Summary
Vi presentiamo un flusso di lavoro per segmentare e quantificare le ossa trabecular per immagini 2D e 3D basate sul contorno esterno di osso utilizzando un plugin di ImageJ. Questo approccio è più efficiente e preciso rispetto l'attuale approccio manuale mano-contornatura e fornisce a strati quantificazioni, che non sono disponibili nel software commerciale corrente.
Abstract
Micro-tomografia (micro-CT) è usata ordinariamente per valutare la quantità di osso e trabecular proprietà microstrutturali nei piccoli animali in condizioni di perdita di osso diverso. Tuttavia, l'approccio standard per trabecular analisi delle immagini di micro-CT è da affettare a mano semi-automatico-contornatura, che è ad alta intensità di manodopera e soggetto a errori. Qui descritto è un metodo efficiente per la segmentazione automatica delle ossa trabecular secondo limiti esterni di osso, dove trabecular ossa possono essere identificate e segmentate automaticamente con precisione con meno pregiudizi operatore quando appropriato parametri di segmentazione sono impostati. Per profilare i parametri di segmentazione soddisfacente, viene visualizzata una serie di immagini di risultati di segmentazione, dove tutte le possibili combinazioni dei parametri di segmentazione sono cambiato uno per uno in sequenza, e risultati di segmentazione con parametri associati possono facilmente essere controllato visivamente. Come una funzionalità di controllo di qualità del plugin, simulati oggetti standard sono quantificati dove le grandezze misurate possono essere confrontati con i valori teorici. Quantificazione di strato dopo strato di proprietà trabecular e trabecular spessori sono segnalati da un plugin, e le distribuzioni di tali proprietà all'interno di regioni selezionate possono essere profilate facilmente. Anche se la quantificazione strato dopo strato mantiene le informazioni ulteriori sulle ossa trabecular e facilita ulteriormente l'analisi statistica dei cambiamenti strutturali, tali misure non sono disponibili dall'output del software commerciali attuale, dove una sola quantificati valore per ciascun parametro viene segnalato per ogni campione. Di conseguenza, i flussi di lavoro descritti sono gli approcci migliori per analizzare le ossa trabecular con precisione ed efficienza.
Introduction
Analisi di micro-CT delle ossa trabecular sono l'approccio standard per tenere traccia delle modifiche morfologiche delle ossa in piccoli animali sotto differenti dell'osso perdita condizioni1,2,3, dove diverse variabili relative alla strutture delle ossa sono segnalati4. Tuttavia, tali parametri non sono distribuiti uniformemente nella metafisi delle ossa lunghe5, e solo un valore di riepilogo o una media viene segnalato per ogni variabile strutturale di ogni campione di corrente commerciale macchine micro-CT6,7 , anche se un singolo valore non può rappresentare appieno le caratteristiche del parametro misurato nella regione analyzing. Strati-quantificazione delle ossa trabecular non solo mantiene ulteriori informazioni per ogni variabile, ma consente anche la profilatura delle distribuzioni di tali variabili nella regione analyzing, facilitando la successiva analisi statistica dei fondi strutturali modifiche sotto diverse condizioni5. Pertanto, l'obiettivo di questo metodo è quantificare trabecular ossa di micro-TAC ad ogni livello della fetta, che non è attualmente disponibile in qualsiasi pacchetto di analisi micro-CT commercialmente disponibile.
Per in modo efficiente segmento trabecular ossa-di-affettare, metodi di segmentazione automatica sono desiderabili. Tuttavia, l'attuale tecnica standard per l'analisi di micro-CT è basata su manuale interattivo contornatura seguita da interpolazione semiautomatica per separare le ossa trabecular dai comparti corticale, che è lavoro intensivo, errori, e associato con operatore sostanziale bias8,9,10. Segmentazione automatica metodi11,12 sono stati segnalati, ma tali metodi sono ottimali solo in regioni con buona separazione tra ossa trabecular e corticale delle ossa, ma non nelle regioni senza separazioni chiare. Inoltre, segmentazione diversi parametri sono necessari per diversi campioni12, ed è noioso selezionare manualmente i parametri di segmentazione soddisfacente applicabili ai gruppi di campioni di osso provando varie combinazioni a parametro12, anche se il processo di segmentazione è automatico quando vengono impostati tutti i parametri correlati. Come il limite esterno dell'osso è il più grande contrasto con lo sfondo di scansione e i gusci corticali metafisarie delle ossa lunghe mostrano alcuni cambiamenti nella scelta analizzando regione, metodi di segmentazione in base alla distribuzione di contorno esterno delle ossa lunghe può in modo affidabile e preciso separare trabecular ossa da gusci di corticale. Il vantaggio di un tal metodo di segmentazione è che la segmentazione si basa sulla differenza tra lo sfondo e contorno esterno dell'osso, ma non sulle differenze tra ossa trabecular e corticale6,12, 13, pertanto è generalmente facile da trovare una combinazione di parametri di segmentazione che è soddisfacente per un gruppo di campioni di ossa, facilitando l'analisi più affidabile trabecular variazioni tra i diversi gruppi.
