Summary
Vi præsenterer en arbejdsproces for segmentering og kvantificere trabekulær knogler til 2D og 3D billeder baseret på bone's ydre grænse ved hjælp af en ImageJ plugin. Denne metode er mere effektiv og præcis end de nuværende manuel hånd-konturering tilgang, og giver lag på lag kvantificeringer, som ikke findes i nuværende kommercielle software.
Abstract
Mikro-beregnet tomografi (mikro-CT) anvendes rutinemæssigt til at vurdere knogle mængde og trabekulær mikrostrukturanalyse egenskaber i små dyr under forskellige knogle tab. Standardmetoden for trabekulær analyse af micro-CT billederne er imidlertid skive af skive semi-automatiske hånd-tilretning, der er arbejdskrævende og fejl liggende. Beskrevet her er en effektiv metode til automatisk segmentering af trabekulær knogler efter bone's ydre grænser, hvor trabekulær knogler kan identificeres og segmenteret automatisk med nøjagtighed med mindre operatør bias når det er hensigtsmæssigt segmentering parametrene er angivet. For at profilere tilfredsstillende segmentering parametre, vises en billedstak af segmentering resultater, hvor alle mulige kombinationer af parametrene segmentering er ændrede sig i rækkefølge, og segmentering resultater med tilhørende parametre kan nemt visuelt kontrolleres. Som en kvalitetskontrol funktion af plugin, er simulerede standard objekter kvantificeret, hvor de målte mængder kan sammenlignes med teoretiske værdier. Lag på lag kvantificering af trabekulær egenskaber og trabekulær tykkelser er rapporteret af sådan et plugin, og fordelinger af sådanne egenskaber inden for de udvalgte regioner kan blive profileret nemt. Selv om lag-på-lag bevarer flere oplysninger om trabekulær knogler og letter yderligere statistisk analyse af strukturelle ændringer, er sådanne foranstaltninger ikke tilgængelig fra produktionen af nuværende kommercielle software, hvor kun en enkelt kvantificerede værdi for hver parameter er rapporteret for hver prøve. Derfor, de beskrives arbejdsprocesser er bedre metoder til at analysere trabekulær knogler med præcision og effektivitet.
Introduction
Mikro-CT analyse af trabekulær knogler er standardmetoden til sporing af morfologiske forandringer af knoglerne i små dyr under forskellige knogle tab betingelser1,2,3, hvor flere variabler relateret til den strukturer af knoglerne er rapporteret4. Men sådanne parametre er ikke jævnt fordelt i metaphysis af lange knogler5, og kun en sammenfattet eller gennemsnit værdi er rapporteret for hver strukturel variabel af hver prøve af nuværende kommercielle mikro-CT maskiner6,7 , om en enkelt værdi ikke kan fuldt ud repræsenterer Karakteristik af den målte parameter i regionen analyse. Lag på lag kvantificering af trabekulær knoglerne ikke kun bevarer flere oplysninger for hver variabel, men giver også mulighed for profilering af distributioner af disse variabler i regionen analysere lette efterfølgende statistisk analyse af strukturelle ændringer under forskellige forhold5. Derfor er målet med denne metode kvantificere trabekulær knogler af micro-CT scanninger på hver skive plan, hvilke ikke er anvendelig i hvilken som helst kommercielt tilgængelige mikro-CT-analyse pakke i øjeblikket.
Til effektivt segment trabekulær knogler skive-af-skive er automatiske segmentering metoder ønskelig. Den nuværende standard teknik til micro-CT analyse er imidlertid baseret på manuel interaktive Profilstyring efterfulgt af semiautomatisk interpolation at adskille trabekulær knogler fra de kortikale rum, der er arbejdsintensive, fejlbehæftet, og forbundet med betydelig operatør bias8,9,10. Automatisk segmentering metoder11,12 blev rapporteret, men sådanne metoder er kun optimal i regioner med god adskillelse mellem trabekulær knogler og kortikale knogler, men ikke i regioner uden klare separationer. Desuden, der kræves for forskellige prøver12forskellige segmentering parametre, og det er trættende at manuelt vælge tilfredsstillende segmentering parametre gælder for grupper af knogle prøver ved at prøve forskellige parameter kombinationer12, Selvom segmentering proces er automatisk, når alle relaterede parametre er angivet. Som knoglen ydre grænse har den største kontrast med scanning baggrunden og metafyseale kortikale skaller af lange knogler vise nogle ændringer i den valgte analyse region, segmentering metoder ifølge ydre grænse konturen af lange knogler kan pålideligt og præcist separate trabekulær knogler fra kortikale skaller. Fordelen ved sådan en segmentering metode er, at segmenteringen er baseret på forskellen mellem baggrunden og bone's ydre grænse, men ikke på forskelle mellem trabekulær og kortikale knogler6,12, 13, derfor er det generelt nemt at finde en kombination af segmentering parametre, der er tilfredsstillende for en gruppe af knogle prøver, lette mere pålidelig analyse af trabekulær ændringer mellem forskellige grupper.
