Summary
Vi presenterer en arbeidsflyt for segmentering og kvantifisere trabekulært bein for 2D- og 3D-bilder basert på benets ytre grensen ved hjelp av en ImageJ plugin. Denne tilnærmingen er mer effektiv og nøyaktig enn gjeldende manuell hånd å omforme tilnærming, og gir lag-på-lag quantifications, som ikke er tilgjengelige i gjeldende kommersiell programvare.
Abstract
Mikro-beregnet tomografi (mikro-CT) er rutinemessig brukes til å vurdere bein antall og trabekulært microstructural egenskaper i små dyr under ulike bein forhold. Men er tilnærmingen for trabekulært analyse av mikro-CT-bilder skive av skive halvautomatisk hånd omforme, arbeidskrevende og feil. Beskrevet her er en effektiv metode for automatisk segmentering av trabekulært bein etter benets ytre grenser, hvor trabekulært bein kan identifiseres og segmentert automatisk med nøyaktighet med mindre operatør bias når det passer segmentering er angitt. Profilen tilfredsstillende segmentering parametere, vises en bildestakk segmentering resultater, der alle mulige kombinasjoner av parameterne segmentering er endret en etter en i rekkefølgen, og segmentering resultater med tilknyttede parametere kan enkelt kontrolleres visuelt. Som en kvalitetskontroll funksjon av plugin, er simulert standard objekter kvantifisert der målt mengder kan sammenlignes med teoretiske verdier. Lag-på-lag kvantifisering av trabekulært egenskaper og trabekulært tykkelser rapporteres av en plugin, og distribusjonen av egenskaper i utvalgte regioner kan bli profilert lett. Selv om lag-på-lag kvantifisering beholder mer om trabekulært bein og forenkler mer statistisk analyse av strukturelle endringer, er slike tiltak utilgjengelige fra utdataene for gjeldende kommersiell programvare, der bare én kvantifisert verdi for hver parameter er rapportert for hver prøve. Beskrevet arbeidsflytene er derfor bedre metoder for å analysere trabekulært bein med nøyaktighet og effektivitet.
Introduction
Mikro-CT analyse av trabekulært bein er standard tilnærming til å spore morfologiske endringer av bein i små dyr under ulike bein tap forhold1,2,3, hvor flere variabler knyttet til den strukturer av bein er rapportert4. Men slike parametre er jevnt fordelt ikke i metaphysis lange ben5, og bare summerte eller gjennomsnitt verdien rapporteres for hver strukturelle variabel for hvert utvalg med gjeldende kommersielle mikro-CT maskiner6,7 , men en enkeltverdi ikke fullt representerer egenskapene til parameteren målt i regionen analyse. Lag-på-lag kvantifisering av trabekulært Ben ikke bare beholder mer informasjon for hver variabel, men kan også profilering av distribusjonen av slike variabler i regionen analyse, tilrettelegge påfølgende statistisk analyse av strukturelle endringer under ulike forhold5. Målet med denne metoden er derfor kvantifisere trabekulært bein av mikro-CT skanner på hver sektor nivå, som ikke er tilgjengelig i alle kommersielt tilgjengelig mikro-CT analyse pakken.
Effektivt segmentet trabekulært bein sektor-av-skive er automatisk segmentering metoder ønskelig. Gjeldende standard teknikken for mikro-CT analyse er imidlertid basert på manuell interaktive kontur etterfulgt av halvautomatisk interpolering skille trabekulært bein fra de kortikale avdelinger, som er arbeidsintensiv, utsatt for feil, og knyttet til betydelige operatør bias8,9,10. Automatisk segmentering metoder11,12 ble rapportert, men slike metoder er bare optimale i områder med god separasjon mellom trabekulært bein og kortikale bein, men ikke i områder uten klart separasjoner. Videre ulike segmentering parametere kreves for forskjellige prøver12, og det er kjedelig å manuelt velge tilfredsstillende segmentering parametere gjelder for grupper av bein prøver ved å prøve forskjellige parameteren kombinasjoner12, Selv om segmentering prosessen er automatisk når alle relaterte parametere er angitt. Som bein ytre grensen har høyest kontrast med skanning bakgrunn og metaphyseal kortikale skall av lange ben vise noen endringer i valgt analysere regionen, segmentering metoder i forhold ytre-grensen konturene av lange ben kan pålitelig og nøyaktig separat trabekulært bein kortikale skjell. Fordelen med slik segmentering metode er at oppdeling er basert på forskjellen mellom bakgrunnen og benets ytre grensen, men ikke på forskjellene mellom trabekulært og kortikale bein6,12, 13, derfor er det vanligvis lett å finne en kombinasjon av segmentering parametere som er tilfredsstillende for en gruppe av bein prøver, tilrettelegge mer pålitelig analyse av trabekulært endringer mellom forskjellige grupper.
