Summary
Beschrijven we een methode voor het onderzoeken van de mogelijkheid van tip-groeiende plantencellen, met inbegrip van stuifmeel buizen, root haren, en mos protonemata, naar elongate via zeer smalle openingen (~ 1 µm) in een microfluidic apparaat.
Abstract
In vivo, tip groeiende plantencellen moeten overwinnen van een aantal fysieke belemmeringen; onderzoekers ontbreekt echter de methodologie om te visualiseren van cellulaire gedrag in dergelijke beperkende voorwaarden. Om dit probleem te verhelpen, hebben we groei kamers voor tip groeiende plantencellen die een aantal smalle, micro-verzonnen lacunes (~ 1 µm bevatten) in een poly-dimethylsiloxane (PDMS) substraat. Deze transparante materiaal zorgt voor de gebruiker te volgen uiteinde rek processen in afzonderlijke cellen tijdens microgap penetratie door time-lapse imaging. Met behulp van deze experimenteel platform, waargenomen wij morfologische veranderingen in stuifmeel buizen als ze de microgap doorgedrongen. We veroverde de dynamische veranderingen in de vorm van een fluorescently geëtiketteerde vegetatieve kern en zaadcellen in een stuifmeel buis tijdens dit proces. Bovendien, we toonden de mogelijkheden van de root haren en mos protonemata te dringen de 1 µm-kloof. Dit platform in vitro kan worden gebruikt om te bestuderen hoe individuele cellen reageren op fysiek beperkte ruimten en kan inzicht verwerven in de mechanismen van de tip-groei.
Introduction
Nadat stuifmeel korrels op een stigma ontkiemen, produceert elke graan een enkele stuifmeel buis dat zaadcellen de eicel en de centrale cel in de zaadknop voor double bevruchting draagt. Stuifmeel buizen elongate door middel van de stijl en uiteindelijk het bereiken van de zaadknop door het aftasten van meerdere begeleiding signalen langs hun manier1. Tijdens de rek tegenkomen stuifmeel buizen een aantal fysieke belemmeringen; de verzendende track is gevuld met cellen, en pollen buizen moet invoeren de minieme micropylar opening van de zaadknop te bereiken hun doel (figuur 1A)2. Stuifmeel buisjes moeten daarom de mogelijkheid om te penetreren fysieke obstakels, terwijl het gedogen van de drukspanning uit hun omgeving. Root haren zijn een ander soort tip groeiende plant cel die moet bestand zijn tegen fysieke obstakels in de omgeving, in de vorm van verpakte gronddeeltjes (figuur 1B).
Diverse mechanische eigenschappen van het stuifmeel buis zijn bestudeerd, met inbegrip van turgor druk en stijfheid van de apicale regio van de cel, die kan worden gemeten met behulp van de beginnende Plasmolyse methode3,4 en cellulaire kracht microscopie (CFM) 5 , 6, respectievelijk. Echter, deze methoden alleen niet onthullen of stuifmeel buizen staat grondvlak via fysieke barrières langs hun groei paden zijn. Een alternatieve techniek waarmee stuifmeel buis rek gecontroleerde in vivo is twee foton microscopie7. Met deze methode, het is echter moeilijk te observeren de morfologische veranderingen in individuele stuifmeel buizen diep in het weefsel van de zaadknop. Bovendien kan root haargroei in de bodem worden gevisualiseerd met behulp van X-ray berekend tomografie (CT) en magnetic resonance imaging (MRI)8, zij het met een lage resolutie. Hier presenteren we een methode die kan worden gebruikt voor het verwerven van resolutieafbeeldingen van deformatieproces in van een cel op een conventionele Microscoop.
Het algemene doel van de hier beschreven methode is om te visualiseren de rek mogelijkheid van tip-groeiende plantencellen, met inbegrip van stuifmeel buizen, root haren, en mos protonemata, in uiterst kleine ruimtes. Zoals de microdevices van de poly-dimethylsiloxane (PDMS) gepresenteerd in dit manuscript optisch transparant zijn en door de lucht permeabele, we kunnen cultuur van levende cellen binnen in het apparaat en observeren van het gedrag van hun groei onder een microscoop. Het is ook mogelijk te maken van micro ~ nanometer schaal ruimten door de zachte lithografie techniek9 met het gebruik van mallen. Deze functies laten te bestuderen van de rek mogelijkheid van plantencellen tip-groeien in een fysiek afgesloten omgeving.
