Summary
팁 성장 하는 식물 세포, 꽃가루 관, 루트 머리, 등의 기능을 조사 하 고 미세 장치에서 protonemata, 매우 좁은 간격 (~ 1 μ m)을 통해 길게 하기 이끼 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
Vivo에서, 팁 성장 하는 식물 세포의 물리적 장벽; 시리즈를 극복 하기 위해 필요한 그러나, 연구 방법론 등 제한적인 조건에서 세포 행동을 시각화에 부족 합니다. 이 문제를 해결 하려면 폴 리-dimethylsiloxane (PDMS) 기판에 성장 챔버 팁 성장 식물, 마이크로 조작 좁은 간격 (~ 1 μ m)의 시리즈를 포함 하는 셀에 대 한 개발 했습니다. 이 투명 한 소재를 사용 하면 시간 경과 영상에 의해 microgap 침투 하는 동안 개별 셀에 팁 신장 프로세스를 모니터링할 수 있습니다. 그들은 관통는 microgap 꽃가루 관의 형태학 변화 관찰이 실험 플랫폼을 사용 하 여 합니다. 우리이 과정 붙일 레이블된 식물 핵의 모양에 동적 변화와 꽃가루 관에서 정자 세포를 점령. 또한, 우리 1 µ m 간격 침투 루트 머리카락과 모스 protonemata의 기능을 시연 했다. 이 체 외에 플랫폼은 물리적으로 제한 된 공간에 개별 세포 응답을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다 하 고 팁 성장 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Introduction
낙인에 꽃가루 곡물 발 아, 후 각 곡물 계란 세포 및 중앙 셀 더블 수정에 대 한 난에 정자 세포를 운반 단일 꽃가루 관을 생성 합니다. 꽃가루 관 스타일을 통해 연장 하 고 결국은 난을 도달 하는 그들의 방법1에 따라 여러 지도 신호를 감지 하 여. 신장, 동안 꽃가루 관 발생 하는 일련의 물리적 장벽; 전송 추적 셀, 채워집니다 그리고 꽃가루 관 그들의 대상 (그림 1A)2도달 하 난의 분 micropylar 개통을 입력 해야 합니다. 따라서, 꽃가루 관은 그들의 주위에서 압축 스트레스를 견 뎌 하는 동안 물리적 장애물을 관통할 수가 있어야 합니다. 루트 머리 포장된 토양 입자 (그림 1B)의 형태로 환경에서 물리적 장애물을 견딜 해야 합니다 팁 성장 하는 식물 세포의 또 다른 유형입니다.
꽃가루 관의 다양 한 기계적 특성 연구, turgor 압력 및 영역의 셀의 꼭대기, 초기 plasmolysis3,방법4 와 셀룰러 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 측정 될 수 있는 강성을 포함 한 (CFM) 5 , 6, 각각. 그러나, 이러한 방법은 혼자 꽃가루 관 성장 경로 따라 물리적 장벽을 통해 elongating 수 인지 공개 하지 않습니다. 모니터링 vivo에서 꽃가루 관 신장 수는 대체 기법 두 광자 현미경7이다. 그러나,이 방법으로, 그것은 개별 꽃가루 관의 형태학 적 변화를 관찰 하기 어려운 난 조직 깊숙한. 또한, 루트 머리 성장 토양에서 수 수 시각 계산 x 선 단층 촬영 (CT) 및 자기 공명 영상 (MRI)8를 사용 하 여 낮은 해상도와. 여기, 우리는 기존의 현미경에는 셀의 변형 과정의 고해상도 이미지를 사용할 수 있는 방법 제시.
여기에 설명 된 방법의 전반적인 목표는 꽃가루 관, 루트 머리를 포함 하 여 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능을 시각화 하 고 protonemata 매우 작은 공간에서 이끼입니다. 폴 리-dimethylsiloxane (PDMS) 렌이이 원고에 광학 투명 하 고 공기 침투성, 우리 수 장치 내부에 살아있는 세포를 문화 고 현미경 아래에서 그들의 성장 행동 관찰. 그것은 또한 마이크로 만들 수 ~ 금형의 사용과 소프트 리소 그래피 기술9 나노미터 스케일 공간. 이러한 기능은 물리적으로 밀폐 된 환경에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능을 공부 수 있습니다.
