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Bioengineering

Microfluidic उपकरणों का विकास अत्यंत छोटे रिक्त स्थान में टिप-बढ़ते संयंत्र कोशिकाओं की बढ़ाव क्षमता का अध्ययन करने के लिए

Published: May 22, 2018 doi: 10.3791/57262
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 2
1Division of Biological Science, Graduate School of Science, Nagoya University, 2Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM), Nagoya University

Summary

हम एक microfluidic डिवाइस में अत्यंत संकीर्ण अंतराल (~ 1 µm) के माध्यम से बढ़ाव करने के लिए, पराग ट्यूबों, जड़ बाल, और काई protonemata सहित टिप-बढ़ते संयंत्र कोशिकाओं की क्षमता की जांच करने के लिए एक विधि का वर्णन ।

Abstract

vivo में, टिप-बढ़ती संयंत्र कोशिकाओं को शारीरिक बाधाओं की एक श्रृंखला पर काबू पाने की जरूरत है; हालांकि, शोधकर्ताओं ने इस तरह के प्रतिबंधात्मक शर्तों में सेलुलर व्यवहार कल्पना करने के लिए पद्धति की कमी है । इस समस्या को हल करने के लिए, हम एक पाली-dimethylsiloxane (PDMS) सब्सट्रेट में संकीर्ण, सूक्ष्म गढ़े अंतराल की एक श्रृंखला (~ 1 µm) होते हैं कि टिप-बढ़ते संयंत्र कोशिकाओं के लिए विकास कक्षों विकसित किया है. इस पारदर्शी सामग्री उपयोगकर्ता समय चूक इमेजिंग द्वारा microgap प्रवेश के दौरान व्यक्तिगत कोशिकाओं में टिप बढ़ाव प्रक्रियाओं पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है । इस प्रायोगिक मंच का प्रयोग, हम पराग ट्यूबों में रूपात्मक परिवर्तन मनाया के रूप में वे microgap प्रवेश । हम इस प्रक्रिया के दौरान एक पराग ट्यूब में एक फ्लोरोसेंट लेबल वनस्पति नाभिक और शुक्राणु कोशिकाओं के आकार में गतिशील परिवर्तन पर कब्जा कर लिया । इसके अलावा, हम जड़ बाल और काई protonemata की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए 1 µm अंतर घुसना । इस में इन विट्रो मंच का अध्ययन कैसे व्यक्तिगत कोशिकाओं को शारीरिक रूप से विवश रिक्त स्थान का जवाब और टिप में अंतर्दृष्टि विकास तंत्र प्रदान कर सकते है इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

पराग अनाज एक कलंक पर उगना के बाद, प्रत्येक अनाज एक एकल पराग ट्यूब है कि अंडा सेल के लिए शुक्राणु कोशिकाओं और डबल निषेचन के लिए बीजांड में केंद्रीय सेल वहन करती है । पराग ट्यूब शैली के माध्यम से बढ़ाव और अंततः उनके रास्ते1के साथ कई मार्गदर्शन cues संवेदन द्वारा बीजांड तक पहुंचने । बढ़ाव के दौरान, पराग ट्यूबों शारीरिक बाधाओं की एक श्रृंखला का सामना; प्रसारण ट्रैक कोशिकाओं से भरा है, और पराग ट्यूबों बीजांड के मिनट micropylar खोलने के लिए अपने लक्ष्य तक पहुंचने के लिए दर्ज करना होगा (चित्र 1a)2। इसलिए, पराग ट्यूबों शारीरिक बाधाओं घुसना करने की क्षमता है, जबकि अपने परिवेश से संपीड़न तनाव सहन करना चाहिए । रूट बाल टिप के एक अंय प्रकार के संयंत्र सेल है कि पर्यावरण में शारीरिक बाधाओं का सामना कर रहे हैं, पैक्ड मिट्टी कणों के रूप में कर रहे है (आंकड़ा 1b) ।

पराग ट्यूब के विभिन्न यांत्रिक गुणों का अध्ययन किया गया है, जिसमें कोशिका के शिखर क्षेत्र का turgor दाब और अकड़न शामिल है, जिसे प्रारंभिक plasmolysis विधि3,4 और सेलुलर बल माइक्रोस्कोपी का प्रयोग करके मापा जा सकता है CFM) 5 , 6, क्रमशः । हालांकि, इन तरीकों अकेले पता चलता है कि पराग ट्यूबों उनके विकास के रास्तों के साथ शारीरिक बाधाओं के माध्यम से बढ़ाव के लिए सक्षम हैं नहीं है । एक वैकल्पिक तकनीक है कि पराग ट्यूब बढ़ाव vivo में निगरानी की अनुमति देता है दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी7है । हालांकि, इस विधि के साथ, यह व्यक्तिगत पराग बीजांड ऊतक के अंदर गहरी ट्यूबों में रूपात्मक परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए मुश्किल है । इसके अतिरिक्त, मिट्टी में जड़ बाल विकास एक्स-रे गणना टोमोग्राफी (सीटी) और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई)8का उपयोग कर कल्पना की जा सकती है, हालांकि कम संकल्प के साथ । यहां, हम एक विधि है कि एक पारंपरिक माइक्रोस्कोप पर एक कोशिका के विरूपण प्रक्रिया के उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता वर्तमान ।

