Summary
Se describe un método para investigar la capacidad de células de la planta de cultivo de punta, incluyendo tubos de polen, pelos de la raíz y musgo protonemata, para alargar a través de espacios estrechos (~ 1 μm) en un dispositivo de microfluidos.
Abstract
In vivo, células de la planta creciendo de punta necesitan superar una serie de barreras físicas; sin embargo, los investigadores carecen de la metodología para visualizar el comportamiento celular en esas condiciones restrictivas. Para solucionar este problema, hemos desarrollado cámaras de crecimiento de la punta de crecimiento de células de vegetales que contienen una serie de brechas estrechas, fabricado de micro (~ 1 μm) en un sustrato de poly-dimethylsiloxane (PDMS). Este material transparente permite al usuario monitorizar procesos de alargamiento de punta en celdas individuales durante la penetración de microespacios por proyección de imagen de Time-lapse. Usando esta plataforma experimental, observamos cambios morfológicos en los tubos de polen como penetraron los microespacios. Capturamos los cambios dinámicos en la forma de un núcleo vegetativo fluorescencia etiquetada y espermatozoides en un tubo de polen durante este proceso. Además, hemos demostrado la capacidad de pelos radicales y musgo protonemata para penetrar el espacio μm 1. Esta plataforma en vitro puede utilizarse para estudiar cómo individuales las células responden a espacios físicamente limitados y puede proporcionar penetraciones en los mecanismos de crecimiento de la punta.
Introduction
Después de los granos de polen germinan en un estigma, cada grano produce un solo tubo de polen que transporta espermatozoides el óvulo y la célula central en el óvulo para la fertilización doble. Tubos de polen alargado a través del estilo y eventualmente alcanzar el óvulo detectando múltiples señales de orientación a lo largo de la manera1. Durante la elongación, tubos de polen se encuentran una serie de barreras físicas; la pista que está llena de células y tubos de polen debe entrar en el minuto abertura micropilar del óvulo para llegar a su destino (figura 1A)2. Por lo tanto, tubos de polen deben tener la capacidad de penetrar obstáculos físicos, mientras se tolera el esfuerzo de compresión de su entorno. Pelos de la raíz son otro tipo de célula vegetal crece en punta que debe soportar obstáculos físicos en el ambiente, en forma de partículas de suelo compacto (figura 1B).
Se han estudiado diversas propiedades mecánicas del tubo polínico, incluyendo presión de turgencia y rigidez de la región apical de la célula, que puede ser medida usando el método de plasmólisis incipiente3,4 y microscopía de fuerza celular (CFM) 5 , 6, respectivamente. Sin embargo, estos métodos solos no revelan si los tubos de polen son capaces de alargar a través de barreras físicas a lo largo de sus trayectorias de crecimiento. Una técnica alternativa que permite el alargamiento del tubo polínico ser monitoreado en vivo es de microscopia de dos fotones7. Sin embargo, con este método, es difícil de observar los cambios morfológicos en los tubos de polen dentro del tejido del óvulo. Además, crecimiento de pelos en el suelo puede ser visualizado usando el tomography de la radiografía computada (CT) y resonancia magnética (MRI)8, aunque con baja resolución. Aquí, presentamos un método que puede utilizarse para adquirir imágenes de alta resolución del proceso de deformación de las células en un microscopio convencional.
El objetivo general del método descrito aquí es visualizar la capacidad de elongación de células de la planta de cultivo de punta, incluyendo tubos de polen, pelos de la raíz, y musgo protonemata, en espacios muy pequeños. Los microdispositivos de poly-dimethylsiloxane (PDMS) presentadas en este manuscrito son ópticamente transparentes y de aire permeable, podemos cultura células vivas dentro del aparato y observar sus comportamientos de crecimiento bajo un microscopio. También es posible crear micro ~ espacios de escala nanométrica por la técnica de litografía blanda9 con el uso de moldes. Estas características nos permiten estudiar la capacidad de elongación de la punta de crecimiento de las células vegetales en un entorno físicamente confinado.