Presso ogni fetta livello, area, perimetro e bidimensionali (2D) spessore sono segnalati per analisi 2D, mentre volume, superficie e spessore di tridimensionale (3D) sono segnalati in 3D quantificazioni. Tali informazioni non viene generalmente segnalate da strumenti di analisi di immagine corrente, che indica che le procedure riportate possono essere applicate alle immagini generale dove tali informazioni sono desiderate.
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Protocol
Procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati condotti in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (pubblicazione NIH, 8a edizione, 2011) e sono state esaminate e approvate dal istituzionale Animal Care e uso Comitato di Wuhan Università.
1. installazione del software
- Installare il software ImageJ. Scarica la versione per Windows del software ImageJ (versione p 1,51) in bundle con Java a 64 bit da https://imagej.nih.gov/ij/. Estrarre il software scaricato in una cartella, che sarà successivamente di cui a come "ImageJ Directory".
Nota: Analisi Trabecular plugin richiedono java a 64 bit eseguita tempo (versione 1.8) e un sistema operativo windows a 64 bit, preferibilmente un sistema operativo di Windows 7 64-bit. - Installare i plugin di analisi trabecular. Richiesta analisi trabecular plugin da http://www.bomomics.com e decomprimere il contenuto nella directory dei plugin di ImageJ, che è "ImageJ Directory/plugins".
Nota: Il plugin può essere ottenuto come una versione gratuita, dove le misurazioni per 5 specificato fette adiacenti sono segnalati, o come una versione commerciale, dove una gamma di fette può essere specificata e misurata.
2. preparare il set di dati 3D per l'analisi Trabecular
- Scansione dei femori di ratto con un seguito di micro-CT macchina il protocollo n.5 di controllo standard e quindi salvare i dati in un formato che può essere importato in ImageJ, ad esempio, il formato tiff. Se campioni multipli dell'osso sono stati scansionati simultaneamente in una singola provetta, prima di importare i dati in ImageJ e quindi separare ogni singolo osso ritagliando fuori altri esempi che utilizzano strumenti di elaborazione delle immagini di ImageJ. Successivamente, è possibile salvare l'immagine risultante in un formato che può essere importato in ImageJ più tardi.
Nota: È incluso un file di immagine campione rappresentativo utilizzato nell'analisi (complementare File 1). -
Simulare oggetti 2D e 3D standard.
- Aprire il software ImageJ. Sotto i plugin di | BoMomics | Simulare oggetti menu, fare clic sul pulsante cerchio e immettere 200 come il diametro nella finestra popup, quindi fare clic su OK per generare il cerchio simulato con un diametro di 200 pixel (Figura 3B). Salvare il cerchio generato in formato tiff.
- Aprire il software ImageJ. Sotto i plugin di | BoMomics | Simulare oggetti menu, fare clic sul pulsante quadrato e immettere 200 come la lunghezza laterale nella finestra popup, quindi fare clic su OK per generare la piazza simulata con una lunghezza laterale di 200 pixel (Figura 3B). Salvare la piazza generata in formato tiff.
- Aprire il software ImageJ. Sotto i plugin di | BoMomics | Simulare oggetti menu, fare clic sul pulsante rettangolo e immettere 200 come la larghezza e 100 come l'altezza nella finestra popup, quindi fare clic su OK per generare il rettangolo simulato con una larghezza di 200 pixel e un'altezza di 100 pixel (Figura 3 B). Salvare il rettangolo generato in formato tiff.
