Summary

ספציפית, איתור מדויק של spp. הפתוגן ירוק הדרים Candidatus liberibacter באמצעות PCR המקובלת על דגימות רקמה עלה הדרים

Published: June 29, 2018
doi:

Summary

ירוק הדר היא מחלה הרסנית במיוחד להשפיע על גידולי הדרים באופן גלובלי. המוצג כאן שיטה פשוטה משתמש PCR, דנ א גנומי, הפקת רקמת העלה הדר לצורך זיהוי ומדויקים המחלה ירוק הדרים, Candidatus liberibacter spp.

Abstract

הדר ירוק, הידוע גם בשם huanglongbing, היא מחלה הדר הרסני ravaging החוות הדרים באופן גלובלי. מחלה זו גורמת עלה הצהובים סימטרית mottling וריד הצהבה, defoliation, שורש דעיכה, בסופו של דבר, למותו של הצמח הדרים. כאשר נגוע, הצמחים הדר יש קצב גדילתם ומפיקים פרחים מחוץ לעונה. הפרחים האלה נדירות מניבים פרי, ואלו המניבים פירות הדר קטן, מריר, חריגה זה לא רצוי. מחלה זו היא התפשטה את psyllid הדר אסיאתי, Diaphorina קמחית, ועל ידי משתילים רקמת הדר נגועים. המחלה יש תקופת הדגירה ארוכה ומשתנה בתוך המפעל הדרים – לפעמים שנים, לפני הופעת התסמינים. ניסיונות תרבות פתוגן זה במבחנה כבר נכשל, ייתכן שעקב הנמוך ואת ריכוז לא אחידה של המחלה בתוך נגוע רקמות הדרים, או כי קשה לשכפל את הסביבה תנאים להצטיינות הצמיחה של הפתוגן. . זה קשה מאוד לזהות את המחלה לפני שהיא התפשטה, בשל תקופת הדגירה ארוכה שלו ואת היכולת של חוקרי תרבות את הפתוגן. כתוצאה מכך, המחלה רק הופכת נראית לעין לאחר השמדת לפתע התשואה כולה של חקלאי הדרים. המובאת כאן היא שיטת איתור מדויק וספציפי הפתוגן ירוק הדרים, Candidatus liberibacter spp. באמצעות ערכת חילוץ דנ א גנומי PCR. שיטה זו היא פשוט, יעיל, חסכוני, ו וישימה אנליזה כמותית. בשיטה זו ניתן להתאים לשימוש על כל רקמות הדרים; עם זאת, זה פוטנציאל מוגבל לפי הסכום של פתוגן נוכח הרקמה. ובכל זאת, שיטה זו לאפשר חקלאים הדר לזהות צמחים נגועים הדר קודם לכן, לבלום את התפשטות המחלה ההרסנית הזאת לפני זה יכול להתפשט עוד יותר.

Introduction

הדר ירוק, הידוע גם בשם huanglongbing, גרמה לאובדן משמעותי של עצי הדר. במקרה זה פלורידה, שבו המחלה היא תחזית כדי לגרום 70% לירידה בייצור של פלורידה כתום תיבות של 244 מיליון תיבות עונת 1997-1998 70 מיליון תיבות עד 2016-2017 עונה1 מעל 90% של עצי הדר בפלורידה הם נגועים2, ההערכה היא כי תעשיית הדר פלורידה מאבד כמיליארד דולר בשנה עקב מחלות הדרים, שבו הדר ירוק ממלא תפקיד מרכזי3. ירוק הדר מופצת בעיקר על ידי פולשני psyllid אסיה הדרים Diaphorina קמחית, אבל גם יכול להיות להתפשט על-ידי הארכת רקמות הנגוע. המחלה גורמת הצהבה של ורידים, עלה הצהובים סימטרית mottling, defoliation מוקדמת, dieback זרד, שורש, ומוות של הצמח. חשוב לציין, המחלה גורמת תחנת הדר כדי לייצר פרחים מחוץ לעונה, אשר לעתים נדירות מייצרים פירות. הפרי המיוצר על ידי צמחים נגועים הדר הן ילדותי, ירוק ומריר טעימות4.

מטרת שיטה זו היא מדויקת ואת לזהות במדויק את החיידק תאי Candidatus liberibacter spp., סוכן סיבתי של ירוק הדרים, שחיו במרחק שיפה של עצי הדר נגוע5. דנ א גנומי מופק מרקמות העלה כולו, אשר מכיל חיידקים חיים. את הדנ א הגנומי שחולצו משמש כתבנית עבור PCR קונבנציונאלי, איפה oligonucleotides משלימים לרצף rDNA מטוסי אף-16 של החיידק משמשים כדי להגביר את הרצף הזה. Oligonucleotides משלים FBOX גן הדרים משמשים פקד הגברה פנימית. בחרנו להשתמש בשיטה זו, כי הוכח כדי להיות מוצלחת מחקר קודמות6.

