Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Udvikling af mikrofluid enheder til at studere brudforlængelse evne til Tip-voksende planteceller i ekstremt små rum

Published: May 22, 2018 doi: 10.3791/57262
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 2
1Division of Biological Science, Graduate School of Science, Nagoya University, 2Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM), Nagoya University

Summary

Vi beskriver en metode til at undersøge muligheden for tip-voksende planteceller, herunder pollen rør, rodtråde, og mos protonemata til aflang gennem ekstremt smalle huller (~ 1 µm) i en mikrofluid enhed.

Abstract

In vivo, tip-voksende plantecellerne behøver for at overvinde en række fysiske barrierer; men forskere mangler metode til at visualisere cellulære adfærd i sådanne restriktive betingelser. For at løse dette problem, har vi udviklet vækst kamre for tip-voksende planteceller, der indeholder en serie af smalle, mikro-fabrikerede huller (~ 1 µm) i poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrat. Dette gennemsigtige materiale tillader brugeren at overvåge tip brudforlængelse processer i enkelte celler under microgap penetration af time-lapse billeddannelse. Brug denne eksperimentelle platform, observerede vi morfologiske ændringer i pollen rør, som de trængte ind i microgap. Vi fangede de dynamiske ændringer i form af en fluorescently mærket vegetativ kerne og sædceller i et pollen rør under denne proces. Desuden demonstrerede vi rodtråde og mos protonemata evne til at trænge ind 1 µm kløften. Denne in vitro- platform kan bruges til at studere hvordan de enkelte celler reagerer på fysisk begrænset rum og kan give indsigt i tip-vækst mekanismer.

Introduction

Efter pollenkorn spire på en stigmatisering, producerer hvert korn en enkelt pollen rør, der bærer sædceller ægcellen og den centrale celle i ovule dobbelt befrugtning. Pollen rør aflang gennem stilen og til sidst nå ovule af sensing flere vejledning stikord langs deres vej1. Under strækforlængelse støder pollen rør en række fysiske barrierer; de fremsendende spor er fyldt med celler, og pollen rør skal angive minut micropylar åbningen af ovule at nå deres mål (figur 1A)2. Derfor, pollen rør skal have mulighed for at trænge fysiske forhindringer, mens tolerere trykstyrke stress fra omgivelserne. Rodtråde er en anden type af tip-voksende plante celle, der skal modstå fysiske hindringer i miljøet, i form af pakket jordpartikler (figur 1B).

Forskellige mekaniske egenskaber af pollen røret er blevet undersøgt, herunder turgor pres og stivhed af cellens apikale region, som kan måles ved hjælp af begyndende plasmolysis metode3,4 og cellulære force mikroskopi (CFM) 5 , 6, henholdsvis. Men disse metoder alene ikke afsløre om pollen rør er i stand til at forlængede gennem fysiske barrierer langs deres vækst stier. En alternativ teknik, der tillader pollen tube brudforlængelse skal overvåges i vivo er to foton mikroskopi7. Med denne metode, er det imidlertid vanskeligt at observere de morfologiske ændringer i individuelle pollen rør dybt inde i ovule væv. Derudover kan rod hårvækst i jord visualiseres med X-ray beregnet tomografi (CT) og magnetisk resonans imaging (MR)8, omend med lav opløsning. Vi præsenterer her, en metode, der kan bruges til at erhverve højopløselige billeder af en celle deformation proces på en konventionel mikroskop.

Det overordnede mål med metoden beskrevet her er at visualisere brudforlængelse evne til tip-voksende planteceller, herunder pollen rør, rodtråde, og mos protonemata i ekstremt små rum. Som poly-dimethylsiloxane (PDMS) microdevices præsenteret i dette håndskrift er optisk gennemsigtige og luft gennemtrængelige, vi kan kultur levende celler inde i enheden, og observere deres vækst adfærd under et mikroskop. Det er også muligt at oprette micro ~ nanometer skala rum af bløde litografi teknik9 med brug af forme. Disse funktioner tillade os at studere brudforlængelse evne til tip-voksende planteceller i en fysisk begrænset miljø.