이 작품에서는, 우리는 미세 장치에 1 µ m 넓은 간격 (높이 4 µ m)를 건설 하 고 원통형 꽃가루 관 (약 8 µ m)의 직경 보다 훨씬 작은 이러한 인공 장애물을 관통 하는 꽃가루 관의 기능을 검사. 이 실험 플랫폼 microgaps 꽃가루 관의 응답을 시각화 하 고 셀의 변형 과정을 추적 하 고 응답의 시간 경과 이미지를 캡처 수 있습니다. 우리는 또한 렌 루트 머리카락과 모스 protonemata의 침투 능력을 조사 하는 데 사용할 수 있는 개발. 여러 렌 공장 루트10,11,12,13 모스 protonemata14 성장과 높은 해상도에서 시각화를 가능 하 게 날짜에 보고 되었습니다. 우리의 장치에 루트 머리 성장 채널 시리즈 루트 성장 챔버에 수직으로 연결 하 고 개별 루트 머리 (직경에서 약 7 µ m)는 1 µ m 넓은 간격으로 유체 채널 가이드. 우리는 또한 이끼를 경작이 물리적 장벽에 대 한 그들의 응답을 검사 하는 microgaps를 포함 하는 microdevice에서 protonemata (직경에서 약 20 µ m). 제안 된 미세 기반 접근 방식을 다른 현재 사용할 수 있는 방법으로 시험 될 수 있는 매우 작은 공간을 통해 연장 하는 다양 한 팁 성장 하는 식물 세포의 기능을 탐구 수 있습니다.
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Protocol
1. PDMS Microdevice 꽃가루 관 성장 검사의 제작 및 Protonemata 이끼
참고: 우리는 실리콘 웨이퍼에 PDMS 몰드를 준비 하 maskless 사진 평판 장비를 사용. 시스템의 운영에 관한 세부 사항은이 원고에서 생략 됩니다. 표준 사진 평판 기술은9 는 포토 마스크를 사용 하 여이 원고에 설명 된 PDMS 몰드를 만드는 데 사용할 수 있습니다.
- 11g 사전 폴리머 PDMS 혼합물을 부 어 (탄성 기본: 10: 1의 비율로 경화제) 각 4 인치 형으로.
- 형 단계 1.1 진공 챔버에 20 분에 드
- 비 대류 오븐에서 90 분 65 ° C에서 경화 후, 금형에서 PDMS 레이어를 껍질 하 고 생 검 펀치를 사용 하 여 유체 채널에 액세스 구멍을 펀치.
참고: 꽃가루 관 장치에 대 한 구멍의 크기는 암 술의 직경을 반영 하기 위해 조정 될 해야 합니다. 이 값이 따라서 종에 의해 달라질 수 있습니다. 이 실험에서 우리는 암 술만 위한 1 m m 구멍 및 액체 중간 저수지에 대 한 1.5 m m 구멍 찍 었다고. 모스 protonemata 장치는 4mm 구멍 샘플 저수지에 대 한 사용 되었습니다. - PDMS 층 및 유리 하단 접시 (지름에서 3.5-5 c m) 50 플라즈마 공기 노출 s.
- 미세 네트워크를 완전히 봉쇄 비 대류 오븐에서 30 분 동안 유리 바닥 접시와 65 ° C에서 열 PDMS 레이어를 누릅니다.
2. 루트 머리카락에 대 한 PDMS Microdevice의 제조
- 1.1-1.3 루트 및 루트 머리 렌에 대 한 두 개의 PDMS 레이어를 준비 하는 금형을 사용 하 여 단계를 반복 합니다.
참고: 루트 microdevice에서 액체 중간 저수지에 2mm 구멍을 사용. - 노출 50 플라즈마 공기 PDMS 레이어 모두 s.
- 맞춤 바탕 화면 동기 기를 사용 하 여 stereomicroscope에서 2 개의 PDMS 층을 조립.