På hver skive indberettes niveau, areal, omkreds og todimensionale (2D) tykkelse for 2D analyse, mens volumen, overflade og tre-dimensionelle (3D) tykkelse er rapporteret i 3D kvantificeringer. Sådanne oplysninger er generelt ikke rapporteret af aktuelle billede analyseværktøjer, der angiver, at indberettede procedurer kan anvendes til generelle billeder hvor sådanne oplysninger ønskes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer, der involverer dyr emner har blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (NIH publikation, 8. udgave, 2011), og gennemgået og godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Wuhan Universitet.
1. Programinstallation
- Installere ImageJ software. Hente Windows-versionen af ImageJ (version 1.51 p) software bundled med 64-bit Java fra https://imagej.nih.gov/ij/. Uddrag den downloadede software i en mappe, som vil være senere omtalt som "ImageJ Register".
Bemærk: Trabekulær analyse plugins kræver 64-bit java køre tid (version 1,8) og en 64-bit windows-operativsystem, helst et 64-bit Windows 7 operativsystem. - Installere trabekulær analyse plugins. Anmode om trabekulær analyse plugins fra http://www.bomomics.com og unzip indhold i Imagej's plugins mappe, som er "ImageJ mappen/plugins".
Bemærk: Plugin kan fås enten som en gratis version, hvor målingerne til 5 angivne tilstødende udsnit er rapporteret, eller som en kommerciel version, hvor en række skiver kan være angivet og målt.
2. klargør 3D datasæt for trabekulær analyse
- Skan rotte lårben med en mikro-CT maskine efter den standard scanning protokol5 og derefter gemme data i et format, der kan importeres til ImageJ, fx, tiff-format. Hvis flere bone prøver blev scannet samtidigt i en enkelt prøveglas, først importere dataene til ImageJ, og derefter adskille hver enkelt knogle ved at beskære ud andre prøver ved hjælp af Imagejs billedbehandling værktøjer. Efterfølgende, gemme det resulterende billede i et format, der kan importeres til ImageJ senere.
Bemærk: En repræsentativ prøve billedfil anvendes i analysen er inkluderet (supplerende fil 1). -
Simulere standard 2D og 3D objekter.
- Åbn ImageJ software. Under Plugins | BoMomics | Simulere objekter menu, klik på knappen cirkel og Indtast 200 som diameter i pop-up-vinduet, og klik på OK for at generere den simulerede cirkel med en diameter på 200 pixel (fig. 3B). Gemme den genererede cirkel i tiff-format.
- Åbn ImageJ software. Under Plugins | BoMomics | Simulere objekter menuen, klik på knappen Square og Indtast 200 som sidelængde i pop-up-vinduet, og klik på OK for at generere den simulerede firkant med en sidelængde på 200 pixel (fig. 3B). Gemme den genererede square i tiff-format.
- Åbn ImageJ software. Under Plugins | BoMomics | Simulere objekter menu, klik på knappen rektangel og Indtast 200 som bredde og 100 som højde i pop-up-vinduet, og klik på OK for at generere den simulerede rektanglet med en bredde på 200 pixel og en højde på 100 pixel (figur 3 B). Gemme den genererede rektangel i tiff-format.
Bemærk: En cirkel (diameter: 200 pixels), et kvadrat (sidelængde: 200 pixels), og et rektangel (bredde: 200 pixels, højden: 100 pixel) er gemt for de efterfølgende analyser. - Åbn ImageJ software. Under Plugins | BoMomics | Simulere objekter menuen, klik på knappen kube og Indtast 30 som sidelængde i pop-up-vinduet, så klik på OK for at generere den simulerede kube. Endelig skal du klikke Plugins | 3D | Volumen seer at se oprettede kuben, og gemme det i tiff format (figur 3C).
- Åbn ImageJ software. Under Plugins | BoMomics | Simulere objekter menuen, klik på knappen kasse og Indtast 80 som længde, 40 som bredde og 30 som højde i popup-vinduet, så klik på OK for at generere den simulerede kasseformet. Endelig skal du klikke Plugins | 3D | Volumen seer at se den genererede kasseformet og gemme det i tiff format (figur 3C).