I dette arbejde, vi bygget 1 µm store huller (4 µm i højden) i mikrofluid enheder og undersøgt pollen rør evne til at trænge ind på disse kunstige hindringer, der er meget mindre end diameteren af den cylindriske pollen tube (ca 8 µm). Denne eksperimentelle platform gør det muligt at visualisere pollen tube's svar til microgaps og fange time-lapse billeder af svaret, som registrere cellens deformation proces. Vi har også udviklet den microdevices, der kan bruges til at undersøge penetration formåen rodtråde og mos protonemata. Flere microdevices er blevet rapporteret til dato, der aktiverer visualisering af root10,11,12,13 og mos protonemata14 plantevækst i høj opløsning. I vores enhed, en serie af rod hår vækst kanaler er vinkelret tilsluttet et rod vækst kammer, og enkelte rodtråde (ca. 7 µm i diameter) er styret at fluidic kanaler med en 1 µm store kløft. Vi også kulturperler mos protonemata (ca. 20 µm i diameter) i en microdevice, der indeholder microgaps for at undersøge deres svar til disse fysiske barrierer. Den foreslåede mikrofluid-baseret tilgang giver os mulighed at udforske forskellige tip-voksende planteceller evne til at aflang gennem meget små rum, som ikke kan blive undersøgt af eventuelle andre foreliggende metode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fabrikation af PDMS Microdevice at undersøge voksende Pollen rør og mos Protonemata

Bemærk: Vi brugte en maskless fotolitografi instrument til at forberede PDMS forme på silicium wafers. Detaljer vedrørende driften af systemet er udeladt i dette håndskrift. En standard fotolitografi teknik9 ved hjælp af en photomask kan også bruges til at oprette PDMS formene beskrevet i dette håndskrift.

  1. Hæld 11 g før polymer PDMS blanding (elastomer base: hærdning agent i forholdet 10:1) til hver 4-tommer skimmel.
  2. Degas skimmel forberedt i trin 1.1 i 20 min. i en vakuumkammer.
  3. Efter hærdning på 65 ° C til 90 min i en ikke-konvektionsovn, skræl PDMS lag ud af mug og punch adgang huller i de fluidic kanaler ved hjælp af biopsi slag.
    Bemærk: For pollen rør enhed, størrelsen af hullet skal justeres for at afspejle diameteren af pistil. Denne værdi vil derfor variere efter art. I dette eksperiment slog vi et 1 mm hul til Støvvejen fjorde og 1,5 mm huller til de flydende medium reservoirer. For mos protonemata enhed, blev en 4 mm hul brugt til prøven reservoir.
  4. Udsætte PDMS lag og et glas bund fad (3,5-5 cm i diameter) til air plasma for 50 s.
  5. Tryk på laget PDMS i glas bund fad og varme ved 65 ° C i 30 min. i en ikke-konvektionsovn at helt lukke mikrofluid netværk.

2. fabrikation af PDMS Microdevice for rodtråde

  1. Gentag trin 1.1-1.3 ved hjælp af forme til at forberede roden og rod hår microdevices to PDMS lag.
    Bemærk: Vi brugte en 2 mm hul til de flydende medium reservoirer i rod microdevice.
  2. Afdække begge PDMS lag for at luft plasma for 50 s.
  3. Saml de to PDMS lag under et stereomikroskop ved hjælp af en skræddersyet desktop aligner.
    Bemærk: Microchannels på disse PDMS lag skal møde hinanden. Før montering, Sørg for, at justering mærkerne på begge lag svarer.
  4. Varme på 65 ° C i 30 min i en ikke-konvektionsovn at helt lukke mikrofluid netværk.
  5. Fjern dækslet slip fra den beregnede microdevice og placere enheden på en glas bund fad, der er 5 cm i diameter.