विधि का समग्र लक्ष्य यहां वर्णित है टिप की बढ़ाव क्षमता-पराग ट्यूबों, जड़ बाल, और काई protonemata, अत्यंत छोटे रिक्त स्थान में शामिल संयंत्र कोशिकाओं, कल्पना है । के रूप में पाली-dimethylsiloxane (PDMS) microdevices इस पांडुलिपि में प्रस्तुत ऑप्टिकली पारदर्शी और हवा पारगंय हैं, हम संस्कृति डिवाइस के अंदर रहने वाले कोशिकाओं और एक खुर्दबीन के नीचे उनके विकास के व्यवहार का निरीक्षण कर सकते हैं । यह भी मोल्ड के उपयोग के साथ नरम लिथोग्राफी तकनीक9 द्वारा माइक्रो ~ नैनोमीटर पैमाने पर रिक्त स्थान बनाने के लिए संभव है । इन सुविधाओं को हम एक शारीरिक रूप से सीमित वातावरण में टिप बढ़ती संयंत्र कोशिकाओं की बढ़ाव क्षमता का अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं ।

इस काम में, हम microfluidic उपकरणों में 1 µm चौड़े अंतराल (ऊंचाई में 4 µm) का निर्माण और पराग ट्यूबों की क्षमता की जांच करने के लिए इन कृत्रिम बाधाओं कि बेलनाकार पराग ट्यूब के व्यास से बहुत छोटे है घुसना (लगभग 8 µm) । इस प्रायोगिक मंच हमें microgaps और प्रतिक्रिया है, जो सेल के विरूपण प्रक्रिया को ट्रैक की समय चूक छवियों को पकड़ने के लिए पराग ट्यूब की प्रतिक्रिया कल्पना करने के लिए सक्षम बनाता है । हम भी microdevices कि जड़ बाल और काई protonemata की पैठ क्षमता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित की है । कई microdevices तिथि करने के लिए सूचित किया गया है कि संयंत्र जड़10,11,12,13 और काई उच्च संकल्प पर14 विकास protonemata के दृश्य सक्षम करें । हमारे डिवाइस में, रूट बाल विकास चैनलों की एक श्रृंखला सीधा एक रूट विकास कक्ष से जुड़े हैं, और व्यक्तिगत जड़ बाल (व्यास में लगभग 7 µm) एक 1 µm चौड़ी खाई के साथ द्रवित चैनलों के लिए निर्देशित कर रहे हैं । हम भी एक microgaps युक्त microdevice में काई protonemata (लगभग 20 µm व्यास में) इन शारीरिक बाधाओं को अपनी प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए कल्चरल । प्रस्तावित microfluidic आधारित दृष्टिकोण हमें विभिन्न टिप की क्षमता का पता लगाने के लिए संयंत्र कोशिकाओं को अत्यंत छोटे रिक्त स्थान है, जो किसी भी अन्य वर्तमान में उपलब्ध विधि द्वारा जांच नहीं की जा सकती के माध्यम से बढ़ाव की अनुमति देता है.