- Åbn ImageJ software. Under Plugins | BoMomics | Simulere objekter menuen, klik på knappen sfære og Angiv 30 som diameter i pop-up-vinduet, og klik på OK for at generere den simulerede sfære. Endelig skal du klikke Plugins | 3D | Volumen seer at se den genererede sfære og gemme det i tiff format (figur 3C).
- Åbn ImageJ software. Under Plugins | BoMomics | Simulere objekter menu, klik på knappen Cylinder og Indtast 30 som diameter og 100 som højde i pop-up-vinduet, og klik på OK for at generere den simulerede cylinder. Endelig skal du klikke Plugins | 3D | Volumen seer at se den genererede cylinder og gemme det i tiff format (figur 3C).
Bemærk: En kugle (diameter: 30 pixels), en terning (sidelængde: 30 pixels), en kasseformet (længde: 80 pixels; bredde: 40 pixels, højde: 30 pixels), og en cylinder (diameter: 30 pixels, højden: 100 pixel) er gemt for de efterfølgende analyser.
3. profilering analyseparametre
- Åbn ImageJ softwaren og åbne eller importere et scannet billede.
- Skub bunden rullepanelet for at vælge ét udsnit og derefter klikke på billede | Justere | Tærskel knappen. I vinduet popup tærskel justere de minimale og maksimale grænseværdier ved manuel inspektion for at sikre at knoglerne er godt adskilt fra baggrunden og optage minimal tærskelværdien som beløbsgrænsen kortikale knogle.
Bemærk: Som forskellige mikro-CT producenter bruger forskellige skalering faktorer til lagring af X-ray dæmpning koefficienter i billederne, de faktiske tærskelværdi bør fastsættes empirisk enten ved manuel kontrol eller efter fabrikantens specifikke anbefalinger. I vores praksis kan indstilling minimumsgrænsen for ISQ filer produceret af micro-CT maskiner til 6.000-7.000 pålideligt adskilt knogler fra scanning baggrunden. - Klik på Plugins | BoMomics | Trab Param profilering knappen. I popup-vinduet, indstille Skive indeks til positionen for den repræsentative udsnit, og Indstil kortikale knogle ("Cort knogle"), range ("Range") og trinværdier ("Step") til beregning af et sæt af kortikale tærskler for profilering segmentering parametre, hvor den kortikale knogle tærskelværdi er erhvervet af trin 3.2 (figur 1). Standard sortiment og trin værdier for 2.000 og 400 arbejde for de fleste micro-CT billederne. Skive indeks til 5 for eksempel datasæt, og beholde standardværdierne for andre indstillinger.
Bemærk: "Cort knogle" er tærsklen for kortikale knogler, og værdien for tærskel bruges for parameteren profilering ændringer fra den laveste tærskelværdien til den højeste tærskelværdi med tilvækst af trinværdien, hvor den laveste grænseværdien er værdien af Cort Knogle - interval, og den højeste tærskelværdi er Cort ben + udvalg. Hvis de værdier for Cort knogle, rækkevidde og skridt er 6.000, 1.000 og 500, henholdsvis, så den laveste tærskelværdien for kortikale knogler er 6.000-1, 000 = 5, 000, højeste grænseværdien er 6, 000 + 1, 000 = 7, 000 og tærsklerne, der anvendes i er analyserne 5.000, 5.500, 6.000, 6.500 og 7.000. - Angive støj diameter ("støj Dia."), ("trin") og spænder ("Range") værdier for at angive et sæt støj værdier i analyserne, og huldiameter ("hul Dia."), trin ("Step") og intervalværdier ("Range") til beregning af et sæt af værdier, hul. Generelt virker standardindstillingen for de fleste mikro-CT bone prøver, hvor støj, trin og rækkevidde er 5, 5, 2, henholdsvis, og huldiameter, trin og sortiment er 15, 5, 2, henholdsvis. Holde standardindstillingerne for eksempel datasæt.
