Summary
Vi beskriver en metode for å undersøke evnen til tips voksende anlegget celler, inkludert pollen rør, rot hår, og moss protonemata, til å forlenge gjennom svært smale åpninger (~ 1 µm) i en microfluidic enhet.
Abstract
I vivo, tips voksende anlegget celler må overvinne en rekke fysiske barrierer; men mangler forskere metodikk for å visualisere mobilnettet atferd i slike restriktive. For å løse dette problemet, har vi utviklet vekst kammer for tips voksende anlegget celler som inneholder en rekke smale, mikro-fabrikkert hull (~ 1 µm) i en poly-dimethylsiloxane (PDMS)-underlaget. Dette transparent materiale lar brukeren overvåke tips forlengelse prosesser i enkeltceller under microgap penetrasjon av tidsinnstilt bildebehandling. Bruke denne eksperimentelle plattform, observerte vi morfologiske endringer i pollen rør som de trengte microgap. Vi fanget de dynamiske endringene i form av en fluorescently merket vegetative kjerne og sædceller i et pollen rør under denne prosessen. Videre vist vi evnen til rot hår og moss protonemata å trenge 1 µm gapet. Denne i vitro plattformen kan brukes til å studere hvordan individuelle celler svare på fysisk begrensede områder og gir innsikt i tips-vekst mekanismer.
Introduction
Når pollen korn spire på et stigma, produserer hver korn et enkelt pollen rør som bærer sædceller eggcelle og sentrale cellen i ovule for dobbel befruktning. Pollen rør forlenge gjennom stilen og til slutt komme til ovule ved sensing flere veiledning signaler langs deres måte1. Under elongation møter pollen rør en rekke fysiske barrierer; overfører sporet er fylt med celler, og pollen rør må angi minutt micropylar åpning av ovule å nå sine mål (figur 1A)2. Derfor må pollen rør ha muligheten til å trenge fysiske hindringer, mens tolerer kompresjons stress fra omgivelsene. Rothår er en annen type tips voksende anlegget celle som må tåle fysiske hindringer i miljøet, i form av pakket jordpartikler (figur 1B).
Ulike mekaniske egenskaper av pollen røret har blitt studert, inkludert turgor press og stivhet av cellens apikale regionen, som kan måles med begynnende plasmolysis metode3,4 og mobilnettet force mikroskopi (CFM) 5 , 6, henholdsvis. Men avslører metodene alene ikke om pollen rør kan elongating gjennom fysiske barrierer langs vekst banene. En alternativ teknikk som gjør at pollen tube forlengelse overvåket i vivo er to Foton mikroskopi7. Men med denne metoden, er det vanskelig å observere de morfologiske endringene i individuelle pollen rør dypt inne ovule vev. I tillegg kan rot hårvekst i jord visualiseres ved hjelp av X-ray beregnet tomografi (CT) og magnetisk resonans imaging (MRI)8, men med lav oppløsning. Her presenterer vi en metode som kan brukes til å hente høyoppløselige bilder av en celle deformasjon prosessen på konvensjonell mikroskop.
Det overordnede målet med metoden beskrevet her er å visualisere forlengelse evnen til tips voksende anlegget celler, inkludert pollen rør, rot hår, og moss protonemata, i svært små områder. Poly-dimethylsiloxane (PDMS) Micro Devices presentert i dette manuskriptet er optisk gjennomsiktige og luft gjennomtrengelig, vi kanne kulturen levende celler inne i enheten og observere virkemåtene vekst under et mikroskop. Det er også mulig å opprette mikro ~ nanometer skala spaces av myke litografi teknikk9 med bruk av formene. Disse funksjonene tillater oss å studere forlengelse evnen til tips voksende anlegget celler i et fysisk begrenset miljø.
