Summary
We presenteren een workflow voor segmenteren en kwantificeren van trabecular beenderen voor 2D- en 3D-afbeeldingen op basis van de buitenste rand van het bot met behulp van een plugin ImageJ. Deze aanpak is efficiënter en nauwkeuriger dan de huidige handmatige hand-contouring aanpak, en laag-voor-laag kwantificeringen, die niet beschikbaar zijn in de huidige commerciële software biedt.
Abstract
Micro-berekend tomografie (micro-CT) wordt regelmatig gebruikt ter beoordeling van de hoeveelheid bot en trabecular microstructurele eigenschappen in kleine dieren onder verschillende bot verlies voorwaarden. Echter is de standaardbenadering voor trabecular analyse van micro-CT-beelden slice-door-laagse semi-automatische hand-contouring, arbeidsintensief en foutgevoelig. Hier beschreven is een efficiënte methode voor automatische segmentatie van trabecular botten volgens de buitenste grenzen van het bot, waar trabecular botten kunnen worden geïdentificeerd en gesegmenteerd automatisch met nauwkeurigheid met minder vooringenomenheid van de exploitant voorzover toepasselijk segmentatie parameters zijn ingesteld. Om het profiel van bevredigende segmentatie parameters, wordt een afbeeldingsstapel van segmentatie-resultaten weergegeven, waar alle mogelijke combinaties van de parameters van de segmentatie veranderde één voor één in de reeks, en segmentatie resultaten met bijbehorende parameters kan gemakkelijk worden visueel gecontroleerd. Als een functie van de kwaliteitscontrole van de plugin, zijn gesimuleerde standaardobjecten gekwantificeerd waar de gemeten hoeveelheden kunnen worden vergeleken met theoretische waarden. Laag-voor-laag kwantificering van trabecular eigenschappen en trabecular diktes zijn gerapporteerd door dergelijke plugin en de verdelingen van dergelijke eigenschappen binnen de geselecteerde regio's kunnen gemakkelijk worden geprofileerd. Hoewel laag-voor-laag kwantificering meer informatie over trabecular bones behoudt en verder vergemakkelijkt de statistische analyse van structurele veranderingen, dergelijke maatregelen niet beschikbaar zijn van de output van de huidige commerciële software, waar slechts één gekwantificeerde waarde voor elke parameter wordt voor elk monster gerapporteerd. De beschreven werkstromen zijn dus betere benaderingen voor het analyseren van trabecular botten met nauwkeurigheid en efficiëntie.
Introduction
Micro-CT analyse van trabecular botten is de standaardbenadering voor het bijhouden van de morfologische veranderingen van de botten in kleine dieren onder verschillende bot verlies voorwaarden1,2,3, waar meerdere variabelen met betrekking tot de structuren van de botten zijn gerapporteerde4. Echter, dergelijke parameters niet gelijkelijk zijn verdeeld in de metaphysis van lange beenderen5, en alleen een samengevatte of een gemiddelde waarde voor elke structurele variabele van elk monster wordt gerapporteerd door de huidige commerciële micro-CT machines6,7 , hoewel een enkele waarde kan niet geheel representatief is de kenmerken van de gemeten parameter analyseren regio. Laag-voor-laag kwantificering van trabecular botten niet alleen meer informatie voor elke variabele behoudt, maar maakt het ook mogelijk de profilering van de verdelingen van dergelijke variabelen analyseren regio, vergemakkelijking van latere statistische analyse van structurele veranderingen onder verschillende omstandigheden5. Daarom is het doel van deze methode trabecular beenderen van micro-CT-scans op het niveau van elk segment, dat momenteel niet beschikbaar in alle verkrijgbare micro-CT analyse pakket is kwantificeren.
Automatische segmentatie methoden zijn efficiënt segment trabecular botten segment-door-slice, wenselijk. Echter de huidige standaard techniek voor micro-CT analyse is gebaseerd op de handleiding interactieve contouren, gevolgd door semi-automatische interpolatie te scheiden trabecular beenderen van de corticale compartimenten, die arbeidsintensief, foutgevoelige is, en in verband met de aanzienlijke exploitant bias8,9,10. Automatische segmentatie methoden11,12 werden gemeld, maar dergelijke methoden zijn alleen optimaal in regio's met een goede scheiding tussen trabecular bones en corticale botten, maar niet in regio's zonder duidelijke scheidingen. Bovendien, de segmentering van de verschillende parameters zijn vereist voor verschillende monsters12, en is het handmatig selecteren van bevredigende segmentatie parameters voor groepen van bot monsters door te proberen verschillende parameter combinaties12, vervelend Hoewel de segmentatie-proces wordt automatisch genoemd als alle bijbehorende parameters zijn ingesteld. Als het bot buitenrand heeft het grootste contrast met het scannen van de achtergrond en de metafyse corticale schelpen van lange beenderen paar veranderingen in de gekozen regio, analyseren segmentatie methoden volgens de buitenrand contour van lange beenderen kan weergeven betrouwbaar en nauwkeurig scheiden trabecular botten van corticale schelpen. Het voordeel van deze segmentatie methode is dat de segmentatie is gebaseerd op het verschil tussen de achtergrond en de buitenste rand van het bot, maar niet over de verschillen tussen trabecular en corticale botten6,12, 13, daarom is het over het algemeen gemakkelijk te vinden van een combinatie van segmentatie parameters die bevredigend is voor een groep van bot monsters, meer betrouwbare analyse van trabecular veranderingen tussen verschillende groepen te vergemakkelijken.
