Summary
ルート毛、花粉管を含む先端成長の植物細胞の機能を調査し、マイクロ流体デバイス (〜 1 μ m) の非常に狭い隙間を延長する原糸をコケについて述べる。
Abstract
生体内で、植物細胞の先端成長は一連の物理的な障壁を克服するために必要があります。しかし、研究者は、このような制限の厳しい条件下での細胞挙動を可視化する方法論を欠いています。この問題に対処するためポリ ジメチルシロキサン (PDMS) 基板で、微細加工の狭いギャップ (〜 1 μ m) のシリーズを含む先端成長の植物細胞の培養室内で開発しました。この透明な材料では、タイムラプス イメージングによるギャップ浸透中に個々 の細胞における先端伸長プロセスを監視することができます。この実験のプラットフォームを使用して、彼らが侵入、ギャップとして花粉管の形態変化が観察。このプロセス中には、蛍光に分類された栄養核の形状の動的変化と花粉管内の精子細胞を捕獲しました。さらに、我々 は 1 μ m ギャップを貫通する根毛とコケ原糸体の機能を示した。この体外プラットフォームは物理的に制約された空間にどのように個々 の細胞応答を研究に使用することができ、先端成長メカニズムに洞察力を提供する可能性があります。
Introduction
柱頭に花粉が発芽後、各結晶粒は卵細胞と中央細胞二重受精胚珠内に精子細胞を運ぶ 1 つの花粉管を生成します。花粉管は細長いスタイルを通じて、最終的にその方法1に沿って複数指導の手がかりを感知して胚珠に到達します。延長の間に花粉管発生一連の物理的な障壁。送信トラックは細胞と花粉管が彼らのターゲット (図 1 a)2に到達する胚珠の分の珠孔開口部を入力してください。したがって、花粉管には、自分の周囲から圧縮応力を許容しながら、物理的な障害を貫通する能力が必要です。根毛は詰められた土粒子 (図 1 b) の形式で、環境の物理的な障害に耐える必要がありますヒント成長の植物細胞の別のタイプです。
花粉管の各種力学的性質が研究されている、膨圧と初期原形質分離方法3,4と細胞の顕微鏡を使用して測定することができます細胞の頂部の剛性などを含む(CFM)5,6、それぞれ。ただし、これらの方法を単独で花粉管が伸長成長軌道に沿って物理障壁をことができるかどうかは公表しません。監視されている体内に花粉管伸長を可能にする方法は、2 光子顕微鏡7です。ただし、この方法では、個々 の花粉管の形態学的変化を観察することは困難だ胚珠組織の奥深く。さらに、土壌の根毛成長視覚化できます x 線断層撮影 (CT) や磁気共鳴画像 (MRI)8を使用して低解像度ではあります。従来の顕微鏡で細胞の変形過程の高解像度の画像を取得する方法を紹介します。
ここで説明したメソッドの全体的な目標は、根毛、花粉管を含む先端成長の植物細胞の伸長機能を視覚化し、コケ原糸体、非常に小さなスペースにすることです。本稿で提示ポリ-新規 PDMS マイクロ光学的に透明な空気し透水性、デバイス内部の生きている細胞の培養ができ、顕微鏡下で生育過程を観察します。また、マイクロを作成することが可能だ 〜 金型の使用ソフト ・ リソグラフィー技術9ナノメートル スケール スペース。これらの機能は、物理的に限られた環境での植物細胞の先端成長の伸び能力を研究することを許可します。
この作品は、マイクロ流体デバイスの 1 μ m の広いギャップ (高さ 4 μ m) を構築し、円筒の花粉管 (約 8 μ m) の直径よりもはるかに小さいこれらの人工の障害物を貫通する花粉管の能力を検討しました。この実験のプラットフォームは、私たち microgaps に花粉管の応答を可視化し、細胞の変形過程を追跡する、応答の時間経過の画像をキャプチャできます。根毛とコケ原糸体の浸透能力を調査するため使用することができますマイクロ デバイスを開発しました。いくつかのマイクロ デバイスは、ルート10、11,12,13とコケ原糸体14生育高解像度での可視化を有効にする日付を報告されています。我々 のデバイスでルート成長室一連の根毛成長チャネルは垂直で個々 のルート毛 (直径約 7 μ m) は、1 μ m のワイド ギャップと流路に導かれています。モスも培養を行ったこれらの物理的な障壁への応答を調べる microgaps を含むマイクロ デバイスの原糸体 (直径約 20 μ m)。提案マイクロ ベースのアプローチでは、他の現在利用可能な方法で検査することはできません非常に小さなスペースを延長する様々 なヒント成長植物細胞の機能を探索することが出来ます。