Bemærk: "Støj Dia." diameter for undertrykkelse støjfilter, og "Hul Dia." er diameter for huller inden for de kortikale knogler. Støj og hul værdierne, der bruges for parameteren profilanalyse kan beregnes på samme måde som kortikale tærskelværdier beskrevet ovenfor, ved hjælp af den angivne støj/hul, rækkevidde og trinværdier. På grund af variationer i scanningsparametre ved erhvervelse af billederne, beregnes støj og hul parametre på empirisk basis billedkvalitet, som ingen almindelige intervaller af støj og hul parametre er godt for alle scanninger. Den laveste værdi for tærskel, støj eller huller skal være større end eller lig med 0, og hvis den beregnede laveste værdi er negativ, ved hjælp af de medfølgende parametre, den specifikke laveste værdi er angivet til 0. - Klik på OK for at udføre parameter profilering. Visuelt kontrollere segmentering resultaterne i resultatvinduet Parameter profilering , og vælg et udsnit lag, så knogle ydre grænse er beskrevet helt præcist (figur 1B). Efterfølgende, Hent profilering parametre fra posten i tabellen Parameter profilering resultater svarer til det valgte udsnit lag (tabel 1).
4. trabekulær analyse
-
Segmentering af trabekulær knogler
- Åbn ImageJ software, og derefter åbne eller importere et scannet billede.
- Klik på Plugins | BoMomics | Trab segmentering knappen, og udfyld relevante analyseparametre. Indstille "Start", "Skitse grænse", "Trab. Bones","Støj reduktion Dia.","Hul udfyldning Dia."og"Kortikale tykkelse Dia."5, 7.200, 7.000, 6, 12 og 25, henholdsvis.
Bemærk: "Start" og "Ende" angive det valgte udsnit for segmentering af trabekulær knogler, "Skitse grænse" svarende til parameteren profileret "Cort knogle", "Støj reduktion Dia." til "Støj Dia." Parameter, og "Hul udfyldning Dia." til "Hul Dia." parameter. "Kortikale tykkelse Dia." er den angivne tykkelse for at udelukke de ydre kortikale knogler. "Trab. Knogler "er tærsklen for udvinding trabekulær knogler (figur 2), hvor indstillingerne bestemmes ved hjælp af profilering analyse parametre kommando, som beskrevet i trin 3.5. - Klik på OK for at udføre trabekulær segmentering. Visuelt kontrollere segmentering resultaterne i resultatvinduet Trab segmentering (figur 2B). Gemme de udpakkede trabekulær knogler vist i vinduet Segmenterede trabekulær knogler i tiff-format (figur 2B), som kan analyseres yderligere af anden software.
-
Analyse af trabekulær knogler.
- Åbn ImageJ software, og derefter åbne eller importere et scannet billede.
- Klik på Plugins | BoMomics | Trab analyse -knappen, og udfyld relevante analyseparametre, såsom "Start", "Skitse grænse", "Trab. Bones","Støj reduktion Dia.","Hul udfyldning Dia."og"Kortikale tykkelse Dia."som beskrevet ovenfor (fig. 3A), hvor indstillingerne bestemmes ved hjælp af profilering analyse parametre kommandoen som beskrevet i trin 3.5. Indstille "Start", "Skitse grænse", "Trab. Bones","Støj reduktion Dia.","Hul udfyldning Dia."og"Kortikale tykkelse Dia."5, 7.200, 7.000, 6, 12 og 25, henholdsvis.
Bemærk: I den gratis version af plugin, udvælges fem tilstødende udsnit fra den angivne "Start" skive indeks for måling, mens i den kommercielle version, et vilkårligt antal skiver kan angives af brugeren. - Vælg en eller flere valg i Resultater rapportering sektion for parametrene, der måles, hvor den trabekulær knogle bind (BV), samlede volumen (TV) på den valgte region og tykkelser målt enten todimensionelt (2D) eller tre dimensioner (3D) er anvendelig nemlig udvalg gennem tre afkrydsningsfelter, nemlig "BV TV-kun"2D"og"3D". Vælg afkrydsningsfelterne "2D" og "3D", og klik derefter på "OK" for at udføre trabekulær analyse (fig. 3A, tabel 2).
Bemærk: Når "BV TV kun" er markeret, uanset valg statusser "2D" og "3D", rå foranstaltninger af BV, TV og intensitet er rapporteret, og segmenteret trabekulær knoglerne er udvundet og vises i et nyt vindue, der kan gemmes og yderligere analyseres af andre software. Når "2D" er markeret, rapporteres rå foranstaltninger af BV, TV, intensitet og tykkelser målt todimensionelt på hver skive niveau ved hjælp af plade model. Hvis "3D" er afkrydset, er tre-dimensionelle tykkelse for hver voxel beregnes direkte uden nogen model antagelse, derefter rå foranstaltninger af BV, TV, intensitet og tre-dimensionelle tykkelser på hver skive niveau rapporteret. Men hvis ingen afkrydsningsfelt er markeret, trabekulær knogler er opdelt ved hjælp af den ovennævnte sæt af parametre, men ingen måling er rapporteret.