In dit werk, we gebouwd 1 µm breed lacunes (4 µm in hoogte) in microfluidic apparaten en de mogelijkheid van stuifmeel buizen te dringen deze kunstmatige obstakels die veel kleiner dan de diameter van de cilindrische stuifmeel buis (ongeveer 8 µm zijn) onderzocht. Dit experimenteel platform ons in staat stelt om te visualiseren de stuifmeel buis van reactie op microgaps en vastleggen van time-lapse beelden van de reactie, die van de cel vervorming proces volgen. Ook ontwikkelden we de microdevices die kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de mogelijkheden van de penetratie van root haren en mos protonemata. Verschillende microdevices hebben gemeld tot nu toe waarmee de visualisatie van plant10,11,12,13 en moss protonemata14 wortelgroei met hoge resolutie. In onze apparaat, een reeks van root haar groei kanalen loodrecht op een root groei kamer zijn aangesloten en individuele root haren (ongeveer 7 µm in diameter) worden geleid tot fluidic kanalen met een 1 µm breed opening. Wij ook gekweekt moss protonemata (ongeveer 20 µm in diameter) in een microdevice met microgaps te onderzoeken hun reacties op deze fysieke barrières. De voorgestelde microfluidic gebaseerde aanpak laat ons toe om verkennen van de mogelijkheid van verschillende tip groeiende plantencellen om te rekken door zeer kleine ruimtes, die door een andere beschikbare methode kunnen niet worden onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabricage van het PDMS Microdevice te onderzoeken groeiende Pollen buizen en mos Protonemata
Opmerking: We gebruikten een maskless fotolithografie instrument te bereiden PDMS mallen (wafers) van silicium. De details over de werking van het systeem worden weggelaten in dit manuscript. Een standaard fotolithografie techniek9 met behulp van een photomask kan ook worden gebruikt om het maken van de mallen van de PDMS beschreven in dit manuscript.
- 11 g van pre polymeer PDMS mengsel giet (elastomeer base: genezen van agent bij een verhouding van 10:1) in elke 4-inch mal.
- Ontgas de schimmel in stap 1.1 gedurende 20 min. in een vacuuemcel voorbereid.
- Na uitharding bij 65 ° C gedurende 90 min. in een niet-convectie oven, schil de PDMS laag uit de mal, en punch toegang gaten in de fluidic kanalen met biopsie stoten.
Opmerking: Voor het stuifmeel buis-apparaat, de grootte van het gat moet worden aangepast voor de diameter van de stamper. Deze waarde zal daarom variëren per soort. In dit experiment sloeg wij een 1 mm gat voor de stamper inhammen en 1,5 mm gaten voor de vloeibare middellange reservoirs. Voor de Mos protonemata apparaat, werd een gat van 4 mm gebruikt voor het monster-reservoir. - Bloot de PDMS laag en een glazen bodem schotel (3.5-5 cm in diameter) om de lucht van plasma voor 50 s.
- Druk op de PDMS laag in de glazen bodem schotel en warmte bij 65 ° C gedurende 30 minuten in een niet-convectie oven aan volledig afschermen van het microfluidic netwerk.
2. de fabricage van het PDMS Microdevice voor Root haren
- Herhaal stap 1.1-1.3 met behulp van de mallen voor te bereiden op twee PDMS lagen de wortel en de root haar microdevices.
Opmerking: We gebruikt een 2 mm gat voor de vloeibare middellange stuwmeren in de wortel microdevice. - Bloot zowel PDMS lagen lucht plasma voor 50 s.
- Monteer de twee lagen van het PDMS onder een stereomicroscoop met behulp van een op maat gemaakte desktop aligner.