Nota: Un cerchio (diametro: 200 pixel), una piazza (lunghezza laterale: 200 pixel) e un rettangolo (larghezza: 200 pixel; Altezza: 100 pixel) vengono salvate per le successive analisi. - Aprire il software ImageJ. Sotto i plugin di | BoMomics | Simulare oggetti menu, fare clic sul pulsante del cubo e immettere 30 come la lunghezza laterale nella finestra popup, quindi fare clic su OK per generare il cubo simulato. Infine, fare clic plugin | 3D | Visualizzatore di volume per visualizzare il cubo generato e salvarlo in formato tiff (Figura 3C).
- Aprire il software ImageJ. Sotto i plugin di | BoMomics | Simulare oggetti menu, fare clic sul pulsante Cuboid e immettere 80 come la lunghezza, 40 come larghezza e 30 come l'altezza nella finestra popup, quindi fare clic su OK per generare il cuboid simulato. Infine, fare clic plugin | 3D | Visualizzatore di volume per visualizzare il cuboid generato e salvarlo in formato tiff (Figura 3C).
- Aprire il software ImageJ. Sotto i plugin di | BoMomics | Simulare oggetti menu, fare clic sul pulsante di sfera e immettere 30 come il diametro nella finestra popup, quindi fare clic su OK per generare la sfera simulata. Infine, fare clic plugin | 3D | Visualizzatore di volume per visualizzare la sfera generata e salvarlo in formato tiff (Figura 3C).
- Aprire il software ImageJ. Sotto i plugin di | BoMomics | Simulare oggetti menu, fare clic sul pulsante del cilindro e immettete 30 come il diametro e 100 come l'altezza nella finestra popup, quindi fare clic su OK per generare il cilindro simulato. Infine, fare clic plugin | 3D | Visualizzatore di volume per visualizzare il cilindro generato e salvarlo in formato tiff (Figura 3C).
Nota: Una sfera (diametro: 30 pixel), un cubo (lunghezza laterale: 30 pixel), un parallelepipedo (lunghezza: 80 pixel; width: 40 pixel; Altezza: 30 pixel) e un cilindro (diametro: 30 pixel; Altezza: 100 pixel) vengono salvate per le successive analisi.
3. profilatura parametri di analisi
- ImageJ software Open e aprire o importare un'immagine acquisita.
- Far scorrere la barra di scorrimento inferiore per scegliere una fetta, quindi fare clic sull'immagine di | Regolare | Soglia pulsante. Nella finestra popup soglia, regolare i valori di soglia minima e massima di ispezione manuale per garantire che le ossa sono ben separate dallo sfondo e registrare il valore di soglia minima come il valore di soglia di osso corticale.
Nota: Come diversi micro-CT produttori utilizzano diversi fattori di scala per la memorizzazione di coefficienti di attenuazione di raggi x nelle immagini, il valore di soglia effettiva dovrebbe essere determinato empiricamente mediante ispezione manuale o seguendo le specifiche del produttore consigli. Nella nostra pratica, impostando la soglia minima per i file ISQ prodotte da macchine micro-CT a 6.000-7.000 affidabile può separare le ossa dallo sfondo scansione. - Scegliere il plugin | BoMomics | Profilatura di Trab Param pulsante. Nella finestra popup, impostare Indice fetta alla posizione della fetta rappresentativa e impostare l'osso corticale ("osso Cort"), range ("Range") e valori di passaggio ("passaggio") per il calcolo di un insieme di soglie corticale per profilatura parametri di segmentazione, dove il valore di soglia di osso corticale viene acquisito dal passo 3.2 (Figura 1). Valori di gamma e passaggio di predefiniti di lavoro 2.000 e 400 per la maggior parte delle immagini di micro-CT. Impostare l' Indice fetta a 5 per il set di dati di esempio e mantenere i valori predefiniti per le altre impostazioni.
Nota: "Cort osso" è la soglia per ossa corticali e il valore di soglia utilizzato per profilatura modifiche dei parametri dal valore di soglia più basso al più alto valore di soglia con l'incremento del valore di passo, dove il valore di soglia più basso è il valore di Cort Osso - gamma e il più alto valore di soglia è osseo Cort + gamma. Se i valori impostati per Cort osso, fascia e passo sono 6.000, 1.000 e 500, rispettivamente, allora il valore di soglia più basso per ossa corticali è 6.000-1, 000 = 5, 000, il più alto valore di soglia è di 6, 000 + 1, 000 = 7, 000 e le soglie utilizzate analisi sono 5.000, 5.500, 6.000, 6.500 e 7.000. - Impostare rumore diametro "(diametro di rumore del), passo ("passo") e gamma di valori ("gamma") per specificare un set di valori di rumorosità in analisi e il diametro del foro"(diametro del foro del), passaggio ("passaggio") e valori di intervallo ("gamma") per il calcolo di un insieme di valori di foro. In generale, l'impostazione predefinita funziona per la maggior parte dei campioni di ossa di micro-CT, dove rumore, passo e gamma sono 5, 5, 2, rispettivamente, e gamma, passo e diametro del foro sono 15, 5, 2, rispettivamente. Mantenere le impostazioni predefinite per i set di dati di esempio.