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Protocol

1. PDMS Microdevice के निर्माण के लिए बढ़ रही पराग ट्यूबों और काई Protonemata की जांच

नोट: हमने सिलिकॉन वेफर्स पर PDMS मोल्ड तैयार करने के लिए एक mask photolithography यंत्र का इस्तेमाल किया । प्रणाली के संचालन के संबंध में विवरण इस पांडुलिपि में लोप कर रहे हैं. एक मानक photolithography तकनीक9 एक photomask का उपयोग भी इस पांडुलिपि में वर्णित PDMS मोल्ड बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. डाल 11 पूर्व के जी बहुलक PDMS मिश्रण (elastomer आधार: 10:1 के अनुपात में इलाज एजेंट) प्रत्येक 4 इंच के सांचे में ढालना ।
  2. Degas एक निर्वात चैंबर में 20 मिनट के लिए कदम १.१ में तैयार मोल्ड ।
  3. एक गैर संवहन ओवन में ९० मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर इलाज के बाद, मोल्ड बंद PDMS परत छील, और छिद्रण घूंसे का उपयोग द्रव चैनलों में पंच का उपयोग छेद ।
    नोट: पराग ट्यूब डिवाइस के लिए, छेद के आकार pistil के व्यास को प्रतिबिंबित करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए । यह मान प्रजातियों के आधार पर भिंन होगा । इस प्रयोग में, हम pistil के लिए एक 1 मिमी छेद छिद्रित और तरल मध्यम जलाशयों के लिए १.५ mm छेद छिद्रित । काई protonemata डिवाइस के लिए, एक 4 एमएम होल का नमूना जलाशय के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
  4. ५० एस के लिए हवा प्लाज्मा के लिए PDMS परत और एक ग्लास नीचे डिश (३.५-व्यास में 5 सेमी) बेनकाब ।
  5. microfluidic नेटवर्क को पूरी तरह से सील करने के लिए एक गैर संवहन ओवन में 30 मिनट के लिए ग्लास बॉटम डिश और हीट में ६५ डिग्री सेल्सियस पर PDMS लेयर दबाएं ।

2. जड़ बालों के लिए PDMS Microdevice का निर्माण

  1. दोहराएँ चरणों १.१-१.३ जड़ और जड़ बाल microdevices के लिए दो PDMS परतों को तैयार करने के लिए मोल्ड का उपयोग कर.
    नोट: हम जड़ microdevice में तरल मध्यम जलाशयों के लिए एक 2 मिमी छेद का इस्तेमाल किया ।
  2. ५० एस के लिए हवा प्लाज्मा के लिए दोनों PDMS परतों बेनकाब ।
  3. एक कस्टम-निर्मित डेस्कटॉप संरेखण का उपयोग कर एक stereomicroscope के तहत दो PDMS परतों को इकट्ठा ।
    नोट: इन PDMS परतों पर microchannels एक दूसरे का सामना करना होगा । कोडांतरण से पहले, सुनिश्चित करें कि दोनों परतों पर संरेखण के निशान से मेल खाता है ।
  4. microfluidic नेटवर्क से पूरी तरह से सील करने के लिए एक गैर संवहन ओवन में 30 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
  5. निर्माण microdevice से कवर स्लिप निकालें और एक गिलास नीचे पकवान है कि व्यास में 5 सेमी है पर डिवाइस जगह है ।

3. की तैयारी इन विट्रो सेल संस्कृति मध्यम के लिए पराग ट्यूबों (Torenia fournieri)

  1. संशोधित Nitsch के माध्यम से पहले15 वर्णित के रूप में तैयार है और 20 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर मध्यम आटोक्लेव ।
    नोट: modifed Nitsch के माध्यम की संरचना है एनएच4NO3 (८० मिलीग्राम/l), KNO3 (१२५ mg/l), सीए (कोई3)2‧ 4H2ओ (५०० मिलीग्राम/एल), MgSO4‧ 7H2ओ (१२५ मिलीग्राम/एल), KH2PO4 (१२५ मिलीग्राम/ ), MnSO4‧ 4H2ओ (3 mg/l), ZnSO4‧ 7H2ओ (०.५ मिलीग्राम/एल), H3बो3 (10 mg/l), CuSO4‧ 5H2ओ (०.०२५ mg/l), ना2मू4‧ 2H2ओ (०.०२५ mg/l), सुक्रोज (५०,००० mg/l), और कैसिइन (५०० mg/ तैयार मध्यम 4 महीने के लिए कम से कम चार डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  2. तैयार 26% (डब्ल्यू/v) पॉलीथीन ग्लाइकोल autoclaved जल का उपयोग कर और एक ०.३ µm ताकना फ़िल्टर के साथ समाधान फिल्टर ।
    नोट: तैयार मध्यम 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  3. एक 1:1 (v/v) अनुपात में चरण ३.१ और ३.२ में तैयार रिएजेंट्स को मिलाएं ।
    नोट: यह माध्यम प्रत्येक उपयोग के लिए ताजा तैयार किया जाना चाहिए ।

4. रूट हेयर्स (Arabidopsis थालियाना) के लिए सेल कल्चर माध्यम इन विट्रो में तैयारी

  1. ०.२१५% (w/v) Murashige एवं Skoog मध् यम, ०.०५% (w/v) एमईएस, 1% (w/v) सुक्रोज, और 1% (w/v) आगार के पानी में एक समाधान तैयार करें । आटोक्लेव 20 मिनट के लिए १२१ ° c पर समाधान है ।

5. इन विट्रो सेल कल्चर मीडियम फॉर मॉस Protonemata (Physcomitrella patens) की तैयारी