Opmerking: De microchannels op deze PDMS lagen moeten tegenover elkaar. Voor het monteren, door ervoor te zorgen dat de merken van de uitlijning op beide lagen opgewassen zijn. - Warmte bij 65 ° C gedurende 30 minuten in een niet-convectie oven aan volledig afschermen van het microfluidic netwerk.
- Verwijder de cover slip uit de geconstrueerde microdevice en plaats het apparaat op een glazen bodem gerecht, dat is 5 cm in diameter.
3. voorbereiding van de In Vitro cel kweekmedium stuifmeel buizen (Torenia fournieri)
- Bereiden van gemodificeerde Nitsch medium zoals eerder beschreven15 en autoclaaf het medium bij 121 ° C gedurende 20 minuten.
Opmerking: De samenstelling van de eveneens Nitsch de medium is NH4geen3 (80 mg/L), KNO3 (125 mg/L), Ca (3)2‧4H2O (500 mg/L), MgSO4‧7H2O (125 mg/L), KH2PO4 (125 mg/L ), MnSO4‧4H2O (3 mg/L), ZnSO4‧7H2O (0,5 mg/L), H3BO3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0,025 mg/L), Na2MoO4‧2H2O (0,025 mg/L), sacharose (50.000 mg/L) en caseïne (500 mg/L). Het bereid medium kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor 4 maanden ten minste. - Bereiden van 26% (m/v) polyethyleenglycol met behulp van gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water en filtreer de oplossing met een 0,3 µm porie filter.
Opmerking: Het bereid medium kan worden achtergelaten bij 4 ° C gedurende 1 maand. - Meng de reagentia bereid in stap 3.1 en 3.2 in een verhouding van 1:1 (v/v).
Opmerking: Dit medium moet voorbereid zijn zoet elk gebruik.
4. voorbereiding van de In Vitro cel kweekmedium Root haren (Arabidopsis thaliana)
- Bereid een oplossing van sacharose voor 0.215% (m/v) Murashige & Skoog Medium, 0.05% (m/v) MES, 1% (m/v), en 1% (m/v) agar in gedeïoniseerd water. Autoclaaf de oplossing bij 121 ° C gedurende 20 minuten.
5. voorbereiding van de In Vitro cel kweekmedium Moss Protonemata (Physcomitrella patenen)
- Vooraf Incubeer de Mos-protonemata in BCDAT middellange16 in een petrischaal.
Opmerking: De samenstelling van BCDAT medium is 1 mM MgSO4, 10 mM KNO3, 45 µM FeSO4, 1,8 mM KH2PO4 (pH aangepast aan 6.5 met KOH), spoorelement oplossing (0,22 µM CuSO4, 0,19 µM ZnSO4, 10 µM H3BO 30.1 µM nb2MoO4, 2 µM MnCl2, 0,23 µM CoCl2, en 0,17 µM KI), 1 mM CaCl2en 5 mM diammoniumfosfaat (+)-tartraat. - Cultuur het mos in het medium van de BCDATG in de microdevice.
Opmerking: Het BCDATG medium is BCDAT medium met 0,5% (w/v) glucose. Het bereid medium kan worden achtergelaten bij 4 ° C gedurende 1 maand.
6. in Vitro Culturing van T. fournieri Pollen buizen in de Microdevice
- Plaats de stuifmeel buis microdevice in een vacuuemcel en ontgas voor 20 min.
- Verwijder de microdevice uit de Vacuuemcel en het groeimedium kennismaken met de inlaat van de stamper met behulp van een micropipet met een zeer fijne tip. Vul de resterende putten om hun toppen met hetzelfde medium. Wacht een paar minuten totdat alle de microchannels zijn gevuld met het medium door het vacuüm gecreëerd binnenin de microchannels.
- Plaats enkele natte papieren handdoek in de schotel onder glas om de luchtvochtigheid in de schotel.
- Overbrengen van het stuifmeel korrels van een wild-type T. fournieri 'blauwe en witte' bloem haar stigma met behulp van een naald dissectie.
Opmerking: We leidee dit experiment met een transgene T. fournieri 'Kroon violet' bloem (de RPS5Ap::H2B-tdTomato lijn17), met stuifmeel buizen met fluorescently geëtiketteerde zaadcellen en vegetatief kernen. - Knip de zaadvast stijl (1 cm lang) met behulp van een mes.