Nota: "Dia. rumore" è il diametro del filtro di soppressione del rumore, e il "foro diametro." è il diametro dei fori all'interno delle ossa corticali. I valori di rumore e foro usati per la profilazione di parametro possono essere calcolati allo stesso modo come valori di soglia corticale descritti sopra, utilizzando lo specificato rumore/foro, gamma e valori di passaggio. A causa delle variazioni nei parametri di scansione quando l'acquisizione di immagini, parametri di rumore e foro dovrebbero essere determinati empiricamente secondo la qualità dell'immagine, come non intervalli generali dei parametri rumore e foro sono buoni per tutte le scansioni. Il valore più basso per la soglia, rumore o fori deve essere maggiore o uguale a 0, e se il valore calcolato più basso è negativo utilizzando i parametri forniti, il valore più basso specifico è impostato su 0. - Fare clic su OK per eseguire la profilatura di parametro. Visivamente verificare i risultati di segmentazione nella finestra Dei risultati di profilatura di parametro e selezionare un livello di sezione, in modo che il limite esterno dell'osso è descritto molto accuratamente (Figura 1B). Successivamente, è possibile recuperare i parametri di profilatura dalla voce nella tabella dei Risultati di profilatura del parametro corrispondente al livello scelto sezione (tabella 1).
4. trabecular analisi
-
Segmentazione delle ossa trabecolare
- Aprire il software ImageJ, quindi aprire o importare un'immagine acquisita.
- Scegliere il plugin | BoMomics | Trab segmentazione pulsante e inserire i parametri di analisi appropriato. Impostare la "Start", "Profilo di confine", "Trab. Ossa","Diametro di riduzione di rumore","Foro di riempimento ø"e"Diametro spessore corticale"5, 7.200, 7.000, 6, 12 e 25, rispettivamente.
Nota: "Start" e "Fine" specifica l'intervallo di sezione selezionata per la segmentazione delle ossa trabecular, "Contorni contorno" è corrispondente al parametro "Cort osso" profilato, "Rumore riduzione diametro" a "Rumore dia." Parametro e "Diametro del foro di riempimento." al "Foro dia." parametro. "Spessore corticale diametro" è lo spessore specificato per escludere le ossa corticali esterne. "Trab. Ossa "sono la soglia per l'estrazione di trabecular ossa (Figura 2), dove le impostazioni vengono determinate mediante profilatura comando parametri di analisi, come descritto in passaggio 3.5. - Fare clic su OK per eseguire la segmentazione trabecular. Controllare visivamente i risultati di segmentazione nella finestra Risultati di segmentazione di Trab (Figura 2B). Salvare le ossa trabecular estratte mostrate nella finestra di Ossa Trabecular segmentato in formato tiff (Figura 2B), che può essere ulteriormente analizzata da altri software.
-
Analisi delle ossa trabecular.
- Aprire il software ImageJ, quindi aprire o importare un'immagine acquisita.
- Scegliere il plugin | BoMomics | Analisi di Trab pulsante e riempire in parametri di analisi appropriato, ad esempio "Avvio", "Contorni contorno", "Trab. Bones","Diametro di riduzione del rumore", diametro del" foro di riempimento."e"Diametro spessore corticale"come descritto sopra (Figura 3A), dove sono determinate le impostazioni utilizzando il comando di parametri di analisi profilatura come descritto nel passo 3.5. Impostare la "Start", "Profilo di confine", "Trab. Ossa","Diametro di riduzione di rumore","Foro di riempimento ø"e"Diametro spessore corticale"5, 7.200, 7.000, 6, 12 e 25, rispettivamente.