I dette arbeidet vi bygget 1 µm bredt hull (4 µm i høyden) i microfluidic enheter og undersøkt muligheten for pollen rør å trenge disse kunstige hindringer som er mye mindre enn diameteren på sylindriske pollen røret (ca 8 µm). Denne eksperimentelle plattformen kan vi visualisere pollen rørets svar på microgaps og ta time-lapse bilder i svaret, som sporer cellens deformasjon prosessen. Vi har også utviklet Micro Devices som kan brukes til å undersøke gjennomtrenging evne av rot hår og moss protonemata. Flere Micro Devices er rapportert hittil at visualisering av rot10,11,12,13 og moss protonemata14 plantevekst i høy oppløsning. I vår enhet, en rekke rot hår vekst kanaler er vinkelrett koblet til en rot vekst kammer og personlige rot hår (ca 7 µm i diameter) er guidet til fluidic kanaler med en 1 µm bred hullet. Vi også kultivert moss protonemata (ca 20 µm i diameter) i en microdevice som inneholder microgaps for å undersøke sine svar på disse fysiske barrierer. Den foreslåtte microfluidic tilnærmingen tillater oss å utforske evnen til ulike tips voksende anlegget celler til å forlenge gjennom svært små områder, som ikke kan undersøkes med andre tilgjengelige metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrikasjon av PDMS Microdevice å undersøke voksende Pollen rør og Moss Protonemata
Merk: Vi brukte et maskless klima og jordsmonn instrument for å forberede PDMS formene på silisiumskiver. Detaljer om drift av systemet utelates i dette manuskriptet. En standard klima og jordsmonn teknikk9 ved hjelp av en photomask kan også brukes til å opprette PDMS formene beskrevet i dette manuskriptet.
- Hell 11 g pre polymer PDMS blanding (elastomer base: herding agent i forholdet 10:1) i hver 4-tommers mold.
- Degas mold tilberedt i trinn 1.1 for 20 min i et vakuum kammer.
- Etter herding ved 65 ° C i 90 min i en ikke-konveksjon ovn, skrelle PDMS laget av mold og tilgang hull inn i de fluidic bruker biopsi slag.
Merk: For pollen tube enheten, størrelsen på hullet må justeres for å gjenspeile diameteren på pistil. Denne verdien vil derfor variere av arter. I dette eksperimentet slo vi 1 mm hull for pistil viker og 1,5 mm hull for flytende medium reservoarene. For mose protonemata enheten, ble 4 mm hull brukt for eksempel reservoaret. - Avsløre PDMS laget og et glass bunnen rett (3,5-5 cm i diameter) som lufter plasma 50 s.
- Trykk PDMS laget i glass bunnen rett og varme ved 65 ° C i 30 minutter i en ikke-konveksjon ovn å fullstendig forsegle av microfluidic nettverket.
2. fabrikasjon av PDMS Microdevice for rot hår
- Gjenta 1,1-1,3 bruker formene for å forberede to PDMS lag roten og roten håret Micro Devices.
Merk: Vi brukte 2 mm hull for flytende medium reservoarene i roten microdevice. - Utsette begge PDMS lag som lufter plasma 50 s.
- Sammen de to PDMS lagene under et stereomicroscope med en skreddersydd desktop aligner.
Merk: Microchannels på disse PDMS lag må møte hverandre. Før montering, kontrollerer du at justeringen merkene på begge lag kamp. - Varme ved 65 ° C i 30 minutter i en ikke-konveksjon ovn å fullstendig forsegle av microfluidic nettverket.
- Fjern cover slip fra den bygde microdevice og Plasser enheten på et glass bunnen rett som er 5 cm i diameter.
3. forberedelse av I Vitro celle kultur Medium til Pollen rør (Torenia fournieri)
- Klargjør endret Nitsch medium som beskrevet tidligere15 og autoklav middels på 121 ° C for 20 min.
Merk: Sammensetningen av modifed Nitsch medium er NH4ingen3 (80 mg/L), KNO3 (125 mg/L), Ca (ingen3)2‧4H2O (500 mg/L), MgSO4‧7H2O (125 mg/L), KH2PO4 (125 mg/L ), MnSO4‧4H2O (3 mg/L), ZnSO4‧7H2O (0,5 mg/L), H3BO3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0.025 mg/L), Na2MoO4‧2H2O (0.025 mg/L), sukrose (50.000 mg/L), og kasein (500 mg/L). Forberedt mediet kan lagres på 4 ° C for 4 måneder minst. - Forberede 26% (w/v) polyetylenglykol bruker autoklaveres deionisert vann og filtrere løsningen med en 0,3 µm pore filter.
Merk: Forberedt mediet kan lagres på 4 ° C for 1 måned. - Bland reagenser i trinn 3.1 og 3.2 i forholdet 1:1 (v/v).