5. kvantificering af simulerede genstande
- Åbne ImageJ software, derefter åbne en simuleret billede. Her, åbne den simulerede kugle med en diameter på 30 pixels som eksempel.
- Vælg Plugins | BoMomics | Trab analyse knappen og udfylde relevante analyseparametre, som tidligere beskrevet. Beholde standardværdierne for "Start", "Ende", "Skitse grænse", "Trab. Knogler", og sæt"Støj reduktion Dia.","Støj reduktion Dia.","Hul udfyldning Dia."og"Kortikale tykkelse Dia."til 0 (figur 3).
Bemærk: For simuleret objekter, der er ingen utilsigtet signal-støj, og der kan være nogen tilsvarende kortikale skaller. Derfor, parametre for disse værdier skal være indstillet korrekt (standardindstillingerne er nul). For 3D kvantificeringer skiver 30 før og efter den angivne "Start" skive behandles ved hjælp af den gratis version af plugin, mens kun skiver i specificeret af "Start" og "Ende" skiver er analyseret af den kommercielle version af plugin. - Vælg "2D" og "3D" for parametrene, der skal måles i afsnittet Resultater rapportering , og klik på OK for at udføre trabekulær analyse for den simulerede objekt (tabel 3).
6. kalibrering af trabekulær foranstaltninger og præsentation af Data: profil distributioner af trabekulær foranstaltninger i den valgte analyse Region
- Få kalibrering oplysninger fra scannede datasættet, ifølge mikro-CT leverandørens anvisninger.
Bemærk: Kun rå foranstaltninger af BV, TV, intensitet og tykkelser er rapporteret af plugin. For at få foranstaltninger sammenlignes med rapporter, der genereres af andre software, ønskes resultatet kalibrering. - Åbn Microsoft Excel, og Åbn tabellen rapporterede resultater. Beregne kalibreret knogle bind (BV), samlede volumen (TV), knoglemineralindhold (BMC), knogle volumenfraktion (BV/TV) og mineralske knogletæthed (BMD) i nye excel kolonner ved hjælp af de rapporterede rå BV, TV og intensitet værdier efter følgende udtryk.
- Bemærk: Scanning resolution (opløsning, µm), grå skalering (skalering), tæthed enheder (mg HA/cm3), tæthed hældning (hældning) og massefylde skæringspunkt (skæring) kan udvindes fra scannede mikro-CT billede eller meta filer, såsom Scanco ISQ fil. Derfor er de kalibrerede foranstaltninger beregnes på følgende måde:
Antag, at BV, TV og intensitet er rå foranstaltninger, BVc og TVc er kalibrerede værdier, opløsning, skalering, hældning, skæring er fra kalibrering filer af micro - CT billeder.
BVc = BV × opløsning3 [μm3]
TVc = TV × opløsning3 [μm3]
BV / TV = BV ÷ TV
BMC = (intensitet ÷ skalering × hældning - BV × skæring) × opløsning3 × 10-12 [mg HA]
BMD - BMC ÷ TVc × 1012 [mg HA / cm3] - Oprette et XY-punktdiagram plot for kalibreret foranstaltninger (Y) mod skive lag (X) ved hjælp af Microsoft Excel software (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den trabekulær analyse plugin er designet til automatisk segment og kvantificere trabekulær knogler med nøjagtighed. I første omgang, efterfulgt knogle ydre grænse er opdaget og afgrænset af en hul-udfyldning operation hvor nogen huller i knoglen ydre kortikale skaller er fyldt. Derefter udføres en erosion operation for at udelukke de ydre kortikale knogler og få de segmenterede trabekulær knogler. Endelig er foranstaltninger af trabekulær knogler i regionen segmenterede kvantificeret.