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Protocol
1. 花粉管の成長を調べる PDMS マイクロ デバイスの作製や原糸を苔
注意: シリコンウェーハの PDMS 金型を準備するのにマスクレス露光装置を使用しています。システムの操作に関する詳細は、本稿では省略しています。ソグラフィー技術9フォトマスクを使用しても本稿で説明した PDMS 金型を作成に使えます。
- 中古ポリマーは、PDMS 混合物の 11 グラムを注ぐ (エラストマー ベース: 硬化剤 10:1 の比率で) 各 4 インチ型に。
- 手順 1.1 真空チャンバー内で 20 分間で金型をドガします。
- 非対流のオーブンで 90 分の 65 ° C で硬化後、金型を PDMS 層の皮をむくし、生検パンチを使用流体チャンネルにアクセス穴をパンチします。
注意: 花粉管装置の穴のサイズは雌しべの直径に合わせて調整する必要があります。したがって、この値は、種によって異なります。この実験では、雌しべの吸気 1 mm の穴および液体の中の貯水池の 1.5 mm の穴をパンチしました。コケ原糸体デバイスの 4 mm の穴は、サンプル保存容器に使われました。 - 50 のプラズマを空気に PDMS 層とガラス底皿 (直径 3.5-5 cm) を公開 s。
- 微小流体ネットワークを完全に封鎖する非対流オーブンで 30 分間ガラス底皿と 65 ° C で熱に PDMS 層を押し込みます。
2. 根毛の PDMS マイクロ デバイスの作製
- 1.1 1.3 金型を使用したルートおよびルート髪マイクロ デバイスの 2 つの PDMS 層を準備の手順を繰り返します。
注意: ルート マイクロ デバイスに液体中の貯水池に 2 mm の穴を使用しています。 - 50 のプラズマを空気に両方の PDMS のレイヤーを公開 s。
- カスタム デスクトップ アライナを使用して顕微鏡下で 2 つの PDMS 層を組み立てます。
注: これらの PDMS 層のマイクロ互いに直面する必要があります。、を組み立てる前に両方のレイヤーの位置合わせマーク一致していることを確認します。 - 65 ° c 微小流体ネットワークを完全に封鎖する非対流オーブンで 30 分加熱します。
- 構築されたマイクロ デバイスからカバー スリップを取り出し、直径 5 cm ガラス底皿にデバイスを置きます。
3. 準備体外細胞培養液中の花粉管 (トレニア)
- 20 分の15とオートクレーブを前述のように変更した Nitsch の媒体 121 ° C にある媒体を準備します。
注: 修飾された Nitsch の培地の組成は NH4いいえ3 (80 mg/L)、自演3 (125 mg/L)、Ca (3)2‧4H2O (500 mg/L)、MgSO4‧7H2O (125 mg/L)、KH2PO4 (125 mg/L)、MnSO4‧4H2O (3 mg/L)、ZnSO4‧7H2O (0.5 mg/L)、H3ボー3 (10 mg/L)、CuSO4‧5H2O (0.025 mg/L)、ナ2MoO4‧2H2O (0.025 mg/L)、(50,000 mg/L)、ショ糖、カゼイン (500 mg/L)。準備された媒体は 4 ° C で少なくとも 4 ヶ月間保存できます。 - 26% (w/v) ポリエチレング リコール オートクレーブ脱イオン水を使用しての準備し、ソリューションをフィルター 0.3 μ m 孔フィルターと。
注: 準備された媒体は 4 ° C で 1 ヶ月保存できます。 - ステップ 3.1 と 1:1 (v/v) 比で 3.2 の試薬を混ぜます。
注: この媒体準備されるべき新鮮な使用するたびに。
4. 根毛 (シロイヌナズナ) の体外細胞培養液の準備
- 0.215% (w/v) 培地・培、0.05% (w/v) MES の 1% (w/v) ショ糖と純水で 1% (w/v) 寒天溶液を準備します。オートクレーブ 121 ° C、20 分でソリューション。
