixels ; Hauteur : 30 pixels) et d’un cylindre (diamètre : 30 pixels ; Hauteur : 100 pixels) sont enregistrés pour les analyses suivantes.
3. paramètres d’analyse de profilage
- Ouvrez le logiciel ImageJ et ouvrez ou importez une image numérisée.
- Faites glisser la barre de défilement bas pour choisir une tranche, puis cliquez sur l’Image de | Ajuster | Seuil bouton. Dans la popup de seuil, ajuster les valeurs de seuil minimal et maximal par Manuel d’inspection pour s’assurer que les os sont bien séparées de l’arrière-plan et relever la valeur de seuil minimal sous le seuil de l’os cortical.
Remarque : Comme différentes micro-CT fabricants utilisent différents facteurs d’échelle pour le stockage des coefficients d’atténuation aux rayons x dans les images, la valeur seuil réel devrait être déterminée empiriquement par inspection manuelle ou par suite du fabricant spécifique recommandations. Dans notre pratique, définissant le seuil minimal pour l’ISQ fichiers générés par les machines de micro-CT à 6 000-7 000 peut sûrement séparer os issus de la numérisation. - Cliquez sur les Plugins | BoMomics | Profilage de Param trab bouton. Dans la fenêtre contextuelle, mettre Index tranche sur la position de la tranche représentante et définir l’os cortical (« Cort Bone »), (« plage ») et les valeurs (« étape ») pour calculer un ensemble de seuils corticales pour le profilage des paramètres de segmentation, où la valeur de seuil de l’os cortical est acquise par étape 3.2 (Figure 1). Les valeurs par défaut gamme et étape de travail 2 000 et 400 pour la plupart des images de micro-CT. Définir l' Index de la tranche à 5 pour l’exemple de dataset et gardez les valeurs par défaut pour d’autres réglages.
Remarque : « Cort Bone » est le seuil pour l’OS corticales et la valeur de seuil utilisée pour profilage modifications de paramètre de la valeur de seuil le plus bas à la valeur de seuil plus élevée avec l’augmentation de la valeur du pas, où la valeur de seuil le plus bas est la valeur de Cort OS - gamme et la plus grande valeur de seuil est Cort OS + gamme. Si les valeurs réglées pour OS Cort, gamme et Step sont de 6 000, 1 000 et 500, respectivement, alors la valeur de seuil le plus bas pour l’OS corticales est 6 000-1 000 = 5 000, la plus haute valeur de seuil est de 6, 000 + 1, 000 = 7, 000, et les seuils utilisés dans les analyses sont 5 000, 5 500, 6 000, 6 500 et 7 000. - La valeur de diamètre de bruit (« bruit de diamètre »), (« étape ») et rang des valeurs (« Range ») permettant de spécifier un ensemble de valeurs de bruit dans les analyses et le diamètre du trou (« trou de diamètre ») (« étape ») et valeurs (« plage ») pour calculer un ensemble de valeurs de trou. En général, le paramètre par défaut fonctionne pour la plupart des échantillons osseux micro-CT, où bruit, étape et la plage sont respectivement de 5, 5, 2, et plage, étape et diamètre du trou sont respectivement de 15, 5, 2. Conservez les paramètres par défaut pour l’ensemble de données exemple.
Remarque : « Diamètre de bruit » est le diamètre du filtre de suppression de bruit, et le « trou ø » est le diamètre des trous dans l’OS corticales. Les valeurs de bruit et trou utilisés pour le profilage de paramètre peuvent être calculées de la même manière comme valeurs de seuil corticales décrites ci-dessus, en utilisant le bruit/trou spécifié, gamme et les valeurs de l’étape. En raison des variations dans les paramètres de numérisation lors de l’acquisition des images, les paramètres de bruit et le trou doivent être déterminées empiriquement selon la qualité de l’image, comme aucun fourchettes générales de paramètres bruit et trou ne sont bonnes pour tous les scans. La plus faible valeur seuil, ni bruit, ni percé doit être supérieure ou égale à 0, et si la valeur calculée plus bas est négative en utilisant les paramètres fournis, la valeur la plus basse spécifique est définie sur 0. - Cliquez sur OK pour effectuer le profilage de paramètre. Visuellement vérifier les résultats de la segmentation dans la fenêtre Résultats de profilage de paramètre , puis sélectionnez un calque de section pour que la frontière extérieure de l’OS est décrit très précisément (Figure 1B). Par la suite, récupérer les paramètres de profilage de l’entrée dans la table de Résultats de profilage de paramètre correspondant à la couche de tranche choisie (tableau 1).