Som micro-CT billederne er i sagens natur støjende, segmenter ved hjælp af foruddefinerede vilkårlige parametre ofte undlade at præcist identificere bone's ydre grænser. Det er trættende og labor intensiv at prøve en masse parameter kombinationer for at vælge tilfredsstillende segmentering parametre. Derfor, en parameter profilering plugin er fastsat til at ændre parametre én efter én i sæt området automatisk til hjælpe med at vælge tilfredsstillende parameter kombinationer, som også gør det nemmere at vælge et fælles sæt af parametre for en gruppe af knogle prøver. Figur 1 A viser de indstillinger, der bruges til profilering god segmentering parametre. Når parametre for kortikale knogle tærskel (Cort knogle), vifte af tærsklen til at blive profileret (interval), og markedsandelsforøgelsen beløb for tærskel (trin) på hvert trin er angivet, oprettes en række tærskler at blive profileret. Efterfølgende, genereres en serie af støj og hul værdier på samme måde ved at angive de tilsvarende parametre. Endelig er trabekulær knogler segmenteret ved at ændre parametrene én ad gangen for alle kombinationerne af mulige parametre. Figur 1 B viser de repræsentative segmentering resultater for kombinationer af forskellige parametre. Selvfølgelig, nogle kombinationer af parametre er bedre end andre til at afgrænse en knogle ydre grænser, og mere end én parameter kombination viser tilfredsstillende segmentering resultater. Efter besigtigelse segmentering resultater, kan parameterværdier for tilfredsstillende segmenter hentes fra den profilering resultater tabel (tabel 1).
For at kvantificere foranstaltninger af trabekulær knogler, udføres trabekulær segmentering og analyse. Figur 2 A viser dialogen indstilling for trabekulær segmentering, hvor trabekulær knogler i det valgte område er segmenteret og udvindes (figur 2B), og segmentering resultater ved hjælp af de medfølgende parametre kan kontrolleres udsnit af skive visuelt. Efterfølgende analyseres trabekulær knogler med tilfredsstillende parametre (fig. 3A). Afhængigt af valg af statusserne af rapporteringsmuligheder, rå kvantificeringer af knogle bind (BV), samlede volumen (TV), summen af grå værdier (intensiteten), og tykkelser målt to dimensionsstabil eller tre dimensionsstabil (tabel 2) er rapporteret. Endelig Kalibreringsindstillinger er udvundet fra scannede mikro-CT datasættet og kalibreret foranstaltninger af BV, TV, BMC, BV/TV, og BMD beregnes efterfulgt af profilering deres udlodninger i den valgte analyse region lag-på-lag mod lag positioner (figur 4).
Som en kvalitetskontrol funktion af plugin understøttes kvantificering af simulerede objekter. Simuleret standard objekter med kendte dimensioner er kvantificeret ved plugin til sammenligning med de teoretiske værdier eller foranstaltninger fra andre software, såsom kommerciel software leveres med micro-CT maskiner eller BoneJ14, et gratis open source-plugin for knogle billedanalyse. Til at analysere simulerede genstande, er at støj indstillingerne angivet til nul, som simulerede billeder anses for høj kvalitetsbilleder uden støj. Objekter med forskellige tykkelser blev simuleret og resultater vises (figur 3, tabel 3). For simuleret standard 2D objekter, såsom cirkler, kvadrater og rektangler, eksakte værdier for området (TV eller BV) og tykkelse er rapporteret (tabel 3). For 3D-objekter, nøjagtige tykkelse foranstaltninger for kuber, sfærer og kasser er rapporteret, tykkelser til cylindre er dog ikke nøjagtig for voxels i nærheden af cylinderens begge ender, mens voxel tykkelser i de midterste skiver af flaskerne er præcis som forudsagt. Dette er en funktion af den underliggende tykkelse måling algoritme, hvori den voxel tykkelse for hvert objekt bestemmes af diameteren af den største kugle eller sidelængde for den største kube, der indeholder denne voxel og er helt inde i objekt. Derfor, tykkelser af genstande fremstillet af forskellige sfærer og terninger kan måles nøjagtigt, mens cylindre kan kun måles præcist i den midterste skive radius-afstand fra begge ender.
Figur 1 : Repræsentative resultater parametertype profilanalyse analyse. (A) de parametre indstilling side. (B) repræsentative resultater parametertype profilanalyse analyse. Nogle kombinationer af parametre er bedre end andre til påvisning af de ydre grænser af knogler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentative resultater af trabekulær Segmenteringsanalyse. (A) de parametre indstilling side. (B) repræsentative segmentering resultaterne af trabekulær knogler på forskellige lag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Trabekulær analyse. (A) de parametre indstilling side. (B) repræsentative resultater af simulerede 2D objekter. (C) repræsentative resultater af simuleret 3D objekter visualiseret ved 3D volumen viewer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Distributioner af trabekulær knogle foranstaltninger i den valgte analyse region. Den vandrette akse repræsenterer den relative afstand til start skive lag i regionen analyse. Værdier i y-aksen er kalibreret trabekulær foranstaltninger i regionen analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Skive | Skitse grænse | Støj reduktion Dia. | Hul påfyldning Dia. |
| 4 | 5200 | 0 | 10 |
| 147 | 5200 | 2 | 20 |
| 361 | 7200 | 6 | 16 |
| 539 | 8000 | 10 | 20 |
Tabel 1: Repræsentative resultater parametertype profilanalyse analyse.