Op elk segment worden niveau, omgeving, omtrek en tweedimensionale (2D) dikte gerapporteerd voor 2D analyse, terwijl volume, oppervlak en driedimensionale (3D) dikte worden gerapporteerd in 3D ondermeer. Dergelijke informatie is in het algemeen niet gemeld door de huidige afbeelding analysetools, die aangeeft dat de gerapporteerde procedures kunnen worden toegepast op algemene afbeeldingen waar dergelijke informatie gewenst is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures met betrekking tot dierlijke onderwerpen zijn werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren (NIH publicatie, 8ste editie, 2011), en herzien en goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Wuhan Universiteit.
1. de software installeren
- ImageJ software installeren. Downloaden van de Windows-versie van de software van de ImageJ (versie 1.51 p) gebundeld met 64-bits Java van https://imagej.nih.gov/ij/. Pak de gedownloade software in een map, die zal worden hierna genoemd de "ImageJ Directory".
Opmerking: Trabecular analyse plugins vereisen 64-bits java run time (versie 1.8) en een 64-bits windows-besturingssysteem, bij voorkeur een 64-bits Windows 7 besturingssysteem. - Trabecular analyse plugins installeren. Trabecular analyse plugins van http://www.bomomics.com te vragen, en unzip de inhoud naar de ImageJ plugins directory, oftewel "ImageJ Directory/plugins".
Opmerking: De plugin kan worden verkregen als een gratis versie, waar de metingen voor de 5 opgegeven aangrenzende segmenten worden gemeld, of als een commerciële versie, waar een scala aan segmenten kan worden opgegeven en gemeten.
2. Prepareer 3D Dataset Trabecular analyse
- Scan rat dijbeen met een micro-CT machine aanhang de standaard protocol5 scannen en sla de gegevens in een indeling die kan worden geïmporteerd in ImageJ, bijvoorbeeld, de TIFF-indeling. Als meerdere bot monsters werden gelijktijdig gescand in een enkele monsterbuisje, eerst de gegevens te importeren in ImageJ en elke individuele bot weer worden gescheiden door bijsnijden uit andere monsters met behulp van de ImageJ beeldprocessing tools. Vervolgens de resulterende afbeelding opslaan in een indeling die kan worden geïmporteerd in ImageJ later.
Opmerking: Een representatieve steekproef spiegelbeeld vijl gebruikt bij de analyse is opgenomen (aanvullende bestand 1). -
Standaard 2D- en 3D-objecten te simuleren.
- Open ImageJ software. Onder de Plugins | BoMomics | Simuleren van objecten menu, klik op de cirkel -knop, en voer 200 als de diameter in het pop-up venster, en klik op OK voor het genereren van de gesimuleerde cirkel met een diameter van 200 pixels (Figuur 3B). De gegenereerde cirkel in TIFF-indeling opslaan.
- Open ImageJ software. Onder de Plugins | BoMomics | Simuleren van objecten menu, klikt u op het plein , en voer 200 als de lengte van de kant in het pop-upvenster en klik op OK om het genereren van het gesimuleerde plein met een lengte van de zijde van 200 pixels (Figuur 3B). Het gegenereerde plein in TIFF-indeling opslaan.
- Open ImageJ software. Onder de Plugins | BoMomics | Simuleren van objecten menu, klik op de knop rechthoek en voer 200 100 als de breedte als de hoogte in het pop-up venster, en klik op OK voor het genereren van de gesimuleerde rechthoek met een breedte van 200 pixels en een hoogte van 100 pixels (Figuur 3 B). De gegenereerde rechthoek in TIFF-indeling opslaan.
Opmerking: Een cirkel (diameter: 200 pixels), een plein (kant lengte: 200 pixels), en een rechthoek (breedte: 200 pixels, hoogte: 100 pixels) worden opgeslagen voor latere analyses. - Open ImageJ software. Onder de Plugins | BoMomics | Simuleren van objecten menu, klik op de knop kubus , en 30 invoeren als de lengte van de kant in het pop-upvenster en klik op OK om het genereren van de gesimuleerde kubus. Tenslotte, klik op de Plugins | 3D | Volume Viewer de gegenereerde kubus bekijken en opslaan in TIFF-indeling (Figuur 3C).
