Summary
Vi presenterar ett arbetsflöde för att segmentera och kvantifiera trabekulärt ben för 2D och 3D bilder baserat på bens yttre gräns med en ImageJ plugin. Detta tillvägagångssätt är mer effektiv och korrekt än den nuvarande manuella hand-contouring metoden och ger lager-för-lager kvantifieringar, som inte är tillgängliga i nuvarande kommersiell programvara.
Abstract
Micro-datortomografi (mikro-CT) används rutinmässigt bedöma ben kvantitet och trabekulära Mikrostrukturens boenden i små djur under olika ben förlust villkor. Standardmetoden för trabekulärt analys av mikro-CT-bilder är dock slice-av-slice halvautomatiska hand-contouring, vilket är arbetskrävande och felbenägen. Beskrivs här är en effektiv metod för automatisk segmentering av trabekulärt ben enligt bens yttre gränser, där trabekulärt ben kan identifieras och segmenterad automatiskt med noggrannhet med mindre operatör bias när så är lämpligt segmentering parametrar anges. För att profilera tillfredsställande segmentering parametrar, visas en bildstapel av segmentering resultat, där alla möjliga kombinationer av parametrarna segmentering är ändrade en efter en i följd, och segmentering resultat med associerade parametrar kan enkelt kontrolleras visuellt. Som en kvalitetskontroll av plugin, är simulerade standardobjekt kvantifierade där de uppmätta mängder kan jämföras med teoretiska värden. Lager-för-lager kvantifiering av trabekulärt egenskaper och trabekulära tjocklekar rapporteras av sådan plugin, och fördelningen av sådana egenskaper inom de utvalda regionerna kan profileras enkelt. Även om lager-för-lager kvantifiering behåller mer information om trabekulärt ben och underlättar ytterligare statistisk analys av strukturella förändringar, är sådana åtgärder inte tillgängliga från utdata från nuvarande kommersiell programvara, där en enda kvantifierade värde för varje parameter rapporteras för varje prov. Därför är beskrivs arbetsflöden bättre metoder för att analysera trabekulärt ben med noggrannhet och effektivitet.
Introduction
Micro-CT analys av trabekulärt ben är standardmetoden för att spåra morfologiska förändringar av benen i små djur under olika ben förlust villkor1,2,3, där flera variabler relaterade till den strukturer av ben är rapporterade4. Dock sådana parametrar inte är jämnt fördelade i metaphysis långa ben5, och endast en summerad eller i genomsnitt värde rapporteras för varje strukturell variabel av varje prov av nuvarande kommersiella mikro-CT maskiner6,7 , men ett enda värde inte kan fullt ut representera egenskaperna hos den uppmätta parametern i regionen analysera. Lager-för-lager kvantifiering av trabekulärt ben inte bara behåller mer information för varje variabel, men också kan profilering av fördelningen av sådana variabler i regionen analysera, underlätta efterföljande statistisk analys av strukturella förändringar under olika villkor5. Målet med denna metod är därför kvantifiera trabekulärt ben av mikro-datortomografi på varje skiva nivå, vilket inte är för närvarande tillgänglig i alla kommersiellt tillgängliga mikro-CT analyspaket.
Att effektivt segment trabekulärt ben slice-av-slice är automatisk segmentering metoder önskvärt. Dock den nuvarande standardteknik för mikro-CT analys bygger på manuell interaktiva contouring följt av halvautomatisk interpolation att separera trabekulärt ben från de kortikala fack, vilket är arbetskrävande, felbenägna, och associerade med betydande aktör bias8,9,10. Automatisk segmentering metoder11,12 rapporterades, men dessa metoder är endast optimal i regioner med god separation mellan trabekulärt ben och kortikalt ben, men inte i regioner utan tydliga separationer. Dessutom olika segmentering parametrar krävs för olika prover12, och det är jobbigt att manuellt välja tillfredsställande segmentering parametrar tillämpas på grupper av ben prover genom att prova olika parametern kombinationer12, även om segmentering processen är automatisk när alla relaterade parametrar ställs in. Som benet yttre gräns har den största kontrasten med skanning bakgrunden och metafyseala kortikala skal av långa ben Visa några ändringar i den valda analysera region, segmentering metoder enligt yttre-gränsen konturen av långa ben kan tillförlitligt och korrekt separat trabekulärt ben från kortikala skal. Fördelen med en sådan segmentering metod är att segmenteringen är baserad på skillnaden mellan bakgrunden och bens yttre gräns, men inte på skillnaderna mellan trabekulära och kortikalt ben6,12, 13, därför är det oftast lätt att hitta en kombination av segmentering parametrar som är tillfredsställande för en grupp av ben prover, underlätta mer tillförlitlig analys av trabekulärt förändringar mellan olika grupper.