En este trabajo, había construido 1 μm ancho vacíos (a 4 μm de altura) en dispositivos microfluídicos y examinó la capacidad de los tubos de polen para penetrar estos obstáculos artificiales que son mucho más pequeños que el diámetro del tubo polínico cilíndrico (aproximadamente 8 μm). Esta plataforma experimental nos permite visualizar ante del tubo polen microgaps y capturar imágenes de lapso de tiempo de la respuesta, que proceso de deformación de la célula. También desarrollamos los microdispositivos que pueden utilizarse para investigar la capacidad de penetración de pelos radicales y musgo protonemata. Microdispositivos varios se han divulgado hasta la fecha que permiten la visualización de las plantas raíz10,11,12,13 y musgo protonemata14 en alta resolución. En nuestro dispositivo, una serie de canales de crecimiento del pelo de la raíz perpendicular está conectado a una cámara de crecimiento de la raíz, y los pelos de la raíz (aproximadamente 7 μm de diámetro) son guiados a canales fluídicos con una brecha amplia de 1 μm. También cultiva musgo protonemata (aproximadamente 20 μm de diámetro) en una microdevice que contiene microgaps para examinar sus respuestas a estas barreras físicas. El enfoque propuesto de microfluidos nos permite explorar la capacidad de varias células de plantas de cultivo de punta de alargar por espacios extremadamente pequeños, que no pueden ser examinadas por cualquier otro método disponible actualmente.
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Protocol
1. fabricación de la Microdevice PDMS para examinar el crecimiento tubos de polen y musgo Protonemata
Nota: Se utilizó un instrumento Fotolitografía maskless para preparar moldes PDMS en obleas de silicio. Los detalles sobre el funcionamiento del sistema se omiten en este manuscrito. Una técnica de fotolitografía estándar9 usando un photomask puede usarse para crear los moldes PDMS se describe en este manuscrito.
- Vierta 11 g de mezcla de los polímero PDMS (elastómero base: curado agente a una relación de 10:1) en cada molde de 4 pulgadas.
- Desgasificar el molde preparado en el paso 1.1 durante 20 minutos en una cámara de vacío.
- Después de curar a 65 ° C durante 90 minutos en un horno, pelar la capa PDMS del molde y perforar los orificios de acceso en los canales fluídicos utilizando punzones de biopsia.
Nota: Para el dispositivo del tubo polínico, el tamaño del agujero debe ajustarse para reflejar el diámetro del pistilo. Este valor por lo tanto variará según las especies. En este experimento, perfora un agujero de 1 mm para las entradas de pistilo y orificios de 1,5 mm para los embalses de medio líquidos. Para el dispositivo de musgo protonemata, un agujero de 4 mm fue utilizado para el depósito de la muestra. - Exponer la capa PDMS y un plato de fondo de vidrio (3.5-5 cm de diámetro) para plasma de 50 de aire s.
- Presione la capa PDMS en el plato de fondo de cristal y el calor a 65 ° C por 30 min en un horno de convección no sellar completamente desconectado de la red de microfluidos.
2. fabricación de la Microdevice PDMS para pelos radicales
- Repita los pasos 1.1-1.3 usando los moldes para preparar dos capas PDMS para la raíz y microdispositivos de pelo de la raíz.
Nota: Se utilizaron un agujero de 2 mm para los embalses de medio líquidos en el microdevice de raíz. - Exponer ambas capas PDMS para plasma de 50 de aire s.
- Montar las dos capas PDMS bajo un estereomicroscopio con un alineador de escritorio a medida.
Nota: Los microcanales en estas capas PDMS tienen cara. Antes de ensamblar, asegúrese de que coinciden las marcas de alineación en ambas capas. - Calentar a 65 ° C por 30 min en un horno de convección no sellar completamente desconectado de la red de microfluidos.
- Quite el cubreobjetos la microdevice construida y coloque el dispositivo sobre un plato de fondo de cristal que es de 5 cm de diámetro.
3. preparación de medio de cultivo celular In Vitro para los tubos de polen (Torenia fournieri)
- Preparar medio de Nitsch modificada como se describe anteriormente15 y autoclave el medio a 121 ° C por 20 min.
Nota: La composición del medio de Nitsch de modificado es NH4NO3 (80 mg/L), KNO3 (125 mg/L), Ca (NO3)2‧4H2O (500 mg/L), MgSO4‧7H2O (125 mg/L), KH2PO4 (125 mg/L ), MnSO4‧4H2O (3 mg/L), ZnSO4‧7H2O (0, 5 mg/L), H3BO3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0.025 mg/L), Na2MoO4‧2H2O (0.025 mg/L), sacarosa (50.000 mg/L) y caseína (500 mg/L). El medio preparado puede almacenarse a 4 ° C por 4 meses por lo menos. - Preparar polietilenglicol 26% (w/v) usando autoclave agua desionizada y filtrar la solución con un filtro de poro 0.3 μm.