4. trabéculaire analyse
-
Segmentation de l’OS trabéculaires
- Ouvrez le logiciel ImageJ, puis ouvrez ou importez une image numérisée.
- Cliquez sur les Plugins | BoMomics | Segmentation de trab bouton et renseignez les paramètres d’analyse appropriée. Ensemble « Démarrer », « Contour limite », « Trab. Bones », « Diamètre de réduction de bruit », « Trou de remplissage ø » et « Diamètre d’épaisseur corticale » à 5, 7 200, 7 000, 6, 12 et 25, respectivement.
NOTE : « Start » et « End » spécifier la plage de la tranche sélectionnée pour la segmentation de l’OS trabéculaires, « Contour limite » est correspondant au paramètre profilé « Cort Bone », « Bruit réduction ø » au « Bruit dia. » Paramètre et « Trou de remplissage ø » au paramètre « Trou ø ». « L’épaisseur corticale diamètre » est l’épaisseur spécifiée pour exclure les os corticales externes. « Trab. Bones » est le seuil pour l’extraction de l’OS trabéculaires (Figure 2), où les paramètres sont déterminés à l’aide de profilage commande de paramètres d’analyse tel que décrit à l’étape 3.5. - Cliquez sur OK pour effectuer une segmentation trabéculaire. Vérifier visuellement les résultats de la segmentation dans la fenêtre de Résultats de Segmentation Trab (Figure 2B). Enregistrez l’OS trabéculaires extraits affichées dans la fenêtre d’OS trabéculaire segmentée dans un format tiff (Figure 2B), qui peut être davantage analysée par d’autres logiciels.
-
Analyse de l’OS trabéculaires.
- Ouvrez le logiciel ImageJ, puis ouvrez ou importez une image numérisée.
- Cliquez sur les Plugins | BoMomics | Analyse de trab bouton et remplir des paramètres d’analyse appropriées, telles que « Démarrer », « Contour limite », « Trab. Bones », « Bruit réduction ø », « Trou de remplissage ø » et « Diamètre de l’épaisseur corticale » comme décrit ci-dessus (Figure 3A), où les paramètres sont déterminés en utilisant la commande de paramètres analyse profilage comme décrit dans étape 3.5. Ensemble « Démarrer », « Contour limite », « Trab. Bones », « Diamètre de réduction de bruit », « Trou de remplissage ø » et « Diamètre d’épaisseur corticale » à 5, 7 200, 7 000, 6, 12 et 25, respectivement.
Remarque : Dans la version gratuite du plugin, cinq tranches adjacentes à partir de l’index spécifié de tranche « Start » sont sélectionnés pour la mesure, tandis que dans la version commerciale, un nombre arbitraire de tranches peut être spécifié par l’utilisateur. - Sélectionnez un ou plusieurs choix dans la section Résultats pour les paramètres à mesurer, où le volume de l’OS trabéculaire (BV), le volume total (TV) de la région sélectionnée et les épaisseurs mesurées soit en deux dimensions (2D) ou en trois dimensions (3D) peuvent être sélectionnés par le biais de trois cases à cocher, à savoir « BV TV uniquement », « 2D » et « 3D ». Cochez les cases « 2D » et « 3D », puis cliquez sur « OK » pour réaliser une analyse trabéculaire (Figure 3A, tableau 2).