På hver skive er nivå, area, perimeter og todimensjonal (2D) tykkelse rapportert for 2D analyse, mens volum, overflate og tredimensjonale (3D) tykkelse rapporteres i 3D quantifications. Slik informasjon er generelt ikke rapportert av gjeldende bilde analyseverktøy, som indikerer at rapportert prosedyrene kan brukes til generelle bilder hvor slik informasjon er ønsket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrer som involverer dyr fag har ble utført i henhold til guiden og bruk av forsøksdyr (NIH publikasjonen, 8nde edition, 2011), og blitt vurdert og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Wuhan Universitetet.
1. programvareinstallasjon
- Installere ImageJ. Last ned Windows-versjonen av programmet ImageJ (versjon 1,51 p) sammen med 64-bits Java fra https://imagej.nih.gov/ij/. Pakk ut den nedlastede programvaren til en mappe som vil bli senere referert til som "ImageJ katalogen".
Merk: Trabekulært analyse plugins krever 64-bits java løpe tid (versjon 1.8) og 64-biters windows operativsystem, fortrinnsvis en 64-biters Windows 7 operativsystem. - Installere trabekulært analyse plugins. Be om trabekulært analyse plugins fra http://www.bomomics.com, og pakk ut innholdet i Imagej's plugins-katalogen, som er "ImageJ katalogen/plugins".
Merk: Plugin kan fås som en gratis versjon, der målene for 5 angitt tilstøtende stykker rapporteres, eller som en kommersiell versjon, der en rekke sektorer kan være angitt og målt.
2. Forbered 3D datasett for trabekulært analyse
- Skann rotte femurs med en mikro-CT maskin følgende standard skanning protokollen5 og deretter lagre dataene i et format som kan importeres til ImageJ, f.eks, tiff-format. Hvis flere bein prøver ble skannet samtidig i en enkelt prøve tube, først importere dataene til ImageJ og Separer hvert individuelle bein ved beskjæring av andre prøver ved Imagejs bildebehandling verktøy. Deretter lagre den resulterende bildet i et format som kan importeres til ImageJ senere.
Merk: Et representativt utvalg bildefil brukt i analysen er inkludert (supplerende fil 1). -
Simulere standard 2D- og 3D-objekter.
- Åpne ImageJ programvare. Under Plugins | BoMomics | Simulere objekter menyen klikker sirkel , angi 200 som diameteren i popup-vinduet, og klikk OK for å generere simulert sirkelen med en diameter på 200 piksler (Figur 3B). Lagre den genererte sirkelen i tiff-format.
- Åpne ImageJ programvare. Under Plugins | BoMomics | Simulere objekter menyen klikker Square , angi 200 som sidelengde i popup-vinduet, og klikk OK for å generere det simulerte kvadratet med sidelengde 200 piksler (Figur 3B). Lagre det genererte torget i tiff-format.
- Åpne ImageJ programvare. Under Plugins | BoMomics | Simulere objekter menyen, klikk rektangel , angi 200 som bredden og 100 som høyden i popup-vinduet, og klikk OK for å generere simulert rektanglet med en bredde på 200 piksler og en høyde på 100 piksler (Figur 3 B). Lagre det genererte rektangelet i tiff-format.
Merk: En sirkel (diameter: 200 piksler), en rute (sidelengde: 200 piksler), og et rektangel (bredde: 200 piksler; høyde: 100 piksler) lagres for senere analyser. - Åpne ImageJ programvare. Under Plugins | BoMomics | Simulere objekter menyen, klikk kube , angi 30 som sidelengde i popup-vinduet, og klikk OK for å generere simulert kuben. Til slutt klikker Plugins | 3D | Volumet visningsprogrammet vise genererte kuben og lagre det i tiff-format (Figur 3C).