5 コケ原糸体 (ヒメツリガネゴケ) の体外細胞培養液の準備
- 中古 BCDAT 中16ペトリ皿でコケ原糸を孵化させなさい。
注: BCDAT 培地の組成は 1 mM MgSO4、10 mM 自演3、45 μ M FeSO4、1.8 mM KH2PO4 (pH 島の 6.5 に調整)、微量元素液 (0.22 μ M CuSO4, 0.19 μ M ZnSO4, 10 μ M H3ボー3、0.1 μ M Na2MoO4、2 μ M MnCl2、0.23 μ M CoCl2、および 0.17 μ M KI)、1 mM CaCl2、および 5 mM アンモニウム (+)-酒石酸。 - 文化 BCDATG マイクロ中でモス。
注: BCDATG メディアは、0.5% (w/v) グルコースと BCDAT 中です。準備された媒体は、1 ヶ月の 4 ° C で保存できます。
6. t. について花粉管、マイクロ デバイスのin Vitro培養
- 真空チャンバー内で花粉管マイクロ デバイスを置き、ドガの 20 分間。
- 真空チャンバーからマイクロを削除し、極細先端のピペットを使用して雌しべ入口に成長培地をご紹介します。同じ媒体でそのトップに残りの井戸を埋めます。すべての内壁が内壁の中作成された真空による媒体で満ちているまで、数分待ちます。
- 皿の中の湿度を維持するためにガラスの下皿にいくつか湿らせたペーパー タオルを配置します。
- 野生型から花粉を転送解剖針を用いてその汚名にt. について「青と白の花。
注: また実験を行いこのトランスジェニックt. についてと 'バイオレット クラウン' 花 ( RPS5Ap::H2B tdTomatoライン17)、花粉管の蛍光に分類された精子細胞と栄養核を含みます。 - カット (1 センチ) の受粉のスタイルは、ブレードを使用します。
- 図 2に示すように、デバイスの入口にカット スタイルを挿入します。
- 皿にふたをかぶせるし、テープでそれを封印します。
- 暗闇の中で 5-6 時間 28 ° c の定温器のデバイスの場所。
7. マイクロにおけるシロイヌナズナ根毛のin Vitro培養
注: 手順 7.1 7.9 7.3 と 7.5) を除くは層流フードで実行する必要があります。
- シロイヌナズナコロンビア (コル-0) から種子を殺菌し、transgenic ラインの無菌の液体 (5% (v/v) 世帯の漂白剤と 0.02% (v/v) トリトン X-100) 5 分でそれらを浸すことによってUBQ10pro::H2B mClover (蛍光核マーカーを含む)。
- オートクレーブ処理した水で滅菌の種子を徹底的にすすいでください。
- 暗闇の中で 4 ° C で 2 日間水で洗った種を格納します。
- 一晩、UV 光の下でマイクロ デバイスを滅菌します。
- 真空チャンバー内でマイクロを置き、ドガの 20 分間。
- マイクロ ピペットを使用して、デバイスでの井戸に成長培地を紹介します。真空は、媒体とマイクロ流路をいっぱいになるまで、数分待ってください。
- 皿の中の湿度を維持するためにガラスの下皿にオートクレーブ湿らせたペーパー タオルを配置します。
- デバイスの入口に種子を滅菌を転送します。
- 皿にふたをかぶせるし、テープでそれを封印します。
- 連続白色光の下で 22 ° C でインキュベーターでデバイスを垂直方向に配置します。
- 4-10 日の孵化後ルート髪の成長を確認してください。明視野、倒立顕微鏡を用いた蛍光画像を取得します。
8.ヒメツリガネゴケ(モス) マイクロ流体デバイスの原糸体のin Vitro培養
注: 手順 8.2 8.6 (8.3) を除くは層流フードで実行する必要があります。
- ヒメツリガネゴケひずみ Gransden 200418 25 ° C で連続的な白色光の下で一週間シャーレのセロファンで覆われて BCDAT 中の preculture します。
- 層流フードの一晩紫外線の下でマイクロ デバイスを滅菌します。
- 真空チャンバー内でマイクロを置き、ドガの 20 分間。
- マイクロ ピペットを使用して井戸に成長培地をご紹介します。真空は、媒体とマイクロ流路をいっぱいになるまで、数分待ってください。
- 皿の中の湿度を維持するためにマイクロ デバイスを囲む皿にオートクレーブ処理した水を追加します。