Remarque : Lorsque « BV TV Only » est cochée, quelles que soient les statuts de la sélection de « 2D » et « 3D », des mesures brutes de BV, TV et l’intensité sont signalées, et les os trabéculaires segmentés sont extraites et affichées dans une nouvelle fenêtre, qui peut être enregistrée et analysée plus loin par d’autres logiciel. Lorsque « 2D » est cochée, les mesures brutes de BV, TV, intensité et épaisseurs mesurées en deux dimensions à chaque niveau de la tranche en utilisant le modèle de plaque sont signalées. Si « 3D » est cochée, la télévision, intensité et épaisseurs tridimensionnelles échantillonnés à chaque niveau de la tranche en trois dimensions épaisseur pour chaque voxel est calculée directement sans aucune hypothèse de modèle, puis crus mesures de BV, sont signalées. Toutefois, si aucune case n’est cochée, OS trabéculaires sont segmentés en utilisant l’ensemble ci-dessus des paramètres, mais aucune mesure n’est signalée.
5. quantification des objets simulés
- Ouvrez le logiciel ImageJ, puis ouvrez une image simulée. Ici, ouvrir la sphère simulée avec un diamètre de 30 pixels par exemple.
- Sélectionnez les Plugins | BoMomics | Analyse de trab bouton et renseignez les paramètres d’analyse appropriée comme décrit plus haut. Conservez les valeurs par défaut pour « Démarrer », « End », « Contour limite », « Trab. Bones » et « Diamètre de réduction de bruit », « Diamètre de réduction de bruit », « Trou de remplissage ø » et « Diamètre de l’épaisseur corticale » 0 (Figure 3).
Remarque : Pour des objets simulés, il n’y a aucun bruit de signal non intentionnels, et qu’il ne peut y avoir aucun obus corticales correspondantes. Par conséquent, paramètres pour ces valeurs devraient être établis en fonction (paramètres par défaut sont à zéro). Pour les analyses quantitatives 3D, 30 tranches avant et après la tranche « Start » spécifiée sont traitées à l’aide de la version gratuite du plugin, tandis que seuls tranches dans la plage spécifiée par tranches « Start » et « End » sont analysés par la version commerciale du plugin. - Dans la section de Résultats , sélectionnez « 2D » et « 3D » pour les paramètres à mesurer et cliquez sur OK pour effectuer une analyse trabéculaire pour l’objet simulé (tableau 3).
6. l’étalonnage des mesures trabéculaires et présentation des données : profil de la distribution des mesures trabéculaires dans la région d’analyser certains
- Téléchargez les informations de calibration de l’ensemble de données numérisée, conformément aux instructions du vendeur micro-CT.
Remarque : Seules les mesures brutes de BV, TV, intensité et épaisseurs sont rapportés par le plugin. Pour obtenir des mesures comparables aux rapports générés par d’autres logiciels, étalonnage de résultat est souhaitée. - Ouvrez Microsoft Excel, puis ouvrez le tableau de résultats. Calculer calibré volume osseux (BV), total volume (TV), contenu minéral osseux (BMC), fraction de volume osseux (BV/TV) et la densité minérale osseuse (DMO) au nouveau excel en utilisant les valeurs rapportées de BV, TV et l’intensité brutes selon les expressions suivantes.
- NOTE : Numérisation résolution (résolution, µm), grise mise à l’échelle (scaling), unités de densité (mg HA/cm3), pente (pente) de la densité et l’interception de densité (interception) peuvent être extraite des micro-CT image ou meta fichiers analysés, par exemple, le fichier Scanco ISQ. Par conséquent, les mesures calibrées sont calculées comme suit :
Supposons que BV, TV et l’intensité sont des mesures brutes, BVc et TVc sont des valeurs étalonnées, résolution, mise à l’échelle, pente, ordonnée à l’origine sont des fichiers de calibrage des micro - CT des images.