참고: 이러한 PDMS 레이어에 microchannels 서로 직면해 야 합니다. 조립, 전에 두 레이어에 정렬 마크 일치 하는지 확인 하십시오. - 미세 네트워크를 완전히 봉쇄 비 대류 오븐에서 30 분 65 ° C에서 열.
- 생성 된 microdevice에서 커버 슬립을 제거 하 고 장치는 직경 5 cm 유리 하단 접시에 놓습니다.
3. 준비 체 외에서 세포 배양 매체의 꽃가루 관 (Torenia fournieri)에 대 한
- 20 분에 대 한 수정된 니 매체 앞에서 설명한15 및 고압 121 ° C에서 매체를 준비 합니다.
참고: 수정 니 매체의 조성은 NH43 (80 mg/L), 알 것3 (125 mg/L), Ca (3)2‧4H2O (500 mg/L), MgSO4‧7H2O (125 mg/L), KH2포4 (125 mg/L ), MnSO4‧4H2O (3 mg/L), ZnSO4‧7H2O (0.5 mg/L), H3보3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0.025 mg/L), 총2MoO4‧2H2O (0.025 mg/L), 자당 (50000 mg/L), 그리고 카 세 인 (500 mg/L). 준비 된 매체 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 4 개월 동안 적어도. - 26% (w/v) 폴 리 에틸렌 글리콜 압력가 이온된 수를 사용 하 여 준비 하 고 0.3 µ m 기 공 필터 솔루션을 필터링.
참고: 준비 중간 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 1 개월. - 3.1 및 3.2 1:1 (v/v) 비율에 단계에서 준비 하는 시 약을 혼합.
참고:이 매체 준비 되어야 한다 신선한 각 사용에 대 한.
4. 준비 체 외에서 세포 배양 매체의 루트 머리카락 (애기 thaliana)에 대 한
- 0.215% (w/v) 村 重 & Skoog 매체, 0.05% (w/v) MES, 1% (w/v) 자당과 이온된 수 한 천 1% (w/v)의 솔루션을 준비 합니다. 압력솥 20 분 동안 121 ° C에서 솔루션.
5. 준비 체 외에서 세포 배양 매체의 모스 Protonemata (Physcomitrella patens)에 대 한
- 전 모스 protonemata BCDAT 중간16 페 트리 접시에 품 어.
참고: BCDAT 매체의 조성은 1mm MgSO4, 10 m m 알 것3, 45 µ M FeSO4, 1.8 m m KH2포4 (pH 6.5 코와 조정), 추적 요소 솔루션 (0.22 μ M CuSO4, 0.19 µ M ZnSO4, 10 µ M H3보 3, 0.1 µ M 총2MoO4, 2 µ M MnCl2, 0.23 µ M CoCl2및 0.17 µ M 기), 1 m m CaCl2및 5 밀리미터 diammonium (+)-주석산. - 문화는 microdevice에서 BCDATG 매체에 이끼.
참고: BCDATG 매체는 0.5% (w/v) 포도와 BCDAT 매체. 준비 된 매체는 1 개월 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
6. 생체 외에서 Culturing T. fournieri 는 Microdevice에서 꽃가루 관의
- 진공 챔버에 꽃가루 관 microdevice을 놓고 20 분 드.
- 진공 약 실에서 있는 microdevice를 제거 하 고 아주 좋은 팁는 micropipette를 사용 하 여 암 술 입구에 성장 매체를 소개. 같은 매체에 그들의 정상에 남아 있는 우물 채우십시오. 내부는 microchannels 만든 진공에 의해 매체와 모든 microchannels 가득 때까지 몇 분 동안 기다립니다.
- 접시에 습도 유지 하기 위해 유리 하단 접시에 몇 가지 젖은 종이 타월을 놓습니다.
- 야생-타입에서 꽃가루 곡물을 전송 해 부 바늘을 사용 하 여 그것의 오명에 T. fournieri '파란색과 흰색' 꽃.
참고: 또한 유전자 변형 T. fournieri 와 함께이 실험 실시 '바이올렛 왕관' 꽃 ( RPS5Ap::H2B-tdTomato 17선), 붙일 레이블된 정자 세포와 식물 핵을 포함 하는 꽃가루 관. - 잘라 좋게 스타일 (1 ㎝ 길이)는 블레이드를 사용합니다.