- Åpne ImageJ programvare. Under Plugins | BoMomics | Simulere objekter menyen klikker Cuboid , og angir 80 som lengden, 40 som bredden og 30 som høyden i popup-vinduet, deretter klikker du OK for å generere den simulerte cuboid. Til slutt klikker Plugins | 3D | Volumet visningsprogrammet vise det genererte cuboid og lagre det i tiff-format (Figur 3C).
- Åpne ImageJ programvare. Under Plugins | BoMomics | Simulere objekter menyen klikker sfære , angi 30 som diameteren i popup-vinduet, og klikk OK for å generere den simulerte sfæren. Til slutt klikker Plugins | 3D | Volumet visningsprogrammet vise den genererte sfæren og lagre det i tiff-format (Figur 3C).
- Åpne ImageJ programvare. Under Plugins | BoMomics | Simulere objekter menyen klikker sylinder , angi 30 diameter og 100 som høyden i popup-vinduet, og klikk OK for å generere simulert sylinderen. Til slutt klikker Plugins | 3D | Volumet visningsprogrammet vise genererte sylinderen og lagre det i tiff-format (Figur 3C).
Merk: En kule (diameter: 30 piksler), en kube (sidelengde: 30 piksler), en cuboid (lengde: 80 piksler; bredde: 40 piksler; høyde: 30 piksler), og en sylinder (diameter: 30 piksler; høyde: 100 piksler) lagres for senere analyser.
3. profilering analyseparametrene
- Åpne ImageJ programvare og åpne eller importere et skannet bilde.
- Skyv bunnen rullefeltet for å velge én sektor og deretter bilde | Justere | Terskelen knappen. I vinduet popup terskelen justere minimum og maksimum terskelverdier ved manuell inspeksjon for å sikre at bein er frisk adskilt fra bakgrunnen og registrere minimal terskelverdien som kortikalt benvev terskelverdien.
Merk: Som forskjellige mikro-CT produsenter bruker forskjellige Skaleringsfaktorer for lagring X-ray demping koeffisientene i bilder, faktiske terskelverdien bør fastsettes empirisk manuell inspeksjon eller etter bestemte produsentens anbefalinger. I vår praksis, kan angi det laveste terskelen for ISQ filer produsert av mikro-CT maskiner til 6000-7000 øvelsesdata atskilt bein fra skanning bakgrunnen. - Klikk Plugins | BoMomics | Trab Param profilering knappen. Angi Slice indeksen til stillingen som representant sektoren i popup-vinduet, og angi kortikalt benvev ("Cort ben"), området ("området"), og trinnverdier ("trinn") for å beregne et sett med kortikale terskler for profilering segmentering parametere, der terskelverdien kortikalt benvev anskaffes steg 3.2 (figur 1). Rekkevidde og trinn standardverdiene 2000 og 400 arbeid for de fleste mikro-CT-bilder. Angi Slice indeksen til 5 for eksempel datasettet, og beholde standardverdiene for andre innstillinger.
Merk: "Cort ben" er terskelen for kortikale bein og terskelverdien brukes for parameteren profilering endringer fra laveste terskelverdien høyeste terskelverdien med angir hvor intervallverdien, der den laveste terskelverdien er verdien av Cort Bone - området og høyeste terskelverdien er Cort bein + rekkevidde. Hvis de faste verdiene for Cort bein, utvalg og trinn er 6000, 1000 og 500, henholdsvis så laveste terskelverdien for kortikale bein er 6000-1, 000 = 5, 000, høyeste terskelverdien er 6 000 + 1 000 = 7, 000 og grensene brukes i er analysene 5000, 5500, 6000, 6500 og 7000. - Angi støy diameter ("støy Dia."), trinn ("trinn") og spenner ("området") verdier for å angi et verdisett støy i analysene, og hullet diameter ("Hole Dia."), trinn ("trinn") og ("området") verdier for å beregne et sett med skjulte verdier. Generelt fungerer standardinnstillingen for de fleste mikro-CT bein prøver, der støy, trinn og området er 5, 5, 2, henholdsvis, og hullet diameter, trinn, og området er 15, 5, 2, henholdsvis. Beholde standardinnstillingene for eksempel datasettet.