Merk: Denne medium bør være forberedt frisk for hvert bruk.
4. forberedelse av I Vitro celle kultur Medium for rot hår (Arabidopsis thaliana)
- Forberede 0.215% (w/v) Murashige & Skoog Medium, 0,05% (w/v) MES, 1% (w/v) sukrose, og 1% (w/v) agar i deionisert vann. Autoclave løsningen på 121 ° C i 20 min.
5. forberedelse av I Vitro celle kultur Medium til Moss Protonemata (Physcomitrella patens)
- Pre ruge moss-protonemata i BCDAT middels16 i en Petriskål.
Merk: Sammensetningen av BCDAT medium er 1 mM MgSO4, 10 mM KNO3, 45 µM FeSO4, 1,8 mM KH2PO4 (pH tilpasset 6.5 med KOH), spor element løsning (0.22 µM CuSO4, 0,19 µM ZnSO410 µM H3BO 30.1 µM Na2MoO4, 2 µM MnCl2, 0,23 µM CoCl2og 0,17 µM KI), 1 mM CaCl2og 5 mM diammonium (+)-tartrate. - Kultur mosen i BCDATG medium i microdevice.
Merk: BCDATG mediet er BCDAT medium med 0,5% (w/v) glukose. Forberedt mediet kan lagres på 4 ° C for 1 måned.
6. in Vitro Culturing T. fournieri Pollen rør i Microdevice
- Plasser pollen tube microdevice i et vakuum kammer og degas for 20 min.
- Fjerne microdevice fra vakuum kammeret og introdusere vekstmediet i pistil innløpet brønnene med en veldig fin spiss. Fyll de gjenværende brønnene til sine topper med samme medium. Vent noen minutter før alle microchannels er fylt med mediet av tomrommet i microchannels.
- Sett noen wet papirhåndkle i glass bunnen rett å opprettholde fuktigheten i fatet.
- Overføre pollen korn fra en vill-type T. fournieri "blå og hvit" blomsten sitt stigma bruker en disseksjon nål.
Merk: Vi har også gjennomført dette eksperimentet med en transgene T. fournieri 'Krone violet' blomst ( RPS5Ap::H2B-tdTomato linje17), med pollen rør som inneholder fluorescently merket sædceller og vegetative kjerner. - Kutt pollinated stilen (1 cm lang) med et blad.
- Sett inn stilen kutt i mengden av enheten som vist i figur 2.
- Legg lokk på fatet og forsegle den med tape.
- Plass enheten i en inkubator på 28 ° C for 5-6 h i mørket.
7. in Vitro Culturing av A. thaliana rot hår i Microdevice
Merk: Trinn 7.1-7.9 (unntatt 7.3 og 7.5) skal utføres i laminær strømning hette.
- Sterilisere frø fra A. thaliana Columbia (Col-0) og av transgene linje UBQ10pro::H2B-mClover (med fluorescerende kjernefysiske markøren) av soaking dem i sterilt væske (5% (v/v) husholdning blekemiddel og 0.02% (v/v) Triton X-100) for 5 min.
- Rense sterilisert frøene med autoklaveres vann.
- Lagre skylles frøene i vann for 2 dager 4 ° C i mørket.
- Sterilisere microdevice under UV-lys over natten.
- Legg til microdevice i et vakuum kammer og degas for 20 min.
- Introdusere vekstmediet til brønnene i enheten bruker brønnene. Vent noen minutter før vakuum fyller alle microchannels med mediet.
- Plasser autoklaveres wet papirhåndkle i glass bunnen rett å opprettholde fuktigheten i fatet.
- Overføre et sterilisert frø til mengden av enheten.
- Legg lokk på fatet og forsegle den med tape.
- Plass enheten vertikalt i en inkubator på 22 ° C kontinuerlig hvitt lys.
- Sjekk rot hårvekst etter 4-10 dager etter inkubasjon. Få både lyse felt og fluorescerende bilder ved hjelp av en invertert mikroskop.
8. in Vitro Culturing av P. patens (moss) Protonemata Microfluidic enheten
Merk: Trinn 8.2-8.6 (unntatt 8.3) skal utføres i laminær strømning hette.