- 그림 2와 같이 장치에 컷된 스타일을 삽입 합니다.
- 접시에는 뚜껑을 넣고 테이프로 봉인.
- 어둠 속에서 5-6 h 28 ° C에 인큐베이터에 장치를 넣습니다.
7. A. thaliana 루트 머리는 Microdevice에서의 생체 외에서 Culturing
참고: 단계 7.1 7.9 (제외 7.3 및 7.5) 층 류 후드에서 수행 되어야 한다.
- A. thaliana 컬럼비아 (열-0)에서 종자 소독와 유전자 변형 라인 UBQ10pro::H2B mClover (형광 핵 마커 포함) 5 분에 대 한 살 균 액체 (5% (v/v) 가구 표 백제와 0.02% (v/v) 트라이 톤 X-100)에서 그들을 몸을 담글 하 여.
- 철저 하 게 린스 압력가 마로 소독 물 살 균된 씨.
- 어둠 속에서 4 ° C에서 2 일 동안 물에 씻어 서 씨앗 저장 합니다.
- 밤새 UV 빛에서 microdevice를 소독.
- 진공 챔버에는 microdevice을 놓고 20 분 드.
- 장치는 micropipette 사용 하 우물에 성장 매체를 소개 합니다. 진공에서 매체와 모든 microchannels 채웁니다 때까지 몇 분 정도 기다립니다.
- 접시에 습도 유지 하기 위해 유리 하단 접시에 압력가 젖은 종이 타월을 놓습니다.
- 장치의 입구에 소독된 씨앗을 전송 합니다.
- 접시에는 뚜껑을 넣고 테이프로 봉인.
- 연속 하얀 빛 아래에서 22 ° C에서 인큐베이터에 수직으로 장치를 놓습니다.
- 외피의 4-10 일 후 루트 머리 성장 확인. 밝은 분야와는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 형광 이미지를 얻을.
8. 피. patens (이끼) 미세 장치에서 Protonemata의 생체 외에서 Culturing
참고: 단계 8.2 8.6 (8.3)을 제외 하 고 층 류 후드에서 수행 되어야 한다.
- 25 ° c.에 연속 하얀 빛 아래에서 1 주일 동안 배양 접시에 셀로판으로 덮여 BCDAT 매체에 P. patens 스트레인 Gransden 200418 preculture
- UV 광원을 층 류 두건에서 하룻밤 microdevice 소독.
- 진공 챔버에는 microdevice을 놓고 20 분 드.
- 성장 매체는 micropipette 사용 하 우물에 소개. 진공에서 매체와 모든 microchannels 채웁니다 때까지 몇 분 정도 기다립니다.
- 접시는 접시에 습도 유지 하기 위해 microdevice를 주변에 압력가 물을 추가 합니다.
- microdevice의 입구에 모스 protonemata 조직의 작은 조각을 전송 하 고 연속 하얀 빛 아래에서 25 ° C에서 인큐베이터에서 조직 문화.
- 외피의 2-3 주 후 모스 protonemata 성장 확인. 현미경을 사용 하 여 밝은 필드 이미지를 얻을.
9. T. fournieri 꽃가루 관 성장 시간 경과 영상
- 이미지 수집 하드웨어를 갖춘 거꾸로 형광 현미경에는 microdevice를 배치 (예., CCD 카메라) 및 소프트웨어. Microgap 위치를 찾아.
참고: 이미지 수집 소프트웨어 사용 했습니다 상용 제품 (자료 테이블). µManager와 같은 오픈 소스 현미경 소프트웨어 사용할 수 온라인 (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager) 이기도합니다. 더 높은 해상도 이미지를 현미경에 현미경 콘덴서를 설치 하는 것이 좋습니다. - 모든 10 필드 밝은 이미지를 캡처 현미경 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 s.