På varje segment redovisas nivå, area, omkrets och tvådimensionell (2D) tjocklek för 2D analys, medan volym, yta och tredimensionella (3D) tjocklek redovisas i 3D kvantifieringar. Sådan information rapporteras vanligtvis inte av nuvarande bild analysverktyg, som anger att de rapportera förfaranden kan tillämpas allmänna bilder där sådan information är önskvärd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfaranden som omfattar animaliska ämnen har genomfördes i enlighet med guiden för skötsel och användning av försöksdjur (NIH publikation, 8: e upplagan, 2011), och granskats och godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén av Wuhan Universitet.
1. Installation av
- Installera programvara för ImageJ. Hämta Windows-versionen av programmet ImageJ (version 1,51 p) levereras med 64-bitars Java från https://imagej.nih.gov/ij/. Extrahera den nedladdade mjukvaran till en mapp, som därefter kommer att hänvisas till som ”ImageJ katalogen”.
Obs: Trabekulärt analys plugins kräver 64-bitars java kör tid (version 1.8) och ett 64-bitars Windowsoperativsystem, helst ett 64-bitars Windows 7 operativsystem. - Installera trabekulärt analys plugins. Begära trabekulärt analys plugins från http://www.bomomics.com och packa upp innehållet i Imagej's plugins katalog, som är ”ImageJ katalog/plugins”.
Obs: Plugin kan erhållas antingen som en gratis version, där anges måtten för 5 angränsande segment redovisas, eller som en kommersiell version, där en rad skivor kan anges och mätas.
2. Förbered 3D datamängd för trabekulärt analys
- Skanna råtta lårbenet med en mikro-CT maskin följande standard skanning protokoll5 och sedan spara data i ett format som kan importeras till ImageJ, t.ex., tiff-format. Om flera ben prover skannades samtidigt i ett enda prov rör, först importera data till ImageJ och sedan separera varje enskilt ben av beskärning av andra prover som använder Imagejs bildbehandling verktyg. Därefter Spara den resulterande bilden i ett format som kan importeras till ImageJ senare.
Obs: Ett representativt urval bildfil som används i analysen ingår (kompletterande fil 1). -
Simulera standard 2D- och 3D-objekt.
- Programvara med öppen ImageJ. Under Plugins | BoMomics | Simulera objekt menyn, klicka på knappen cirkel , och ange 200 som diametern i popup-fönstret, klicka OK för att generera den simulerade cirkeln med en diameter på 200 pixlar (figur 3B). Spara genererade cirkeln i tiff-format.
- Programvara med öppen ImageJ. Under Plugins | BoMomics | Simulera objekt menyn Klicka på torget , och ange 200 som den side längden i popupfönstret och sedan på OK för att generera det simulerade torget med en side längden 200 pixlar (figur 3B). Spara genererade torget i tiff-format.
- Programvara med öppen ImageJ. Under Plugins | BoMomics | Simulera objekt menyn, klicka på knappen rektangel , och ange 200 som bredd och 100 som höjden i popup-fönstret och klicka på OK för att generera den simulerade rektangeln med bredden 200 bildpunkter och en höjd av 100 pixlar (figur 3 B). Spara genererade rektangeln i tiff-format.
Obs: En cirkel (diameter: 200 pixlar), en kvadrat (sidolängd: 200 pixlar), och en rektangel (bredd: 200 pixlar, höjd: 100 pixlar) sparas för de efterföljande analyserna. - Programvara med öppen ImageJ. Under Plugins | BoMomics | Simulera objekt menyn, klicka på knappen kuben , och skriv in 30 som den side längden i popup-fönstret, klicka OK för att generera den simulerade kuben. Slutligen, klicka på Plugins | 3D | Volym Viewer att visa genererade kuben och spara den i tiff-format (figur 3C).
- Programvara med öppen ImageJ. Under Plugins | BoMomics | Simulera objekt menyn, klicka på knappen rätblock , och ange 80 som längd, 40 som bredd, och 30 som höjden i popupfönstret och sedan klicka på OK att generera simulerade kub. Slutligen, klicka på Plugins | 3D | Volym Viewer att visa den genererade rätblock och spara den i tiff-format (figur 3C).