- Plaats de gesneden stijl in de inlaat van het apparaat zoals afgebeeld in Figuur 2.
- Zet een deksel op de schotel en verzegel het met tape.
- Plaats het apparaat in een incubator bij 28 ° C gedurende 5-6 uur in de duisternis.
7. in Vitro Culturing van A. thaliana Root haren in de Microdevice
Opmerking: Stappen 7.1-7,9 (behalve 7.3 en 7.5) moeten worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap.
- Steriliseren van zaden van A. thaliana Columbia (Col-0) en de transgene UBQ10pro::H2B-mClover (met de fluorescerende nucleaire marker) door inweken hen in steriele vloeistof (5% (v/v) huishoudelijk bleekwater en 0,02% (v/v) Triton X-100) gedurende 5 minuten.
- Spoel de gesteriliseerde zaden met gesteriliseerde met autoclaaf water.
- Slaan de gespoeld zaden in water voor 2 dagen bij 4 ° C in het donker.
- De microdevice onder UV-licht 's nachts steriliseren.
- Plaats de microdevice in een vacuuemcel en ontgas voor 20 min.
- Het groeimedium kennismaken met de putten in het apparaat met behulp van een micropipet. Wacht enkele minuten totdat het vacuüm alle van de microchannels met het medium vult.
- Plaats de gesteriliseerde met autoclaaf natte papieren handdoek in de schotel onder glas om de luchtvochtigheid in de schotel.
- Pipetteer een gesteriliseerde zaad in de inlaat van het apparaat.
- Zet een deksel op de schotel en verzegel het met tape.
- Plaats het apparaat verticaal in een incubator bij 22 ° C onder voortdurende wit licht.
- Controleer root haargroei na 4-10 dagen incubatie. Zowel de lichte veld en de fluorescerende beelden met behulp van een omgekeerde Microscoop verkrijgen.
8. in Vitro Culturing van P. patens (moss) Protonemata in het Microfluidic-apparaat
Opmerking: Stappen 8.2-8.6 (met uitzondering van 8.3) moeten worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap.
- Preculture P. patens stam Gransden 200418 op de drager van het BCDAT bedekt met cellofaan in een petrischaal gedurende één week onder continue wit licht bij 25 ° C.
- Het steriliseren van de microdevice onder UV-licht 's nachts in een laminaire flow-kap.
- Plaats de microdevice in een vacuuemcel en ontgas voor 20 min.
- Het groeimedium kennismaken met de putjes met behulp van een micropipet. Wacht enkele minuten totdat het vacuüm alle van de microchannels met het medium vult.
- Voeg gesteriliseerde met autoclaaf water in de schotel rondom de microdevice om de luchtvochtigheid in de schotel.
- Een klein stukje mos protonemata weefsel overbrengen in de inlaat van de microdevice en de cultuur van het weefsel in een incubator bij 25 ° C onder voortdurende wit licht.
- Controleer de Mos protonemata groei na 2-3 weken incubatietijd. Verkrijgen helder veld beelden met behulp van een microscoop.
9. time-lapse beeldvorming van T. fournieri stuifmeel buis groei
- Plaats de microdevice op een omgekeerde fluorescentie Microscoop uitgerust met afbeelding overname hardware (bijv., een CCD-camera) en software. Het vinden van de locaties van de microgap.
Opmerking: Voor de afbeelding acquisitie software gebruikten we een commercieel beschikbaar product (Tabel van materialen). Opensource microscopie software zoals µManager is ook beschikbaar online (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Het is raadzaam een Microscoop condensor installeren op de Microscoop te verkrijgen van resolutiebeelden met een hogere. - Helder veld fotograferen elke 10 s met behulp van de Microscoop afbeelding acquisitie software.
- Om te zien hoe de fluorescently geëtiketteerde zaadcellen en vegetatief kern in de stuifmeel buis van de RPS5Ap::H2B-tdTomato -lijn, het model met 561 nm laser bestralen en een bandfilter optische filter gebruiken (578/105 nm).