Merk: "Støy Dia." er diameteren på støy undertrykkelse filteret, og "Hullet Dia." er diameteren for hull i kortikale bein. Støy og skjulte verdiene som brukes for parameteren profilering kan beregnes på samme måte som kortikale terskelverdier beskrevet ovenfor, angitte støy/hull, utvalg og trinnverdier. På grunn av variasjoner i skanning parametere da anskaffe bilder, skal støy og hull fastsettes empirisk etter bildekvaliteten, som ingen generell celleområder støy og hull er bra for alle skanner. Den laveste verdien for Grenseverdi, støy eller hull må være større enn eller lik 0, og hvis den beregnede laveste verdien er negativ bruker parameterne, bestemt laveste verdien settes til 0. - Klikk OK for å utføre parameteren profilering. Visuelt kontrollere segmentering resultatene i resultatvinduet parameteren profilering og velge et stykke lag slik at bein ytre grensen er beskrevet ganske nøyaktig (figur 1B). Deretter hente profilering parameterne fra oppføringen i Parameteren profilering resultatene tabellen tilsvarer valgte skive laget (tabell 1).
4. trabekulært analyse
-
Segmentering av trabekulært Ben
- Åpne ImageJ programvare, så åpne eller importere et skannet bilde.
- Klikk Plugins | BoMomics | Trab segmentering knappen, og fyll ut riktige analyseparametrene. Sette "Start", "Disposisjon grensen", "Trab. Bones","Støy reduksjon Dia.","Hull fylle Dia."og"Kortikale tykkelse Dia."5, 7200, 7000, 6, 12 og 25, henholdsvis.
Merk: "Start" og "End" Angi merkede for segmentering av trabekulært Ben, "Disposisjon grensen" tilsvarende til profilerte "Cort ben" parameter, "Støy reduksjon Dia." til "Støy Dia." Parameteren og "Hullet fylle Dia." til "Hull Dia." parameter. "Kortikale tykkelse Dia." er angitt tykkelsen for å ekskludere ytre kortikale bein. "Trab. Bones "er terskelen for utpakking trabekulært bein (figur 2), der innstillingene fastslås kommandoen profilering analyse parametere som beskrevet i trinn 3.5. - Klikk OK for å utføre trabekulært segmentering. Visuelt kontrollere segmentering resultatene i vinduet Trab segmentering resultater (figur 2B). Lagre utdraget trabekulært bein i Segmentert trabekulært bein vinduet i en tiff-format (figur 2B), som kan analyseres videre av annen programvare.
-
Analyse av trabekulært ben.
- Åpne ImageJ programvare, så åpne eller importere et skannet bilde.
- Klikk Plugins | BoMomics | Trab analyse knappen, og fyll ut riktige analyseparametrene, som "Start", "Disposisjon grensen", "Trab. Bones","Støy reduksjon Dia.","Hull fylle Dia."og"Kortikale tykkelse Dia."som beskrevet ovenfor (Figur 3A), der innstillingene fastslås kommandoen profilering analyse parametere som beskrevet i trinn 3.5. Sette "Start", "Disposisjon grensen", "Trab. Bones","Støy reduksjon Dia.","Hull fylle Dia."og"Kortikale tykkelse Dia."5, 7200, 7000, 6, 12 og 25, henholdsvis.
Merk: I gratis versjon av plugin, fem tilstøtende stykker fra spesifiserte "Start" slice indeksen er valgt for måling, mens i den kommersielle versjonen, et vilkårlig antall sektorer kan angis av brukeren. - Velg ett eller flere alternativer under Resultatrapportering for parameterne skal måles, der trabekulært bein volumet (BV), totalt volum (TV) valgte regionen og tykkelser målt enten two-dimensionally (2D) eller tredimensjonalt (3D) tilgjengelige gjennom tre avmerkingsbokser, nemlig "BV TV bare", "2D", og "3D". Merk av for "2D" og "3D", deretter "OK" for å utføre trabekulært analyse (Figur 3, tabell 2).
Merk: Når "BV TV bare" er sjekket, uansett utvalg statusene til "2D" og "3D", rå tiltak BV, TV og intensitet er rapportert, og segmentert trabekulært bein er pakket ut og vises i et nytt vindu, som kan lagres og ytterligere analysert av andre programvare. Når «2D» er avkrysset, er rå tiltak BV, TV, intensitet og tykkelser målt two-dimensionally på hvert stykke nivå ved hjelp av platen modellen rapportert. Hvis "3D" er avmerket, rapporteres tredimensjonale tykkelse for hver voxel beregnes direkte uten noen modell antagelse, deretter rå tiltak av BV, TV, intensitet og tredimensjonale tykkelser samplet på hvert stykke nivå. Men hvis ingen er merket, trabekulært bein er segmentert bruker ovenfor settet med parametere, men ingen måling er rapportert.