Nota: El medio preparado puede almacenarse a 4 ° C durante 1 mes. - Mezclar los reactivos preparados en el paso 3.1 y 3.2 en una proporción de 1:1 (v/v).
Nota: Este medio debe ser preparado fresco para cada uso.
4. preparación de medio de cultivo celular In Vitro para pelos radicales (Arabidopsis thaliana)
- Preparar una solución de 0,215% (w/v) Murashige & Skoog medio, 0.05% (w/v) MES, 1% (p/v) de sacarosa y 1% (p/v) de agar en agua desionizada. Autoclave de la solución a 121 ° C por 20 min.
5. preparación de medio de cultivo In Vitro de células de musgo Protonemata (Physcomitrella patens)
- Incubar previamente la protonemata musgo en medio BCDAT16 en una placa Petri.
Nota: La composición del medio BCDAT es 1 mM MgSO4, 10 mM KNO3, 45 μm FeSO4, 1,8 mM KH2PO4 (pH a 6.5 con KOH), solución de elementos traza (0,22 μm CuSO4, 0.19 μm ZnSO4y 10 μm H3BO 3, 0.1 μm Na2MoO4, 2 μm MnCl2, 0.23 μm CoCl2y 0,17 μm KI), 1 mM CaCl2y 5 mM diamónico (+)-tartrato. - El musgo en el medio BCDATG en el microdevice de la cultura.
Nota: El medio BCDATG es medio BCDAT con glucosa 0,5% (p/v). El medio preparado puede almacenarse a 4 ° C durante 1 mes.
6. cultivo in Vitro de T. fournieri tubos de polen en el Microdevice
- Colocar el tubo polínico microdevice en una cámara de vacío y desgasificación durante 20 minutos.
- Retire el microdevice de la cámara de vacío e introducir el medio de crecimiento a la entrada de pistilo mediante una micropipeta con punta muy fina. Llenar los pozos restantes a sus tapas con el mismo medio. Espere unos minutos hasta que los microcanales se llenan con el medio por el vacío creado dentro de los microcanales.
- Colocar algunas toallas de papel mojado en el plato de fondo de cristal para mantener la humedad en el plato.
- Transferencia de los granos de polen de un tipo salvaje T. fournieri flor 'azul y blanca' a su estigma utilizando una aguja de disección.
Nota: También se realizó este experimento con un transgénico T. fournieri 'Corona violeta' flor ( RPS5Ap::H2B-tdTomato línea17), con tubos de polen que contienen fluorescencia etiquetadas espermatozoides y los núcleos vegetativos. - Corte el estilo polinización (1 cm de largo) usando una cuchilla.
- Introduzca el estilo de corte en la entrada del dispositivo como se muestra en la figura 2.
- Ponga una tapa en el plato y séllelo con cinta.
- Coloque el dispositivo en una incubadora a 28 ° C durante 5-6 h en la oscuridad.
7. cultivo in Vitro de a. thaliana pelos de la raíz en el Microdevice
Nota: Los pasos 7.1 7.9 (a excepción de 7.3 y 7.5) deben realizarse en una campana de flujo laminar.
- Esterilizar las semillas de a. thaliana Columbia (Col-0) y los transgénicos línea UBQ10pro::H2B-mClover (contiene el marcador nuclear fluorescente) por inmersión en líquido estéril (cloro 5% (v/v) y 0,02% (v/v) Triton X-100) durante 5 minutos.
- Enjuague bien las semillas esterilizadas con agua esterilizada.
- Almacenar las semillas enjuagadas en agua durante 2 días a 4 ° C en oscuridad.
- Esterilizar microdevice bajo luz UV durante la noche.
- Colocar el microdevice en una cámara de vacío y desgasificación durante 20 minutos.
- Introducir el medio de crecimiento para los pozos en el dispositivo utilizando una micropipeta. Espere unos minutos hasta que el vacío llena todos los microcanales con el medio.
- Coloque toalla de papel húmeda esterilizado en el plato de fondo de cristal para mantener la humedad en el plato.
- Transferencia de una semilla esterilizada en la entrada del dispositivo.
- Ponga una tapa en el plato y séllelo con cinta.
- Coloque el dispositivo en posición vertical en una incubadora a 22 ° C bajo luz blanca continua.
- Controlar el crecimiento del cabello de la raíz después de 4 a 10 días de incubación. Obtener campo brillante y fluorescentes imágenes usando un microscopio invertido.