- Preculture P. patens belastning Gransden foretrakk 200418 på BCDAT medium dekket med cellofan i en Petriskål for en uke under kontinuerlig hvitt lys på 25 ° C.
- Sterilisere microdevice under UV-lys over natten i laminær strømning hette.
- Legg til microdevice i et vakuum kammer og degas for 20 min.
- Introdusere vekstmediet fordelt ved hjelp av brønnene. Vent noen minutter før vakuum fyller alle microchannels med mediet.
- Legg autoklaveres vann i fatet rundt microdevice for å opprettholde fuktigheten i fatet.
- Overføre et lite stykke moss protonemata vev i innløpet til microdevice og kultur vevet i en inkubator ved 25 ° C under kontinuerlig hvitt lys.
- Sjekk moss protonemata vekst etter 2-3 uker etter inkubasjon. Få lyse feltet bilder ved hjelp av et mikroskop.
9. tidsinnstilt bildebehandling T. fournieri Pollen Tube vekst
- Plasser microdevice på en invertert fluorescens mikroskop utstyrt med bilde oppkjøpet maskinvare (f.eks., en CCD kamera) og programvare. Finne microgap steder.
Merk: For bilde oppkjøpet programvare, vi brukte et kommersielt tilgjengelig produkt (Tabell for materiale). Åpen kildekode mikroskopi som µManager er også tilgjengelig online (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Vi anbefaler at du installerer et mikroskop kondensatoren på mikroskopet å få høyere oppløsning. - Ta lyse feltet bilder hver 10 s med mikroskopet oppkjøpet programvare.
- For å observere fluorescently merket sperm celler og vegetative kjernen i pollen tube av RPS5Ap::H2B-tdTomato linje, irradiate prøven med 561 nm laser og bruker en optisk båndpassfilter (578/105 nm).
Merk: Selv om time-lapse bilder av pollen tube vekst ble fanget ofte, bildebehandling ikke synes å påvirke vekst. Men er det alltid anbefalt å minimere den laser intensitet, eksponeringstid og time-lapse intervallet, for å minimere Phototoksisitet og photobleaching av fluorophore. - Justere lysstyrken og kontrasten i bildene og lage en video arkiv bruker ImageJ programvare (https://imagej.nih.gov/ij/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som illustrert i figur 1, møte tips voksende anlegget celler en rekke fysiske barrierer langs deres vekst baner i vivo. Microfluidic i vitro celle kultur plattformene presentert i denne studien aktivert eksamen det av tips voksende prosess i tre typer anlegg celler (pollen rør, rot hår og moss protonemata) gjennom 1 µm kunstig hull (Figur 3, Figur 4, figur 5). For pollen tube studien, ble live-celle imaging brukt til å overvåke morfologiske endringer i regionen apikale pollen rør samt vegetative kjernen og sædceller Svar å møte en ekstremt liten plass (ekstra film 1 og 2).
Selv om de fleste av microgaps var vellykket fabrikert ved å bruke metoden beskrevet her, la vi merke til at noen av dem var helt lukket (figur 6). Fordi 1 µm brede kanaler opprettet på silisium mold er skjøre, kan gjentatt bruk av denne formen skade hullene, fører til gap blokkering på PDMS laget. Derfor før utføre eksperimentet, er det viktig å sjekke at de PDMS microgaps er intakte.