5. kvantifisering simulerte objekter
- Åpne ImageJ programvare og åpne en simulert bilde. Her åpne simulert sfæren med en diameter på 30 piksler som et eksempel.
- Velg Plugins | BoMomics | Trab analyse knapp og fyll ut riktige analyseparametrene som beskrevet tidligere. Beholde standardverdiene for "Start", "End", "Disposisjon grensen", "Trab. Bones", og angi"Støy reduksjon Dia.","Støy reduksjon Dia.","Hull fylle Dia."og"Kortikale tykkelse Dia."til 0 (Figur 3).
Merk: Simulerte objekter, det er ingen utilsiktede signal-støy, og det kan være ingen tilsvarende kortikale skjell. Derfor parametere for slike verdier skal angis korrekt (standardinnstillingene er null). For 3D quantifications skiver 30 før og etter angitt "Start" sektoren behandles ved hjelp av gratis versjon av plugin, mens bare sektorer i området som er angitt med "Start" og "End" skiver analyseres av den kommersielle versjonen av plugin. - Velg "2D" og "3D" for parameterne skal måles i delen Resultatrapportering , og klikk OK for å utføre trabekulært analyse for simulert objektet (tabell 3).
6. kalibrering av trabekulært tiltak og Data presentasjon: profil distribusjonen av trabekulært tiltak i regionen valgte analysere
- Få kalibrering fra skannede datasettet ifølge mikro-CT leverandørens anvisninger.
Merk: Bare rå tiltak av BV, TV, intensitet og tykkelser rapporteres av plugin. For å få tiltak sammenlignes med rapporter genereres av annen programvare, er resultatet kalibrering ønsket. - Åpne Microsoft Excel, og åpne tabellen rapporterte resultater. Beregne kalibrert bein volum (BV), totalt volum (TV), Ben mineral innhold (BMC), bein volum brøkdel (BV/TV) og beinmineraltetthet (BMD) i nye kolonner ved hjelp av rapporterte rå BV, TV og intensitet verdiene i henhold til følgende uttrykk i excel.
- Merk: Skanner oppløsning (oppløsning, µm), grå skalering (skalering), tetthet enheter (mg HA/cm3), tetthet skråningen (stigningstallet) og tetthet skjæringspunkt (skjæringspunkt) kan trekkes fra de skannede filene som filen Scanco ISQ bilde eller metakoder i mikro-CT. Derfor er kalibrert tiltak beregnet som følger:
BV, TV og intensitet er rå tiltak, BVc og TVc er kalibrert verdier, oppløsning, skalering, slope, intercept er fra kalibrering filer av mikro - CT bilder.
BVc = BV × resolution3 [μm3]
TVc = TV × resolution3 [μm3]
BV / TV = BV ÷ TV
BMC = (intensitet ÷ skalering × skråning - BV × skjæringspunkt) × resolution3 × 10-12 [mg HA]
BMD - BMC ÷ TVc × 1012 [mg HA / cm3] - Opprette et Punktdiagram plott kalibrert tiltak (Y) mot skive lag (X) ved hjelp av Microsoft Excel programvare (Figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trabekulært analyse plugin er utviklet for å automatisk segment og kvantifisere trabekulært bein med nøyaktighet. I utgangspunktet etterfulgt bein ytre grensen oppdages og avgrenset av en hull fyller operasjon der noen hull i benet ytre kortikale skjell fylt. Deretter utføres en erosjon operasjon for å utelukke ytre kortikale bein og få segmentert trabekulært bein. Til slutt, tiltak av trabekulært bein i regionen segmentert er kvantifisert.