Opmerking: Hoewel de time-lapse beelden van stuifmeel buis groei vaak gevangen werden, imaging niet lijken te groei beïnvloeden. Het is echter altijd raadzaam om te minimaliseren van de laser intensiteit, belichtingstijd of time-lapse-intervallen om de fototoxiciteit en photobleaching van de fluorophore te minimaliseren. - Aanpassen van de helderheid en het contrast van de beelden en een video bestand met behulp van ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/) te bereiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als aangegeven in Figuur 1, tegenkomen plantencellen tip groeiende een aantal fysieke barrières langs hun groei paden in vivo. De microfluidic in vitro cel cultuur platforms gepresenteerd in deze studie ingeschakeld het onderzoek naar de tip-groeiende proces in drie soorten plantencellen (stuifmeel buizen, root haren en mos protonemata) via 1 µm kunstmatige lacunes (Figuur 3, Figuur 4 Figuur 5). Voor de studie van stuifmeel buis, werd live-cel imaging gebruikt ten aanzien van morfologische veranderingen in de apicale regio van stuifmeel buizen evenals de vegetatieve nucleus en zaadcellen in reactie op het ontmoeten van een zeer kleine ruimte (aanvullende film 1 en 2).
Hoewel de meeste van de microgaps werden met succes vervaardigd door gebruik te maken van de hier beschreven methode, merkten we dat enkelen van hen volledig werden gesloten (Figuur 6). Omdat de 1 µm breed kanalen gemaakt op de siliconen mal kwetsbaar zijn, kan herhaald gebruik van deze schimmel de lacunes, leidt tot de kloof blokkeren op de PDMS laag beschadigen. Daarom, voordat u het experiment uitvoert, is het belangrijk om te controleren dat de PDMS microgaps intact zijn.
Figuur 1: penetratie van tip-groeiende plant cellen in fysiek beperkte ruimtes. (A) stuifmeel buis grondvlak via verschillende fysieke barrières op weg naar een zaadknop. Hindernissen zijn onder andere overbrengen tract weefsel in de stijl en de integuments rond de micropyle. (B) Root haren penetreren door dichte bodem. Inzetstukken in (A) en (B) Toon uitbreidingen van de doos van de regio's. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Kenmerken van de microdevices gebruikt bij het bestuderen van T. fournieri pollen buizen, A. thaliana root haren en P. patens protonemata. In de schematische tekeningen van microchannels, een monster is geplaatst op de locatie aangegeven door het merk van een sterretje (*). Microchannel ontwerpen, foto's van elk apparaat, kanaal structuren en cel culturing perioden worden samengevat. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Yanagisawa et al. 201719. Schaal bar, 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: T. fournieri stuifmeel buis rek door een gat 1 µm. (A) stuifmeel buis een hoge kloof bij 1 µm breed en 4 µm passeren. De time-lapse helder veld beelden werden gemaakt met behulp van een omgekeerde Microscoop voorzien van een draaiende schijf confocal systeem. Schaal bar, 20 µm. (B) Time lapse beelden van een fluorescently geëtiketteerde vegetatieve kern en zaadcellen in een stuifmeel buis van de RPS5Ap::H2B-tdTomato lijn overschrijden van de microgap. Schaal bar, 20 µm. figuur (A) en (B) met toestemming van Yanagisawa et al.zijn gewijzigd. 201719. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. A. thaliana root haar rek door een 1 µm gat. (A) Root en root haar groei in de microdevice. De microgaps (1 µm breed) en 4 µm in hoogte bevinden zich aan de linker kant van het kanaal van de groei wortel. De microchannels aan de rechterzijde bevatten geen microgaps en kan worden gebruikt als een besturingselement. Schaal bar, 100 µm. (B) helder veld, fluorescentie (C) en (D) samengevoegd beelden van root haren langs de microgaps. De kernen in root haren worden fluorescently aangeduid in de UBQ10pro::H2B-mClover -lijn. De tip van elk haar van de wortel is aangegeven met een pijl. Schaal bar, 30 µm. Deze cijfers zijn aangepast met toestemming van Yanagisawa et al. 201719. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. P. patens protonemata rek door een 1 µm gat. Moss protonemata cellen oversteken via een kloof met 1 µm (4 µm in hoogte), die als gevolg van druk van de turgor van de protonemata werd verruimd. Schaal bar, 20 µm. De figuur is gewijzigd met toestemming van Yanagisawa et al. 201719. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Gesloten microgaps. SEM-beeld van de 1 µm kloof regio. De microgap aan de rechterkant volledig is gesloten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende film 1. Stuifmeel buis groei door een 1 µm kloof. Time-lapse helder veld beelden werden gevangen elke 10 s met behulp van een omgekeerde Microscoop voorzien van een draaiende schijf confocal microscoop. Schaal bar, 20 µm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende film 2. Penetratie van de vegetatieve nucleus en zaadcellen via een 1 µm kloof. Time-lapse heldere veld en fluorescentie beelden werden gevangen elke 20 s met behulp van een omgekeerde fluorescentie Microscoop. Schaal bar, 20 µm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende kritische stappen in het protocol moeten worden gevolgd om juist te verkrijgen van de resultaten van bovenstaande. Eerst, de PDMS laag en glazen bodem schotel oppervlakken moeten beide worden behandeld met plasma voor een voldoende hoeveelheid tijd voordat hechting. Anders kan de PDMS laag lokaal losmaken van het glasoppervlak terwijl tip groeiende cellen zijn het overschrijden van de microgaps. Een andere cruciale stap in het haar van de wortel en moss protonemata-protocol is de sterilisatie van de microdevice. Normaal gesproken moeten root haren en mos protonemata cellen worden gekweekt in de microdevice voor een paar weken. Zonder het apparaat te steriliseren, kunnen micro-organismen gedijen, die van invloed kunnen zijn op de groei van deze cellen tip groeiende. Sterilisatie van het stuifmeel buis-apparaat is niet als kritiek, aangezien het experiment wordt gesloten binnen een halve dag. We hebben regelmatig gebruikt het stuifmeel buis apparaat zonder sterilisatie en deed niet houd rekening met eventuele ongewenste effecten tijdens het experiment.
De microchannel-ontwerp moet worden gewijzigd volgens de cellen van belang. In ons werk was het kanaalontwerp gebruikt voor de A. thaliana root haar experiment anders dan die van de T. fournieri stuifmeel buis en de P. patens protonemata experimenten. Verschillende apparaten zijn vereist omdat de monsters verschillende dimensies hebben; root haren zijn bijvoorbeeld veel korter dan de stuifmeel buizen en mos protonemata. Daarom werd onze root haar apparaat zodanig ontworpen dat de microgap regio's grenzend aan de belangrijkste wortel-kanaal werden. Naast het kanaalontwerp verschilt de procedure voor het voorbereiden van het haar van de root-apparaat ook de procedures die voor stuifmeel buizen of MOS protonemata. Voor de pollen buis en moss protonemata studies gebruikten we een microdevice met een enkellaags PDMS met de microchannels verzegeld tegen een glazen bodem schotel. Echter, het apparaat gebruikt bij het bestuderen van root haren omvat twee PDMS lagen: de bovenste laag met een microchannel (diepte: 200 µm) voor de belangrijkste wortel is verzegeld tegen de onderste laag, bevattende microchannels (diepte: 4 µm) voor root haren. De standaard fotolithografie techniek die werkte te fabriceren de siliconen mal is beperkt tot een hoogte-breedteverhouding van rond de 5:1. Als u wilt maken een 1 µm diepe kloof, zal de hoogte van het kanaal dus beperkt tot ongeveer 5 µm. Het is ook technisch uitdagend nauwkeurig uitlijnen een diepe kanaal (bijv., 200 µm) in de buurt van de 1 µm brede kloof op een siliconen mal. Daarom we afzonderlijke PDMS lagen voorbereid met de belangrijkste wortel en de root-haren, en het apparaat gebouwd door hen samen te verzegelen.