- Open ImageJ software. Onder de Plugins | BoMomics | Simuleren van objecten menu, klik op de knop van de balk , en voer 80 in de lengte, 40 als de breedte, en 30 als de hoogte in het pop-up venster, klik op OK voor het genereren van de gesimuleerde balk. Tenslotte, klik op de Plugins | 3D | Volume Viewer de gegenereerde balk bekijken en opslaan in TIFF-indeling (Figuur 3C).
- Open ImageJ software. Onder de Plugins | BoMomics | Simuleren van objecten menu, klik op de knop van de bol , en 30 invoeren als de diameter in het pop-up venster, en klik op OK voor het genereren van de gesimuleerde bol. Tenslotte, klik op de Plugins | 3D | Volume Viewer om te bekijken de gegenereerde bol en sla het op in TIFF-indeling (Figuur 3C).
- Open ImageJ software. Onder de Plugins | BoMomics | Simuleren van objecten menu, klik op de knop van de cilinder , en 30 invoeren als de diameter en 100 als de hoogte in het pop-up venster, en klik op OK voor het genereren van de gesimuleerde cilinder. Tenslotte, klik op de Plugins | 3D | Volume Viewer om te bekijken de gegenereerde cilinder en sla het op in TIFF-indeling (Figuur 3C).
Opmerking: Een bol (diameter: 30 pixels), een kubus (kant lengte: 30 pixels), een balk (lengte: 80 pixels; width: 40 pixels, hoogte: 30 pixels), en een cilinder (diameter: 30 pixels, hoogte: 100 pixels) worden opgeslagen voor latere analyses.
3. profilering van de analyse gebruikte Parameters
- ImageJ software openen en opent of importeert van een gescande afbeelding.
- Schuif de schuifbalk van de bodem om te kiezen van een segment, dan klikt u op de afbeelding | Aanpassen | Drempel knop. De minimale en maximale drempelwaarden aanpassen door handmatige controle om ervoor te zorgen dat de botten goed zijn gescheiden van de achtergrond in het pop-upvenster drempel, en neem de minimale drempelwaarde als de drempelwaarde corticaal bot.
Opmerking: Als de verschillende micro-CT fabrikanten gebruiken verschillende schalen factoren voor het opslaan van X-ray demping coëfficiënten in de beelden, de werkelijke drempelwaarde moet worden bepaald empirisch hetzij door handmatige inspectie of naar aanleiding van de specifieke fabrikant aanbevelingen. In onze praktijk, kan instellen van de minimumdrempel voor ISQ bestanden geproduceerd door micro-CT machines tot 6.000-7.000 betrouwbaar scheiden botten van de scanning achtergrond. - Klik op de -Plugins | BoMomics | Trab Param Profiling knop. In het pop-up venster, Slice Index naar de positie van het representatieve segment in te stellen, en de corticaal bot ("Cort Bone"), range ("Range"), en ("stap") waarden voor het berekenen van een reeks van corticale drempels voor profilering segmentatie parameters, waar de drempelwaarde corticaal bot wordt overgenomen door stap 3.2 (Figuur 1). Het bereik en stap standaardwaarden van 2.000 en 400 werk voor de meeste micro-CT afbeeldingen. De Slice Index ingesteld op 5 voor de voorbeeld-dataset, en houden de standaardwaarden voor andere instellingen.
Opmerking: "Cort bot" is de drempel voor corticale botten, en de waarde van de drempel wordt gebruikt voor de parameter profiling wijzigingen ten opzichte van de laagste drempelwaarde met de hoogste drempelwaarde met de toename van de waarde voor stap, waar de laagste drempelwaarde is de waarde van Cort Bone - bereik en de hoogste drempelwaarde is Cort bot + Range. Als de ingestelde waarden voor de Cort bot, bereik en stap 6000, 1000 en 500, respectievelijk zijn, dan de laagste grenswaarde voor corticale botten 6.000-1, 000 = 5, 000 is, de hoogste drempelwaarde 6, 000, 000 + 1, 000 = 7 is en de drempels gebruikt zijn de analyses 5.000, 5.500, 6.000 6.500 en 7.000. - Instellen van lawaai diameter ("lawaai Dia."), stap ("Step") en bereik ("Range") waarden voor het opgeven van een set van ruiswaarden in de analyses, gat diameter ("gat Dia."), ("stap") en de range ("Range") waarden voor het berekenen van een verzameling waarden van de hole. In het algemeen, werkt de standaardinstelling voor de meeste micro-CT bot monsters, waar ruis, stap, en bereik 5, 5, 2, respectievelijk zijn, en gat diameter, step en bereik 15, 5, 2, respectievelijk zijn. Houd de standaardinstellingen voor de voorbeeld-dataset.