Som mikro-CT-bilder er iboende støyende, segmentations bruke forhåndsdefinerte vilkårlig parametere ofte unnlate å nøyaktig identifisere benets ytre grenser. Det er kjedelig og arbeidsintensiv prøve en masse parameterkombinasjonene for å velge tilfredsstillende segmentering parametere. Derfor gis en parameter profilering plugin for endre parameterne enkeltvis i Angi området automatisk å hjelpe i å velge tilfredsstillende parameterkombinasjonene, som også forenkler velge et felles sett med parametere for en gruppe av bein prøver. Figur 1 En viser innstillingene som brukes for profilering god segmentering parametere. Når parameterne for kortikalt benvev terskelen (Cort bein), rekke terskelen skal profilert (område), og øke beløpet for terskelen (trinn) på hvert trinn er angitt, genereres en rekke terskler å bli profilert. Deretter genereres en rekke støy og hull tilsvarende ved å sette de tilsvarende parameterne. Til slutt, trabekulært bein er segmentert ved å endre parameterne én om gangen for alle mulige parameterkombinasjonene. Figur 1 B viser representant segmentering resultatene for ulike parameterkombinasjonene. Selvfølgelig noen parameterkombinasjonene er bedre enn andre på skildre et bein ytre grenser, og flere parameterkombinasjon viser tilfredsstillende segmentering resultater. Etter visuelt sjekke segmentering resultatene, kan parameterverdier for tilfredsstillende segmentations hentes fra profilering resultattabellen (tabell 1).
For å kvantifisere tiltak av trabekulært Ben, utføres trabekulært segmentering og analyse. Figur 2 En viser dialogboksen innstilling for trabekulært segmentering, der trabekulært bein i den valgte regionen er segmentert og pakket ut (figur 2B), og segmentering resultater ved hjelp av parameterne kan bli sjekket skive av skive visuelt. Deretter analyseres trabekulært bein med tilfredsstillende parametere (Figur 3A). Avhengig av valget statusene til rapportering alternativer, rå quantifications bein volum (BV), totalt volum (TV), summen av gråverdier (intensitet), og tykkelser målt med enten to eller tre med (tabell 2) er rapportert. Endelig Kalibreringsinformasjon er Hentet fra skannede mikro-CT datasettet og kalibrert tiltak av BV, TV, BMC, BV/TV, og BMD beregnes etterfulgt av profilering deres distribusjoner i den valgte analysere regionen--lagvis mot laget stillinger (Figur 4).
Som en kvalitetskontroll funksjon av plugin støttes kvantifisering av simulerte objekter. Simulert standard objekter med kjente dimensjoner er kvantifisert ved plugin for sammenligning med teoretiske verdier eller tiltak fra annen programvare, som kommersiell programvare leveres med mikro-CT maskiner eller BoneJ14, en gratis åpen kildekode plugin for bein bildeanalyser. For å analysere simulerte objekter, er støy innstillingene satt til null, som simulerte bilder anses høykvalitetsbilder uten støy. Objekter med ulike tykkelser ble oppnådd, og resultatene vises (Figur 3 tabell 3). Simulert standard 2D objekter, for eksempel sirkler, firkanter og rektangler, eksakte verdier for området (TV eller BV) og tykkelse er rapportert (tabell 3). For 3D-objekter nøyaktig tykkelse tiltak for kuber, kuler og cuboids er rapportert, tykkelser for sylindere er imidlertid ikke nøyaktig for voxels nær sylinders begge ender, mens voxel tykkelser i midten skiver sylindere er akkurat som spådd. Dette er en funksjon av underliggende tykkelse måling algoritmen, hvor den voxel tykkelsen for hvert objekt bestemmes av diameteren på den største sfæren eller sidelengde største kubens faktatabell som inneholder denne voxel og er helt inni den objektet. Derfor tykkelser av gjenstander laget av ulike og kuber kan måles nøyaktig, mens sylindere kan bare måles nøyaktig i midten stykket radius-avstand fra begge ender.
Figur 1 : Representant resultatene av parameteren profilering analyse. (A) parameterne innstillingen side. (B) representant resultatene av parameteren profilering analyse. Noen parameterkombinasjonene er bedre enn andre for å oppdage de ytre grensene av bein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant resultatene av trabekulært segmentering analyse. (A) parameterne innstillingen side. (B) representant segmentering resultatene av trabekulært bein på ulike lag. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Trabekulært analyse. (A) parameterne innstillingen side. (B) representant resultatene av simulert 2D objekter. (C) representant resultatene av simulert 3D-objekter visualisert av 3D-volumet visningsprogrammet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Distribusjoner av trabekulært bein tiltak i regionen utvalgte til analysering. Den vannrette aksen viser den relative avstanden til Start skive laget i regionen analyse. Verdiene i y-aksen er kalibrert trabekulært tiltak i regionen analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Skive | Disposisjon grensen | Støy reduksjon Dia. | Hull fylling Dia. |
| 4 | 5200 | 0 | 10 |
| 147 | 5200 | 2 | 20 |
| 361 | 7200 | 6 | 16 |
| 539 | 8000 | 10 | 20 |
Tabell 1: Representant resultatene av parameteren profilering analyse.