  1. एक पेट्री डिश में BCDAT मीडियम16 में काई protonemata प्री-मशीन ।
    नोट: BCDAT मध्यम की संरचना है 1 मिमी MgSO4, 10 मिमी KNO3, ४५ µ एम FeSO4, १.८ mM KH2PO4 (पीएच KOH के साथ ६.५ के लिए समायोजित), ट्रेस तत्व समाधान (०.२२ µ m CuSO4, ०.१९ µ एम ZnSO4, 10 µ एम एच3बो 3, ०.१ µ m ना2मू4, 2 µ m MnCl2, ०.२३ µ m CoCl2, औ ०.१७ µ m KI), 1 mm CaCl2, और 5 एमएम diammonium (+)-tartrate.
  2. microdevice में BCDATG माध्यम में संस्कृति मॉस ।
    नोट: BCDATG मीडियम ०.५% (डब्ल्यू/वी) ग्लूकोज के साथ BCDAT माध्यम है । तैयार मध्यम 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।

6. इन विट्रो संवर्धन के fournieri में पराग ट्यूबों का Microdevice

  1. एक वैक्यूम चैंबर में पराग ट्यूब microdevice प्लेस और 20 मिनट के लिए degas ।
  2. निर्वात चैंबर से microdevice निकालें और pistil प्रवेश के लिए विकास के माध्यम परिचय एक बहुत ही ठीक टिप के साथ एक micropipette का उपयोग कर । शेष कुओं को एक ही माध्यम से अपने ऊपर से भरें । कुछ मिनट तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी microchannels microchannels के अंदर बनाए गए निर्वात द्वारा मध्यम से भर रहे हों.
  3. डिश में नमी बनाए रखने के लिए ग्लास बॉटम डिश में कुछ गीले पेपर तौलिया रखें ।
  4. एक जंगली प्रकार से पराग अनाज स्थानांतरण fournieri ' नीला और सफेद ' फूल अपने कलंक एक विच्छेदन सुई का उपयोग कर ।
    नोट: हम भी एक ट्रांसजेनिक fournieri ' क्राउन वायलेट ' फूल के साथ इस प्रयोग का आयोजन किया ( RPS5Ap:: H2B-tdTomato लाइन17), पराग फ्लोरोसेंट लेबल शुक्राणु कोशिकाओं और वनस्पति नाभिक युक्त ट्यूबों के साथ ।
  5. एक ब्लेड का उपयोग परागण शैली (1 सेमी लंबे) में कटौती ।
  6. डिवाइस के प्रवेश में कट शैली डालें के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है ।
  7. डिश पर एक ढक्कन रखो और टेप के साथ इसे सील ।
  8. अंधेरे में 5-6 ज के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में डिवाइस रखें ।

7. इन विट्रो संवर्धन ए. थालियाना रूट हेयर्स इन द Microdevice

नोट: चरण ७.१-७.९ (७.३ और ७.५ को छोड़कर) एक लामिना प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए ।

  1. ए. थालियाना कोलंबिया (कर्नल-0) और ट्रांसजेनिक लाइन UBQ10pro से बीज निष्फल :: H2B-mClover (फ्लोरोसेंट परमाणु मार्कर युक्त) उंहें बाँझ तरल में भिगोने के द्वारा (5% (v/v) घरेलू ब्लीच और ०.०२% (v/v) ट्राइटन X-१००) 5 मिनट के लिए ।
  2. निष्फल बीजों को autoclaved जल से अच्छी तरह कुल्ला कर लें ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए पानी में कुल्ला बीज अंधेरे में स्टोर ।
  4. रात भर यूवी प्रकाश के तहत microdevice निष्फल ।
  5. एक वैक्यूम चैंबर में microdevice प्लेस और 20 मिनट के लिए degas ।
  6. एक micropipette का उपयोग कर डिवाइस में कुओं के विकास के माध्यम परिचय । कुछ मिनट रुको जब तक निर्वात मध्यम के साथ सभी microchannels भरता है ।
  7. डिश में नमी बनाए रखने के लिए ग्लास बॉटम डिश में autoclaved गीले पेपर तौलिया रखें ।
  8. डिवाइस के प्रवेश में एक निष्फल बीज स्थानांतरण ।
  9. डिश पर एक ढक्कन रखो और टेप के साथ इसे सील ।
  10. लगातार सफेद रोशनी के तहत 22 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में खड़ी डिवाइस रखें ।
  11. जांच रूट बाल विकास के बाद 4-10 दिन की मशीन । दोनों उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट छवियों एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त करें ।