בשיטה זו יש יתרון ברור של להיות פשוטה, זולה יחסית, ומסוגל לבצע במעבדה ביוכימיה בדרך כלל מאובזר בכל. בנוסף, ה-PCR נשאר שיטת ומדויקים מדויק ביותר עבור זיהוי הפתוגן הזה, בשל הקושי culturing הזאת הפתוגן7, ואת היכולת של המחלה לשרוד להתרבות במשך שנים בתוך המארח אסימפטומטיים8. מבחני ה-PCR מיוחדים שונים רבים השתמשו בהצלחה לזהות את הפתוגן; עם זאת, PCR קונבנציונאלי נשאר וזמינותו הפשוטה ביותר לצורך זיהוי מדויק וספציפי, במיוחד בתוך מארחים ללא תסמינים8.

Protocol

1. לבודד דנ א גנומי מרקמות הצמח באמצעות ערכת חילוץ גנומית להשיג את רקמת העלה הדר על ידי חיתוך רענן כל העלים מעץ הדרים באמצעות מספריים נקי, ולמקם העלה לשקית פלסטיק נקי אוכל.הערה: התיק המכיל את רקמת העלה יוצבו במקרר 4 ° C או על קרח במיכל מבודד בהקדם האפשרי לאחר אוסף כדי למנוע קלקול. ?…

Representative Results

תוצאה חיובית התשואות להקה ברורים המתאימים 500 bp טיריה Liberibacter Candidatus Las606/Lss6, ו/או להקה ברורים המתאימים ל- 700 bp Laa2/Laj5, מוסף בβ ribosomal מטוסי אף-16 אופרון9. הלהקה בקרת הגברה פנימית להופיע גם 400 bp. הלהקה הזאת מקביל הגברה של ג’ין FBOX הדר<su…

Discussion

. זה קריטי כי כל השלבים עוקבים בדיוק כדי להשיג את התנאים האופטימליים ניסיוני רקמת כל העלה שימש במהלך הפגנה זו; עם זאת, ניתן לשנות בפרוטוקול תיאורטית לכלול כל סוג של רקמת הצמח. בעבר, חוקרים מופק דנ א גנומי רקמת הווריד של העלה, יותר מאשר רקמת העלה כולו, השיגו תוצאות דומות11. אם הלהקה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

וימשיג, ע מ ו צ ש פ; החקירה, ח ג, ג’ C ו- F ש צ; משאבים, צ ש פ; כתיבת – הטיוטה המקורית, א פ א; כתיבה – סקירה & עריכה, פ א א, י ג, ה ג, S. T ל’ ו צ ש פ; ויזואליזציה, ה ג; פיקוח, צ ש פ; מימון הרכישה, צ ש F ול’ ש פ

פרוייקט הנתמך על ידי דרום קרוליינה שיפור המורה איכות ההשכלה הגבוהה המדינה מענק שכותרתו שיפור האמצעי ציונים מורים למדע של הידע של הצמח תהליכים, מבנים, פונקציות באמצעות מעורבות במחקר מדעי הצמח (צמח מדע)

קרנות הוענק על ידי יונייטד משביעה את משרד החינוך (CFDA מספר 84.367B)

המחברים רוצה להודות ד ר וואנג Nian באוניברסיטת פלורידה למתן דגימות דנ א גנומי מן נגוע סיננסיס הדר ולנסיה.

Materials

Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120 Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions
Liquid nitrogen Air Products N/A
Mastercycler pro with control panel Eppendorf 6321000019
1250 W Microwave Panasonic N/A
5424 table top centrifuge Eppendorf 05-403-93
Isotemp 215 digital water bath Fisher scientific 15-462-15Q
Metal spatula Sigma-Aldrich Z283274
Mortar and pestle Sigma-Aldrich Z247464
LSE Vortex Mixer Corning 6775
2-propanol Sigma-Aldrich I9516
Sterile 10 μL tips TipOne 1161-3730
Sterile 200 μL tips TipOne 1163-1730
Sterile 1250 μL tips TipOne 1161-1750
Variable Volume Pipettor Kit VWR 75788-460
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510
Agarose IBI Scientific IB70041
EDTA Thermo Fisher Scientific 17892
Acetic acid Fisher Chemical A38-212
Tris base Sigma-Aldrich 10708976001
μcuvette Eppendorf 6138000018
Stackable casting tray and combs Carolina 213655
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1645050
Mini-Sub Cell GT System Bio-Rad 1704487EDU
Biospectrometer basic Eppendorf 6135000009
0.2 mL PCR tubes Fisher scientific AB-0620
1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fisher Scientific 3439
2X Taq Green PCR Master Mix Promega M7122
Forward Primer Thermo Fisher Scientific N/A
Reverse Primer Thermo Fisher Scientific N/A
Water, PCR grade Sigma-Aldrich 3315953001
Gel Doc XR+ Bio-Rad 1708195
1 KB+ DNA ladder Thermo Fisher Scientific 10787018

References

  1. Field Office, F. l. o. r. i. d. a. . Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).
  2. Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).
  3. Spreen, T. H., Hodges, A. . The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).
  4. UICEP. . Pathology. , (2013).
  5. Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
  6. Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
  7. Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
  8. Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. . Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
  9. Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
  10. Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
  11. Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).

Play Video

Cite This Article
Chen, H., Palmer, I. A., Chen, J., Chang, M., Thompson, S. L., Liu, F., Fu, Z. Q. Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples. J. Vis. Exp. (136), e57240, doi:10.3791/57240 (2018).

View Video