- 관찰 하기 위해 붙일 레이블된 정자 세포와 RPS5Ap::H2B tdTomato 라인의 꽃가루 관 식물 핵, 561 nm 레이저는 견본을 비추는 및 대역 통과 광 필터를 사용 하 여 (578/105 nm).
참고: 꽃가루 관 성장의 시간 경과 이미지는 자주 체포 되었다, 비록 이미징 성장에 영향을 미치는 듯 하지 않았다. 그러나, 그것은 항상 레이저 강도, 노출 시간, phototoxicity 및 photobleaching는 fluorophore의 최소화 하기 위해 시간 간격을 최소화 하 고 좋습니다. - 이미지의 명암과 밝기를 조정 하 고 ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/)를 사용 하 여 비디오 파일을 준비.
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Representative Results
그림 1에서 볼 수 있듯이 팁 성장 하는 식물 세포에서 발생 하는 일련의 그들의 성장 경로 비보따라 물리적 장벽. 미세 체 외에서 세포 문화 플랫폼이이 연구에 사용 검사는 성장 하는 팁의 세 가지 유형의 1 µ m 인공 격차 (그림 3를 통해 식물 세포 (꽃가루 관, 루트 머리, 및 모스 protonemata)에서 프로세스 그림 4, 그림 5). 꽃가루 관 연구에 대 한 라이브 셀 이미징 꽃가루 관 뿐만 아니라 식물 핵의 꼭대기 지역에 형태학 상 변화 및 발생 (보충 영화 1, 2)는 매우 작은 공간에 대 한 응답에서 정자 세포 모니터링 하 사용 되었다.
microgaps의 대부분은 성공적으로 여기에서 설명한 메서드를 사용 하 여 조작, 비록 우리를 발견 하는 그들 중 몇 가지 완전히 폐쇄 (그림 6). 실리콘 몰드에 만든 1 µ m 넓은 채널 깨지기 때문에, 곰이 팡이의 반복된 사용 간격, PDMS 레이어에 차단 간격에 지도 손상 수 있습니다. 따라서, 실험을 수행 하기 전에 그것은 PDMS microgaps 그대로 유지 되는지 확인 하는 것이 중요입니다.
그림 1: 성장 하는 팁의 침투 물리적으로 제한 된 공간으로 셀 공장. (A)는 난에가 길에 여러 물리적 장벽을 통해 꽃가루 관 elongating. 장벽 주변에 micropyle integuments와 스타일으로 조직 전송 포함 됩니다. (B) 루트 머리카락 조밀한 토양을 통해 침투. (A) 와 (B) 인세트 박스형 영역의 확대 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: T. fournieri 꽃가루 관, A. thaliana 루트 머리, 및 피. patens protonemata 공부 하는 데 사용 하는 렌의 특성. Microchannels의 회로도 도면에서 샘플 별표 표시 (*)로 표시 된 위치에 배치 됩니다. 아닌 디자인, 사진 각 장치, 채널 구조 및 경작 기간 셀의 요약 된다. 이 수치는 야나기사와 외허가 수정 되었습니다. 201719. 눈금 막대, 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 1 µ m의 차이 통해 T. fournieri 꽃가루 관 신장. (A) 꽃가루 관 1 µ m 폭 및 4 µ m 높은 차이 통해 전달. 시간 경과 밝은 필드 이미지 회전 디스크 confocal 시스템는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 점령 했다. 눈금 막대, 20 µ m. (B) 시간 경과의 이미지 붙일 레이블된 식물 핵 RPS5Ap::H2B tdTomato 의 꽃가루 관에서 정자 세포는 microgap를 건너 라인. 스케일 바, 20 µ m. 그림 (A) 와 (B) 야나기사와 외허가 수정 되었습니다. 201719. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 1 µ m 간격을 통해 A. thaliana 루트 머리 신장. microdevice에서 (A) 루트 및 루트 머리 성장. Microgaps (폭에서 1 µ m)와 4 µ m 높이에 루트 성장 채널의 왼쪽에 있습니다. 오른쪽에 microchannels microgaps를 포함 하지 않는 고 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 눈금 막대, 100 µ m. (B) 밝은 분야, (C) 형광, 및 (D)는 microgaps를 통과 하는 루트 머리의 이미지를 병합. 