8. cultivo in Vitro de p. patens (moss) Protonemata en el dispositivo de microfluidos
Nota: Medidas 8.2-8.6 (excepto 8.3) deben realizarse en una campana de flujo laminar.
- Preculture p. patens cepa Gransden 200418 en medio BCDAT cubierta con celofán en caja Petri durante una semana bajo luz blanca continua a 25 ° C.
- Esterilizar microdevice bajo luz UV durante la noche en una campana de flujo laminar.
- Colocar el microdevice en una cámara de vacío y desgasificación durante 20 minutos.
- Introducir el medio de crecimiento en los pozos utilizando una micropipeta. Espere unos minutos hasta que el vacío llena todos los microcanales con el medio.
- Agregue el agua esterilizada en el plato alrededor de la microdevice para mantener la humedad en el plato.
- Transferencia de una pequeña pieza de musgo protonemata tejido a la entrada de la microdevice y el tejido en una incubadora a 25 ° C bajo luz blanca continua de la cultura.
- Controlar el crecimiento de musgo protonemata después de 2-3 semanas de incubación. Obtener imágenes de campo claro utilizando un microscopio.
9. proyección de imagen de Time-lapse del crecimiento del tubo polínico de T. fournieri
- Coloque el microdevice en un microscopio de fluorescencia invertido equipado con hardware de adquisición de imagen (por ej., una cámara CCD) y el software. Encontrar los lugares de microespacios.
Nota: Para el software de adquisición de imagen, hemos utilizado un producto comercialmente disponible (Tabla de materiales). Software libre de la microscopia como µManager también está disponible en línea (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Recomendamos instalar un condensador del microscopio en el microscopio para obtener imágenes de mayor resolución. - Capturar imágenes de campo claro cada 10 s con software de adquisición de imágenes de microscopio.
- Para observar la fluorescencia etiquetadas espermatozoides y núcleo vegetativo en el tubo de polen de la línea RPS5Ap::H2B-tdTomato , irradiar la muestra con 561 nm láser y utilizar un filtro óptico de paso de banda (578/105 nm).
Nota: Aunque con frecuencia se capturaron las imágenes de Time-lapse del crecimiento del tubo polínico, la proyección de imagen no parece afectar el crecimiento. Sin embargo, es siempre aconsejable para reducir al mínimo la intensidad del láser, el tiempo de exposición y el intervalo de Time-lapse, para minimizar la fototoxicidad y fotoblanqueo de fluoróforo. - Ajustar el brillo y el contraste de las imágenes y preparar un archivo de vídeo utilizando el software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
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Representative Results
Como se ilustra en la figura 1, las células vegetales creciendo de punta encuentran una serie de barreras físicas a lo largo de sus trayectorias de crecimiento in vivo. Microfluídicos en vitro de la célula cultura plataformas presentadas en este estudio permitió la examinación el cultivo de punta de procesos en tres tipos de células de la planta (tubos de polen, pelos de la raíz y musgo protonemata) a través de las lagunas artificiales de 1 μm (figura 3, Figura 4, figura 5). Para el estudio del tubo polínico, proyección de imagen de células vivas fue utilizada para supervisar cambios morfológicos en la región apical de los tubos de polen así como el núcleo vegetativo y células de la esperma en respuesta a encontrar un espacio extremadamente pequeño (suplementario Movie 1 y 2).
Aunque la mayoría de los microgaps correctamente fueron fabricada empleando el método descrito aquí, notamos que algunos de ellos eran totalmente cerrado (figura 6). Porque los canales ancho 1 μm en el molde de silicona son frágiles, uso repetido de este molde puede dañar las brechas, llevando a bloqueo de la capa PDMS de gap. Por lo tanto, antes de realizar el experimento, es importante comprobar que el PDMS microgaps están intactas.