Figur 1: gjennomtrengning av tips voksende anlegget celler i fysisk begrensede områder. (A) Pollen tube elongating gjennom flere fysiske barrierer på vei til en ovule. Barrierer omfatter overføring av luftveiene vev i stil og integuments rundt micropyle. (B) roten håret inntrengende gjennom tett jord. Insets i (A) og (B) vise forstørrelser av regionene eske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kjennetegner Micro Devices brukes til å studere T. fournieri pollen rør, A. thaliana rothår og P. patens protonemata. Skjematisk tegninger av microchannels, et eksempel er plassert på stedet angitt med en stjerne merke (*). MicroChannel design, fotografier av hver enhet, kanal struktur og celle dyrking perioder oppsummeres. Dette tallet er endret med tillatelse fra Yanagisawa et al. 201719. Skala bar, 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: T. fournieri pollen tube forlengelse gjennom et 1 µm gap. (A) Pollen tube passerer gjennom et 1 µm bredt og 4 µm høy gap. Time-lapse lyse feltet bildene ble tatt med en invertert mikroskop utstyrt med et spinning-disk AC confocal system. Skala bar, 20 µm. (B) tid lapse bilder av en fluorescently merket vegetative kjerne og sædceller i en pollen tube RPS5Ap::H2B-tdTomato linje krysset av microgap. Skala bar, 20 µm. figur (A) og (B) er endret med tillatelse fra Yanagisawa et al. 201719. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. A. thaliana rot hår forlengelse gjennom et 1 µm gap. (A) rot og rot hår vekst i microdevice. Microgaps (1 µm i bredde) og 4 µm i høyden ligger på venstre side av rot veksten kanalen. Microchannels til høyre inneholder microgaps og kan brukes som en kontroll. Skala bar, 100 µm. (B) lysende felt, (C) fluorescens og (D) sammen bilder av rot hår passerer gjennom microgaps. Kjerner i rot hår merket fluorescently i UBQ10pro::H2B-mClover linje. Spissen av hver roten håret er angitt med en pil. Skala for, 30 µm. Disse tallene er endret med tillatelse fra Yanagisawa et al. 201719. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. P. patens protonemata forlengelse gjennom et 1 µm gap. Moss protonemata celler krysset en 1 µm gap (4 µm i høyden), som ble utvidet på grunn av protonemata turgor tidspress. Skala bar, 20 µm. Figuren er endret med tillatelse fra Yanagisawa et al. 201719. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Lukket microgaps. SEM bilde av 1 µm gapet regionen. Microgap til høyre er helt lukket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Sekvenser komplementære filmen 1. Pollen tube vekst gjennom en 1 µm gap. Time-lapse lyse feltet bilder ble tatt hver 10 s med en invertert mikroskop utstyrt med et spinning disk AC confocal mikroskop. Skala bar, 20 µm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende film 2. Gjennomtrengning av vegetative kjernen og sædceller gjennom en 1 µm gap. Time-lapse lyse felt og fluorescens bilder ble tatt hver 20 s med en invertert fluorescens mikroskop. Skala bar, 20 µm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere kritiske trinn i protokollen må følges nøyaktig for å få resultatene presentert ovenfor. Først må PDMS lag og glass bunnen rett overflater begge behandles med plasma en tilstrekkelig mengde tid før bånd. Ellers løsne PDMS laget lokalt fra glassplaten mens spissen voksende celler er krysset av microgaps. Et viktig skritt i roten håret og moss protonemata protokollen er sterilisering av microdevice. Normalt må rot hår og moss protonemata cellene være dyrket i microdevice for et par uker. Uten sterilisering enheten, kan mikroorganismer blomstre, som kan påvirke veksten av disse tips voksende celler. Sterilisering av pollen tube enheten er ikke like kritisk, siden eksperimentet er avsluttet i halv dag. Vi har regelmessig brukt pollen tube enheten uten sterilisering og observerer ikke noen bivirkninger under eksperimentet.
Microchannel design bør endres i henhold til cellene rundt. I vårt arbeid var kanal design brukt for A. thaliana rot hår eksperimentet forskjellig fra den som brukes for T. fournieri pollen røret og P. patens protonemata eksperimenter. Forskjellige enheter kreves fordi prøvene har ulike dimensjoner. for eksempel er rot hår mye kortere enn pollen rør og moss protonemata. Derfor ble våre rot hår enheten utformet slik at de microgap områdene ble hovedavdeling rot kanalen. I tillegg til channel design varierer fremgangsmåten for å forberede roten håret enheten også fra prosedyrer brukes til pollen rør eller moss protonemata. For pollen tube og moss protonemata studiene brukt vi en microdevice som inneholder et enkelt PDMS lag med microchannels forseglet mot et glass bunnen rett. Men enheten brukes til å studere rot hår består av to PDMS lag: det øverste laget med en microchannel (dybde: 200 µm) for det hovedavdeling rot forseglet mot det nederste laget, som inneholder microchannels (dybde: 4 µm) for rot hår. Standard klima og jordsmonn teknikken som var ansatt å dikte silicon formen er begrenset til et størrelsesforhold på ca 5:1. Derfor, for å opprette en 1 µm store gapet, kanal høyden vil være begrenset til ca 5 µm. Det er også teknisk utfordrende til nøyaktig justering av en dyp kanal (f.eks., 200 µm) nær 1 µm bredt gapet på en silicon formen. Derfor vi forberedt separate PDMS lag for det hovedavdeling rot og rot hår og konstruert enheten forsegle dem sammen.