- Programvara med öppen ImageJ. Under Plugins | BoMomics | Simulera objekt menyn, klicka på knappen sfär , och ange 30 som diametern i popup-fönstret och klicka på OK för att generera den simulerade sfären. Slutligen, klicka på Plugins | 3D | Volym Viewer att visa den genererade sfären och spara den i tiff-format (figur 3C).
- Programvara med öppen ImageJ. Under Plugins | BoMomics | Simulera objekt menyn, klicka på knappen Cylinder , ange 30 som diametern och 100 som höjden i popup-fönstret och klicka på OK att generera simulerade cylindern. Slutligen, klicka på Plugins | 3D | Volym Viewer att visa genererade cylindern och spara den i tiff-format (figur 3C).
Obs: En sfär (diameter: 30 pixlar), en kub (sidolängd: 30 pixlar), en kub (längd: 80 pixlar; bredd: 40 pixlar; Höjd: 30 pixlar), och en cylinder (diameter: 30 pixlar; Höjd: 100 pixlar) sparas för de efterföljande analyserna.
3. profilering analysparametrar
- Öppna ImageJ programvara och öppna eller importera en scannad bild.
- Dra rullningslisten längst ned för att välja en skiva, klicka på bilden | Justera | Tröskelvärde för knappen. Justera de lägsta och högsta tröskelvärdena genom manuell inspektion för att säkerställa att ben är väl avskilda från bakgrunden i popupfönstret tröskel och registrera minimal tröskelvärdet som kortikala benet tröskelvärdet.
Obs: Eftersom olika mikro-CT tillverkare använder olika skalningsfaktorer för att lagra röntgen dämpning koefficienter i bilderna, faktiska tröskelvärdet bör bestämmas empiriskt antingen genom manuell inspektion eller efter särskilda tillverkarens rekommendationer. I vår praxis kan ställa Minimitröskeln för ISQ filer som produceras av mikro-CT maskiner till 6.000-7.000 tillförlitligt separat ben från skanning bakgrunden. - Klicka på Plugins | BoMomics | Trab Param profilering knappen. Ange Slice Index till positionen för den representativa slice i popupfönstret och ange kortikala benet (”Cort ben”), område (”område”) och (”steg”) stegvärden för att beräkna en uppsättning kortikala tröskelvärden för profilering segmentering parametrar, där kortikala benet tröskelvärdet förvärvas av steg 3,2 (figur 1). Utbud och steg standardvärdena för 2.000 och 400 arbete för de flesta micro-CT-bilder. Ange Slice Index 5 för exempel datamängden, och hålla standardvärden för andra inställningar.
Obs: ”Cort Bone” är tröskelvärdet för kortikal ben och tröskelvärdet används för parametern profilering ändringar från lägsta tröskelvärdet till högsta tröskelvärdet med tillväxten för stegvärdet, där lägsta tröskelvärdet är värdet av Cort Ben - Range och högsta tröskelvärdet är Cort ben + utbud. Om börvärde för Cort ben, utbud och steg är 6 000, 1 000 och 500, respektive, då lägsta tröskelvärdet för kortikal ben är 6 000-1 000 = 5, 000, högsta tröskelvärdet är 6, 000 + 1, 000 = 7, 000 och tröskelvärden som används i är analyserna 5,000, 5.500, 6.000, 6 500 och 7 000. - Ange buller diameter (”buller Dia.”), steg (”steg”) och räckvidd (”räckvidd”) värden för att ange en uppsättning bullervärden analyserna, håldiameter (”hål Dia.”), steg (”steg”), och intervallvärden (”räckvidd”) för att beräkna en uppsättning hål värden. I allmänhet fungerar standardinställningen för de flesta micro-CT ben prover, där brus, steg och utbud är 5, 5, 2, respektive, och håldiameter, steg och utbud är 15, 5, 2, respektive. Behåll standardinställningarna för exempel datamängden.