- マイクロの入口にコケ原糸体組織の小片を転送し、連続白色光の下で 25 の ° c の定温器の組織文化します。
- 孵化の 2 〜 3 週間後コケ原糸体の成長を確認してください。顕微鏡を用いた明視野画像を取得します。
9 T. について花粉管伸長のタイムラプス イメージング
- 画像集録ハードウェアを搭載した倒立蛍光顕微鏡、マイクロ デバイスに配置 (e.g。、CCD カメラ) とソフトウェア。ギャップの場所を見つけます。
注: 画像集録ソフトウェアの市販製品 (材料表) を使用しました。µManager などオープン ソース顕微鏡ソフトウェアは、利用可能なオンライン (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager) であります。高解像度画像を得るために、顕微鏡に顕微鏡コンデンサーをインストールするをお勧めします。 - すべての 10 の明視野画像をキャプチャ顕微鏡画像集録ソフトウェアを使用して s。
- 蛍光に分類された精子細胞と栄養RPS5Ap::H2B tdTomatoラインの花粉管核を観察する 561 nm レーザーを試料に照射し、帯域光学フィルターを使用 (578/105 nm)。
注: が花粉管の伸長のコマ撮り画像は頻繁に捕獲された、イメージングでした成長に影響を与えるには表示されません。ただし、レーザー強度、露光時間、光毒性と蛍光の退色を最小限に抑えるためのコマ間隔を最小化することを常にお勧めします。 - 明るさとコントラスト画像の調整し、ImageJ ソフトウェア (https://imagej.nih.gov/ij/) を使用してビデオ ファイルを準備します。
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Representative Results
図 1に示すように、植物細胞の先端成長の成長パスの vivoに沿って物理的な障壁のシリーズに遭遇します。本論文で示したセル文化プラットフォーム マイクロ流体の in vitro試験を有効に、先端成長の植物細胞 (花粉管、根毛、コケ原糸) を 1 μ m の人工の隙間 (図 3からの 3 つのタイプのプロセス図 4図 5)。花粉管の調査では、住セルイメージ投射は花粉管と同様の栄養核の根尖部の形態変化と (補足ムービー 1 と 2) の非常に小さいスペースを発生する応答内の精細胞を監視する使用されました。
我々 はそれらのいくつかが完全に気づいたが、microgaps のほとんどは、ここで説明した方法を採用することにより正常に捏造だった、(図 6) を閉鎖。シリコン型には、1 μ m 幅のチャンネルは壊れやすいので、この金型の繰り返された使用は PDMS 層にブロックのギャップにつながるギャップを傷つける恐れが。したがって、実験を実行する前に、PDMS microgaps がそのままであることを確認することが重要です。
図 1: 先端成長の浸透植物細胞を物理的に制約されたスペースにします。(A)花粉管は胚珠にその方法のいくつかの物理的な障壁を伸長します。送信管組織スタイルと珠孔が囲むされた障壁があります。(B)ルートの毛が密な土壌を貫通します。(A)と(B)のくぼみは、ボックス化された領域の拡大を表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: t. について花粉管、シロイヌナズナ根毛、ヒメツリガネゴケ原糸体を調査する使用マイクロ デバイスの特性。マイクロ流路の模式図、サンプルはアスタリスク マーク (*) で示される位置に配置。マイクロ デザイン、各デバイス、チャネル構造と細胞培養期間の写真のとおりです。この図は、柳澤らからの許可と変更されています。201719。スケール バー、20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: t. について花粉管伸長 1 μ m ギャップを介してします。(A)花粉管が 1 μ m 幅と 4 μ m 高ギャップを通過します。コマ撮りの明視野画像は、回転ディスク共焦点システムを搭載した倒立顕微鏡を使用して捕獲されました。