BVc = résolution x BV3 [μm3]
TVc = résolution × TV3 [μm3]
BV / TV = TV ÷ BV
BMC = (intensité ÷ × pente - intercept × BV d’échelle) résolution ×3 × 10-12 [mg HA]
BMD - BMC ÷ TVc × 1012 [mg HA / cm3] - Créer une intrigue de nuages de (points XY) des mesures étalonnées (Y) contre tranche de couches (X) en utilisant le logiciel Microsoft Excel (Figure 4).
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Representative Results
Le plugin trabéculaire analyse vise automatiquement segmenter et quantifier l’OS trabéculaires avec précision. Au départ, OS limite extérieure est détecté et délimitée suivie d’une opération de remplissage de trous où tous les trous dans les coques corticale externe osseuse sont remplis. Puis une opération de l’érosion est effectuée pour exclure les os corticales externes et obtenir l’OS trabéculaires segmentés. Enfin, les mesures d’os trabéculaires dans la région segmentée sont quantifiées.
Images de micro-CT étant intrinsèquement bruyants, segmentations, à l’aide de paramètres prédéfinis d’arbitraires souvent ne parviennent pas à identifier avec précision les limites extérieures de l’OS. C’est fastidieux et main d’oeuvre intensive d’essayer beaucoup de combinaisons de paramètres pour sélectionner les paramètres de segmentation satisfaisante. Par conséquent, un paramètre plugin de profilage est fourni pour changer les paramètres un par un dans la plage définie automatiquement pour aider à sélectionner des combinaisons de paramètres satisfaisant, qui facilite également la sélection d’un ensemble commun de paramètres pour un groupe d’OS échantillons. Figure 1 A montre les paramètres utilisés pour le profilage des paramètres de segmentation bon. Lorsque les paramètres de seuil de l’os cortical (OS de la Cort), gamme de seuil d’être profilée (plage), et montant de l’incrément pour seuil (étape) à chaque étape sont spécifiés, une série de seuils que nous vous présentons sont générés. Par la suite, une série de valeurs de bruit et trou proviennent de la même façon en définissant les paramètres correspondants. Enfin, l’OS trabéculaires sont segmentés en changeant les paramètres un à la fois pour toutes les combinaisons de paramètres possibles. Figure 1 B montre les résultats de segmentation représentatif pour les combinaisons de paramètres différents. De toute évidence, certaines combinaisons de paramètres sont mieux que d’autres à délimiter la frontière externe de l’OS, et plus d’une combinaison de paramètres montre des résultats satisfaisants de segmentation. Après avoir vérifié la visuellement les résultats de la segmentation, les valeurs de paramètre pour les segmentations satisfaisantes peuvent être récupérés de la table de résultats profilage (tableau 1).
Afin de quantifier les mesures des os trabéculaires, analyse et segmentation trabéculaire sont effectuées. Figure 2 A montre la boîte de dialogue de réglage pour la segmentation trabéculaire, où OS trabéculaires dans la région sélectionnée sont segmentés et extrait (Figure 2B), et les résultats de segmentation à l’aide des paramètres fournis peuvent être vérifiés tranche par tranche visuellement. Par la suite, les os trabéculaires sont analysées avec paramètres satisfaisantes (Figure 3A). Selon les statuts de la sélection des options, premières analyses quantitatives du volume osseux (BV), volume (TV), somme des valeurs de gris (intensité), total et épaisseurs mesurées soit deux dimensionnellement ou trois dimensions (tableau 2) sont rapportés. Enfin, l’information de calibrage est extraite de l’ensemble de données numérisée micro-CT et calibré mesures de BV, TV, BMC, BV/TV et BMD sont calculés suivies par leurs distributions dans l’analyse région couche-par-couche sélectionnée contre la couche de profilage postes (Figure 4).