Nota: Nella versione gratuita del plugin, cinque fette adiacenti a partire dall'indice specificato di fetta di "Start" sono selezionati per la misura, mentre nella versione commerciale, un numero arbitrario di fette può essere specificato dall'utente. - Selezionare una o più scelte nella sezione Risultati Reporting per i parametri da misurare, dove il volume trabecular dell'osso (BV), il volume totale (TV) della regione selezionata e spessori di misura è bidimensionale (2D) o tridimensionale (3D) sono disponibili per la selezione attraverso tre caselle di controllo, vale a dire BV TV"solo", "2D", "3D". Selezionare le caselle di controllo "2D" e "3D", quindi fare clic su "OK" per eseguire l'analisi trabecular (Figura 3A, tabella 2).
Nota: Quando "BV TV solo" è selezionata, indipendentemente dagli Stati di selezione di "2D" e "3D", crudi misure di BV, TV e l'intensità sono segnalati, e le ossa trabecular segmentate sono estratte e visualizzate in una nuova finestra, che può essere salvata e ulteriormente analizzata da altri software. Quando "2D" è selezionata, vengono segnalati crudi misure di BV, TV, intensità e spessori misurati è bidimensionale ad ogni livello di fetta utilizzando il modello di piastra. Se è selezionata la "3D", spessore tridimensionale per ogni voxel viene calcolato direttamente senza alcuna assunzione di modello, quindi crudi misure di BV, TV, intensità e spessori tridimensionale campionate a ogni livello di sezione sono segnalati. Tuttavia, se nessuna casella di controllo è selezionata, trabecular ossa sono segmentate utilizzando il precedente set di parametri, ma nessuna misura è segnalata.
5. quantificare oggetti simulati
- Aprire il software ImageJ, quindi aprire un immagine simulata. Qui, aprire la sfera simulata con un diametro di 30 pixel ad esempio.
- Selezionare il plug-in | BoMomics | Analisi di Trab pulsante e inserire i parametri di analisi appropriato come descritto in precedenza. Mantenere i valori predefiniti per "Start", "Fine", "Profilo di confine", "Trab. Bones"e impostare"Diametro di riduzione di rumore","Diametro di riduzione di rumore", diametro del" foro di riempimento."e"Diametro spessore corticale"a 0 (Figura 3).
Nota: Per oggetti simulati, non c'è nessun rumore di segnale non intenzionale, e non ci può essere nessuna conchiglie corticale corrispondente. Pertanto, i parametri per tali valori devono essere impostati in modo appropriato (impostazioni predefinite sono a zero). Per 3D quantificazioni, 30 fette prima e dopo la fetta di "Start" specificata vengono elaborati utilizzando la versione gratuita del plugin, mentre soli fette nell'intervallo specificato da fette di "Inizio" e "Fine" vengono analizzati dalla versione commerciale del plugin. - Nella sezione Risultati Reporting , selezionare "2D" e "3D" per i parametri da misurare e fare clic su OK per eseguire l'analisi trabecular per l'oggetto simulato (tabella 3).
6. calibrazione delle misure Trabecular e presentazione dei dati: profilo le distribuzioni di Trabecular misure della regione selezionati analizzando
- Ottenere le informazioni di calibrazione del set di dati scansionati, secondo le istruzioni del fornitore di micro-CT.
Nota: Solo crude misure di BV, TV, intensità e spessori sono segnalate dal plugin. Per ottenere misure comparabili ai report generati da altri software, calibrazione di risultato è desiderato. - Aprire Microsoft Excel e aprire la tabella di risultati riferiti. Calcolare calibrato volume osseo (BV), totale volume (TV), contenuto minerale osseo (BMC), frazione di volume osseo (BV/TV) e densità minerale ossea (BMD) in nuove colonne utilizzando i valori segnalati crudi BV, TV e intensità secondo le seguenti espressioni di excel.
- Nota: Scansione ad alta risoluzione (risoluzione, µm), grigio ridimensionamento (scalatura), unità di densità (mg HA/cm3), pendenza di densità (pendenza) e intercetta densità (intercetta) possono essere estratti dai micro-CT immagine o meta file digitalizzati, ad esempio il file Scanco ISQ. Di conseguenza, le misure calibrate sono calcolate come segue:
Supponiamo che BV, TV e l'intensità sono misure crudi, BVc e TVc sono valori calibrati, risoluzione, ridimensionamento, pendenza, intercetta sono da file di calibrazione di micro - CT immagini.