スケール バー、20 μ m の範囲(B)時間経過イメージの蛍光に分類された栄養核と精子細胞RPS5Ap::H2B tdTomatoの花粉管ラインのギャップを渡るします。スケール バー、20 μ m 図(A)と(B)は、柳沢らからの許可と変更されています。201719。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。1 μ m ギャップを介してシロイヌナズナ根毛の伸長します。(A)根と根毛成長マイクロ。(幅 1 μ m)、高さは 4 μ m の microgaps は、ルート成長チャネルの左側に配置されます。右側にあるマイクロは microgaps が含まれていないと、コントロールとして使用することができます。スケール バー、100 μ m の範囲(B)明るいフィールド、 (C)蛍光、 (D) 、microgaps を通過根における根毛の画像がマージされます。UBQ10pro::H2B mCloverラインで、根毛の核が蛍光に分類します。各ルートの髪の先端は矢印によって示されます。スケール バー、30 μ m。これらの数字は、柳澤らからの許可と変更されています。201719。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。1 μ m ギャップを介してヒメツリガネゴケ原糸体伸長します。コケ原糸体細胞膨圧、原糸のため拡大した 1 μ m ギャップ (4 μ m の高さ) を通るします。スケール バー、20 μ m。図は、柳澤らからの許可と変更されています。201719。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。Microgaps を閉じる。1 μ m ギャップ領域の SEM 画像。右側のギャップが完全に閉じています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
附則ムービー 1。花粉管の成長を 1 μ m ギャップ。コマ明視野画像がキャプチャされたすべて 10 回転のディスク共焦点顕微鏡を搭載した倒立顕微鏡を使用して s 。スケール バー、20 μ m.ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください。
附則ムービー 2。栄養核と精子細胞の浸透 1 μ m ギャップ。コマ撮りの明るいフィールドと蛍光画像がキャプチャされたすべての 20 s 倒立蛍光顕微鏡を用いたします。スケール バー、20 μ m.ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください。
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Discussion
プロトコルのいくつかの重要な手順は、上記に示した結果を得るために正確に続くことに必要があります。まず、PDMS 層およびガラス底皿の表面両方扱われなければならないプラズマ接合前に、の時間の十分な量の。それ以外の場合、先端成長のセルは、microgaps を交差させている間、ガラス面から PDMS 層可能性がありますデタッチ ローカル。根毛とコケ原糸体のプロトコルの別の重要なステップは、マイクロの殺菌です。通常、根毛とコケ原糸体細胞は数週間のカップルのためのマイクロで培養する必要があります。デバイスを滅菌せずこれらのヒント成長細胞の成長に影響するかもしれない微生物は活気づくかもしれない。半日以内実験を締結以来、花粉管デバイスの滅菌は、重要ではありません。我々 は定期的に滅菌せず花粉管デバイスを使用しているし、実験中に任意の望ましくない影響を観察しなかった。