Figura 1: penetración de la punta de crecimiento las células de la planta en espacios físicamente limitados. (A) tubo de polen alarga a través de varias barreras físicas en su manera a un óvulo. Las barreras incluyen transmisión de tejido de la zona en el estilo y los tegumentos que rodean el micrópilo. (B) pelos de la raíz penetrando a través de suelo denso. Inserciones en (A) y (B) Mostrar ampliaciones de las regiones en caja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Características de los microdispositivos estudio T. fournieri tubos de polen, pelos de la raíz de a. thaliana y p. patens protonemata. De los dibujos esquemáticos de microcanales, se coloca una muestra en el lugar indicado por una marca de asterisco (*). Diseños de Microchannel, fotografías de cada dispositivo, estructuras canal y períodos de cultivo celular se resumen. Esta figura se ha modificado con permiso de Yanagisawa et al. 201719. Escala de la barra, 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Elongación de tubo polínico T. fournieri a través de un boquete de 1 μm. (A) tubo de polen pasando a través de un 1 μm μm ancho y 4 alto. Las imágenes de campo claro lapso de tiempo fueron capturadas utilizando un microscopio invertido, dotado de un sistema confocal de disco giratorio. Barra de escala, 20 μm. (B) tiempo lapso imágenes de fluorescencia etiquetado núcleo vegetativo y espermatozoides en un tubo de polen de RPS5Ap::H2B-tdTomato línea cruzando los microespacios. Barra de escala, 20 μm. figura (A) y (B) se han modificado con permiso de Yanagisawa et al. 201719. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. A. thaliana alargamiento de cabello de raíz a través de una brecha de μm 1. (A) crecimiento de la raíz y el pelo de raíz en el microdevice. Microgaps (1 μm de ancho) y 4 en altura se encuentran en el lado izquierdo del canal de crecimiento de la raíz. Los microcanales en el lado derecho no contienen microgaps y pueden ser utilizados como un control. Barra de escala, 100 μm. (B) de campo claro, fluorescencia (C) y (D) combinan imágenes de pelos radicales, pasando por el microgaps. Los núcleos de pelos radicales fluorescencia están marcados en la línea UBQ10pro::H2B-mClover . La punta de cada pelo de la raíz se indica con una flecha. Barra de escala, 30 μm. Estas cifras se han modificado con permiso de Yanagisawa et al. 201719. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Alargamiento de p. patens protonemata a través de una brecha de μm 1. Células de protonemata cruzando a través de un boquete de 1 μm (4 μm de altura), que se amplió debido a la presión de turgencia de la protonemata de musgo. Barra de escala, 20 μm. La figura se ha modificado con permiso de Yanagisawa et al. 201719. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Cerrado microgaps. Imagen de SEM de la región de boquete 1 μm. Los microespacios de la derecha está completamente cerrada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película complementaria 1. Crecimiento del tubo polínico a través de una brecha μm 1. Imágenes de Time-lapse campo brillante fueron capturados cada 10 s, utilizando un microscopio invertido equipado con un microscopio confocal de disco giratorio. Escala de la barra, 20 μm. haga clic aquí para descargar este archivo.
Película complementario 2. Penetración del núcleo vegetativo y células de la esperma a través de una brecha μm 1. Time-lapse imágenes brillantes del campo y de la fluorescencia fueron capturadas cada 20 s usando un microscopio de fluorescencia invertido. Escala de la barra, 20 μm. haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Varios pasos críticos en el protocolo deben seguirse exactamente para obtener los resultados presentados arriba. En primer lugar, el PDMS vidrio y capa inferior plato las superficies deben ambos ser tratadas con plasma una suficiente cantidad de tiempo antes de la adhesión. De lo contrario, la capa PDMS localmente puede separarlo de la superficie de cristal mientras que la punta de crecimiento de las células atraviesan el microgaps. Otro paso crucial en el protocolo de pelos y musgo protonemata es la esterilización de lo microdevice. Normalmente, pelos de la raíz y musgo protonemata células necesitan ser cultivadas en el microdevice para un par de semanas. Sin el dispositivo de esterilización, microorganismos pueden florecer, que podría afectar el crecimiento de estas células de cultivo de punta. Esterilización del dispositivo tubo polínico no es tan crítica, puesto que el experimento concluye dentro de medio día. Regularmente han utilizado el dispositivo de tubo polínico sin esterilización y no observaron ningún efecto indeseable durante el experimento.