Opmerking: "Lawaai Dia." is de diameter voor het filter ruis onderdrukking, en het "gat Dia." is de diameter voor gaten in de corticale botten. De waarden van het lawaai en gat gebruikt voor de parameter profileren kunnen worden berekend op dezelfde manier als de van de corticale drempelwaarden hierboven beschreven, met behulp van het opgegeven geluid/gat, bereik en stapwaarde is ingesteld. Als gevolg van de variaties in de scanparameters bij de aankoop van de beelden, moeten geluid en gat parameters worden bepaald empirisch volgens de kwaliteit van de afbeelding, zoals geen algemene bereiken van lawaai en gat parameters goed voor alle scans zijn. De laagste waarde voor drempel, ruis, of gaten moet groter dan of gelijk aan 0, en als de berekende laagste waarde negatief met behulp van de meegeleverde parameters is, de specifieke laagste waarde is ingesteld op 0. - Klik op OK om uit te voeren met de parameter profilering. Visueel controleren van de resultaten van de segmentatie in het resultatenvenster Parameter Profiling en selecteer een segment laag zodat de buitenste rand van het bot is vrij nauwkeurig beschreven (Figuur 1B). Vervolgens haalt de profilering parameters op uit de vermelding in de tabel van de Parameter Profiling resultaten overeenkomen met de gekozen segment laag (tabel 1).
4. trabecular analyse
-
Segmentatie van trabecular botten
- Open ImageJ software, dan opent of importeert van een gescande afbeelding.
- Klik op de -Plugins | BoMomics | Trab-segmentatie knop en vul in passende analyse gebruikte parameters. Stel "Start", "Overzicht grens", "Trab. Bones","Noise Reduction Dia.","Gat vullen Dia."en"Corticale dikte Dia."5, 7200, 7000, 6, 12 en 25, respectievelijk.
Opmerking: "Start" en "End" Geef het bereik geselecteerd segment voor segmentatie van trabecular botten, "Overzicht grens" is overeenkomt met de geprofileerde "Cort Bone" parameter, "Ruis vermindering Dia." naar "Lawaai Dia." Parameter, en "Gat vullen Dia." aan "Gat Dia." parameter. "Corticale dikte Dia." is de opgegeven dikte voor het uitsluiten van de buitenste corticale botten. "Trab. Bones "is de drempel voor het extraheren van trabecular botten (Figuur 2), waar de instellingen worden bepaald opdracht profiling analyse parameters zoals beschreven in stap 3.5. - Klik op OK om te voeren trabecular segmentatie. Visueel controleren de segmentering van de resultaten in het resultatenvenster van Trab segmentatie (Figuur 2B). Sla de uitgepakte trabecular botten weergegeven in het venster van de Gesegmenteerde Trabecular botten in een TIFF-indeling (Figuur 2B), die verder kan worden geanalyseerd door andere software.
-
Analyse van trabecular botten.
- Open ImageJ software, dan opent of importeert van een gescande afbeelding.
- Klik op de -Plugins | BoMomics | Trab analyse knop en vul in passende analyse gebruikte parameters, zoals "Start", "Overzicht grens", "Trab. Bones","Noise Reduction Dia.","Gat vullen Dia.", en"Corticale dikte Dia."als beschreven boven (Figuur 3,A), waar de instellingen worden bepaald de opdracht profiling analyse parameters zoals beschreven in stap 3.5. Stel "Start", "Overzicht grens", "Trab. Bones","Noise Reduction Dia.","Gat vullen Dia."en"Corticale dikte Dia."5, 7200, 7000, 6, 12 en 25, respectievelijk.
Opmerking: De gratis versie van de plugin, vijf aangrenzende segmenten vanaf de opgegeven "Start" segment index zijn geselecteerd voor de meting, terwijl in de commerciële versie, een willekeurig aantal segmenten kan worden opgegeven door de gebruiker. - Selecteer één of meerdere keuzes in Resultaten rapportage sectie voor de parameters te worden gemeten, waarbij het trabecular bot volume (BV), het totale volume (TV) van de geselecteerde regio en diktes hetzij two-dimensionally gemeten (2D) of ruimtelijk (3D) zijn beschikbaar voor selectie via drie selectievakjes, namelijk "BV TV alleen", "2D" en "3D". Schakel de selectievakjes "2D" en "3D", klik vervolgens op "OK" om het trabecular analyses (Figuur 3, tabel 2) uit te voeren.
Opmerking: Als 'Alleen BV-TV' is ingeschakeld, ongeacht de status van de selectie van "2D" en "3D", ruwe maatregelen van BV, TV en intensiteit worden gemeld, en de gesegmenteerde trabecular botten zijn uitgepakt en weergegeven in een nieuw venster, dat kan worden opgeslagen en verder geanalyseerd door andere software. Wanneer "2D" is aangevinkt, worden ruwe maatregelen van BV, TV, intensiteit en diktes gemeten two-dimensionally op elk niveau van de segmenten met behulp van het model van de plaat gemeld. Als "3D" is aangevinkt, worden driedimensionale dikte voor elke voxel wordt berekend rechtstreeks, dus zonder enige model veronderstelling, dan rauwe maatregelen van BV, TV, intensiteit en driedimensionale diktes bemonsterd op elk segment niveau gemeld. Als echter geen selectievakje is ingeschakeld, trabecular botten zijn gesegmenteerd met behulp van de bovenstaande set van parameters, maar geen meting wordt gemeld.