Obs: ”Buller Dia.” är diametern för buller dämpning filtret, och den ”hål Dia.” är diametern för hål inom kortikalt ben. Värdena för buller och hål används för parametern profilering kan beräknas på motsvarande sätt som kortikal tröskelvärdena ovan, med den angivna buller/hål, utbud och stegvärden. På grund av variationerna i avsökningstäthet när förvärva bilderna, bör buller och hål parametrar bestämmas empiriskt enligt bildkvaliteten, som inga allmänna spänner av buller och hål parametrar är bra för alla skanningar. Det lägsta värdet för tröskelvärde, buller eller hål måste vara större än eller lika med 0, och om det beräknade lägsta värdet är negativt med medföljande parametrar, det specifika lägsta värdet sätts till 0. - Klicka på OK om du vill utföra parametern profilering. Visuellt kontrollera segmentering resultaten i fönstret Parameter profilering resultat och välj ett segment lager så att Ben yttre gränsen markeras ganska exakt (figur 1B). Därefter hämta profilering parametrarna från posten i tabellen Parametern profilering resultat motsvarar det valda segment lagret (tabell 1).
4. trabekulärt analys
-
Segmentering av trabekulärt ben
- Öppna ImageJ programvara, sedan öppna eller importera en scannad bild.
- Klicka på Plugins | BoMomics | Trab segmentering knappen och fyll i lämplig analysparametrar. Ställ in ”Start”, ”disposition gräns”, ”Trab. Bones ”,” buller minskning Dia. ”,” hål fylla Dia. ”och” kortikal tjocklek Dia. ”5, 7200, 7,000, 6, 12 och 25, respektive.
Obs: ”Start” och ”slutet” ange det markerade segment intervallet för segmentering av trabekulärt ben, ”disposition gräns” motsvarande profilerad ”Cort Bone” parametern ”buller minskning Dia.” till ”buller Dia.” Parametern, och ”hålet fylla Dia.” till ”hål Dia.” parameter. ”Kortikal tjocklek Dia.” är angiven tjocklek för att utesluta de yttersta kortikalt ben. ”Trab. Bones ”är tröskelvärdet för utdrager trabekulärt ben (figur 2), där inställningarna bestäms med profilering analys parametrar kommandot enligt beskrivningen i steg 3.5. - Klicka på OK om du vill utföra trabekulärt segmentering. Visuellt kontrollera segmentering resultaten i fönstret Trab segmentering resultaten (figur 2B). Spara de extraherade trabekulära ben visas i fönstret Segmenterade trabekulärt ben i en tiff-format (bild 2B), som kan analyseras vidare av andra program.
-
Analys av trabekulärt ben.
- Öppna ImageJ programvara, sedan öppna eller importera en scannad bild.
- Klicka på Plugins | BoMomics | Trab analys knappen och fyll i lämplig analysparametrar, såsom ”Start”, ”disposition gräns”, ”Trab. Bones ”,” buller minskning Dia. ”,” hål fylla Dia. ”och” kortikal tjocklek Dia. ”som beskrivs ovan (figur 3A), där inställningarna bestäms med hjälp av profilering analys parametrar kommandot som beskrivs i steg 3.5. Ställ in ”Start”, ”disposition gräns”, ”Trab. Bones ”,” buller minskning Dia. ”,” hål fylla Dia. ”och” kortikal tjocklek Dia. ”5, 7200, 7,000, 6, 12 och 25, respektive.
Obs: I den fria versionen av plugin, fem angränsande skivor start från det angivna ”Start” slice indexet väljs för mätning, medan i den kommersiella versionen, ett godtyckligt antal skivor kan anges av användaren. - Välj en eller flera val i Resultat rapportering avsnitt för parametrarna som skall mätas, där trabekulärt ben volume (BV), total volym (TV) av vald region och tjocklekar mätt antingen two-dimensionally (2D) eller tredimensionellt (3D) finns tillgängliga för markering genom tre kryssrutor, nämligen ”BV endast TV”, ”2D” och ”3D”. Markera kryssrutorna ”2D” och ”3D”, klicka sedan på ”OK” för att utföra trabekulärt analys (figur 3A, tabell 2).
Obs: När ”BV TV bara” kontrolleras, oavsett val av status för ”2D” och ”3D”, rå åtgärder av BV, TV och intensitet redovisas och segmenterade trabekulärt ben extraheras och visas i ett nytt fönster, som kan sparas och ytterligare analyseras av andra programvara. När ”2D” är markerad, redovisas rå åtgärder av BV, TV, intensitet och tjocklekar mätt two-dimensionally på varje skiva-nivå med hjälp av tallriksmodellen. Om ”3D” är markerad, redovisas tredimensionella tjocklek för varje voxel beräknas direkt utan någon modell antagande, då rå åtgärder för BV, TV, intensitet och tredimensionella tjocklekar på varje skiva nivå. Om ingen är markerad, trabekulärt ben segmenteras använder ovanstående uppsättning parametrar, men ingen mätning redovisas.