Tabell 2: Representant resultatene av trabekulært analyse.
| Objekt | Dimensjon | Volumb | Overflatenc | Tykkelsen |
| Square | 200 X 200 | 40000 | 796 | 200 |
| Rektangel | 200 X 100 | 20000 | 596 | 100 |
| Sirkel | Dia: 200 | 31428 | 796 | 200 |
| Kube | 30 X 30 X 30 | 27000 | 5048 | 30 |
| Cuboid | 80 X 40 X 30 | 96000 | 13008 | 30 |
| Sfære | Dia: 30 | 14328 | 3944 | 30 |
| Sylinderend | Dia:30; H: 100 | 71600 | 12800 | 27.84 |
| Sylindere | Dia:30; H: 100 | 51552 | 9552 | 30 |
| a: resultatene er i rå voxels. Dia: diameter; H: høyde. | ||||
| b: volum (3D) eller område (2D). | ||||
| c: overflaten (3D) eller omkrets (2D). | ||||
| d: Measurs fra skive 1 til stykke 100 brukes for analyse. | ||||
| e: Measurs fra skive 15 til stykke 85 brukes for analyse. | ||||
Tabell 3: Kvantifisering resultater for simulerte objekter.
Supplerende fil 1. Prøve bein. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien beskriver en ImageJ plugin for å analysere trabekulært Ben, som er automatisk, effektiv og brukervennlig. Plugin kan også brukes til å kvantifisere alle 2D eller 3D objekter til lag-på-lag tiltak områder, volumer og tykkelser. Foreløpig er bare én målte verdi for hver parameter for trabekulært rapportert for hver prøve av standard mikro-CT analyse, som ikke fullt representerer egenskapene til den målte enheten i den valgte analysere regionen. Beskrevet plugin rapporter lag-på-lag mengder hver parameter for hver prøve, som beholder fullt distribusjonsinformasjon for parameteren målt i den valgte analysere regionen, og derfor mer avanserte og følsom statistisk tilnærminger gjelder for å analysere slike data.
Med standard, halvautomatisk hånd å omforme segmentering metoden betydelig variasjon mellom ulike hånd å omforme stykker ble observert med operatøren bias8,9,10, krever en mer enhetlig og automatisk metode for trabekulært segmentering. Kontrasten er maksimal mellom skanning bakgrunnen og bein ytre grensen, er ytre-grensen assistert trabekulært segmentering utført av plugin, der benets ytre grensen kan oppdages automatisk med nøyaktighet, om nødvendig terskel, støy og hull innstillinger tilbys. For å lette fastsettelsen av segmentering parametere, en rekke parameteren er profilert ettall med en representant skive fra regionen analyse og tilfredsstillende segmentering resultater er merket visuelt. Deretter analyseres trabekulært bein med profilerte parametere. Når riktig segmentering er angitt, og plugg har vært anvendt for å analysere trabekulært bein fra rotte distale femurs behandlet med ulike bein anabole stoffer5, er reproduserbare resultatene rapportert for samme bilde uten operatør bias.
Plugin kan for tiden bare behandle ett utvalg om gangen. Hvis det finnes flere eksempler i bildet, er alle prøver kvantifisert som et enkeltobjekt uten diskriminering. Derfor er forbehandling nødvendig hvis flere eksempler skannes samtidig i en enkelt prøve rør. Kvantifisering utgangene er rå pixel teller eller grå verdier, som bør kalibreres manuelt ved hjelp av riktig Kalibreringsinformasjon.
Det viktigste trinnet i denne protokollen er å velge riktig parametere for trabekulært analyse. Vanligvis analyseres grupper av bein prøver med identiske segmentering parameterne gjøre resultatene sammenlignbare. I slike tilfeller bør utvises slik at segmentering resultater for alle prøvene er undersøkt visuelt potensielle feil før videre analyser utføres.