루트 머리카락에 핵 붙일 UBQ10pro::H2B mClover 줄에 표시 됩니다. 각 루트 머리의 끝 화살표에 의해 표시 됩니다. 스케일 바, 30 µ m입니다. 이러한 수치는 야나기사와 외허가 수정 되었습니다. 201719. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. 1 µ m 간격을 통해 피. patens protonemata 신장. Protonemata 셀 turgor 압력은 protonemata의 확대는 1 µ m 간격 (높이 4 µ m)를 통해 건너 이끼 스케일 바, 20 µ m입니다. 야나기사와 외허가 그림 수정 되었습니다. 201719. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6입니다. 닫힌 microgaps. 1 µ m 간격의 SEM 이미지입니다. 오른쪽에 microgap 완전히 닫힙니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 1입니다. 통해 꽃가루 관 성장 1 µ m 간격. 시간 경과 밝은 필드 이미지 캡처된 모든 10 회전 디스크 confocal 현미경 장비는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 s. 눈금 막대, 20 µ m. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 2입니다. 식물 핵 및 통해 정자 세포의 침투 1 µ m 간격. 시간 경과 밝은 분야 및 형광 이미지 캡처된 모든 20를 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 s. 눈금 막대, 20 µ m. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계 위의 결과 얻기 위해 정확 하 게 지켜질 필요가 있다. 첫째, PDMS 층 및 유리 하단 접시 표면 둘 다 대우 되어야 한다 플라즈마로 충분 한 양의 결합 하기 전에 시간에 대 한. 그렇지 않으면, 팁 성장 세포는 microgaps를 건너는 동안 PDMS 층 유리 표면에서 분리 로컬 수 있습니다. 루트 머리와 모스 protonemata 프로토콜에서 다른 중요 한 단계는 microdevice의 살 균입니다. 일반적으로, 루트 머리카락과 모스 protonemata 세포는 몇 주에 대 한 교양은 microdevice에 있이 필요가 있다. 없이 장치를 살 균, 미생물은 이러한 팁 성장 세포의 성장에 영향을 미칠 수 번성 수 있습니다. 실험 반나절 내 결론은 꽃가루 관 장치의 살 균, 중요 하지 않습니다. 우리는 정기적으로 살 균 없이 꽃가루 관 장치를 사용 하 고 실험 하는 동안 어떤 바람직하지 않은 효과 관찰 하지 않았다.
아닌 디자인 관심사의 세포에 따라 수정 해야 합니다. 우리의 작품에서는, A. thaliana 루트 머리 실험에 사용 된 채널 디자인 T. fournieri 꽃가루 관 및 P. patens protonemata 실험 사용에서 달랐다. 다른 장치는 필요한 샘플 있기 때문에 다른 치수; 예를 들어, 루트 머리는 꽃가루 관 및 모스 protonemata 보다 훨씬 짧습니다. 따라서, 우리의 루트 머리 장치 microgap 지역 주요 루트 채널에 인접 한 했다 되도록 설계 되었다. 채널 디자인 루트 머리 장치를 준비 하기 위한 절차는 또한 꽃가루 관 또는 모스 protonemata 사용 하는 프로시저에서 다릅니다. 꽃가루 관 및 모스 protonemata 연구 microchannels 유리 하단 접시에 대 한 봉인 된 PDMS 층을 포함 하는 microdevice를 사용 했습니다. 그러나 루트 머리카락을 공부 하는 데 사용 하는 장치 2 개의 PDMS 층을 구성 하는,:는 아닌 함께 상위 레이어 (깊이: 200 µ m) 아래 계층에 대 한 기본 루트는 봉인에 대 한 포함 된 microchannels (깊이: 4 µ m) 루트 머리카락에 대 한. 실리콘 금형을 제작 하기 위해 고용 되었다 표준 사진 평판 기술은 주위 5: 1의 가로 세로비로 제한 됩니다. 따라서, 1 µ m 넓은 간격을 만들려면 채널 높이 약 5 µ m로 제한 될 것입니다. 그것은 또한 기술적으로 정확 하 게 깊은 채널에 맞게 도전 (예., 200 µ m) 실리콘 몰드에 1 µ m 와이드 갭 근처. 따라서, 우리 주요 루트 및 루트 머리카락에 대 한 별도 PDMS 레이어를 준비 하 고 그들을 함께 밀봉 하 여 장치를 건설.