3. forberedelse af dyrkningsmediet In Vitro celle for Pollen rør (Torenia fournieri)

  1. Forberede modificerede Nitsch medium som beskrevet tidligere15 og autoklave medium ved 121 ° C i 20 min.
    Bemærk: Sammensætningen af modifed Nitsch medium er NH4ingen3 (80 mg/L), KNO3 (125 mg/L), Ca (3)2‧4H2O (500 mg/L), MgSO4‧7H2O (125 mg/L), KH2PO4 (125 mg/L ), MnSO4‧4H2O (3 mg/L), ZnSO4‧7H2O (0,5 mg/L), H3BO3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0,025 mg/L), Na2MoO4‧2H2O (0,025 mg/L), saccharose (50.000 mg/L), og kasein (500 mg/L). Rede medium kan opbevares ved 4 ° C for 4 måneder i det mindste.
  2. Forberede 26% (w/v) polyethylenglycol bruger autoklaveres deioniseret vand og opløsningen filtreres med en 0,3 µm pore filter.
    Bemærk: Den forberedte medium kan opbevares ved 4 ° C i 1 måned.
  3. Bland de reagenser, der er udarbejdet i trin 3.1 og 3.2 i forholdet 1:1 (v/v).
    Bemærk: Dette medium bør være forberedt friske for hver anvendelse.

4. forberedelse af dyrkningsmediet In Vitro celle for rodtråde (Arabidopsis thaliana)

  1. Der fremstilles en opløsning af 0.215% (w/v) Murashige & Skoog Medium, 0,05% (w/v) MES, 1% (w/v) saccharose, og 1% (w/v) agar i ionbyttet vand. Autoklave løsning ved 121 ° C i 20 min.

5. forberedelse af dyrkningsmediet In Vitro celle til mos Protonemata (Physcomitrella patens)

  1. Pre Inkuber mos protonemata i BCDAT medium16 i en petriskål.
    Bemærk: Sammensætning af BCDAT medium er 1 mM MgSO4, 10 mM KNO3, 45 µM FeSO4, 1,8 mM KH2PO4 (pH justeret til 6,5 med KOH), mikronaeringsstof løsning (0,22 µM CuSO4, 0,19 µM ZnSO4, 10 µM H3BO 3, 0,1 µM Na2MoO4, 2 µM frihedsbevægelse2, 0,23 µM CoCl2og 0,17 µM KI), 1 mM CaCl2og 5 mM diammoniumphosphat (+)-tartrat.
  2. Kultur af mos i BCDATG medium i microdevice.
    Bemærk: BCDATG medium er BCDAT medium med 0,5% (w/v) glukose. Rede mediet kan opbevares ved 4 ° C i 1 måned.

6. in Vitro Culturing T. fournieri Pollen rør i Microdevice

  1. Placer pollen tube microdevice i en vakuumkammer og degas i 20 min.
  2. Fjerne microdevice fra de vakuumkammer og indføre vækstmediet til Støvvejen fjorden med en mikropipette med en meget fin spids. Udfyld de resterende brønde til deres toppe med samme medium. Vent et par minutter indtil alle microchannels er fyldt med medium af Undertrykket skabes i microchannels.
  3. Placer nogle våde køkkenrulle i glas bund fad til at opretholde fugtigheden i fadet.
  4. Overføre pollenkorn fra en vildtype T. fournieri blå og hvid blomst til sit stigma ved hjælp af en dissektion nål.
    Bemærk: Vi har også gennemført dette eksperiment med en transgene T. fournieri «Kronen violet» ( RPS5Ap::H2B-tdTomato linje17), med blomst pollen rør indeholdende fluorescently mærket sædceller og vegetativt kerner.
  5. Cut den bestøvede stil (1 cm lang) ved hjælp af en vinge.
  6. Indsæt typografien snit i indløbet af enheden, som vist i figur 2.
  7. Læg låg på fadet og forsegle det med tape.
  8. Placer enheden i en inkubator ved 28 ° C i 5-6 timer i mørke.