Tabel 2: Repræsentative resultater af trabekulær analyse.
| Objekt | Dimension | Volumenb | Overfladec | Tykkelse |
| Square | 200 X 200 | 40000 | 796 | 200 |
| Rektangel | 200 X 100 | 20000 | 596 | 100 |
| Cirkel | Dia: 200 | 31428 | 796 | 200 |
| Cube | 30 X 30 X 30 | 27000 | 5048 | 30 |
| Kasseformet | 80 X 40 X 30 | 96000 | 13008 | 30 |
| Kugle | Dia: 30 | 14328 | 3944 | 30 |
| Cylinderd | Dia:30; H: 100 | 71600 | 12800 | 27.84 |
| Cylindere | Dia:30; H: 100 | 51552 | 9552 | 30 |
| a: resultater er i rå voxels. Dia: diameter; H: højde. | ||||
| b: volumen (3D) eller område (2D). | ||||
| c: overflade (3D) eller omkredsen (2D). | ||||
| d: Measurs fra Skive 1 til skive 100 bruges til analyse. | ||||
| e: Measurs fra Skive 15 til skive 85 bruges til analyse. | ||||
Tabel 3: Kvantificering resultater for simuleret objekter.
Supplerende fil 1. Prøve knogle. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse beskriver en ImageJ plugin til at analysere trabekulær knogler, der er automatisk, effektiv, og bruger kammeratlig. Plugin kan også bruges til at kvantificere alle 2D eller 3D objekter til lag-på-lag foranstaltninger af områder, mængder og tykkelser. I øjeblikket er kun en enkelt målt værdi for hver trabekulær parameter rapporteret for hver prøve af standard mikro-CT-analyse, som ikke fuldt ud repræsenterer Karakteristik af den målte enhed i den valgte analyse region. Den beskrevne plugin rapporter lag på lag mængder af hver parameter for hver prøve, der fuldt ud bevarer distributionsoplysninger på den målte parameter i den valgte analyse region, og derfor mere avancerede og følsomme statistiske tilgange kan anvendes til at analysere sådanne data.
Med den standard, semi-automatiske hånd-konturering segmentering metode, betydelig variation mellem forskellige hånd-konturering skiver blev observeret med operatøren bias8,9,10, som berettiger indførelsen af en mere ensartet og automatisk metode til trabekulær segmentering. Kontrasten er maksimal mellem scanning baggrunden og knogle ydre grænse, er ydre grænse assisteret trabekulær segmentering udført af plugin, hvor bone's ydre grænse automatisk kan påvises med nøjagtighed, når det er hensigtsmæssigt tærskel, støj og hul indstillinger er angivet. For at lette bestemmelsen af segmentering parametre, en vifte af parameter kombinationer er profileret sig ved hjælp af et repræsentativt udsnit fra regionen analyse, og tilfredsstillende segmentering resultater kontrolleres visuelt. Efterfølgende analyseres trabekulær knogler med profileret parametre. Når passende segmentering parametrene er angivet, og plugin har været anvendt med succes til at analysere trabekulær knogler fra rotte distale lårben behandlet med forskellige knogle anabolske agenter5, er reproducerbare resultater rapporteret for det samme billede uden operatør bias.
Plugin kan i øjeblikket kun behandle én prøve ad gangen. Hvis flere prøver er til stede i billedet, er alle prøver kvantificeret som et enkelt objekt uden forskelsbehandling. Derfor, forbehandling er nødvendig, hvis flere prøver scannes samtidigt i en enkelt prøveglas. Kvantificering udgange er rå foranstaltninger af pixel tæller eller grå værdier, som skal kalibreres manuelt ved hjælp af passende Kalibreringsindstillinger.
Det mest afgørende skridt i denne protokol er at vælge passende parametre for trabekulær analyse. Generelt, grupper af knogle prøver er analyseret ved hjælp af identiske segmentering parametre for at gøre resultaterne sammenlignelige. I sådanne tilfælde skal det sørges at sørge for, at segmentering resultater for alle prøver er undersøges visuelt for potentielle fejl før yderligere analyser er gennemført.