8. इन विट्रो संवर्धन of P patens (काई) Protonemata में Microfluidic डिवाइस

नोट: चरण ८.२-८.६ (८.३ के लिए छोड़कर) एक लामिना प्रवाह हूड में किया जाना चाहिए ।

  1. संस्कृति पी patens तनाव Gransden २००४18 BCDAT मध्यम पर लगातार सफेद प्रकाश के तहत एक सप्ताह के लिए एक पेट्री डिश में सिलोफ़न के साथ कवर पर 25 डिग्री सेल्सियस ।
  2. एक लामिना प्रवाह हूड में रात भर यूवी प्रकाश के तहत microdevice निष्फल ।
  3. एक वैक्यूम चैंबर में microdevice प्लेस और 20 मिनट के लिए degas ।
  4. एक micropipette का उपयोग कर कुओं के विकास के माध्यम परिचय । कुछ मिनट रुको जब तक निर्वात मध्यम के साथ सभी microchannels भरता है ।
  5. पकवान में नमी बनाए रखने के लिए microdevice आसपास के पकवान में autoclaved पानी जोड़ें ।
  6. microdevice और संस्कृति के प्रवेश के लिए काई protonemata ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा स्थानांतरण एक मशीन में 25 डिग्री सेल्सियस पर लगातार सफेद प्रकाश के तहत ऊतक ।
  7. काई protonemata वृद्धि की जांच के बाद 2-3 गर्मी के सप्ताह । उज्ज्वल क्षेत्र छवियों एक खुर्दबीन का उपयोग कर प्राप्त करें ।

9. fournieri पराग ट्यूब विकास की समय-चूक इमेजिंग

  1. छवि अधिग्रहण हार्डवेयर (उदा, एक सीसीडी कैमरा) और सॉफ्टवेयर से लैस एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर microdevice रखें । microgap स्थानों का पता लगाएं ।
    नोट: छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के लिए, हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पाद (सामग्री की तालिका) का इस्तेमाल किया । खुला स्रोत माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर जैसे µ प्रबंधक भी ऑनलाइन उपलब्ध है (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager) । हम उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप पर एक खुर्दबीन संघनित्र स्थापित करने की सलाह देते हैं ।
  2. चमकदार क्षेत्र छवियों हर 10 माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एस पर कब्जा ।
  3. RPS5Ap के पराग ट्यूब में फ्लोरोसेंट लेबल शुक्राणु कोशिकाओं और वनस्पति नाभिक का निरीक्षण करने के लिए :: H2B-tdTomato रेखा, विकीर्ण ५६१ एनएम लेजर के साथ नमूना और एक bandpass ऑप्टिकल फ़िल्टर (578/105 एनएम) का उपयोग करें ।
    नोट: हालांकि पराग ट्यूब विकास के समय चूक छवियों अक्सर कैप्चर किए गए थे, इमेजिंग विकास को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं हुआ । हालांकि, यह हमेशा लेजर तीव्रता, एक्सपोज़र समय, और समय चूक अंतराल को कम करने के लिए, phototoxicity और fluorophore के photobleaching को कम करने के लिए अनुशंसित है ।
  4. छवियों की चमक और इसके विपरीत समायोजित करें और ImageJ सॉफ्टवेयर (https://imagej.nih.gov/ij/) का उपयोग कर एक वीडियो फ़ाइल तैयार ।

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Representative Results

के रूप में चित्रा 1में सचित्र, टिप बढ़ती संयंत्र कोशिकाओं vivo मेंउनके विकास के रास्तों के साथ शारीरिक बाधाओं की एक श्रृंखला का सामना । इस अध्ययन में प्रस्तुत की microfluidic इन विट्रो सेल संस्कृति प्लेटफार्मों में इस परीक्षा में टिप-बढ़ती प्रक्रिया के संयंत्र कोशिकाओं के तीन प्रकार (पराग ट्यूबों, रूट बाल, और काई protonemata) के माध्यम से 1 µm कृत्रिम अंतराल के माध्यम से सक्षम (चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5) । पराग ट्यूब अध्ययन के लिए, लाइव सेल इमेजिंग पराग ट्यूबों के शिखर क्षेत्र में रूपात्मक परिवर्तन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वनस्पति नाभिक और शुक्राणु कोशिकाओं के एक अत्यंत छोटे अंतरिक्ष (पूरक फिल्म 1 और 2) का सामना करने के जवाब में निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