Terwijl dit protocol met succes gebruikt werd voor het visualiseren van het proces van stuifmeel buizen via de microgaps (aanvullende film 1 en 2), time-lapse imaging van root haar groeiende uiteinde en mos protonemata rek bij de microgap-regio zou meer uitdagende. In de microdevice gebruikt voor het kweken van A. thaliana root haren, is de hoogte van de kanalen van de kant waar de microgaps zijn gevestigd (4 µm) veel ondieper dan die van de wortel groei kamer (200 µm), zodat de meeste root haren zijn niet in staat om verder te gaan in de zijde-kanalen. Zelfs als de root haren de ingang voor het kanaal van kant vinden, is het moeilijk te voorspellen wanneer zij zullen invoeren. Om het vastleggen van time-lapse beelden van root haargroei op de microgap, is het raadzaam met behulp van een microscoop voorzien van een geautomatiseerde podium waarop kan worden geprogrammeerd worden gesitueerd op meerdere posities voor Beeldacquisitie. Wanneer dergelijke instrumenten niet beschikbaar is, is het raadzaam op zoek naar de root-haren die al de kant kanalen hebt ingevoerd, maar de microgaps nog niet hebben overschreden. Aangezien het groeitempo op jaarbasis van A. thaliana root haren veel langzamer is (meestal 1-2.5 µm/min20) dan die van de T. fournieri pollen buizen (meestal 22-23 µm/min19), het mogelijk time-lapse opnamen van deze root-haren die zijn bezig met het Kruis van de microgaps. Aan de andere kant, vereist moss protonemata opmerkingen een time-lapse stelsel dat uitsluitend kan worden gebruikt voor deze studie, omdat een langdurige observatieperiode vereist als gevolg van de trage groei is.
De hier gepresenteerde benadering van microfluidic is de eerste methode dat ons toelaat om het bestuderen van de mogelijkheid van plantencellen tip groeiende om te rekken door uiterst smalle ruimten. Deze microdevices nuttig kunnen zijn voor screening tests die de functies van genen geassocieerd met de celwand biosynthese en de integriteit van de tip-groeiende onderzoeken cellen via hun penetratie mogelijkheden. Bovendien, Denais et al. 21 onlangs aangetoond een breuk van de nucleaire envelop en reparatie mechanisme door uitknijpen van een kankercel via een afgesloten ruimte, bereid in een microfluidic-apparaat, en het mogelijk is om te studeren of een soortgelijk mechanisme bestaat in stuifmeel buizen met behulp van onze apparaat. Deze nieuw ontwikkelde experimenteel platform kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe afzonderlijke cellen reageren op fysiek beperkte ruimten en dus ons begrip van de mechanismen van de tip-groei kunnen versterken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Wij danken H. Tsutsui en D. Kurihara voor ons te voorzien van transgene planten, met inbegrip van de T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato -lijn en de lijn van A. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , respectievelijk. Dit werk werd ondersteund door het Instituut van transformatieve Bio-moleculen van Nagoya University en het Japan geavanceerde Plant Science netwerk. Financiële steun voor dit werk werd verstrekt door subsidies van de Japan Science and Technology Agency (ERATO project verlenen neen. JPMJER1004 voor T.H.), een Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden (Nos. JP16H06465 en JP16H06464 voor T.H.), en Japan maatschappij voor de promotie van wetenschap (JSPS) Grants-in-Aid voor uitdagende verkennend onderzoek (subsidie no. 26600061 voor N.Y. en grant nos. 25650075 en 15 K 14542 voor aan).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
References
- Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
- Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. Obermeyer, G., Feijó, J. , Springer. 65-85 (2017).
- Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants. J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).
- Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. The turgor pressure of growing lily pollen tubes. Protoplasma. 198, 1-8 (1997).
- Vogler, H., et al. The pollen tube: a soft shell with a hard core. Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).
- Shamsudhin, N., et al. Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform. PloS one. 11 (12), e0168138 (2016).
- Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy. J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip. J Vis Exp. (65), (2012).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).
- Bascom, C. S., Wu, S. -Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. Long-Term Growth of Moss. in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).
- Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri. Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).
- Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis. DNA Res. 7, 9-17 (2000).
- Maruyama, D., et al. Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes. Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).
- Rensing, S., et al. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science. 319, 64-69 (2008).
- Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps. Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).
- Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 120, 2465-2474 (1994).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