En stor begrænsning af denne teknik er, at støj reduktion indstillinger anvendes til kortikale knogler kun for tilretning en knogle ydre grænse, men ikke på uddraget trabekulær knogler. Som forskellige filtrering strategier har været rapporteret15 som optimal for trabekulær analyse under forskellige betingelser, er intet enkelt filter godt for alle billede prøver. Derfor er der ingen indbyggede filtrering skridt før kvantificering af trabekulær knogler. For at være kompatibel med output af software med indbygget billede filtrations, uddraget trabekulær knogler kan være forarbejdet tilsvarende første bruger forskellige billedbehandling værktøjer, og derefter importeres til ImageJ og kvantificeres ved plugin efterfølgende. Desuden forskellige billedformater er genereret af forskellige mikro-CT leverandører, og de fleste af dem kan ikke importeres eller åbnet af ImageJ direkte, således moduler for importere forskellige billedformater til ImageJ for yderligere analyse er ønsket. En anden begrænsning er, at de 3D tykkelser i skiver nær enderne af rækken udvælgelse ikke er korrekt, hvis en del af objekterne, der er uden for det udvælgelse område, som også er sandt for alle tilgængelige 3D kvantificering pakker, derfor, en større vifte af skiver skal kvantificeres, og kun den midterste del af valgte udsnit skal bruges til yderligere analyse. En sådan fremgangsmåde kan kun være tilgængelige når målte mængder er rapporteret lag-på-lag som vist i dette plugin, men ikke for målinger, kun en enkelt værdi er rapporteret for hver kvantificerede parameter i rækken udvalg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Et patent for den underliggende algoritme af kvantificere objekt tykkelse er indgivet. Forfatterne har samarbejdet med andre registrerede de bomomics.com website hosting gratis version plugins, hvor consulting og kvantificere tjenester af billedanalyse leveres efter anmodning.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af grant NFSC 81170806. Forfatterne vil gerne takke mikro-CT core facilitet af skolen af stomatologi, Wuhan University for at hjælpe skanne og analysere de rotte lårben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ | NIH | imagej | Any version with a java 1.8 run time |
| trabecular analysis plugin | Bomomics | bomomics | free or commercial version |
| Micro CT scanner | Scanco | μ-50 | micro CT from any vendor |
| Computer System | Lenovo | any brand | |
| Windows Operating System | Microsoft | Windows 7 x64 | any 64-bit Windows operating system |
| Office Software | Microsoft | Office 2010 | any speadsheet software that has xy chart function |
References
- Ruegsegger, P., Koller, B., Muller, R. A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcif Tissue Int. 58 (1), 24-29 (1996).
- Muller, R., Ruegsegger, P. Micro-tomographic imaging for the nondestructive evaluation of trabecular bone architecture. Stud Health Technol Inform. 40, 61-79 (1997).
- Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Phys Med. 30 (6), 619-634 (2014).
- Bart, Z., Wallace, J. Microcomputed Tomography Applications in Bone and Mineral Research. Advances in Computed Tomography. 2, 121-127 (2013).
- Ji, Y., Ke, Y., Gao, S. Intermittent activation of notch signaling promotes bone formation. Am J Transl Res. 9 (6), 2933-2944 (2017).
- Jiang, Y., Zhao, J., White, D. L., Genant, H. K. Micro CT and Micro MR imaging of 3D architecture of animal skeleton. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (1), 45-51 (2000).
- Laib, A., et al. 3D micro-computed tomography of trabecular and cortical bone architecture with application to a rat model of immobilisation osteoporosis. Med Biol Eng Comput. 38 (3), 326-332 (2000).
- Cole, H. A., Ichikawa, J., Colvin, D. C., O'Rear, L., Schoenecker, J. G. Quantifying intra-osseous growth of osteosarcoma in a murine model with radiographic analysis. J Orthop Res. 29 (12), 1957-1962 (2011).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Med Imaging. 8, 16 (2008).
- Soviero, V. M., Leal, S. C., Silva, R. C., Azevedo, R. B. Validity of MicroCT for in vitro detection of proximal carious lesions in primary molars. J Dent. 40 (1), 35-40 (2012).
- Kohler, T., Stauber, M., Donahue, L. R., Muller, R. Automated compartmental analysis for high-throughput skeletal phenotyping in femora of genetic mouse models. Bone. 41 (4), 659-667 (2007).
- Buie, H. R., Campbell, G. M., Klinck, R. J., MacNeil, J. A., Boyd, S. K. Automatic segmentation of cortical and trabecular compartments based on a dual threshold technique for in vivo micro-CT bone analysis. Bone. 41 (4), 505-515 (2007).
- Dougherty, G. Quantitative CT in the measurement of bone quantity and bone quality for assessing osteoporosis. Med Eng Phys. 18 (7), 557-568 (1996).
- Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47 (6), 1076-1079 (2010).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