हालांकि microgaps के अधिकांश सफलतापूर्वक यहां वर्णित विधि रोजगार द्वारा गढ़े थे, हमने देखा है कि उनमें से कुछ पूरी तरह से बंद (चित्रा 6) थे । क्योंकि 1 µm चौड़े सिलिकॉन मोल्ड पर बनाया चैनलों नाजुक, इस मोल्ड के दोहराया उपयोग अंतराल नुकसान हो सकता है, PDMS परत पर अंतर को अवरुद्ध करने के लिए अग्रणी । इसलिए प्रयोग करने से पहले यह जांचना जरूरी है कि PDMS microgaps बरकरार हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: टिप के प्रवेश-शारीरिक रूप से विवश रिक्त स्थान में पौधों की बढ़ती कोशिकाओं । (क) पराग ट्यूब एक बीजांड के लिए अपने रास्ते पर कई शारीरिक बाधाओं के माध्यम से बढ़ाव । बाधाओं शैली और micropyle आसपास integuments में पथ ऊतक संचारण शामिल हैं । (ख) जड़ घने मिट्टी के माध्यम से मर्मज्ञ बाल । में presets के (क) और (ख) बॉक्स्ड क्षेत्रों की वृद्धि दिखाएँ. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: microdevices के लक्षण fournieri पराग ट्यूबों, ए. थालियाना रूट बाल, और पी. patens protonemata अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया । microchannels के योजनाबद्ध चित्र में, एक नमूना तारांकन चिह्न (*) द्वारा इंगित स्थान पर रखा जाता है. Microchannel डिजाइन, प्रत्येक डिवाइस की तस्वीरें, चैनल संरचनाओं, और सेल संवर्धन अवधि संक्षेप हैं । यह आंकड़ा Yanagisawa एट अलसे अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । २०१७19. स्केल बार, 20 µm. इस आंकड़े का बड़ा वर्शन देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एक 1 µm अंतराल के माध्यम से fournieri पराग ट्यूब बढ़ाव । (क) पराग ट्यूब एक 1 µm चौड़ा और 4 µm उच्च अंतर से गुजर रहा है । समय चूक उज्ज्वल क्षेत्र छवियों एक उल्टे एक कताई डिस्क फोकल प्रणाली से सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया । स्केल बार, 20 µm. (ख) RPS5Ap के एक पराग ट्यूब में एक फ्लोरोसेंट लेबल वनस्पति नाभिक और शुक्राणु कोशिकाओं के समय चूक छवियों :: H2B-tdTomato microgap पार लाइन । स्केल बार, 20 µm. चित्रा (क) और (ख) Yanagisawa एट अलसे अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । २०१७19. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. एक 1 µm अंतराल के माध्यम से थालियाना रूट बाल बढ़ाव । (क) जड़ और microdevice में जड़ बाल विकास । microgaps (1 µm चौड़ाई और ऊंचाई में 4 µm) रूट वृद्धि चैनल के बाईं ओर स्थित हैं । दाईं ओर microchannels microgaps शामिल नहीं है और एक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जा सकता है । स्केल बार, १०० µm. (ख) उज्ज्वल क्षेत्र, (ग) प्रतिदीप्ति, और (घ) जड़ बाल microgaps के माध्यम से गुजर की छवियों को विलय कर । जड़ बालों में नाभिक फ्लोरोसेंट में लेबल कर रहे है UBQ10pro:: H2B-mClover रेखा । प्रत्येक जड़ बालों की नोक एक तीर से संकेत दिया है । स्केल बार, 30 µm । इन आंकड़ों को Yanagisawa एट अलसे अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । २०१७19. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. पृ. patens protonemata बढ़ाव के माध्यम से एक 1 µm गैप । काई protonemata कोशिकाओं एक 1 µm गैप (ऊंचाई में 4 µm) के माध्यम से पार है, जो protonemata के turgor दबाव के कारण चौड़ा किया गया था । स्केल बार, 20 µm । यह आंकड़ा Yanagisawa एट अलसे अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । २०१७19. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. बंद microgaps. 1 µm गैप क्षेत्र के SEM छवि । दाईं ओर microgap पूरी तरह से बंद है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक फिल्म 1. पराग ट्यूब विकास एक 1 µm गैप के माध्यम से । समय चूक उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को हर 10 एक औंधा एक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग एस पर कब्जा कर लिया गया । स्केल बार, 20 µm. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक फिल्म 2. वनस्पति नाभिक और शुक्राणु कोशिकाओं के एक 1 µm अंतराल के माध्यम से प्रवेश । समय चूक उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति छवियों हर 20 एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एस पर कब्जा कर लिया गया । स्केल बार, 20 µm. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम ठीक ऊपर प्रस्तुत परिणाम प्राप्त करने के लिए पीछा किया जा करने की आवश्यकता है । सबसे पहले, PDMS परत और ग्लास नीचे पकवान सतहों दोनों संबंध पहले समय की एक पर्याप्त राशि के लिए प्लाज्मा के साथ इलाज किया जाना चाहिए । अंयथा, PDMS परत स्थानीय रूप से कांच की सतह से अलग कर सकते है जबकि टिप-बढ़ती कोशिकाओं microgaps पार कर रहे हैं । जड़ बाल और काई protonemata प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम microdevice की नसबंदी है । आम तौर पर, जड़ बाल और काई protonemata कोशिकाओं को सप्ताह के एक जोड़े के लिए microdevice में संस्कृति की जरूरत है । डिवाइस को निष्फल करने के बिना, सूक्ष्मजीवों पनप सकते हैं, जो इन टिप-बढ़ती कोशिकाओं के विकास को प्रभावित कर सकता है । नसबंदी के पराग ट्यूब डिवाइस के रूप में महत्वपूर्ण नहीं है, के बाद से प्रयोग आधे दिन के भीतर संपंन है । हम नियमित रूप से नसबंदी के बिना पराग ट्यूब डिवाइस का इस्तेमाल किया है और प्रयोग के दौरान किसी भी अवांछनीय प्रभाव का पालन नहीं किया ।