5. kvantifiera simulerade objekt
- Öppna ImageJ programvara, sedan en simulerad bild. Här, öppna den simulerade sfären med en diameter på 30 bildpunkter som ett exempel.
- Välj Plugins | BoMomics | Trab analys knappen och fyll i lämplig analysparametrar som beskrivs tidigare. Hålla standardvärden för ”Start”, ”End”, ”disposition gräns”, ”Trab. Bones ”, och Ställ in” buller minskning Dia. ”,” buller minskning Dia. ”,” hål fylla Dia. ”och” kortikal tjocklek Dia. ”till 0 (figur 3).
Obs: För simulerad objekt, det finns inga oavsiktliga signal-brus, och det kan finnas ingen motsvarande kortikala skal. Därför, parametrar för sådana värden bör vara korrekt konfigurerade (standardinställningarna är noll). För 3D kvantifieringar skivor 30 före och efter angivna ”Start” slice bearbetas med den fria versionen av plugin, medan bara skivor i intervallet anges av ”Start” och ”slut” skivor analyseras av den kommersiella versionen av plugin. - Välj ”2D” och ”3D” för parametrarna för att mätas i avsnittet Resultat rapportering , och klicka på OK för att utföra trabekulärt analys för objektet simulerade (tabell 3).
6. kalibrering av trabekulärt åtgärder och Presentation av Data: profil fördelningorna av trabekulärt åtgärder i regionen valda analysera
- Få Kalibreringsinformation från skannade datamängden, enligt mikro-CT leverantörens instruktioner.
Obs: Endast rå åtgärder av BV, TV, intensitet och tjocklekar redovisas av plugin. För att få åtgärder jämförbara med rapporter som genereras av andra program, önskas resultatet kalibrering. - Öppna Microsoft Excel och öppna tabellen redovisade resultat. Beräkna kalibrerad benvolym (BV), total volym (TV), benmineralinnehåll (BMC), ben volymfraktion (BV/TV) och bentäthet (BMD) i nya excel kolumner med hjälp av rapporterade raw BV, TV och intensitet värden enligt följande uttryck.
- Obs: Scanning upplösning (upplösning, µm), grå skala (skalning), densitet enheter (mg HA cm3), täthet lutning (lutning) och densitet intercept (intercept) kan extraheras från de skannade mikro-CT bild eller meta filerna, till exempel Scanco ISQ filen. Därför är kalibrerad åtgärderna beräknas enligt följande:
Anta att BV, TV och intensitet är rå åtgärder, BVc och TVc är kalibrerade värden, upplösning, skalning, lutning, avlyssna är från kalibrering filer av mikro - CT bilder.
BVc = BV × beslutsamhet3 [μm3]
TVc = TV × beslutsamhet3 [μm3]
BV / TV = BV ÷ TV
BMC = (intensitet ÷ skalning × lutning - BV × intercept) × beslutsamhet3 × 10-12 [mg HA]
BMD - BMC ÷ TVc × 1012 [mg HA / cm3] - Skapa ett Punktdiagram tomt till kalibrerad åtgärder (Y) mot slice lager (X) med hjälp av Microsoft Excel programvara (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trabekulära analys plugin är utformad för att automatiskt segmentera och kvantifiera trabekulärt ben med noggrannhet. Inledningsvis, följt ben yttre gräns upptäcks och avgränsad av en hål-fyllning operation där några hål inom ben yttre kortikala skal är fyllda. Sedan utförs en erosion operation för att utesluta de yttersta kortikala ben och få de segmenterade trabekulärt ben. Slutligen, åtgärder av trabekulärt ben i regionen segmenterade är kvantifierade.