Comme une fonctionnalité de contrôle de la qualité du plugin, quantification des objets simulés est pris en charge. Simulé objets standard aux dimensions connues sont quantifiés par le plugin pour la comparaison avec les valeurs théoriques ou des mesures des autres logiciels, tels que les logiciels commerciaux fournis avec les machines de micro-CT ou BoneJ14, un plugin libre et open source pour l’analyse d’image osseuse. Pour l’analyse des objets simulés, les paramètres de bruit sont remis à zéro, comme des images simulées sont considérés comme des images de haute qualité sans aucun bruit. Objets avec différentes épaisseurs ont été simulées et les résultats s’affichent (Figure 3, tableau 3). Simulé objets 2D standard, tels que des cercles, des carrés et des rectangles, exacte des valeurs pour la région (TV ou BV) et une épaisseur sont signalés (tableau 3). Pour les objets 3D, les mesures d’épaisseur exacte pour les cubes, sphères et cuboïdes sont signalées, cependant, les épaisseurs pour les bouteilles ne sont pas exactes pour les voxels près les deux extrémités d’un cylindre, tandis que les épaisseurs de voxel dans les tranches moyennes des cylindres sont exactement comme prédit. Il s’agit d’une caractéristique de l’algorithme de mesure épaisseur sous-jacent, dans lequel les épaisseur du voxel pour chaque objet est déterminé par le diamètre de la sphère plus grande, ou la longueur du côté du plus grand cube, qui contient ce voxel et est complètement à l’intérieur du objet. Par conséquent, les épaisseurs d’objets faits de différentes sphères et cubes peuvent être mesurés avec précision, alors que les bouteilles ne peuvent être mesurés avec précision dans rayon-distance de la tranche intermédiaire : les deux extrémités.
Figure 1 : Les résultats représentatifs du paramètre profilage analyse. (A) les paramètres de mise en page. (B) les résultats représentatifs du paramètre analyse de profilage. Certaines combinaisons de paramètres sont mieux que d’autres pour détecter les limites extérieures des os. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Des résultats représentatifs de l’analyse par segmentation trabéculaire. (A) les paramètres de mise en page. (B) les résultats de segmentation représentatifs de l’OS trabéculaires à différentes couches. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse trabéculaire. (A) les paramètres de mise en page. (B) résultats représentatifs des objets 2D simulées. (C) résultats représentatifs des objets 3D simulés, visualisées par la visionneuse 3D volume. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Distribution des mesures de l’OS trabéculaire dans la région sélectionnée analyse. L’axe horizontal représente la distance relative à la couche de tranche départ dans la région de l’analyse. Valeurs sur l’axe y sont calibrés trabéculaires mesures dans la région de l’analyse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Tranche | Limite de contour | Réduction de bruit dia. | Orifice remplissage dia. |
| 4 | 5200 | 0 | 10 |
| 147 | 5200 | 2 | 20 |
| 361 | 7200 | 6 | 16 |
| 539 | 8000 | 10 | 20 |
Tableau 1 : Résultats représentatifs du paramètre analyse de profilage.
Tableau 2 : Résultats représentatifs d’analyse trabéculaire.
| Objet | Dimension | Volumeb | Surfacec | Épaisseur |
| Place | 200 X 200 | 40000 | 796 | 200 |
| Rectangle | 200 X 100 | 20000 | 596 | 100 |
| Cercle | Dia : 200 | 31428 | 796 | 200 |
| Cube | 30 X 30 X 30 | 27000 | 5048 | 30 |
| Parallélépipède rectangle | 80 X 40 X 30 | 96000 | 13008 | 30 |
| Sphère | Diamètre : 30 | 14328 | 3944 | 30 |
| Cylindred | Dia:30 ; H: 100 | 71600 | 12800 | 27.84 |
| Cylindreélectronique | Dia:30 ; H: 100 | 51552 | 9552 | 30 |
| a: résultats sont en crue voxels. Diamètre : diamètre ; H: hauteur. | ||||
| b : Volume (3D) ou région (2D). | ||||
| c : Surface (3D) ou périmètre (2D). | ||||
| d: recense de tranche 1 tranche 100 est utilisés pour l’analyse. | ||||
| e: recense de la tranche 15 à tranche 85 est utilisés pour l’analyse. | ||||
Tableau 3 : Résultats de Quantification pour les objets simulés.