En stor begrensning av denne teknikken er at støy reduksjon innstillingene brukes kortikale bein for kontur et bein ytre grensen, men ikke på utdraget trabekulært bein. Som ulike filtrering strategier har vært rapportert15 som optimalt for trabekulært analyse under ulike forhold, er ingen enkelt filter bra for alle bilde prøver. Derfor er det ingen innebygde filtrering trinn før kvantifisering av trabekulært ben. Er kompatibelt med ut av programvare med innebygd bilde filtrations utdraget trabekulært bein kan bli behandlet på samme måte første bruker ulike tenkelig verktøy, importeres til ImageJ og kvantifisert av plugg senere. Videre ulike bildeformater genereres av forskjellige mikro-CT leverandører, og de fleste av dem kan ikke importeres eller åpnes av ImageJ direkte, dermed moduler for å importere ulike bildeformater til ImageJ for videre analyse er ønsket. En annen begrensning er at 3D tykkelser i skiver nær slutten av området utvalget ikke er nøyaktig hvis en del av objektene er utenfor utvalg, som også gjelder for alle tilgjengelige 3D kvantifisering pakker, derfor et større utvalg av stykker bør være kvantifisert, og bare den midtre delen av valgte skiver bør brukes for videre analyse. En slik tilnærming kan bare være tilgjengelig når målt mengder er rapportert lag-på-lag som vist i denne plugin, men ikke for mål at bare én verdi er rapportert for hver kvantifisert parameter i valg området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Patent underliggende algoritmen for å kvantifisere objektet tykkelse er inngitt. Forfatterne samarbeidet med andre registrert bomomics.com webområdevert gratisversjonen plugins, der rådgivning og kvantifisere tjenester av bildeanalyse tilbys på forespørsel.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av grant NFSC 81170806. Forfatterne vil gjerne takke funksjonen mikro-CT kjernen av skolen av Stomatology, Wuhan University for å hjelpe skanne og analysere rotten femurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ | NIH | imagej | Any version with a java 1.8 run time |
| trabecular analysis plugin | Bomomics | bomomics | free or commercial version |
| Micro CT scanner | Scanco | μ-50 | micro CT from any vendor |
| Computer System | Lenovo | any brand | |
| Windows Operating System | Microsoft | Windows 7 x64 | any 64-bit Windows operating system |
| Office Software | Microsoft | Office 2010 | any speadsheet software that has xy chart function |
References
- Ruegsegger, P., Koller, B., Muller, R. A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcif Tissue Int. 58 (1), 24-29 (1996).
- Muller, R., Ruegsegger, P. Micro-tomographic imaging for the nondestructive evaluation of trabecular bone architecture. Stud Health Technol Inform. 40, 61-79 (1997).
- Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Phys Med. 30 (6), 619-634 (2014).
- Bart, Z., Wallace, J. Microcomputed Tomography Applications in Bone and Mineral Research. Advances in Computed Tomography. 2, 121-127 (2013).
- Ji, Y., Ke, Y., Gao, S. Intermittent activation of notch signaling promotes bone formation. Am J Transl Res. 9 (6), 2933-2944 (2017).
- Jiang, Y., Zhao, J., White, D. L., Genant, H. K. Micro CT and Micro MR imaging of 3D architecture of animal skeleton. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (1), 45-51 (2000).
- Laib, A., et al. 3D micro-computed tomography of trabecular and cortical bone architecture with application to a rat model of immobilisation osteoporosis. Med Biol Eng Comput. 38 (3), 326-332 (2000).
- Cole, H. A., Ichikawa, J., Colvin, D. C., O'Rear, L., Schoenecker, J. G. Quantifying intra-osseous growth of osteosarcoma in a murine model with radiographic analysis. J Orthop Res. 29 (12), 1957-1962 (2011).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Med Imaging. 8, 16 (2008).
- Soviero, V. M., Leal, S. C., Silva, R. C., Azevedo, R. B. Validity of MicroCT for in vitro detection of proximal carious lesions in primary molars. J Dent. 40 (1), 35-40 (2012).
- Kohler, T., Stauber, M., Donahue, L. R., Muller, R. Automated compartmental analysis for high-throughput skeletal phenotyping in femora of genetic mouse models. Bone. 41 (4), 659-667 (2007).
- Buie, H. R., Campbell, G. M., Klinck, R. J., MacNeil, J. A., Boyd, S. K. Automatic segmentation of cortical and trabecular compartments based on a dual threshold technique for in vivo micro-CT bone analysis. Bone. 41 (4), 505-515 (2007).
- Dougherty, G. Quantitative CT in the measurement of bone quantity and bone quality for assessing osteoporosis. Med Eng Phys. 18 (7), 557-568 (1996).
- Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47 (6), 1076-1079 (2010).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
