Desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de ponta-cultivo de células vegetais em espaços extremamente pequenos
Summary
Nós descrevemos um método para investigar a capacidade de crescimento dica células de vegetais, incluindo tubos de pólen, pelos radiculares e musgo protonemata, para alongar através de aberturas muito estreitas (~ 1 µm) em um dispositivo microfluidic.
Abstract
In vivo, células de planta ponta-crescendo precisam superar uma série de barreiras físicas; no entanto, os pesquisadores faltam a metodologia para visualizar o comportamento celular em tais condições restritivas. Para resolver esse problema, nós desenvolvemos câmaras de crescimento para células vegetais crescimento dica que contêm uma série de aberturas estreitas, microfabricada (~ 1 µm) em um substrato de poli-dimetilssiloxano (PDMS). Este material transparente permite que o usuário monitorar processos de alongamento de ponta em células individuais durante a penetração de microgap pela imagem latente de lapso de tempo. Usando esta plataforma experimental, observamos mudanças morfológicas em tubos de pólen como penetraram o microgap. Nós capturamos as mudanças dinâmicas em forma de um núcleo vegetativo fluorescente etiquetada e espermatozoides em um tubo de pólen durante este processo. Além disso, temos demonstrado a capacidade dos cabelos de raiz e musgo protonemata para penetrar a 1 µm lacuna. Esta plataforma em vitro pode ser usada para estudar como individual células respondem aos espaços fisicamente restrito e pode fornecer insights sobre mecanismos de ponta-crescimento.
Introduction
Depois de grãos de pólen germinam em um estigma, cada grão produz um único tubo de pólen que transporta os espermatozoides para a célula-ovo e a célula central no óvulo para fertilização dupla. Tubos de pólen alongar através do estilo e eventualmente atingir o óvulo por sensoriamento várias pistas de orientação ao longo de seu caminho1. Durante o alongamento, tubos de pólen encontram uma série de barreiras físicas; a faixa de transmissão está repleto de células, e tubos de pólen deve entrar a abertura micropylar minuto do óvulo para chegar a seu destino (figura 1A)2. Portanto, tubos de pólen devem ter a capacidade de penetrar obstáculos físicos, enquanto tolerando o esforço compressivo de seus arredors. Pelos radiculares são outro tipo de célula de planta ponta-crescente que deve suportar os obstáculos físicos no ambiente, na forma de partículas de solo compactado (figura 1B).
Diversas propriedades mecânicas do tubo pólen têm sido estudadas, incluindo a pressão de turgor e rigidez da região apical da célula, que pode ser medido usando o método de Plasmólise incipiente3,4 e microscopia de força celular (CFM) 5 , 6, respectivamente. No entanto, estes métodos sozinhos não revelar se os tubos de pólen são capazes de prolongar-se por meio de barreiras físicas ao longo de seus caminhos de crescimento. Uma técnica alternativa que permite o alongamento de pólen tubo ser monitorado na vivo é dois fótons microscopia7. No entanto, com este método, é difícil de observar as mudanças morfológicas em tubos de pólen individuais dentro do tecido do ovule. Além disso, crescimento de pelos radiculares no solo pode ser visualizado usando tomografia de radiografia computadorizada (CT) e ressonância magnética (MRI)8, embora com baixa resolução. Aqui, apresentamos um método que pode ser usado para adquirir imagens de alta resolução do processo de deformação da célula em um microscópio convencional.
O objectivo geral do método descrito aqui é para visualizar a capacidade de alongamento das células vegetais crescendo de ponta, incluindo tubos de pólen, pelos radiculares e musgo protonemata, em espaços extremamente pequenos. Como os poli-dimetilssiloxano (PDMS) microdevices apresentados neste manuscrito são opticamente transparentes e ar permeável, podemos cultura de células vivas no interior do aparelho e observar seus comportamentos de crescimento sob um microscópio. Também é possível criar micro ~ espaços de escala nanométrica pelo macio litografia técnica9 , com o uso de moldes. Esses recursos nos permitem estudar a capacidade de alongamento das células de planta ponta-crescendo em um ambiente fisicamente confinado.
Neste trabalho, nós construído 1 µm Largura lacunas (4 µm de altura) em dispositivos microfluídicos e examinada a capacidade dos tubos de pólen de penetrar esses obstáculos artificiais que são muito menores do que o diâmetro do tubo cilíndrico pólen (aproximadamente 8 µm). Esta plataforma experimental nos permite visualizar a resposta do tubo pólen para microgaps e capturar imagens lapso de tempo de resposta, que acompanhar o processo de deformação da célula. Também desenvolvemos o microdevices que pode ser usado para investigar a capacidade de penetração de pelos radiculares e musgo protonemata. Foram relatados vários microdevices para data que permitem a visualização da raiz10,11,12,13 e musgo protonemata14 crescimento da planta em alta resolução. Em nosso dispositivo, uma série de canais de crescimento de pelos radiculares perpendicularmente estão ligados a uma câmara de crescimento de raiz, e cabelos de raiz individuais (aproximadamente 7 µm de diâmetro) são guiados para canais fluídico com 1 µm larga distância. Nós também cultivadas musgo protonemata (aproximadamente 20 µm de diâmetro) em um microdevice contendo microgaps para examinar suas respostas a estas barreiras físicas. A abordagem proposta microfluidic-baseado nos permite explorar a capacidade de várias células vegetais crescimento dica para alongar através de espaços extremamente pequenos, que não podem ser analisados por qualquer outro método atualmente disponível.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vários passos críticos no protocolo precisam ser seguido precisamente para obter os resultados apresentados acima. Em primeiro lugar, as superfícies PDMS camada e vidro fundo prato devem ambos ser tratadas com plasma para uma quantidade suficiente de tempo antes de ligação. Caso contrário, a camada PDMS localmente pode desanexar da superfície de vidro enquanto ponta crescimento células estão atravessando o microgaps. Mais um passo crucial no protocolo de protonemata de pelos radiculares e moss é a esterilizaç?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Tsutsui H. e m. Kurihara fornecendo-nos com plantas transgénicas, incluindo o T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato e a linha do UBQ10pro::H2B-amor da. thaliana , respectivamente. Este trabalho foi financiado pelo Instituto de transformadora Bio-moléculas de Universidade de Nagoya e a rede de ciência avançada planta Japão. Apoio financeiro para este trabalho foi fornecido por subvenções do Japão de ciência e tecnologia agência (projeto ERATO conceder n. JPMJER1004 por T.H.), um subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (n º s. JP16H06465 e JP16H06464 por T.H.) e da sociedade para a promoção da ciência (JSPS) Grants-in-Aid para pesquisa exploratória desafiador (concessão n. º 26600061 para N.Y. e grant n 25650075 e 15 K 14542 para Y.S.) Japão.
Materials
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
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