7. in Vitro Culturing af A. thaliana rodtråde i Microdevice

Bemærk: Trin 7.1-7,9 (undtagen 7.3 og 7.5) bør udføres i en laminar flow hætte.

  1. Sterilisere frøene fra A. thaliana Columbia (Col-0) og den transgene line UBQ10pro::H2B-mClover (der indeholder fluorescerende nukleare markør) af iblødsætning dem i steril væske (5% (v/v) husholdningernes blegemiddel og 0,02% (v/v) Triton X-100) i 5 min.
  2. Grundigt skylle steriliseret frøene med autoklaveres vand.
  3. Gemme de skylles frø i vand i 2 dage ved 4 ° C i mørke.
  4. Sterilisere microdevice under UV-lys natten over.
  5. Placere microdevice i en vakuumkammer og degas i 20 min.
  6. Indføre vækstmediet brønde i enheden ved hjælp af en mikropipette. Vent et par minutter indtil tomrummet, som fylder alle microchannels med mediet.
  7. Placer autoklaveres våd køkkenrulle i glas bund fad til at opretholde fugtigheden i fadet.
  8. Overføre en steriliseret frø til indløb af enheden.
  9. Læg låg på fadet og forsegle det med tape.
  10. Anbring anordningen lodret i en inkubator ved 22 ° C under kontinuerlig hvidt lys.
  11. Kontrollere rod hårvækst efter 4-10 dage efter inkubation. Få både lysfelt og fluorescerende billeder ved hjælp af en omvendt mikroskop.

8. in Vitro Culturing af P. patens (moss) Protonemata i den mikrofluid enhed

Bemærk: Skridt 8,2-8,6 (undtagen 8.3) bør udføres i en laminar flow hætte.

  1. Preculture P. patens stamme Gransden 200418 på BCDAT medium dækket med cellofan i en petriskål i en uge under kontinuerlig hvidt lys ved 25 ° C.
  2. Sterilisere microdevice i UV-lys natten over i en laminar flow hætte.
  3. Placere microdevice i en vakuumkammer og degas i 20 min.
  4. Indføre vækstmediet brønde med en mikropipette. Vent et par minutter indtil tomrummet, som fylder alle microchannels med mediet.
  5. Tilføje autoklaveres vand i skålen omkring microdevice for at opretholde fugtigheden i fadet.
  6. Overføre et lille stykke af mos protonemata væv til fjorden af microdevice og kultur væv i en inkubator ved 25 ° C under kontinuerlig hvidt lys.
  7. Kontrollere mos protonemata vækst efter 2-3 uger efter inkubation. Få lysfelt billeder ved hjælp af et mikroskop.

9. time-lapse billeddannelse af T. fournieri Pollen Tube vækst

  1. Placere microdevice på en inverteret fluorescens mikroskop udstyret med image erhvervelse hardware (fx., et CCD kamera) og software. Find microgap steder.
    Bemærk: For image erhvervelse software brugte vi et kommercielt tilgængelige produkt (Tabel af materialer). Open source microscopy software som µManager er også tilgængelige online (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Vi anbefaler at installere et mikroskop kondensator på mikroskop til at få billeder i højere opløsning.
  2. Fange lysfelt billeder hver 10 s ved hjælp af mikroskop billede erhvervelse software.
  3. For at overholde fluorescently mærket sædceller og vegetativt kernen i pollen røret af linjen RPS5Ap::H2B-tdTomato , bestråle prøven med 561 nm laser og bruge en optisk båndpasfilter (578/105 nm).
    Bemærk: Selvom de time-lapse billeder af pollen tube vækst blev fanget ofte, imaging syntes ikke at indvirke på væksten. Det anbefales dog altid at minimere laser intensitet, eksponeringstid og time-lapse interval, at minimere fototoksicitet og photobleaching af fluorophore.
  4. Justere lysstyrke og kontrast i billederne og forberede en video-fil ved hjælp af ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som illustreret i figur 1, støder tip-voksende planteceller en række fysiske barrierer langs deres vækst stier in vivo. Mikrofluid i vitro celle kultur platforme præsenteret i denne undersøgelse aktiveret undersøgelse af tip-voksende proces i tre typer af planteceller (pollen rør, rodtråde og mos protonemata) gennem 1 µm kunstige huller (figur 3, Figur 4, figur 5). Pollen tube undersøgelse, var live-celle imaging bruges til at overvåge morfologiske ændringer i den apikale region af pollen rør samt vegetativ kernen og sædceller i svar til at støde på en meget lille plads (supplerende film 1 og 2).