이 프로토콜은 성공적으로 성장 하는 과정 (보충 영화 1, 2)는 microgaps 통해 꽃가루 관의 팁을 시각화 하는 데 사용 됩니다, 하는 동안 시간 경과 루트 머리와 모스 protonemata 신장 microgap 영역에서의 영상 더 있을 것 이라고 도전. A. thaliana 루트 머리카락 경작에 사용 되는 microdevice에는 microgaps 위치 (4 µ m)에 있는 사이드 채널의 높이 이므로 루트 성장 챔버 (200 µ m)의 그것 보다 훨씬 얕은 대부분 루트 머리카락 쪽 채널에 진행 할 수 없습니다. 경우에 루트 머리카락 쪽 채널 입구 발견 때 그들은 그것을 입력 것입니다 예측 하기 어렵다. microgap에서 루트 머리 성장의 시간 경과 이미지 캡처, 이미지 수집을 위한 여러 위치에 위치 하도록 프로그래밍할 수 있는 자동화 된 무대를 갖춘 현미경을 사용 하는 것이 좋습니다. 이러한 기기를 사용할 수 없는 경우 루트 머리카락을 이미 측면 채널 입력 하지만 아직는 microgaps 넘어 하지에 대 한 검색 하는 것이 좋습니다. A. thaliana 루트 머리카락의 성장 속도가 훨씬 느린 이후 (일반적으로 1-2.5 µ m/분20) T. fournieri 꽃가루 관 (일반적으로 22-23 µ m/min19) 보다, 그 루트 머리카락의 시간 경과 이미지를 캡처할 수 있습니다 그는 교차 하는 microgaps에 대해 있습니다. 다른 한편으로, 모스 protonemata 관측 장기간된 관찰 기간 느린 성장 비율 때문에 필요 하기 때문에이 연구를 위해 독점적으로 사용 될 수 있는 시간 경과 시스템이 필요 합니다.
여기에 제시 된 미세 접근 우리가 매우 좁은 공간을 통해 길게 하기 팁 성장 하는 식물 세포의 기능 연구를 첫 번째 방법입니다. 이러한 렌 조사 세포 벽 생 합성 및 성장 하는 팁의 무결성과 관련 된 유전자의 기능 분석 검사에 유용 수 있습니다 그들의 침투 능력을 통해 셀. 또한, Denais 외. 21 최근 핵 파열 시연 및 복구 메커니즘 미세 장치에서 준비 하는 한정 된 공간을 통해 암 세포를 압박 하 여 비슷한 메커니즘을 사용 하 여 꽃가루 관에 존재 하는 여부를 연구 수 있습니다 우리의 장치입니다. 이 새로 개발된 된 실험 플랫폼 조사 개별 셀을 사용할 수 있습니다 물리적으로 제한 된 공간에 대응 하 고 따라서 팁 성장 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 향상 시킬 수 있습니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리 감사 헤 쓰쓰이 D. 구리 유전자 변형 식물, 포함 T. fournieriRPS5Ap::H2B tdTomato 선, A. thaliana UBQ10pro::H2B mClover 선 각각 제공. 이 작품에 의해 연구소의 Transformative 바이오-의 분자 나고야 대학과 일본 고급 식물 과학 네트워크를 지원 했다. 이 작품에 대 한 재정 지원 일본 과학과 기술 기관에서 교부 금에 의해 제공 되었다 (ERATO 프로젝트 부여 없음. 남에 대 한 JPMJER1004), 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 지역 (번호. JP16H06465 고 남에 대 한 JP16H06464), 그리고 도전적인 탐구 연구 (no. 26600061에 대 한 부여 뉴욕 및 그랜트 no. 25650075와 15 K 14542와이 스에 대 한)에 대 한 과학 진흥 (JSP) 연구비를 위한 일본 사회.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
References
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