El diseño de microchannel debe ser modificado según las células de interés. En nuestro trabajo, el diseño de canal utilizado para el experimento de pelo de la raíz de a. thaliana fue diferente de la que se utiliza para el tubo de polen fournieri T. y los experimentos de protonemata p. patens . Se necesitan dispositivos diferentes, debido a que las muestras tienen diferentes dimensiones; por ejemplo, pelos de la raíz son mucho más cortos que los tubos de polen y musgo protonemata. Por lo tanto, nuestro dispositivo de pelo de la raíz fue diseñado de modo que las regiones de microespacios estaban adyacentes al canal de la raíz principal. Además el diseño del canal, el procedimiento para preparar el dispositivo de pelo de la raíz varía también los procedimientos utilizados para los tubos de polen o musgo protonemata. Para los estudios de tubo polínico y musgo protonemata, utilizamos un microdevice que contiene una sola capa PDMS con microcanales sellada contra un plato de fondo de cristal. Sin embargo, el dispositivo utilizado para el estudio de pelos de la raíz compone de dos capas PDMS: la capa superior con un MCP (profundidad: 200 μm) para la raíz principal está sellada contra la capa inferior, que contiene microcanales (profundidad: 4 μm) para los pelos de raíz. La técnica de fotolitografía estándar que fue empleada para fabricar el molde de silicona está limitada a una proporción de alrededor de 5:1. Por lo tanto, para crear una brecha amplia de 1 μm, la altura del canal se limitará a aproximadamente 5 μm. También técnicamente es difícil alinear precisamente un canal profundo (e.g., 200 μm) cerca de 1 μm amplia brecha en un molde de silicona. Por lo tanto, preparamos capas separadas de PDMS para la raíz principal y los pelos de raíz y había construido el dispositivo de sellado de juntas.
Este protocolo fue utilizado con éxito para visualizar la punta creciente proceso de tubos de polen a través de microgaps (complementario Movie 1 y 2), Time-lapse de pelos y musgo protonemata alargamiento en la región de microespacios sería más un desafío. En el microdevice utilizado para el cultivo de pelos de la raíz de a. thaliana , la altura de los canales laterales donde las microgaps está situado (4 μm) es mucho menor que la de la cámara de crecimiento de la raíz (200 μm), por lo que más pelos de la raíz no puede continuar en los canales laterales. Incluso si los pelos de raíz encuentra la entrada del canal lateral, es difícil de predecir cuando se entran. Para capturar imágenes de Time-lapse del crecimiento del vello de raíz en los microespacios, recomendamos el uso de un microscopio equipado con una etapa automatizada que puede ser programada para colocarse en posiciones múltiples para la adquisición de la imagen. Cuando tal instrumentación no está disponible, le sugerimos buscar los pelos de la raíz que ya han entrado en los canales laterales, pero aún no han cruzado el microgaps. Puesto que la tasa de crecimiento de los pelos de la raíz de a. thaliana es mucho más lenta (típicamente 1-2.5 μm/min20) que el de los tubos de polen T. fournieri (típicamente 22-23 μm/min19), es posible capturar imágenes de Time-lapse de los pelos de la raíz están a punto de cruzar la microgaps. Por otro lado, musgo protonemata observaciones requieren un sistema de Time-lapse que puede ser utilizado exclusivamente para este estudio, porque un período de observación prolongado es necesario debido a la tasa de crecimiento lento.
El enfoque de microfluidos presentado aquí es el primer método que nos permite estudiar la capacidad de las células vegetales creciendo de punta para alargar a través de espacios estrechos. Estos microdispositivos pueden ser útiles para la detección de los ensayos que investigan las funciones de genes relacionados con la biosíntesis de la pared celular y la integridad de la punta de crecimiento las células a través de su capacidad de penetración. Además, Denais et al. 21 recientemente demostró una ruptura de la envoltura nuclear y mecanismo de reparación apretando una célula de cáncer a través de un espacio confinado en un dispositivo de microfluidos y puede ser posible estudiar si un mecanismo similar existe en los tubos de polen utilizando nuestro dispositivo. Esta plataforma experimental recientemente desarrollada puede utilizarse para investigar células individuales cómo responder a espacios físicamente limitados y así pueden mejorar nuestra comprensión de los mecanismos de crecimiento de la punta.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Agradecemos a H. Tsutsui y D. Kurihara por facilitarnos las plantas transgénicas, como el T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato y la línea de a. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , respectivamente. Este trabajo fue financiado por el Instituto de transformación biomoléculas de la Universidad de Nagoya y la red de la ciencia de planta avanzada de Japón. Apoyo financiero para este trabajo fue proporcionada por subvenciones de la Agencia de tecnología y ciencia de Japón (no de la concesión del proyecto de ERATO. JPMJER1004 para T.H.), subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (Nos. JP16H06465 y JP16H06464 para T.H.) y la sociedad japonesa para las promoción de la ciencia (JSPS) subvenciones para investigación desafiante (grant no. 26600061 de Nueva York y beca Nº 25650075 y 15 K 14542 de Y.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
References
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