Selv om de fleste af microgaps var med held fremstillet ved hjælp af metoden beskrevet her, vi bemærket, at et par af dem var helt lukket (figur 6). Fordi 1 µm brede kanaler lavet på silicium mug er skrøbelige, kan gentagen brug af denne mug beskadige huller, fører til gap-blokering på laget PDMS. Før du udfører eksperimentet, er det derfor vigtigt at kontrollere, at PDMS microgaps er intakt.

Figure 1
Figur 1: Penetration af tip-voksende plante celler i fysisk begrænsede områder. (A) Pollen tube forlængede gennem flere fysiske barrierer på vej til en ovule. Hindringer omfatter overførsel af tarmkanalen væv i stil og griflen omkring micropyle. (B) rodtråde trænge gennem tætte jord. Mellemværker i (A) og (B) Vis udvidelser af regionerne boxed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Karakteristik af microdevices bruges til at studere T. fournieri pollen rør, A. thaliana rodtråde og P. patens protonemata. i de skematiske tegninger af microchannels, en prøve er placeret på den lokalitet, som angives af en asterisk mærke (*). MicroChannel designs, fotografier af hver enhed, kanal strukturer og celle dyrkning perioder er sammenfattet. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Yanagisawa mfl. 201719. Skala bar, 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: T. fournieri pollen tube brudforlængelse gennem en 1 µm gap. (A) Pollen tube passerer igennem en 1 µm bred og 4 µm store hul. Time-lapse lysfelt billeder blev fanget ved hjælp af en omvendt mikroskop udstyret med en spinning-disk Konfokal system. Skalalinjen, 20 µm. (B) tid lapse billeder af en fluorescently mærket vegetativ kerne og sædceller i en pollen tube RPS5Ap::H2B-tdTomato linje krydser microgap. Skala bar, 20 µm. figur (A) og (B) er blevet ændret med tilladelse fra Yanagisawa mfl. 201719. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. A. thaliana rod hår brudforlængelse gennem en 1 µm gap. (A) rod og rod hår vækst i microdevice. Microgaps (1 µm i bredde) og 4 µm i højden er placeret på venstre side af rod vækst kanal. Microchannels i højre side indeholder ikke microgaps og kan bruges som en kontrol. Skalalinjen, 100 µm. (B) lysfelt, (C) fluorescens og (D) fusionerede billeder af rodtråde passerer gennem microgaps. Kerner i rodtråde er fluorescently mærket i linjen UBQ10pro::H2B-mClover . Spidsen af hver root hår er angivet med en pil. Skalalinjen, 30 µm. Disse tal er blevet ændret med tilladelse fra Yanagisawa mfl. 201719. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. P. patens protonemata brudforlængelse gennem en 1 µm gap. Mos protonemata celler krydser gennem en 1 µm gap (4 µm i højden), som blev udvidet på grund af protonemata turgor tidspres. Skalalinjen, 20 µm. Tallet er blevet ændret med tilladelse fra Yanagisawa mfl. 201719. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Lukket microgaps. SEM billede af regionen 1 µm hul. Microgap til højre er helt lukket. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende Movie 1. Pollen tube vækst gennem en 1 µm gap. Time-lapse lysfelt billeder blev taget til fange hver 10 s ved hjælp af en omvendt mikroskop udstyret med en roterende disk Konfokal mikroskop. Skala bar, 20 µm. venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Movie 2. Penetration af vegetativt kernen og sædceller gennem en 1 µm gap. Time-lapse lyse felt og fluorescens billeder blev taget til fange hver 20 s ved hjælp af en omvendt fluorescens mikroskop. Skala bar, 20 µm. venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere kritiske trin i protokollen skal følges netop for at opnå resultater præsenteret ovenfor. Først, PDMS lag og glas bund fad overflader skal begge dele behandles med plasma for en tilstrækkelig mængde af tid, før limning. Ellers, PDMS lag kan lokalt løsnes fra glasoverfladen mens tip-voksende celler krydser microgaps. En anden afgørende skridt i rod hår og mos protonemata protokol er sterilisering af microdevice. Normalt, skal rodtråde og mos protonemata celler være kulturperler i microdevice for et par uger. Uden sterilisering enheden, kan mikroorganismer blomstre, som kan påvirke væksten af disse tip-voksende celler. Sterilisation af pollen tube enhed er ikke så kritisk, da forsøget er afsluttet inden for en halv dag. Vi har jævnligt brugt pollen tube enhed uden sterilisation og overholdt ikke nogen uønskede virkninger under eksperimentet.