Fichier complémentaire 1. Échantillon OS. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Cette étude décrit un plugin ImageJ pour analyser l’OS trabéculaires, qui est automatique, efficace, et facile à utiliser. Le plugin permet également de quantifier tout objet 2D ou 3D pour des mesures de surfaces, volumes et une épaisseur couche par couche. Actuellement, seule une valeur pour chaque paramètre trabéculaire mesurée est signalée pour chaque échantillon en analyse micro-CT standard, qui ne peut pas représenter pleinement les caractéristiques de l’entité mesurée dans la région sélectionnée analyse. Le plugin décrit des rapports couche par couche des quantités de chaque paramètre pour chaque échantillon, qui entièrement conserve les informations de distribution du paramètre mesuré dans la région analyse sélectionnée et par conséquent plus avancé et sensibles à la statistique les approches sont applicables pour l’analyse de ces données.
Avec la standard, semi automatique main-segmentation méthode, une variation importante entre les différentes tranches de main-contournement ont été observés avec l’opérateur biais8,9,10, justifiant un uniforme plus et une méthode automatique de segmentation trabéculaire. Le contraste étant maximal entre le fond de balayage et de la limite extérieure de l’OS, segmentation trabéculaire assistée limite extérieure est réalisée par le plugin, où la frontière externe de l’OS peut être automatiquement détectée avec précision lorsque cela est approprié seuil, le bruit et les paramètres de trou sont fournis. Afin de faciliter la détermination des paramètres de segmentation, une gamme de paramètre combinaisons sont profilées un par un en utilisant une tranche représentative de la région de l’analyse et les résultats satisfaisants de segmentation sont vérifiées visuellement. Par la suite, les os trabéculaires sont analysés avec les paramètres profilées. Lorsque les paramètres de segmentation appropriée sont définis, et le plugin a été appliqué avec succès pour analyser l’OS trabéculaires du fémur distal rat traité avec des os différents agents anabolisants5, résultats reproductibles sont signalées pour la même image sans préjugé de l’opérateur.
Le plugin actuellement ne peut traiter un échantillon à la fois. Si plusieurs échantillons sont présents dans l’image, tous les échantillons sont quantifiés comme un objet unique sans discrimination. Par conséquent, prétraitement est requis si plusieurs échantillons sont analysés simultanément dans un tube à essais unique. Les sorties de quantification sont des mesures brutes des comtes de pixel ou de valeurs de gris, qui doivent être étalonnés manuellement à l’aide d’informations d’étalonnage approprié.
L’étape la plus critique dans le présent protocole est en sélectionnant les paramètres appropriés pour l’analyse trabéculaire. Généralement, des groupes d’échantillons osseux sont analysés à l’aide de paramètres de segmentation identiques afin de rendre les résultats comparables. Dans un tel cas, il faut pour s’assurer que les résultats de segmentation pour tous les échantillons sont examinés visuellement d’erreurs potentielles avant plus loin les analyses sont effectuées.
Une limitation majeure de cette technique est que les paramètres de réduction du bruit sont appliquées à l’OS corticales uniquement pour le contournement de la limite extérieure de l’OS, mais pas sur l’OS trabéculaires extraites. Comme différentes stratégies de filtrage ont été déclarés15 comme optimal pour l’analyse trabéculaire sous différentes conditions, aucun filtre simple n’est bon pour tous les échantillons de l’image. Il n’y a donc aucune étape de filtration intégrée avant de quantification de l’OS trabéculaires. Pour être compatible avec la sortie du logiciel avec les filtrations d’image intégrée, OS trabéculaires extraites peuvent être transformés de la même façon l’utilisation de divers outils d’imagerie, puis importés dans ImageJ et quantifié par la suite par le plugin. En outre, divers formats d’image sont générés par les différents fournisseurs de micro-CT et la plupart d'entre eux ne peuvent pas être importée ou ouvert directement par ImageJ, ainsi les modules d’importation de différents formats d’image dans ImageJ pour une analyse ultérieure sont souhaitées. Une autre limitation est que les épaisseurs 3D en tranches près des extrémités de la plage de sélection ne sont pas exacts, si des objets sont en dehors de la plage de sélection, qui est également vraie pour des paquets de quantification 3D disponible, par conséquent, un plus large éventail de tranches doivent être quantifiés, et seulement la partie médiane des tranches sélectionnées doit être utilisée pour une analyse ultérieure. Une telle approche ne peut être disponible lorsque les grandeurs mesurées sont déclaré couche par couche comme indiqué dans ce plugin, mais pas pour les mesures qu’une seule valeur est signalée pour chaque paramètre quantifié dans la zone de sélection.