5. kwantificeren van de gesimuleerde objecten
- Open ImageJ software, en open vervolgens een gesimuleerde beeld. Open hier de gesimuleerde bol met een diameter van 30 pixels als voorbeeld.
- Selecteer de Plugins | BoMomics | Trab analyse knop en vul in passende analyse gebruikte parameters, zoals eerder is beschreven. Houd de standaardwaarden voor "Start", "Einde", "Overzicht grens", "Trab. Bones", en instellen"Noise Reduction Dia.","Noise Reduction Dia.","Gat vullen Dia."en"Corticale dikte Dia."op 0 (Figuur 3).
Opmerking: Er is geen onbedoelde signaal-ruis voor gesimuleerde objecten, en kunnen er geen overeenkomstige corticale schelpen. Daarom, parameters voor deze waarden op de juiste manier moeten worden ingesteld (standaardinstellingen zijn op nul). Voor 3D ondermeer plakjes 30 vóór en na het opgegeven segment van de "Start" worden verwerkt met behulp van de gratis versie van de plugin, terwijl alleen de segmenten in het bereik dat is opgegeven door "Start" en "End" segmenten worden geanalyseerd door de commerciële versie van de plugin. - Selecteer "2D" en "3D" voor de parameters te meten in de sectie Resultaten rapporteren en klik op OK om het trabecular analyses uit te voeren voor het gesimuleerde object (tabel 3).
6. kalibratie van Trabecular maatregelen en de presentatie van gegevens: de verdelingen van Trabecular maatregelen in de regio van het analyseren van het geselecteerde profiel
- Krijgen de kalibratie-informatie uit de gescande dataset, volgens de instructies van de leverancier van de micro-CT.
Opmerking: Alleen rauwe maatregelen van BV, TV, intensiteit en diktes zijn gemeld door de plugin. Als u maatregelen vergelijkbaar met rapporten die zijn gegenereerd door andere software, is resultaat kalibratie gewenst. - Open Microsoft Excel en opent u de tabel gerapporteerde resultaten. Berekenen gekalibreerd bot volume (BV), totaal nieuw volume (TV), bone minerale inhoud (BMC), bone volume breuk (BV/TV) en Botmineraaldichtheid (BMD) in excel kolommen met behulp van de gerapporteerde rauwe BV, TV en intensiteit waarden volgens de volgende expressies.
- Opmerking: Scanresolutie (resolutie, µm), grijze schaal (tekenbreedte aanpassen), dichtheid eenheden (mg HA/cm3) dichtheid helling (slope) en dichtheid snijpunt (snijpunt) kunnen worden geëxtraheerd uit de gescande micro-CT afbeelding of meta bestanden, zoals het bestand Scanco ISQ. De geijkte maatregelen zijn daarom als volgt berekend:
Stel dat BV, TV en intensiteit zijn ruwe maatregelen, BVc en TVc zijn gekalibreerd waarden, resolutie, schalen, helling, onderscheppen zijn van kalibratie bestanden van micro - CT afbeeldingen.
BVc = BV × resolutie3 [μm3]
TVc = TV × resolutie3 [μm3]
BV / TV = BV ÷ TV
BMC = (intensiteit ÷ schalen × helling - BV × snijpunt) × resolutie3 × 10-12 [mg HA]
BMD - BMC ÷ TVc × 1012 [mg HA / cm3] - Maak een XY-Diagram (spreiding) plot voor geijkte maatregelen (Y) tegen segment lagen (X) met behulp van Microsoft Excel software (Figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het trabecular analyse plugin is ontworpen om automatisch te segmenteren en kwantificeren trabecular beenderen met een nauwkeurigheid. Aanvankelijk, bot buitenrand is gedetecteerd en afgebakend gevolgd door een gat vullen operatie waar geen gaten in bot buitenste corticale schelpen zijn gevuld. Vervolgens wordt een erosie-bewerking uitgevoerd om te sluiten van de buitenste corticale botten en de gesegmenteerde trabecular botten. Ten slotte worden maatregelen van trabecular botten in de gesegmenteerde regio gekwantificeerd.