Microchannel design bør være tilpasset celler af interesse. I vores arbejde var kanal designet anvendt til A. thaliana rod hår eksperiment forskellig fra den, der anvendes til T. fournieri pollen tube og P. patens protonemata eksperimenter. Forskellige enheder er påkrævet, fordi prøverne har forskellige dimensioner; for eksempel, er rodtråde meget kortere end pollen rør og mos protonemata. Derfor blev vores rod hår enhed designet sådan, at microgap regionerne var ved siden af de vigtigste rod kanal. Ud over kanaldesign varierer procedure for at forberede enheden root hår også fra metoder til pollen rør eller mos protonemata. For pollen tube og mos protonemata undersøgelser brugte vi en microdevice, der indeholder en enkelt PDMS lag med microchannels forseglet mod et glas bund fad. Men den enhed, der bruges til at studere rodtråde består af to PDMS lag: det øverste lag med en microchannel (dybde: 200 µm) for de vigtigste rod er forseglet mod det nederste lag, der indeholder microchannels (dybde: 4 µm) for rodtråde. Den standard fotolitografi teknik, der var ansat til at fabrikere silicium mug er begrænset til et skærmformat på omkring 5:1. Derfor, hvis du vil oprette en 1 µm store kløft, kanal højde vil være begrænset til ca 5 µm. Det er også teknisk udfordrende for at justere præcist en dyb kanal (fx., 200 µm) nær den 1 µm store kløft på en silicium skimmel. Derfor, vi forberedt separate PDMS lag på de vigtigste rod og rodtråde og konstrueret enheden ved forsegling dem sammen.

Mens denne protokol var med held bruges til at visualisere spidsen voksende proces af pollen rør gennem microgaps (supplerende film 1 og 2), time-lapse imaging af rod hår og mos protonemata brudforlængelse på regionen microgap ville være mere udfordrende. I microdevice anvendes til dyrkning af A. thaliana rodtråde, er højden af de side kanaler hvor microgaps er beliggende (4 µm) meget fladere end rod vækst kammer (200 µm), så de fleste rodtråde er afskåret fra fortsætte ind i side-kanaler. Selvom rodtråde finder kanal sideindgang, er det svært at forudsige, hvornår de vil træde det. For at fange time-lapse billeder af roden hårvækst på microgap, anbefaler vi at bruge et mikroskop udstyret med en automatisk etape, der kan programmeres til at være beliggende i flere positioner for image erhvervelse. Når sådanne instrumentation er utilgængelig, foreslår vi søger de rodtråde, der allerede har angivet side kanaler, men endnu ikke har krydset microgaps. Da A. thaliana rodtråde vækstrate er meget langsommere (typisk 1-2,5 µm/min.20) end T. fournieri pollen rør (typisk 22-23 µm/min19), kan det være muligt at fange time-lapse billeder af disse rodtråde der er ved at krydse microgaps. På den anden side kræver mos protonemata observationer en time-lapse system, der udelukkende kan anvendes for denne undersøgelse, fordi en forlænget observationsperiode er nødvendig på grund af den langsomme vækst.