Som mikro-CT-bilder är till sin natur bullriga, segmenteringar använder fördefinierade godtyckliga parametrar ofta misslyckas med att korrekt identifiera bens yttre gränser. Det är tråkiga och labor intensiv att prova en massa parameterkombinationerna för att välja tillfredsställande segmentering parametrar. Därför tillhandahålls en parameter profilering plugin för att ändra parametrarna en efter en i den ange intervall automatiskt för att hjälpa att välja tillfredsställande parameterkombinationer, vilket underlättar också att välja en gemensam uppsättning parametrar för en grupp av ben prover. Figur 1 A visar inställningarna som används för profilering bra segmentering parametrar. När parametrarna för kortikala benet tröskel (Cort ben), utbud av tröskeln vara profilerad (intervall), och öka beloppet för tröskelvärde (steg) vid varje steg anges, skapas en rad tröskelvärden att profileras. Därefter genereras en serie med buller och hål värden på samma sätt genom att ange motsvarande parametrar. Slutligen segmenteras trabekulärt ben genom att ändra parametrarna en i taget för alla möjliga parameterkombinationerna. Figur 1 B visar representativa segmentering resultaten för olika parameterkombinationer. Uppenbarligen vissa parameterkombinationer är bättre än andra på avgränsar ett bens yttre gränser, och mer än en parameter kombination visar tillfredsställande segmentering resultat. Efter visuellt kontrollera resultaten segmentering, kan parametervärden för tillfredsställande segmenteringar hämtas från resultattabellen profilering (tabell 1).
För att kvantifiera åtgärder av trabekulärt ben, utförs trabekulära segmentering och analys. Figur 2 A visar dialogrutan inställning för trabekulärt segmentering, där trabekulärt ben i den valda regionen är segmenterad extraheras (figur 2B) och segmentering resultaten med hjälp av medföljande parametrar kan kontrolleras slice-av-slice visuellt. Därefter analyseras trabekulärt ben med tillfredsställande parametrar (figur 3A). Beroende på val av status för rapportalternativ, rå kvantifieringar av benvolym (BV), total volym (TV), summan av gråvärden (intensitet), och tjocklekar mätt antingen två dimensionellt eller tre dimensionellt (tabell 2) redovisas. Slutligen Kalibreringsinformation utvinns från skannade mikro-CT datamängden och kalibrerad åtgärder av BV, TV, BMC, BV/TV och BMD beräknas följt genom att profilera sina distributioner i det valda analysera region lager-för-lagret mot lagret positioner (figur 4).
Som en kvalitetskontroll av plugin stöds kvantifiering av simulerade objekt. Simulerade standardobjekt med kända dimensioner kvantifieras av plugin för jämförelse med de teoretiska värdena eller åtgärder från andra program, såsom kommersiell programvara som levereras med micro-CT maskiner eller BoneJ14, ett gratis open source plugin för ben bildanalys. För att analysera simulerad objekt, är de buller-inställningarna inställda på noll, som simulerade bilder anses hög kvalitetsbilder utan något buller. Objekt med olika tjocklekar var simuleras och resultaten visas (figur 3, tabell 3). För simulerad standard 2D objekt, såsom cirklar, kvadrater och rektanglar, exakta värden för område (TV eller BV) och tjocklek redovisas (tabell 3). För 3D-objekt, exakta tjocklek åtgärder för kuber, sfärer och kvader redovisas, men tjockleken för cylindrar är inte korrekt för voxlar nära cylinder's båda ändar, medan de voxel tjocklekar i mellersta skivor av cylindrarna är exakt lika förutspådde. Detta är en funktion av den underliggande tjocklek mätning algoritm, vari den voxel tjocklek för varje objekt bestäms av diametern på den största sfären, eller den side längden av största kuben, som innehåller denna voxel och är helt inne i objektet. Därför tjocklekar av objekt gjorda av olika sfärer och kuber kan mätas noggrant, medan cylindrar kan endast mätas noggrant i den mellersta segmentets radius-avstånd från båda ändar.
Figur 1 : Representativa resultat parameterns profilering analys. (A) de parametrar som anger sida. (B) representativa resultat parameterns profilering analys. Vissa parameterkombinationer är bättre än andra för att upptäcka yttre gränserna för ben. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa resultat av trabekulärt segmentering analys. (A) de parametrar som anger sida. (B) representativa segmentering resultaten av trabekulärt ben på olika lager. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Trabekulärt analys. (A) de parametrar som anger sida. (B) representativa resultat av simulerade 2D-objekt. (C) representativa resultat av simulerade 3D-objekt visualiseras av 3D-volym viewer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Distributioner av trabekulärt ben åtgärder i regionen valda analysera. Den vågräta axeln representerar det relativa avståndet till Start skiva lagret i regionen analysera. Värdena i y-axeln är kalibrerad trabekulärt åtgärder i regionen analysera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Skiva | Kontur gräns | Buller minskning Dia. | Hål fyllning Dia. |
| 4 | 5200 | 0 | 10 |
| 147 | 5200 | 2 | 20 |
| 361 | 7200 | 6 | 16 |
| 539 | 8000 | 10 | 20 |
Tabell 1: Representativa resultat parameterns profilering analys.