Zoals micro-CT-beelden zijn inherent luidruchtige, segmentaties met behulp van vooraf gedefinieerde willekeurige parameters vaak niet nauwkeurig identificeren de buitenste grenzen van het bot. Het is vervelend en arbeid intensieve om te proberen een heleboel parametercombinaties voor het selecteren van bevredigende segmentatie parameters. Daarom is een parameter profilering plugin opgegeven voor het veranderen van de parameters één voor één in het ingestelde bereik automatisch om te helpen bij het selecteren van bevredigende parametercombinaties, die ook vergemakkelijkt een gemeenschappelijke set parameters voor een groep van bone te selecteren monsters. Figuur 1 A geeft de instellingen gebruikt voor profilering van goede segmentatie parameters. Wanneer de parameters voor corticaal bot drempel (Cort bot), bereik van drempel te zijn geprofileerd (bereik) en increment bedrag voor drempel (Step) bij elke stap zijn opgegeven, worden een aantal drempels te worden geprofileerd gegenereerd. Vervolgens worden een reeks waarden van het lawaai en gat ook gegenereerd door de overeenkomstige parameters. Ten slotte zijn trabecular botten gesegmenteerd door het veranderen van de parameters een tegelijkertijd voor alle mogelijke parametercombinaties. Figuur 1 B toont de segmentering van de representatieve resultaten voor verschillende parametercombinaties. Natuurlijk, sommige parametercombinaties zijn beter dan anderen op de buitenste grenzen van een bone uitgezet, en meer dan één parameter combinatie toont de segmentering van de bevredigende resultaten. Na de visuele controle van de resultaten van de segmentatie, kunnen parameterwaarden voor bevredigend segmentaties worden opgehaald uit de profilering resultaten tabel (tabel 1).
Om te kwantificeren maatregelen van trabecular botten, worden trabecular segmentatie en analyse uitgevoerd. Figuur 2 A toont de instelling dialoogvenster voor trabecular segmentatie, waar trabecular botten in het geselecteerde gebied worden gesegmenteerd en geëxtraheerd (Figuur 2B), en segmentatie resultaten met behulp van de meegeleverde parameters kunnen worden gecontroleerd segment-door-slice visueel. Trabecular botten worden vervolgens geanalyseerd met bevredigende parameters (Figuur 3A). Afhankelijk van de status van de selectie van rapportage opties, ruwe ondermeer van bot volume (BV), totaal volume (TV), som van grijswaarden (intensiteit), en diktes gemeten dimensioneel ofwel twee of drie dimensioneel (tabel 2) worden gemeld. Ten slotte, kalibratie-informatie wordt gewonnen uit de gescande micro-CT dataset en gekalibreerd maatregelen van BV, TV, BMC, BV/TV, en BMD gevolgd worden berekend door de profilering van hun distributies in de geselecteerde analyseren regio Laag-voor-laag tegen de laag positie (Figuur 4).
Als een functie van de kwaliteitscontrole van de plugin, wordt kwantificering van gesimuleerde objecten ondersteund. Gesimuleerde standaardobjecten met bekende afmetingen zijn gekwantificeerd door de plugin voor vergelijking met de theoretische waarden of maatregelen van andere software, zoals commerciële software voorzien van micro-CT machines of BoneJ14, een gratis open source plugin voor bot beeldanalyse. Voor het analyseren van gesimuleerde objecten, zijn het lawaai instellingen ingesteld op nul, aangezien gesimuleerde beelden worden beschouwd als van hoge kwaliteitsbeelden zonder enige ruis. Objecten met verschillende diktes werden gesimuleerd en resultaten worden weergegeven (Figuur 3, tabel 3). Voor gesimuleerde standaard 2D-objecten, zoals cirkels, vierkanten en rechthoeken, exacte waarden voor gebied (TV of BV) en dikte zijn gemeld (tabel 3). Voor 3D-objecten, exacte dikte maatregelen voor kubussen, bollen en blokken worden gemeld, de diktes voor cilinders zijn echter niet nauwkeurig voor voxels in de buurt van cilinder van beide uiteinden, terwijl de voxel diktes in de middelste segmenten van de cilinders zijn precies zoals voorspelde. Dit is een functie van het onderliggende dikte meting algoritme, waarin van de voxel dikte voor elk object wordt bepaald door de diameter van de grootste bol, of de lengte van de zijde van de grootste kubus, die deze voxel bevat en volledig binnen de object. Daarom, diktes van objecten gemaakt van verschillende bollen en kubussen nauwkeurig kunnen worden gemeten, terwijl cilinders kunnen alleen nauwkeurig worden gemeten in het midden segment straal-afstand van beide uiteinden.
Figuur 1 : Representatieve resultaten van parameter profilering analyse. (A) de parameters instellen pagina. (B) representatieve resultaten van parameter profilering analyse. Sommige parametercombinaties zijn beter dan anderen voor het opsporen van de buitenste grenzen van botten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatieve resultaten van trabecular segmentatie analyse. (A) de parameters instellen pagina. (B) de segmentering van de representatieve resultaten van trabecular botten op verschillende lagen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Trabecular analyse. (A) de parameters instellen pagina. (B) representatieve resultaten van gesimuleerde 2D-objecten. (C) representatieve resultaten van gesimuleerde 3D-objecten gevisualiseerd door 3D-volume viewer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Distributies van trabecular bot maatregelen in de geselecteerde analyseren regio. De horizontale as vertegenwoordigt de relatieve afstand tot de eerste laag van het segment analyseren regio. Waarden in de y-as zijn gekalibreerd trabecular maatregelen analyseren regio. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Segment | Overzicht grens | Ruis vermindering Dia. | Gat vullen Dia. |
| 4 | 5200 | 0 | 10 |
| 147 | 5200 | 2 | 20 |
| 361 | 7200 | 6 | 16 |
| 539 | 8000 | 10 | 20 |
Tabel 1: Representatieve resultaten van parameter profilering analyse.