microchannel डिजाइन ब्याज की कोशिकाओं के अनुसार संशोधित किया जाना चाहिए । हमारे काम में, चैनल डिजाइन ए. थालियाना रूट हेयर प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया एक fournieri पराग ट्यूब और पी patens protonemata प्रयोगों के लिए इस्तेमाल एक से अलग था । विभिन्न उपकरणों की आवश्यकता होती है क्योंकि नमूने विभिन्न आयामों है; उदाहरण के लिए, जड़ बाल बहुत पराग ट्यूब और काई protonemata से कम हैं । इसलिए, हमारे रूट हेयर डिवाइस इस तरह डिजाइन किया गया था कि microgap क्षेत्रों मुख्य रूट चैनल से सटे थे । चैनल डिजाइन के अलावा, रूट हेयर डिवाइस तैयार करने के लिए प्रक्रिया भी पराग ट्यूब या काई protonemata के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं से भिन्न होता है । पराग ट्यूब और काई protonemata अध्ययन के लिए, हम microchannels एक गिलास नीचे पकवान के खिलाफ बंद के साथ एक एकल PDMS परत युक्त microdevice का इस्तेमाल किया । हालांकि, रूट बाल अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया डिवाइस दो PDMS परतों शामिल हैं: मुख्य जड़ के लिए एक microchannel (गहराई: २०० µm) के साथ शीर्ष परत नीचे की परत के खिलाफ बंद है, युक्त microchannels (गहराई: 4 µm) जड़ बाल के लिए । मानक photolithography तकनीक है कि सिलिकॉन मोल्ड बनाना कार्यरत था लगभग 5:1 के एक पहलू अनुपात तक ही सीमित है । इसलिए, 1 µm चौड़े अंतराल बनाने के लिए, चैनल की ऊंचाई लगभग 5 µm तक सीमित होगी । यह भी तकनीकी रूप से ठीक एक गहरे चैनल (eg, २०० µm) एक सिलिकॉन मोल्ड पर 1 µm व्यापक अंतर के पास संरेखित करने के लिए चुनौतीपूर्ण है । इसलिए, हम मुख्य जड़ और जड़ बाल के लिए अलग PDMS परतों तैयार है, और उंहें एक साथ सील करके उपकरण का निर्माण किया ।

हालांकि इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक microgaps के माध्यम से पराग ट्यूब की नोक बढ़ती प्रक्रिया कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (अनुपूरक फिल्म 1 और 2), microgap क्षेत्र में जड़ बाल और काई protonemata बढ़ाव के समय चूक इमेजिंग अधिक होगा चुनौतीपूर्ण. संवर्धन ए. थालियाना जड़ बालों के लिए इस्तेमाल किया microdevice में, पक्ष चैनलों की ऊंचाई जहां microgaps स्थित हैं (4 µm) जड़ विकास चैंबर (२०० µm) की तुलना में ज्यादा आमूलचूल है, तो सबसे जड़ बाल पक्ष चैनलों में आगे बढ़ने में असमर्थ हैं । यहां तक कि अगर जड़ बाल साइड चैनल प्रवेश द्वार मिल जाए, यह भविष्यवाणी करने के लिए जब वे इसे दर्ज करेंगे कठिन है । microgap में जड़ बाल विकास के समय चूक छवियों को पकड़ने के लिए, हम एक स्वचालित मंच है कि छवि अधिग्रहण के लिए कई पदों पर स्थित होने के लिए क्रमादेशित किया जा सकता है के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की सलाह देते हैं । जब इस तरह के उपकरण उपलब्ध नहीं है, हम रूट बाल है कि पहले से ही पक्ष चैनलों में प्रवेश किया है, लेकिन अभी तक microgaps पार नहीं किया है के लिए खोज सुझाव देते हैं । चूंकि एनटीपीसी की विकास दर थालियाना रूट बाल बहुत धीमी है (आमतौर पर 1-२.५ µm/ंयूनतम20) की तुलना में टी. fournieri पराग ट्यूबों (आमतौर पर 22-23 µm/ंयूनतम19), यह समय पर कब्जा करने के लिए संभव हो सकता है-चूक उन जड़ बाल की छवियां जो microgaps को पार करने वाले हैं । दूसरी ओर, काई protonemata प्रेक्षणों एक समय चूक प्रणाली है कि विशेष रूप से इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की आवश्यकता है, क्योंकि एक लंबे समय तक अवलोकन अवधि धीमी वृद्धि दर के कारण की आवश्यकता है ।