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Disclosures
Un brevet pour l’algorithme sous-jacent de quantifier l’épaisseur de l’objet a été déposé. Les auteurs ont collaboré avec d’autres inscrits du site bomomics.com les plugins de la version gratuite, où la consultation et à la quantification des services d’analyse d’image sont fournis sur demande.
Acknowledgments
Ce travail a été partiellement soutenu par grant 81170806 de la CNSA. Les auteurs tiennent à remercier le laboratoire de micro-CT central d’école de stomatologie, Université de Wuhan pour avoir aidé les scanner et analyser les fémurs de rat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ | NIH | imagej | Any version with a java 1.8 run time |
| trabecular analysis plugin | Bomomics | bomomics | free or commercial version |
| Micro CT scanner | Scanco | μ-50 | micro CT from any vendor |
| Computer System | Lenovo | any brand | |
| Windows Operating System | Microsoft | Windows 7 x64 | any 64-bit Windows operating system |
| Office Software | Microsoft | Office 2010 | any speadsheet software that has xy chart function |
References
- Ruegsegger, P., Koller, B., Muller, R. A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcif Tissue Int. 58 (1), 24-29 (1996).
- Muller, R., Ruegsegger, P. Micro-tomographic imaging for the nondestructive evaluation of trabecular bone architecture. Stud Health Technol Inform. 40, 61-79 (1997).
- Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Phys Med. 30 (6), 619-634 (2014).
- Bart, Z., Wallace, J. Microcomputed Tomography Applications in Bone and Mineral Research. Advances in Computed Tomography. 2, 121-127 (2013).
- Ji, Y., Ke, Y., Gao, S. Intermittent activation of notch signaling promotes bone formation. Am J Transl Res. 9 (6), 2933-2944 (2017).
- Jiang, Y., Zhao, J., White, D. L., Genant, H. K. Micro CT and Micro MR imaging of 3D architecture of animal skeleton. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (1), 45-51 (2000).
- Laib, A., et al. 3D micro-computed tomography of trabecular and cortical bone architecture with application to a rat model of immobilisation osteoporosis. Med Biol Eng Comput. 38 (3), 326-332 (2000).
- Cole, H. A., Ichikawa, J., Colvin, D. C., O'Rear, L., Schoenecker, J. G. Quantifying intra-osseous growth of osteosarcoma in a murine model with radiographic analysis. J Orthop Res. 29 (12), 1957-1962 (2011).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Med Imaging. 8, 16 (2008).
- Soviero, V. M., Leal, S. C., Silva, R. C., Azevedo, R. B. Validity of MicroCT for in vitro detection of proximal carious lesions in primary molars. J Dent. 40 (1), 35-40 (2012).
- Kohler, T., Stauber, M., Donahue, L. R., Muller, R. Automated compartmental analysis for high-throughput skeletal phenotyping in femora of genetic mouse models. Bone. 41 (4), 659-667 (2007).
- Buie, H. R., Campbell, G. M., Klinck, R. J., MacNeil, J. A., Boyd, S. K. Automatic segmentation of cortical and trabecular compartments based on a dual threshold technique for in vivo micro-CT bone analysis. Bone. 41 (4), 505-515 (2007).
- Dougherty, G. Quantitative CT in the measurement of bone quantity and bone quality for assessing osteoporosis. Med Eng Phys. 18 (7), 557-568 (1996).
- Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47 (6), 1076-1079 (2010).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