Tabel 2: Representatieve resultaten van trabecular analyse.
| Object | Dimensie | Volumeb | Oppervlaktec | Dikte |
| Plein | 200 X 200 | 40000 | 796 | 200 |
| Rechthoek | 200 X 100 | 20000 | 596 | 100 |
| Cirkel | Dia: 200 | 31428 | 796 | 200 |
| Kubus | 30 X 30 X 30 | 27000 | 5048 | 30 |
| Balk | 80 X 40 X 30 | 96000 | 13008 | 30 |
| Bol | Dia: 30 | 14328 | 3944 | 30 |
| Cilinderd | Dia:30; H: 100 | 71600 | 12800 | 27.84 |
| Cilindere | Dia:30; H: 100 | 51552 | 9552 | 30 |
| a: resultaten zijn in de ruwe voxels. Dia: de diameter van; H: de hoogte. | ||||
| b: Volume (3D) of gebied (2D). | ||||
| c: oppervlak (3D) of omtrek (2D). | ||||
| d: Measurs van segment 1 aan het segment 100 worden gebruikt voor analyse. | ||||
| e: Measurs van segment 15 aan het segment 85 worden gebruikt voor analyse. | ||||
Tabel 3: Kwantificering resultaten voor gesimuleerde objecten.
Aanvullende bestand 1. Proeven van bot. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie beschrijft een ImageJ plugin voor het analyseren van trabecular botten, oftewel automatic, efficiënt, en verbruiker vriendschappelijk. De plugin kan ook worden gebruikt te kwantificeren van elk 2D- of 3D-object voor laag-voor-laag maatregelen voor gebieden, volumes en diktes. Op dit moment wordt slechts één gemeten waarde voor elke trabecular parameter voor elk monster gerapporteerd via micro-CT standaardanalyse, die de kenmerken van de gemeten entiteit in de geselecteerde analyseren regio volledig kan niet vertegenwoordigen. De beschreven plugin rapporten laag-voor-laag hoeveelheden van elke parameter voor elk monster, die volledig de gegevens van de distributie van de gemeten parameter in het geselecteerde gebied analyseren, en dus meer geavanceerde en gevoelige statistische behoudt benaderingen zijn van toepassing voor het analyseren van deze gegevens.
Met de standaard, semi-automatische hand-contouring segmentatie methode aanzienlijke variatie tussen de verschillende segmenten van het hand-contouring werden waargenomen met exploitant bias8,9,10, die rechtvaardigen een meer uniform en automatische methode voor trabecular segmentatie. Het contrast is maximale tussen scannen achtergrond en de buitenste rand van het bot, wordt buitenrand geassisteerde trabecular segmentatie uitgevoerd door de plugin, waar de buitenste rand van het bot met nauwkeurigheid indien nodig automatisch kan worden gedetecteerd drempel, lawaai en gat-instellingen worden verstrekt. Ter vergemakkelijking van de bepaling van de parameters van de segmentatie, geprofileerd een scala van parameter combinaties zijn één voor één met behulp van een representatieve segment uit de regio analyseren, en de segmentering van de bevredigende resultaten visueel worden gecontroleerd. Trabecular botten worden vervolgens geanalyseerd met de geprofileerde parameters. Wanneer de segmentering van de juiste parameters zo zijn ingesteld, en de plugin met succes toegepast is om te analyseren trabecular beenderen van de distale dijbeen rat behandeld met verschillende bot anabolen5, worden reproduceerbare resultaten gerapporteerd voor dezelfde afbeelding zonder vooringenomenheid van de exploitant.
De plugin kan alleen verwerken momenteel één monster tegelijk. Als meerdere monsters in het beeld aanwezig zijn, zijn alle monsters gekwantificeerd als een enkel object zonder discriminatie. Daarom, voorbewerken is vereist als meerdere monsters tegelijk in een enkele monsterbuisje worden gescand. De kwantificering uitgangen zijn ruwe maatstaf voor pixel graven of grijswaarden, die handmatig met behulp van passende Kalibratie-informatie moeten worden gekalibreerd.
De meest kritische stap in dit protocol is het selecteren van passende parameters voor trabecular analyse. In het algemeen, groepen van bot monsters worden geanalyseerd met behulp van identieke segmentatie parameters de resultaten om vergelijkbaar te maken. In een dergelijk geval, moet zorg men zich ervan vergewissen dat segmentatie resultaten voor alle monsters visueel worden onderzocht op mogelijke fouten, voordat verdere analyses worden uitgevoerd.