Den mikrofluid tilgang præsenteres her er den første metode, som tillader os at studere evne til tip-voksende planteceller til aflang gennem meget snævre rum. Disse microdevices kan være nyttige for screening assays, der undersøger funktioner af gener forbundet med cellevæg biosyntese og integriteten af tip-voksende celler gennem deres penetration formåen. Hertil kommer, Denais mfl. 21 for nylig viste en nuklear kuvert brud og reparation mekanisme ved at klemme en kræftcelle gennem indelukkede tilberedt i en mikrofluid enhed, og det kan være muligt at undersøge, om en lignende ordning findes i pollen rør ved hjælp af vores enhed. Dette nyligt udviklede eksperimentel platform kan bruges til at undersøge, hvordan de enkelte celler reagerer på fysisk begrænset rum og kan dermed øge vores forståelse af tip-vækst mekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker H. Tsutsui og D. Kurihara for at forsyne os med transgene planter, herunder T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato -linjen og linjen A. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , henholdsvis. Dette arbejde blev støttet af Institute af Transformative Bio-molekylerne af Nagoya University og Japan avanceret anlæg videnskab netværk. Finansiel støtte til dette arbejde blev leveret af tilskud fra Japan videnskab og teknologi Agency (ERATO projektet give nr. JPMJER1004 for T.H.), en licensbetaling for videnskabelig forskning på Innovative områder (Nos. JP16H06465 og JP16H06464 for T.H.), og Japan samfund til fremme af videnskab (JSP'ER) Grants-in-Aid for udfordrende sonderende forskning (grant no. 26600061 for N.Y. og grant nr. 25650075 og 15 K 14542 for Y.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Dow Corning Co. Sylgard184
Murashige & Skoog Medium Wako Pure Chemical 392-00591
MES Dojindo 345-01625
Sucrose Wako Pure Chemical 196-00015
50 mm glass-bottom dish Matsunami Glass D210402
35 mm glass-bottom dish Iwaki  3971-035
Surgical blade Feather No.11
biopsy punches Harris Uni-Core
Gel loading tips Bio-Bik 124-R-204
Inverted Microscope Olympus IX83
CSU-W1 Yokogawa Electric No Catalog number is avairable for this customized microscope
MetaMorph imaging software Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
  2. Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. Obermeyer, G., Feijó, J. , Springer. 65-85 (2017).
  3. Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants. J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).
  4. Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. The turgor pressure of growing lily pollen tubes. Protoplasma. 198, 1-8 (1997).
  5. Vogler, H., et al. The pollen tube: a soft shell with a hard core. Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).
  6. Shamsudhin, N., et al. Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform. PloS one. 11 (12), e0168138 (2016).
  7. Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy. J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).
  8. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).
  9. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
  10. Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).
  11. Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip. J Vis Exp. (65), (2012).
  12. Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).
  13. Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).
  14. Bascom, C. S., Wu, S. -Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. Long-Term Growth of Moss. in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).
  15. Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri. Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).
  16. Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis. DNA Res. 7, 9-17 (2000).
  17. Maruyama, D., et al. Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes. Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).
  18. Rensing, S., et al. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science. 319, 64-69 (2008).
  19. Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps. Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).
  20. Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 120, 2465-2474 (1994).
  21. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 135 mikrofluidik plante biologi live-celle imaging pollen rør rodtråde mos protonemata
Udvikling af mikrofluid enheder til at studere brudforlængelse evne til Tip-voksende planteceller i ekstremt små rum
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yanagisawa, N., Sugimoto, N.,… More

Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Higashiyama, T., Sato, Y. Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces. J. Vis. Exp. (135), e57262, doi:10.3791/57262 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter