ספציפית, איתור מדויק של spp. הפתוגן ירוק הדרים Candidatus liberibacter באמצעות PCR המקובלת על דגימות רקמה עלה הדרים
Summary
ירוק הדר היא מחלה הרסנית במיוחד להשפיע על גידולי הדרים באופן גלובלי. המוצג כאן שיטה פשוטה משתמש PCR, דנ א גנומי, הפקת רקמת העלה הדר לצורך זיהוי ומדויקים המחלה ירוק הדרים, Candidatus liberibacter spp.
Abstract
הדר ירוק, הידוע גם בשם huanglongbing, היא מחלה הדר הרסני ravaging החוות הדרים באופן גלובלי. מחלה זו גורמת עלה הצהובים סימטרית mottling וריד הצהבה, defoliation, שורש דעיכה, בסופו של דבר, למותו של הצמח הדרים. כאשר נגוע, הצמחים הדר יש קצב גדילתם ומפיקים פרחים מחוץ לעונה. הפרחים האלה נדירות מניבים פרי, ואלו המניבים פירות הדר קטן, מריר, חריגה זה לא רצוי. מחלה זו היא התפשטה את psyllid הדר אסיאתי, Diaphorina קמחית, ועל ידי משתילים רקמת הדר נגועים. המחלה יש תקופת הדגירה ארוכה ומשתנה בתוך המפעל הדרים – לפעמים שנים, לפני הופעת התסמינים. ניסיונות תרבות פתוגן זה במבחנה כבר נכשל, ייתכן שעקב הנמוך ואת ריכוז לא אחידה של המחלה בתוך נגוע רקמות הדרים, או כי קשה לשכפל את הסביבה תנאים להצטיינות הצמיחה של הפתוגן. . זה קשה מאוד לזהות את המחלה לפני שהיא התפשטה, בשל תקופת הדגירה ארוכה שלו ואת היכולת של חוקרי תרבות את הפתוגן. כתוצאה מכך, המחלה רק הופכת נראית לעין לאחר השמדת לפתע התשואה כולה של חקלאי הדרים. המובאת כאן היא שיטת איתור מדויק וספציפי הפתוגן ירוק הדרים, Candidatus liberibacter spp. באמצעות ערכת חילוץ דנ א גנומי PCR. שיטה זו היא פשוט, יעיל, חסכוני, ו וישימה אנליזה כמותית. בשיטה זו ניתן להתאים לשימוש על כל רקמות הדרים; עם זאת, זה פוטנציאל מוגבל לפי הסכום של פתוגן נוכח הרקמה. ובכל זאת, שיטה זו לאפשר חקלאים הדר לזהות צמחים נגועים הדר קודם לכן, לבלום את התפשטות המחלה ההרסנית הזאת לפני זה יכול להתפשט עוד יותר.
Introduction
הדר ירוק, הידוע גם בשם huanglongbing, גרמה לאובדן משמעותי של עצי הדר. במקרה זה פלורידה, שבו המחלה היא תחזית כדי לגרום 70% לירידה בייצור של פלורידה כתום תיבות של 244 מיליון תיבות עונת 1997-1998 70 מיליון תיבות עד 2016-2017 עונה1 מעל 90% של עצי הדר בפלורידה הם נגועים2, ההערכה היא כי תעשיית הדר פלורידה מאבד כמיליארד דולר בשנה עקב מחלות הדרים, שבו הדר ירוק ממלא תפקיד מרכזי3. ירוק הדר מופצת בעיקר על ידי פולשני psyllid אסיה הדרים Diaphorina קמחית, אבל גם יכול להיות להתפשט על-ידי הארכת רקמות הנגוע. המחלה גורמת הצהבה של ורידים, עלה הצהובים סימטרית mottling, defoliation מוקדמת, dieback זרד, שורש, ומוות של הצמח. חשוב לציין, המחלה גורמת תחנת הדר כדי לייצר פרחים מחוץ לעונה, אשר לעתים נדירות מייצרים פירות. הפרי המיוצר על ידי צמחים נגועים הדר הן ילדותי, ירוק ומריר טעימות4.
מטרת שיטה זו היא מדויקת ואת לזהות במדויק את החיידק תאי Candidatus liberibacter spp., סוכן סיבתי של ירוק הדרים, שחיו במרחק שיפה של עצי הדר נגוע5. דנ א גנומי מופק מרקמות העלה כולו, אשר מכיל חיידקים חיים. את הדנ א הגנומי שחולצו משמש כתבנית עבור PCR קונבנציונאלי, איפה oligonucleotides משלימים לרצף rDNA מטוסי אף-16 של החיידק משמשים כדי להגביר את הרצף הזה. Oligonucleotides משלים FBOX גן הדרים משמשים פקד הגברה פנימית. בחרנו להשתמש בשיטה זו, כי הוכח כדי להיות מוצלחת מחקר קודמות6.
בשיטה זו יש יתרון ברור של להיות פשוטה, זולה יחסית, ומסוגל לבצע במעבדה ביוכימיה בדרך כלל מאובזר בכל. בנוסף, ה-PCR נשאר שיטת ומדויקים מדויק ביותר עבור זיהוי הפתוגן הזה, בשל הקושי culturing הזאת הפתוגן7, ואת היכולת של המחלה לשרוד להתרבות במשך שנים בתוך המארח אסימפטומטיים8. מבחני ה-PCR מיוחדים שונים רבים השתמשו בהצלחה לזהות את הפתוגן; עם זאת, PCR קונבנציונאלי נשאר וזמינותו הפשוטה ביותר לצורך זיהוי מדויק וספציפי, במיוחד בתוך מארחים ללא תסמינים8.
Protocol
Representative Results
Discussion
. זה קריטי כי כל השלבים עוקבים בדיוק כדי להשיג את התנאים האופטימליים ניסיוני רקמת כל העלה שימש במהלך הפגנה זו; עם זאת, ניתן לשנות בפרוטוקול תיאורטית לכלול כל סוג של רקמת הצמח. בעבר, חוקרים מופק דנ א גנומי רקמת הווריד של העלה, יותר מאשר רקמת העלה כולו, השיגו תוצאות דומות11. אם הלהקה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
וימשיג, ע מ ו צ ש פ; החקירה, ח ג, ג’ C ו- F ש צ; משאבים, צ ש פ; כתיבת – הטיוטה המקורית, א פ א; כתיבה – סקירה & עריכה, פ א א, י ג, ה ג, S. T ל’ ו צ ש פ; ויזואליזציה, ה ג; פיקוח, צ ש פ; מימון הרכישה, צ ש F ול’ ש פ
פרוייקט הנתמך על ידי דרום קרוליינה שיפור המורה איכות ההשכלה הגבוהה המדינה מענק שכותרתו שיפור האמצעי ציונים מורים למדע של הידע של הצמח תהליכים, מבנים, פונקציות באמצעות מעורבות במחקר מדעי הצמח (צמח מדע)
קרנות הוענק על ידי יונייטד משביעה את משרד החינוך (CFDA מספר 84.367B)
המחברים רוצה להודות ד ר וואנג Nian באוניברסיטת פלורידה למתן דגימות דנ א גנומי מן נגוע סיננסיס הדר ולנסיה.
Materials
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
References
- Field Office, F. l. o. r. i. d. a. . Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).
- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. . The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).
- UICEP. . Pathology. , (2013).
- Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
- Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
- Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
- Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. . Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
- Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
- Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
- Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).