Tabell 2: Representativa resultat av trabekulärt analys.
| Objekt | Dimension | Volymb | Ytac | Tjocklek |
| Torget | 200 X 200 | 40000 | 796 | 200 |
| Rektangel | 200 X 100 | 20000 | 596 | 100 |
| Cirkel | Dia: 200 | 31428 | 796 | 200 |
| Kub | 30 X 30 X 30 | 27000 | 5048 | 30 |
| Rätblock | 80 X 40 X 30 | 96000 | 13008 | 30 |
| Sphere | Dia: 30 | 14328 | 3944 | 30 |
| Cylinderd | Dia:30; H: 100 | 71600 | 12800 | 27.84 |
| Cylindere | Dia:30; H: 100 | 51552 | 9552 | 30 |
| svar: resultaten är i raw voxlar. Dia: diameter; H: höjd. | ||||
| b: volym (3D) eller område (2D). | ||||
| c: yta (3D) eller perimeter (2D). | ||||
| d: Measurs från skiva 1 till skiva 100 används för analys. | ||||
| e: Measurs från skiva 15 att skiva 85 används för analys. | ||||
Tabell 3: Kvantifiering resultat för simulerad objekt.
Kompletterande fil 1. Prova ben. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie beskriver en ImageJ plugin för att analysera trabekulärt ben som är automatisk, effektiv, och användarvänlig. Plugin kan också användas för att kvantifiera eventuella 2D- eller 3D-objekt för lager-för-lager åtgärder av områden, volymer och tjocklekar. För närvarande rapporteras endast ett uppmätt värde för varje trabekulärt parameter för varje prov av standarden micro-CT-analys, som inte fullt representerar egenskaperna hos den uppmätta enheten i den valda analysera regionen. Beskrivs plugin rapporterar lager-för-lager kvantiteter av varje parameter för varje prov, som fullt behåller Distributionsinformation av den uppmätta parametern i den valda analysera regionen, och därför mer avancerade och känsliga statistiska metoder är tillämpliga för att analysera sådana uppgifter.
Med standard, halvautomatisk hand-contouring segmentering metod observerades betydande variation mellan olika hand-contouring skivor med operatören bias8,9,10, motiverar en mer enhetlig och automatiska metoden för trabekulärt segmentering. Kontrasten är maximal mellan scanning bakgrund och ben yttre gränsen, utförs yttre-gränsen assisterad trabekulärt segmentering av plugin, där bens yttre gräns kan identifieras automatiskt med noggrannhet vid behov tröskel, buller och hål inställningar finns. För att underlätta fastställandet av segmentering parametrar, ett utbud av parametern kombinationer är profilerad en efter en med en representativ skiva från regionen analysera och tillfredsställande segmentering resultaten kontrolleras visuellt. Därefter analyseras trabekulärt ben med profilerad parametrar. När lämpliga segmentering parametrar ställs in, och plugin har tillämpats framgångsrikt för att analysera trabekulärt ben från råtta distala lårbenet behandlas med olika ben anabola substanser5, rapporteras reproducerbara resultat för samma bild utan operatör bias.
Plugin kan för närvarande endast behandla ett prov i taget. Om flera prover finns i bilden, är alla prover kvantifierade som ett enskilt objekt utan diskriminering. Därför krävs förbehandling om flera prover skannas samtidigt i ett enda prov rör. Rapporteringsgräns utgångarna är rå åtgärder för pixelantal eller grå värden, vilka bör kalibreras manuellt med hjälp av lämpliga Kalibreringsinformation.
Det mest kritiska steget i detta protokoll är att välja lämpliga parametrar för trabekulärt analys. Allmänhet, grupper av ben prover analyseras med identiska segmentering parametrar för att göra resultaten jämförbara. I sådana fall bör vara försiktig att säkerställa att segmentering resultat för alla prover granskas visuellt för potentiella fel innan ytterligare analyser genomförs.
