Specifiche e rilevazione accurata del Using PCR convenzionale su campioni di tessuto foglia agrumi Citrus Greening patogeno Candidatus liberibacter spp.
Summary
Citrus Greening è una malattia particolarmente distruttiva che interessano colture di agrumi a livello globale. Presentato qui è un metodo semplice usando PCR ed estrazione del DNA genomico di tessuto fogliare agrumi per l’accurata e precisa identificazione dell’agente patogeno citrus greening, Candidatus liberibacter spp.
Abstract
Citrus greening, noto anche come huanglongbing, è una malattia distruttiva agrumi devastando agrumeti a livello globale. Questa malattia provoca asimmetrico foglia giallo chiazzatura, vena ingiallimento, defogliazione, decadimento di radice e in ultima analisi, la morte della pianta di agrumi. Quando infetta, le piante di agrumi hanno stentata crescita e producono fiori fuori stagione. Questi fiori frutti raramente, e quelli che producono agrumi piccoli, amaro, dalla forma irregolare che non sono desiderabili. Questa malattia è sparsa per l’Asian psyllid agrumi, Diaphorina citri e margotta di tessuto infetto di agrumi. L’agente patogeno ha un periodo di incubazione lungo e variabile all’interno della pianta di agrumi — a volte anni, prima che i sintomi compaiono. Tentativi di questo agente patogeno in vitro della coltura sono stati infruttuosi, possibilmente dovuto il livello basso e irregolare concentrazione dell’agente patogeno all’interno tessuto di agrumi contaminati, o perché è difficile da replicare l’ambientale condizioni favorevoli alla crescita di l’agente patogeno. È molto difficile individuare la malattia prima che si è diffuso, a causa del suo lungo periodo di incubazione e l’incapacità dei ricercatori alla cultura l’agente patogeno. Di conseguenza, la malattia diventa solo apparente dopo aver distrutto improvvisamente resa intera di un contadino di agrumi. Presentato qui è un metodo per la rilevazione accurata e specifica dell’agente patogeno citrus greening, Candidatus liberibacter spp utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico e PCR. Questo metodo è semplice, efficiente, conveniente e adattabile per l’analisi quantitativa. Questo metodo può essere adattato per l’uso su qualsiasi tessuto agrumi; Tuttavia, è potenzialmente limitato dalla quantità di agente patogeno presente nel tessuto. Tuttavia, questo metodo verrà consentire agli agricoltori di agrumi identificare le piante infette di agrumi all’inizio e frenare la diffusione di questa malattia distruttiva prima che possa diffondersi ulteriormente.
Introduction
Citrus greening, noto anche come huanglongbing, ha causato una perdita significativa di alberi di agrumi. Un caso rappresentativo è Florida, dove la malattia è prevista per causare una riduzione del 70% nella produzione di scatole di Florida arancione da scatole di 244 milioni nella stagione 1997-1998 a caselle 70 milioni a partire dal 2016-2017 stagione1. Oltre il 90% degli alberi di agrumi in Florida sono infetti2, e si stima che l’industria dell’agrume di Florida perde circa 1 miliardo di dollari ogni anno a causa di malattie degli agrumi, in cui citrus greening gioca un ruolo importante3. Citrus greening è trasmesso principalmente per la dilagante psyllid agrume asiatico Diaphorina citri, ma può essere trasmessa anche mediante innesto di tessuto infetto. La malattia provoca l’ingiallimento delle vene, foglia giallo asimmetrico chiazzatura, defogliazione precoce, avvizzimento progressivo ramoscello, decadimento di radice e morte della pianta. D’importanza, la malattia provoca la pianta di agrumi a produrre fiori fuori stagione, che raramente producono frutta. La frutta che è prodotta da piante di agrumi infetti è immaturi, verde e amaro degustazione4.
Lo scopo di questo metodo è quello con precisione e identificare con precisione il batterio mobile Candidatus liberibacter spp., l’agente causativo di citrus greening, vivono all’interno del floema di alberi di agrumi infetti5. Il DNA genomico è estratto dal tessuto foglia intera, che contiene i batteri vivi. Questo DNA genomico estratto viene utilizzato come un modello per PCR convenzionale, dove oligonucleotidi complementari alla sequenza del rDNA 16S del batterio sono utilizzati per amplificare questa sequenza. Oligonucleotidi complementari ad un gene FBOX agrumi sono utilizzati come un controllo di amplificazione interna. Abbiamo scelto di utilizzare questo metodo, perché essa ha dimostrato di avere successo nella precedente ricerca6.
Questo metodo ha il chiaro vantaggio di essere semplice, relativamente poco costoso e in grado di essere eseguita in qualsiasi laboratorio di biochimica normalmente attrezzata. Inoltre, PCR rimane il metodo più accurato e preciso per la rilevazione di questo agente patogeno, a causa della difficoltà di coltura di questo agente patogeno7e capacità del patogeno di sopravvivere e riprodursi per anni all’interno di un host asintomatico8. Molte specialità diverse analisi di PCR sono state usate per rilevare correttamente questo agente patogeno; Tuttavia, PCR convenzionale rimane il più semplice test per la rilevazione accurata e specifica, soprattutto all’interno di host asintomatico8.
Protocol
Representative Results
Discussion
È fondamentale che tutti i passaggi sono seguiti esattamente per ottenere le condizioni sperimentali ottimali. Tessuto di foglia intera è stato utilizzato durante questa dimostrazione; Tuttavia, il protocollo può essere modificato per includere teoricamente qualsiasi tipo di tessuto vegetale. In precedenza, i ricercatori hanno estratto il DNA genomico da tessuto fogliare della vena, piuttosto che del tessuto foglia intera e raggiunto simili risultati11. Se la fascia corrispondente al gene F…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Concettualizzazione, H.C. e Z. d. F.; Indagine, C. H., J. C e Z. d. F; Risorse, Z. F. d.; Scrittura – bozza originale, i. P. r.; Scrittura – recensione & Editing, i. P. r., J. C., C. H., S. L. T. e Z. d. F.; Visualizzazione, H. C.; Supervisione, Z. F. d.; Finanziamento acquisizione, Z. d. F e F. d. L.
Progetto sostenuto da un South Carolina migliorando insegnante qualità dell’istruzione superiore stato Grant intitolato, miglioramento medio gradi scienza insegnanti processi della conoscenza della pianta, strutture e funzioni attraverso impegno in Plant Sciences Research (pianta Science)
Fondi assegnati dal Regno Stati dipartimento dell’educazione (CFDA numero 84.367B)
Gli autori vorrei ringraziare Dr. Nian Wang dell’Università della Florida per la fornitura di campioni di DNA genomico da infettati Citrus sinensis Valencia.
Materials
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
References
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