BVc = BV × risoluzione3 [μm3]
TVc = TV × risoluzione3 [μm3]
BV / TV = BV ÷ TV
BMC = (intensità ÷ ridimensionamento × pendenza - intercetta × BV) risoluzione ×3 × 10-12 [mg HA]
BMD - BMC ÷ TVc × 1012 [mg ettari / cm3] - Creare un diagramma di dispersione (XY) per misure calibrate (Y) contro fetta strati (X) utilizzando Microsoft Excel software (Figura 4).
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Representative Results
Il plugin di analisi trabecular è progettato per segmentare e quantificare le ossa trabecular con precisione automaticamente. Inizialmente, osso contorno esterno viene rilevato e delineato seguita da un'operazione di riempimento foro dove qualsiasi fori all'interno delle conchiglie corticale esterna dell'osso sono riempiti. Quindi viene eseguita un'operazione di erosione per escludere le ossa corticali esterne e ricevere le ossa trabecular segmentate. Infine, misure delle ossa trabecular nella regione segmentata sono quantificati.
Come immagini di micro-CT sono intrinsecamente rumorose, segmentazioni utilizzando parametri predefiniti arbitrari spesso non riescono a identificare con precisione i contorni esterni di osso. È noiosa e labor intensive per provare un sacco di combinazioni di parametri per la selezione dei parametri di segmentazione soddisfacente. Pertanto, viene fornito un parametro profilatura plugin per modificare i parametri uno ad uno nel range impostato automaticamente per assistere nella scelta di combinazioni di parametri soddisfacenti, che facilita anche la selezione di un insieme comune di parametri per un gruppo di osso campioni. Figura 1 A Mostra le impostazioni utilizzate per l'analisi di parametri di buona segmentazione. Quando i parametri di soglia di osso corticale (Cort dell'osso), gamma di soglia essere profilata (gamma), e importo incremento per soglia (passaggio) ad ogni passo vengono specificati, vengono generate una serie di soglie per realizzarne. Successivamente, una serie di valori di rumore e foro vengono generati allo stesso modo impostando i parametri corrispondenti. Infine, trabecular ossa sono segmentate modificando i parametri uno alla volta per tutte le combinazioni di parametri possibile. Figura 1 B Mostra i risultati di segmentazione rappresentativo per le combinazioni di parametri diversi. Ovviamente, alcune combinazioni di parametro sono meglio di altri a delineare contorni esterni di un osso, e più di una combinazione di parametri Mostra risultati di segmentazione soddisfacente. Dopo controllando visivamente i risultati di segmentazione, i valori di parametro per segmentazioni soddisfacente possono essere Estratto da profilatura tabella dei risultati (tabella 1).
Per quantificare le misure delle ossa trabecular, vengono eseguite analisi e segmentazione trabecular. Figura 2 A Mostra la finestra di dialogo di impostazione per la segmentazione trabecular, dove trabecular ossa nella regione selezionata sono segmentate ed estratti (Figura 2B), e possono essere controllati risultati di segmentazione utilizzando i parametri forniti da affettare visivamente. Successivamente, trabecular ossa vengono analizzate con soddisfacenti parametri (Figura 3A). A seconda lo stato di selezione di opzioni, crudi quantificazioni di volume osseo (BV), volume (TV), somma dei valori di grigio (intensità), totale e spessori misurati dimensionalmente entrambi due o tre dimensionale (tabella 2) sono segnalati. Infine, informazioni di calibrazione viene estratta dal dataset micro-CT digitalizzati e calibrato misure di BV, TV, BMC, BV/TV e BMD sono calcolati seguita da loro distribuzioni in analyzing regione strato-da-livello selezionato contro lo strato di profilatura posizioni (Figura 4).
Come una funzionalità di controllo di qualità del plugin, quantificazione di oggetti simulati è supportato. Oggetti standard simulati con dimensioni conosciute sono quantificati dal plugin per il confronto con i valori teorici o di misure da altri software, come software commerciale fornito con macchine micro-CT o BoneJ14, un plugin gratuito open source per analisi di immagine dell'osso. Per analizzare oggetti simulati, rumore siano impostate a zero, come immagini simulate sono considerati immagini di alta qualità senza alcun rumore. Oggetti con vari spessori sono stati simulati e i risultati sono riportati (Figura 3, tabella 3). Per gli oggetti 2D standard simulati, quali cerchi, quadrati e rettangoli, i valori per area (TV o BV) esatti e spessore sono segnalati (tabella 3). Per gli oggetti 3D, misure di spessore esatto per cubi, sfere e parallelepipedi sono segnalati, tuttavia, gli spessori per i cilindri non sono accurati per voxel vicino entrambe le estremità del cilindro, mentre gli spessori di voxel nelle fette centrale dei cilindri sono esattamente come predetto. Questa è una caratteristica dell'algoritmo di misurazione spessore sottostante, in cui lo spessore di voxel per ogni oggetto è determinato dal diametro della sfera più grande, o la lunghezza del lato del cubo più grande, che contiene questo voxel ed è completamente all'interno del oggetto. Di conseguenza, spessori di oggetti è costituito da diverse sfere e cubi possono essere misurate con precisione, mentre cilindri possono essere misurate con precisione solo in raggio-distanza della fetta medio da entrambe le estremità.