En stor begränsning av denna teknik är att buller minskning inställningarna tillämpas på kortikal ben bara för contouring ett bens yttre gräns, men inte på extraherade trabekulärt ben. Som olika filtrering strategier har varit rapporterade15 som optimal för trabekulärt analys under olika förhållanden, är ingen enda filter bra för alla bild prover. Därför finns det ingen inbyggd filtrering steg innan kvantifiering av trabekulärt ben. För att vara kompatibel med produktionen av programvara med inbyggd bild filtreringar, extraherade trabekulärt ben kan vara bearbetade på samma sätt först med olika bildframställning, och sedan importeras till ImageJ och kvantifieras av plugin därefter. Dessutom olika bildformat genereras av olika mikro-CT-leverantörerna, och de flesta av dem kan inte importeras eller öppnas av ImageJ direkt, således moduler för att importera olika bildformat till ImageJ för vidare analys önskas. En annan begränsning är att de 3D tjocklekar i skivor nära ändarna av intervallet urval inte korrekt om en del av objekten är utanför urval spänna, som gäller även för eventuella tillgängliga 3D kvantifiering paket, därför ett större urval av skivor ska kvantifieras, och endast den mellersta delen av valda segment bör användas för vidare analys. Ett sådant tillvägagångssätt kan bara användas när uppmätta mängder är rapporterade lager-för-lager som visas i denna plugin, men inte för mätningar att endast ett värde rapporteras för varje kvantifierade parameter i intervallet urval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ett patent för underliggande algoritmen att kvantifiera objekt tjocklek har lämnats in. Författarna samarbetat med andra registrerade de bomomics.com website hosting gratis version plugins, där consulting och kvantifiera tjänster av bildanalys tillhandahålls på begäran.
Acknowledgments
Detta arbete var delvis stöds av grant NFSC 81170806. Författarna vill tacka de mikro-CT core facilitet i skolan av stomatologi, Wuhan University för att hjälpa skanna och analysera de råtta lårbenet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ | NIH | imagej | Any version with a java 1.8 run time |
| trabecular analysis plugin | Bomomics | bomomics | free or commercial version |
| Micro CT scanner | Scanco | μ-50 | micro CT from any vendor |
| Computer System | Lenovo | any brand | |
| Windows Operating System | Microsoft | Windows 7 x64 | any 64-bit Windows operating system |
| Office Software | Microsoft | Office 2010 | any speadsheet software that has xy chart function |
References
- Ruegsegger, P., Koller, B., Muller, R. A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcif Tissue Int. 58 (1), 24-29 (1996).
- Muller, R., Ruegsegger, P. Micro-tomographic imaging for the nondestructive evaluation of trabecular bone architecture. Stud Health Technol Inform. 40, 61-79 (1997).
- Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Phys Med. 30 (6), 619-634 (2014).
- Bart, Z., Wallace, J. Microcomputed Tomography Applications in Bone and Mineral Research. Advances in Computed Tomography. 2, 121-127 (2013).
- Ji, Y., Ke, Y., Gao, S. Intermittent activation of notch signaling promotes bone formation. Am J Transl Res. 9 (6), 2933-2944 (2017).
- Jiang, Y., Zhao, J., White, D. L., Genant, H. K. Micro CT and Micro MR imaging of 3D architecture of animal skeleton. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (1), 45-51 (2000).
- Laib, A., et al. 3D micro-computed tomography of trabecular and cortical bone architecture with application to a rat model of immobilisation osteoporosis. Med Biol Eng Comput. 38 (3), 326-332 (2000).
- Cole, H. A., Ichikawa, J., Colvin, D. C., O'Rear, L., Schoenecker, J. G. Quantifying intra-osseous growth of osteosarcoma in a murine model with radiographic analysis. J Orthop Res. 29 (12), 1957-1962 (2011).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Med Imaging. 8, 16 (2008).
- Soviero, V. M., Leal, S. C., Silva, R. C., Azevedo, R. B. Validity of MicroCT for in vitro detection of proximal carious lesions in primary molars. J Dent. 40 (1), 35-40 (2012).
- Kohler, T., Stauber, M., Donahue, L. R., Muller, R. Automated compartmental analysis for high-throughput skeletal phenotyping in femora of genetic mouse models. Bone. 41 (4), 659-667 (2007).
- Buie, H. R., Campbell, G. M., Klinck, R. J., MacNeil, J. A., Boyd, S. K. Automatic segmentation of cortical and trabecular compartments based on a dual threshold technique for in vivo micro-CT bone analysis. Bone. 41 (4), 505-515 (2007).
- Dougherty, G. Quantitative CT in the measurement of bone quantity and bone quality for assessing osteoporosis. Med Eng Phys. 18 (7), 557-568 (1996).
- Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47 (6), 1076-1079 (2010).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