microfluidic दृष्टिकोण यहां प्रस्तुत पहली विधि है कि हमें टिप की क्षमता का अध्ययन करने की अनुमति देता है पौधों की बढ़ती कोशिकाओं को अत्यंत संकीर्ण रिक्त स्थान के माध्यम से बढ़ाव । इन microdevices परख है कि सेल दीवार के साथ जुड़े जीन के कार्यों की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है संश्लेषण और उनकी पैठ क्षमता के माध्यम से टिप की बढ़ती कोशिकाओं की अखंडता । इसके अलावा, Denais एट अल। 21 हाल ही में एक microfluidic डिवाइस में तैयार एक सीमित स्थान के माध्यम से एक कैंसर कोशिका निचोड़ द्वारा एक परमाणु लिफाफा टूटना और मरंमत तंत्र का प्रदर्शन किया, और यह अध्ययन करने के लिए संभव हो सकता है कि एक समान तंत्र पराग ट्यूबों में मौजूद है का उपयोग कर हमारे डिवाइस. इस नव विकसित प्रयोगात्मक मंच कैसे व्यक्तिगत कोशिकाओं को शारीरिक रूप से विवश रिक्त स्थान का जवाब और इस प्रकार टिप के विकास तंत्र की हमारी समझ में वृद्धि कर सकते है की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम ट्रांसजेनिक पौधों के साथ हमें प्रदान करने के लिए एच Tsutsui और डी Kurihara का धन्यवाद करते हैं, जिसमें क्रमशः टी. fournieriRPS5Ap:: H2B-tdTomato रेखा और ए. थालियाना UBQ10pro:: H2B-mClover रेखा शामिल हैं । यह काम परिवर्तनकारी जैव नागोया विश्वविद्यालय के अणुओं और जापान उंनत संयंत्र विज्ञान नेटवर्क के संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था । इस कार्य के लिए वित्तीय सहायता जापान विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी एजेंसी (ERATO परियोजना अनुदान सं. से अनुदान द्वारा प्रदान की गई थी । JPMJER1004 for T.H.), नवीन क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान में सहायता (नग. JP16H06465 और JP16H06464 T.H. के लिए), और विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (JSPS) अनुदान में सहायता के लिए चुनौतीपूर्ण खोजपूर्ण अनुसंधान (अनुदान सं २६६०००६१ N.Y. के लिए और अनुदान के लिए २५६५००७५ और 15K14542 के लिए Y.S.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Dow Corning Co. Sylgard184
Murashige & Skoog Medium Wako Pure Chemical 392-00591
MES Dojindo 345-01625
Sucrose Wako Pure Chemical 196-00015
50 mm glass-bottom dish Matsunami Glass D210402
35 mm glass-bottom dish Iwaki  3971-035
Surgical blade Feather No.11
biopsy punches Harris Uni-Core
Gel loading tips Bio-Bik 124-R-204
Inverted Microscope Olympus IX83
CSU-W1 Yokogawa Electric No Catalog number is avairable for this customized microscope
MetaMorph imaging software Molecular Devices

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References

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जैव इंजीनियरिंग अंक १३५ Microfluidics संयंत्र जीव विज्ञान लाइव सेल इमेजिंग पराग ट्यूबों रूट बाल काई protonemata
Microfluidic उपकरणों का विकास अत्यंत छोटे रिक्त स्थान में टिप-बढ़ते संयंत्र कोशिकाओं की बढ़ाव क्षमता का अध्ययन करने के लिए
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Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Higashiyama, T., Sato, Y. Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces. J. Vis. Exp. (135), e57262, doi:10.3791/57262 (2018).

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