Figura 1 : Risultati rappresentativi del parametro analisi. (A) i parametri di impostazione pagina. (B) risultati rappresentativi del parametro analisi del profilo. Alcune combinazioni di parametro sono meglio di altri, per la rilevazione i contorni esterni delle ossa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Risultati rappresentativi di analisi di segmentazione trabecular. (A) i parametri di impostazione pagina. (B) risultati rappresentativi di segmentazione delle ossa trabecular a diversi livelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Analisi trabecular. (A) i parametri di impostazione pagina. (B) risultati rappresentativi di oggetti 2D simulati. (C) risultati rappresentativi degli oggetti 3D simulati visualizzati dal Visualizzatore di volume 3D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Distribuzioni di misure trabecular dell'osso nella regione selezionata analyzing. L'asse orizzontale rappresenta la distanza relativa al livello di partenza fetta analisi della regione. Valori nell'asse y sono misure calibrate trabecular analisi della regione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Fetta | Profilo confine | Diametro di riduzione del rumore | Diametro del foro di riempimento. |
| 4 | 5200 | 0 | 10 |
| 147 | 5200 | 2 | 20 |
| 361 | 7200 | 6 | 16 |
| 539 | 8000 | 10 | 20 |
Tabella 1: Risultati rappresentativi del parametro analisi del profilo.
Tabella 2: Risultati rappresentativi di analisi trabecular.
| Oggetto | Dimensione | Volumeb | Superficiec | Spessore |
| Piazza | 200 X 200 | 40000 | 796 | 200 |
| Corpo a rettangolo | 200 X 100 | 20000 | 596 | 100 |
| Cerchio | Diametro: 200 | 31428 | 796 | 200 |
| Cubo | 30 X 30 X 30 | 27000 | 5048 | 30 |
| Cuboid | 80 X 40 X 30 | 96000 | 13008 | 30 |
| Sfera | Dia: 30 | 14328 | 3944 | 30 |
| Cilindrod | Dia:30; H: 100 | 71600 | 12800 | 27,84 |
| Cilindroe | Dia:30; H: 100 | 51552 | 9552 | 30 |
| r: risultati sono in raw voxel. Diametro: diametro; H: altezza. | ||||
| b: Volume (3D) o zona (2D). | ||||
| c: superficie (3D) o perimetrale (2D). | ||||
| d: Measurs da 1 fetta per fetta 100 vengono utilizzati per l'analisi. | ||||
| e: Measurs da fetta 15 a fetta 85 vengono utilizzati per l'analisi. | ||||
Tabella 3: Risultati di quantificazione per oggetti simulati.
File supplementari 1. Campione osseo. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo studio descrive un plugin di ImageJ per analizzare le ossa trabecular, che è automatico, efficiente, e facile da usare. Il plugin è utilizzabile anche per quantificare qualsiasi oggetto 2D o 3D per strato dopo strato misure di aree, volumi e spessori. Attualmente, solo un singolo valore misurato per ogni parametro trabecular è segnalato per ciascun campione di analisi micro-CT standard, che non può rappresentare appieno le caratteristiche dell'entità misurata nella regione analisi selezionata. Il plugin descritto rapporti quantitativi a strati di ciascun parametro per ogni campione, che mantiene pienamente le informazioni di distribuzione del parametro misurato in regione analisi selezionata e quindi più avanzati e sensibile statistica approcci sono applicabili per l'analisi di tali dati.