Een belangrijke beperking van deze techniek is dat de instellingen van de vermindering van lawaai aan corticale botten alleen voor contouren van de buitenrand van een bot, maar niet op de uitgepakte trabecular botten worden toegepast. Als verschillende filteren strategieën gerapporteerde15 als optimale trabecular analysemateriaal onder verschillende omstandigheden zijn, is geen enkel één filter goed voor alle monsters van de image. Daarom is er geen ingebouwde filtratie stap vóór kwantificering van trabecular botten. Om compatibel te zijn met de output van software met ingebouwde afbeelding filteringen, kunnen uitgepakte trabecular botten verwerkte ook eerste met behulp van verschillende imaging tools, en vervolgens geïmporteerd in ImageJ en gekwantificeerd door de plugin later. Bovendien verschillende beeldformaten worden gegenereerd door verschillende micro-CT leveranciers, en de meeste van hen niet kan worden geïmporteerd of rechtstreeks door ImageJ geopend, dus gewenst zijn modules voor het importeren van verschillende beeldformaten in ImageJ voor verdere analyse. Een andere beperking is dat de 3D diktes in plakjes in de buurt van de uiteinden van het bereik van de selectie niet nauwkeurig zijn als onderdeel van de objecten zijn selectie buiten het bereik vallen, die ook geldt voor alle beschikbare 3D kwantificering pakketten, dus een groter bereik van segmenten moeten worden gekwantificeerd, en alleen het middelste gedeelte van de geselecteerde segmenten moet worden gebruikt voor verdere analyse. Een dergelijke aanpak kan alleen beschikbaar zijn wanneer gemeten hoeveelheden gerapporteerde laag-voor-laag, zijn zoals te zien in deze plugin, maar niet voor metingen dat slechts één waarde voor elke gekwantificeerde parameter in het bereik van de selectie wordt gerapporteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Een octrooi voor de onderliggende algoritme van de kwantificering van de dikte van het object is ingediend. De auteurs werkte samen met anderen de bomomics.com-website hosting van de gratis versie plugins, waar consulting en kwantificeren van de diensten van de beeldanalyse worden geleverd op aanvraag geregistreerd.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door grant NFSC 81170806. De auteurs bedank de faciliteit van de micro-CT kern van School voor stomatologie, Wuhan Universiteit voor het scannen en analyseren van de rat dijbeen helpen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ | NIH | imagej | Any version with a java 1.8 run time |
| trabecular analysis plugin | Bomomics | bomomics | free or commercial version |
| Micro CT scanner | Scanco | μ-50 | micro CT from any vendor |
| Computer System | Lenovo | any brand | |
| Windows Operating System | Microsoft | Windows 7 x64 | any 64-bit Windows operating system |
| Office Software | Microsoft | Office 2010 | any speadsheet software that has xy chart function |
References
- Ruegsegger, P., Koller, B., Muller, R. A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcif Tissue Int. 58 (1), 24-29 (1996).
- Muller, R., Ruegsegger, P. Micro-tomographic imaging for the nondestructive evaluation of trabecular bone architecture. Stud Health Technol Inform. 40, 61-79 (1997).
- Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Phys Med. 30 (6), 619-634 (2014).
- Bart, Z., Wallace, J. Microcomputed Tomography Applications in Bone and Mineral Research. Advances in Computed Tomography. 2, 121-127 (2013).
- Ji, Y., Ke, Y., Gao, S. Intermittent activation of notch signaling promotes bone formation. Am J Transl Res. 9 (6), 2933-2944 (2017).
- Jiang, Y., Zhao, J., White, D. L., Genant, H. K. Micro CT and Micro MR imaging of 3D architecture of animal skeleton. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (1), 45-51 (2000).
- Laib, A., et al. 3D micro-computed tomography of trabecular and cortical bone architecture with application to a rat model of immobilisation osteoporosis. Med Biol Eng Comput. 38 (3), 326-332 (2000).
- Cole, H. A., Ichikawa, J., Colvin, D. C., O'Rear, L., Schoenecker, J. G. Quantifying intra-osseous growth of osteosarcoma in a murine model with radiographic analysis. J Orthop Res. 29 (12), 1957-1962 (2011).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Med Imaging. 8, 16 (2008).
- Soviero, V. M., Leal, S. C., Silva, R. C., Azevedo, R. B. Validity of MicroCT for in vitro detection of proximal carious lesions in primary molars. J Dent. 40 (1), 35-40 (2012).
- Kohler, T., Stauber, M., Donahue, L. R., Muller, R. Automated compartmental analysis for high-throughput skeletal phenotyping in femora of genetic mouse models. Bone. 41 (4), 659-667 (2007).
- Buie, H. R., Campbell, G. M., Klinck, R. J., MacNeil, J. A., Boyd, S. K. Automatic segmentation of cortical and trabecular compartments based on a dual threshold technique for in vivo micro-CT bone analysis. Bone. 41 (4), 505-515 (2007).
- Dougherty, G. Quantitative CT in the measurement of bone quantity and bone quality for assessing osteoporosis. Med Eng Phys. 18 (7), 557-568 (1996).
- Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47 (6), 1076-1079 (2010).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