Mens denne protokollen ble brukt å visualisere spissen voksende prosessen av pollen rør gjennom microgaps (supplerende film 1 og 2), time-lapse imaging rot hår og moss protonemata forlengelse på regionen microgap ville være mer utfordrende. I microdevice brukes for dyrking A. thaliana rothår, er høyden på siden kanaler hvor microgaps er lokalisert (4 µm) mye grunnere enn roten vekst kammeret (200 µm), så de fleste rot hår er ikke fortsette inn i de side. Selv om roten hårene finner kanalen sideinngang, er det vanskelig å forutsi når de vil skrive den. For å fange time-lapse bilder av rot hårvekst på microgap, anbefaler vi å bruke et mikroskop utstyrt med en automatisk scene som kan programmeres til å bli plassert på flere posisjoner for bildeopptak. Når slike instrumentation er utilgjengelig, anbefaler vi søker for root hårene som allerede har angitt side kanalene, men som ennå ikke har krysset av microgaps. Siden veksten av A. thaliana rot hår er mye tregere (vanligvis 1-2.5 µm/min20) enn T. fournieri pollen rør (vanligvis 22-23 µm/min19), kan det være mulig å ta time-lapse bilder av disse rot hår som er ferd med å krysse i microgaps. På den annen side, krever mose protonemata observasjoner en time-lapse system som kan brukes utelukkende for denne studien fordi en langvarig observasjon er nødvendig på grunn av den langsomme veksten.
Microfluidic tilnærmingen presenteres her er den første metoden som tillater oss å studere evnen til tips voksende anlegget celler til å forlenge gjennom svært smale områder. Disse Micro Devices kan være nyttig for screening analyser som undersøke funksjonene av gener knyttet cellevegg biosyntesen og integriteten til tips voksende celler gjennom deres gjennomtrenging evne. I tillegg Denais et al. 21 nylig vist en kjernefysiske konvolutten brudd og reparasjon mekanisme klemme en kreftcelle gjennom et trangt sted i en microfluidic enhet, og det kan være mulig å studere om en lignende mekanisme finnes i pollen rør med våre enhet. Denne nyutviklet eksperimentelle plattformen kan brukes til å undersøke hvordan enkeltceller svare på fysisk begrenset mellomrom og kan dermed styrke vår forståelse av tips vekst mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker H. Tsutsui og D. Kurihara for å gi oss med transgene planter, inkludert T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato -linjen og linjen A. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , henholdsvis. Dette arbeidet ble støttet av Institutt for Transformative Bio-molekylene i Nagoya University og Japan avansert Plant Science nettverket. Økonomisk støtte til dette arbeidet ble gitt av tilskudd fra Japan vitenskap og teknologi Agency (ERATO prosjektstøtte nei. JPMJER1004 for th), en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på nyskapende områder (Nos. JP16H06465 og JP16H06464 for th), og Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) Grants-in-Aid for utfordrende utforskende forskning (grant nr. 26600061 for N.Y. og grant nr. 25650075 og 15 K 14542 for utleid).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
References
- Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
- Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. Obermeyer, G., Feijó, J. , Springer. 65-85 (2017).
- Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants. J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).
- Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. The turgor pressure of growing lily pollen tubes. Protoplasma. 198, 1-8 (1997).
- Vogler, H., et al. The pollen tube: a soft shell with a hard core. Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).
- Shamsudhin, N., et al. Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform. PloS one. 11 (12), e0168138 (2016).
- Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy. J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip. J Vis Exp. (65), (2012).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).
- Bascom, C. S., Wu, S. -Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. Long-Term Growth of Moss. in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).
- Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri. Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).
- Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis. DNA Res. 7, 9-17 (2000).
- Maruyama, D., et al. Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes. Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).
- Rensing, S., et al. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science. 319, 64-69 (2008).
- Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps. Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).
- Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 120, 2465-2474 (1994).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