Con il metodo standard e semi-automatica mano-contornatura segmentazione, una variazione sostanziale tra fette diverse di mano-contornatura sono stati osservati con operatore bias8,9,10, garantendo un aspetto più uniforme e un metodo automatico per la segmentazione trabecular. Come il contrasto è massimo tra lo sfondo di scansione e il limite esterno dell'osso, contorno esterno assistita trabecular segmentazione è eseguita dal plugin, dove contorno esterno di osso possa essere automaticamente rilevato con precisione quando appropriato soglia, rumore e impostazioni fori sono fornite. Per facilitare la determinazione dei parametri di segmentazione, una serie di parametri sono combinazioni di profilato uno ad uno con una fetta di rappresentanza della regione di analisi, e segmentazione soddisfacenti risultati sono controllati visivamente. Successivamente, trabecular ossa vengono analizzate con i parametri profilati. Quando vengono impostati parametri di segmentazione appropriata, e il plugin è stato applicato con successo per analizzare trabecular ossa da femori distali di ratto trattate con differenti dell'osso agenti anabolizzanti5, risultati riproducibili sono segnalati per la stessa immagine senza pregiudizi di operatore.
Il plugin attualmente solo può elaborare un campione alla volta. Se campioni multipli sono presenti nell'immagine, tutti i campioni sono quantificati come un singolo oggetto senza discriminazioni. Pertanto, la pre-elaborazione è necessaria se campioni multipli vengono analizzati simultaneamente in una singola provetta. Le uscite di quantificazione sono misure crude di conteggi pixel o valori di grigio, che dovrebbero essere calibrati manualmente utilizzando informazioni di calibrazione appropriata.
La fase più critica in questo protocollo sta selezionando i parametri appropriati per l'analisi trabecular. In generale, gruppi di campioni di osso sono analizzati utilizzando parametri di segmentazione identici per rendere comparabili i risultati. In tal caso, si dovrebbe prestare attenzione affinché i risultati di segmentazione per tutti i campioni sono esaminati visivamente per potenziali errori prima ulteriormente le analisi vengono condotte.
Una limitazione principale di questa tecnica è che le impostazioni di riduzione del rumore vengono applicate alle ossa corticali solo per contouring contorno esterno di un osso, ma non su ossa trabecular estratte. Come varie strategie di filtraggio sono stati segnalati15 come ottimale per analisi trabecular in condizioni diverse, nessun singolo filtro è buono per tutte le immagini di esempio. Pertanto, non esiste nessun passaggio di filtrazione integrata prima quantificazione delle ossa trabecular. Per essere compatibile con l'output del software con filtrazioni di immagine incorporata, estratte trabecular ossa possono essere trattati allo stesso modo prima con vari strumenti di imaging e poi importati in ImageJ e quantificato dal plugin successivamente. Inoltre, diversi formati di immagine vengono generati dai diversi fornitori di micro-CT e la maggior parte di loro non possono essere importata o aperti di ImageJ direttamente, così i moduli per l'importazione di vari formati di immagine in ImageJ per ulteriori analisi sono desiderati. Un'altra limitazione è che i 3D spessori in fette vicino alle estremità del campo di selezione non sono precisi se parte degli oggetti è fuori dell'intervallo di selezione, che vale anche per tutti i pacchetti disponibili quantificazione 3D, di conseguenza, una più vasta gamma di fette devono essere quantificati, e solo la porzione centrale di sezioni selezionate deve essere utilizzata per ulteriori analisi. Tale approccio può essere disponibile solo per grandezze misurate sono segnalato strato dopo strato, come mostrato in questo plugin, ma non per le misure che un solo valore viene segnalato per ogni parametro quantificato nell'intervallo di selezione.
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Disclosures
È stato depositato un brevetto per l'algoritmo sottostante di quantificare lo spessore oggetto. Gli autori hanno collaborato con altri utenti registrati il sito Web di bomomics.com hosting plug-in versione gratuita, dove consulenza e quantificare i servizi di analisi dell'immagine sono disponibili su richiesta.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato parzialmente supportato da grant NFSC 81170806. Gli autori vorrei ringraziare la struttura micro-CT nucleo della scuola di stomatologia, Università di Wuhan per aiutare scansione e analizzare i femori di ratto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ | NIH | imagej | Any version with a java 1.8 run time |
| trabecular analysis plugin | Bomomics | bomomics | free or commercial version |
| Micro CT scanner | Scanco | μ-50 | micro CT from any vendor |
| Computer System | Lenovo | any brand | |
| Windows Operating System | Microsoft | Windows 7 x64 | any 64-bit Windows operating system |
| Office Software | Microsoft | Office 2010 | any speadsheet software that has xy chart function |
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