マイクロ デザインは、興味のセルに従って変更する必要があります。我々 の仕事でシロイヌナズナ根毛の実験のために使用されるチャネルの設計はt. について花粉管とヒメツリガネゴケ原糸体実験に使用するものと違っていた。サンプルは、異なるディメンションを持っているので、別のデバイスが必要例えば、根毛は花粉管とコケ原糸体よりもはるかに短いです。したがって、私たちの根毛デバイス ギャップ領域が主なルート チャネルに隣接するようなものを設計されました。チャネル設計に加えて根毛デバイスを準備するための手順は、花粉管のコケ原糸使用手順からも異なります。花粉管とコケ原糸体研究含む PDMS の単層ガラス底皿に対して密封マイクロ マイクロ デバイスを使用しました。根毛を研究に使用するデバイスが 2 つの PDMS 層を構成するただし、: マイクロとの最上層 (深さ: 200 μ m) の主なルートは下のレイヤーに対してシールを含むマイクロ (深さ: 4 μ m) 根毛の。シリコン型を作製する採用された標準フォトリソグラフィ技術は約 5:1 の縦横比に制限されます。したがって、1 μ m のワイド ギャップを作成するチャネルの高さは、約 5 μ m に制限されます。それはまた技術的に深いチャネルを正確に合わせて挑戦 (e.g。、200 μ m) 付近の 1 μ m シリコン型ワイド ギャップ。ですから、主根の根毛、PDMS の個別のレイヤーを用意して、それらを一緒にシールでデバイスを構築します。
このプロトコルは、ヒント microgaps (附則ムービー 1 と 2) を花粉管の成長過程を視覚化する正常に使われていた、根毛やコケ原糸伸びギャップ領域イメージング コマ以上になります。挑戦しています。シロイヌナズナ根毛を養殖で使われるマイクロ デバイス、ほとんど根毛はサイド チャンネルに進むことができないので、位置 (4 μ m) の microgaps の側チャンネルの高さあるルート成長室 (200 μ m) よりもはるかに浅い。たとえ根毛側チャネルの入り口を見つけるか、彼らはそれを入力を予測するは難しいです。ルート毛、ギャップでのコマ撮り画像をキャプチャ、イメージ獲得のための複数の位置で置かれるようにプログラムすることができます自動ステージを搭載した顕微鏡を使用をお勧めします。このようなインストルメンテーションを使用できない場合側のチャネルをすでに入力しているが、microgaps をまだ越えていない根毛の検索をお勧めします。シロイヌナズナ根毛の成長率は非常に低速なので (通常 1 〜 2.5 μ m/分20) t. について花粉管 (通常 22 23 μ m/分19) よりも、ことが可能これらの根毛のコマ撮り画像をキャプチャするにはmicrogaps に渡っているとしています。その一方で、コケ原糸体観測では、長い観察期間が必要なため成長の遅い率のため、この研究に排他的使用できますタイムラプス システムが必要。
ここで紹介したマイクロ アプローチは、非常に狭いスペースを通って延長する植物細胞の先端成長の機能を調べることができる最初の方法です。これらのマイクロはスクリーニング アッセイ先端成長の細胞壁生合成性と関連付けられる遺伝子の機能を調査する役に立つかもしれません、浸透機能により細胞。また、Denaisら。21最近核膜の破断を示したし、マイクロ流体デバイスの作製した限られたスペースを介して癌細胞を絞ることによって修復機構が花粉管を使用して同様のメカニズムが存在するかどうかを検討することが可能かもしれない、デバイス。この新開発の実験プラットフォームはどのように個々 の細胞を調査する使用ことができます物理的に制約された空間に対応し、先端成長メカニズムの私達の理解を高めることができる従って。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato線、シロイヌナズナ UBQ10pro::H2B mClover線をそれぞれ含むトランスジェニック植物をご提供する、h. 筒井と + 栗原に感謝します。この作業によって、研究所のトランスフォーマティブ生命分子の名古屋大学と日本高等植物科学ネットワークに対応しました。この仕事のための財政支援は、日本科学技術振興機構からの補助金によって提供された (ERATO プロジェクト許可なし。T. h. の JPMJER1004)、革新的な領域 (Nos 科学研究費補助金。JP16H06465 と t. h. のための JP16H06464)、挑戦的萌芽研究 (25650075, 15 K 14542 ニューヨークとグラント番のグラント号 26600061 ある) の科学振興費の日本社会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
References
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