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Bioengineering

Entwicklung von mikrofluidischen Geräten um die Dehnung Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen in sehr kleinen Räumen zu studieren

Published: May 22, 2018 doi: 10.3791/57262
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 2
1Division of Biological Science, Graduate School of Science, Nagoya University, 2Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM), Nagoya University

Summary

Wir beschreiben eine Methode, um die Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen, einschließlich der pollenschläuche, Wurzelhaare, untersuchen und Moos Protonemata, zu verlängern, durch extrem schmale Lücken (~ 1 µm) in einem mikrofluidischen Gerät.

Abstract

In Vivo, Spitze wachsenden pflanzlichen Zellen müssen eine Reihe von physischen Barrieren zu überwinden; Allerdings fehlen Forscher die Methodik um zelluläre Verhalten in solchen restriktiven Bedingungen zu visualisieren. Um dieses Problem zu beheben, haben wir Klimakammern für Tipp-wachsende Pflanzenzellen, die eine Reihe von schmalen, Mikro-fabrizierten Lücken (~ 1 µm) enthalten in einem Poly-Dimethylsiloxane (PDMS) Substrat entwickelt. Das transparente Material ermöglicht dem Benutzer, Tipp Dehnung Prozesse in einzelnen Zellen während der Mikrospalt Penetration durch Time-Lapse-Bildgebung zu überwachen. Mit Hilfe dieser experimentelle Plattform, beobachteten wir morphologische Veränderungen in pollenschläuche, wie sie der Mikrospalt eingedrungen. Die dynamischen Veränderungen in der Form eines eindringmittel beschrifteten vegetativen Kerns und Spermien in einem Pollen Rohr eingefangen wir während dieses Prozesses. Darüber hinaus haben wir die Fähigkeit der Wurzelhaare und Moos Protonemata, 1 µm Spalt durchdringen. Dieser in-vitro- Plattform verwendet werden, wie die einzelnen Zellen reagieren auf körperlich eingeschränkte Räume zu studieren und vielleicht geben Einblicke in Tipp-Wachstum-Mechanismen.

Introduction

Nachdem Pollenkörner auf ein Stigma Keimen, produziert jedes Korn ein Pollen Rohr, die Spermien in die Eizelle und die zentrale Zelle in das Ovulum für doppelte Befruchtung führt. Pollenschläuche verlängern durch den Stil und erreichen schließlich das Ovulum durch Sensierung mehrere Anleitungen Hinweise entlang ihrem Weg1. Während die Dehnung auftreten pollenschläuche eine Reihe von physischen Barrieren; die übertragende Strecke ist mit Zellen gefüllt und pollenschläuche müssen die Minute micropylar Eröffnung das Ovulum, erreichen ihr Ziel (Abbildung 1A)2eingeben. Daher müssen die pollenschläuche die Fähigkeit, physische Hindernisse, eindringen, während die Druckspannung aus ihrer Umgebung zu tolerieren. Wurzelhaare sind eine andere Art von Spitze wachsenden Pflanzenzelle, die physische Hindernisse in der Umgebung in Form von verpackten Bodenteilchen (Abbildung 1 b) standhalten muss.

Verschiedenen mechanische Eigenschaften des Rohres Pollen sind untersucht worden, darunter Turgor Druck und Steifigkeit der apikalen Region der Zelle, die mit dem beginnenden Plasmolyse Methode3,4 und zelluläre Rasterkraftmikroskopie gemessen werden kann, (CFM) 5 , 6, beziehungsweise. Diese Methoden allein zeigen jedoch nicht ob pollenschläuche durch physische Hindernisse entlang ihrer Wachstumspfade verlängern werden. Eine alternative Technik, mit dem Pollen Rohr Dehnung überwachten in Vivo zu kann ist zwei-Photonen-Mikroskopie-7. Mit dieser Methode ist jedoch schwierig zu beobachten, die morphologischen Veränderungen in einzelnen pollenschläuche tief in das Ovulum Gewebe. Darüber hinaus kann Root Haarwachstum im Boden mit visualisiert werden berechnet Röntgen-Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT)8, wenn auch mit geringer Auflösung. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, die verwendet werden, um hochauflösende Bilder von einer Zelle Verformung Prozess auf einem herkömmlichen Mikroskop zu erwerben.

Das übergeordnete Ziel des hier beschriebenen Verfahrens ist es, die Dehnung Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen, einschließlich der pollenschläuche, Wurzelhaare, zu visualisieren und Moos Protonemata, in sehr kleinen Räumen. Da die Poly-Dimethylsiloxane (PDMS) abformverfahren präsentiert in dieser Handschrift optisch transparent sind und durchlässig, wir können Kultur lebenden Zellen im Inneren des Gerätes und ihr Wachstum Verhalten unter einem Mikroskop zu beobachten. Es ist auch möglich, Mikro erstellen ~ Nanometer Skala Räume durch die weiche Lithographie-Technik9 mit der Verwendung von Formen. Diese Funktionen ermöglichen es uns, die Dehnung Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen in einer physisch beengten Umgebung zu studieren.

In dieser Arbeit, die wir gebaut 1 µm Breite Lücken (4 µm in der Höhe) in mikrofluidischen Geräten und untersucht die Fähigkeit der pollenschläuche, diese künstliche Hindernisse durchdringen, die viel kleiner sind als der Durchmesser des zylindrischen Pollen Rohr (ca. 8 µm). Diese experimentelle Plattform ermöglicht uns zu visualisieren die Pollen Rohr Reaktion auf Mikropausen und Zeitraffer-Bilder der Antwort, die die Zelle Verformung Prozess verfolgen zu erfassen. Wir haben auch die abformverfahren, die verwendet werden können, zu untersuchen, die Penetration Fähigkeit der Wurzelhaare und Moos Protonemata entwickelt. Mehrere abformverfahren wurden gemeldet, bis heute, die es ermöglichen die Visualisierung der Wurzel10,11,12,Moos und13 Protonemata14 Pflanzenwachstum mit hoher Auflösung. In unserem Gerät eine Reihe von Wurzelhaare Wachstum Kanäle senkrecht zu einer Wurzel Wachstum Kammer verbunden sind, und einzelne Wurzelhaare (etwa 7 µm im Durchmesser) orientieren sich fluidische Kanäle mit einer 1 µm breite Lücke. Wir kultiviert auch Moos Protonemata (ca. 20 µm im Durchmesser) in einer mikroapparat mit Mikropausen um ihre Reaktionen auf diese physischen Barrieren zu untersuchen. Der vorgeschlagene mikrofluidischen basierenden Ansatz erlaubt uns, erkunden die Fähigkeit der verschiedenen Tipp wachsenden Pflanzenzellen zu verlängern durch extrem kleine Räume, die von keiner anderen derzeit verfügbaren Methode geprüft werden kann.

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Protocol

1. Herstellung von PDMS Mikroapparat, wachsen Pollenschläuche zu untersuchen und Moos Protonemata

Hinweis: Wir verwendet ein Instrument maskless Photolithographie PDMS Formen auf Silizium-Wafer vorzubereiten. Die Details zur Bedienung des Systems werden in dieser Handschrift ausgelassen. Ein standard Photolithographie Technik9 mit einer Fotomaske kann auch verwendet werden, um die PDMS Formen beschrieben in dieser Handschrift zu erstellen.

  1. 11 g Pre-Polymer PDMS Mischung Gießen (Elastomer Basis: Härtemittel im Verhältnis 10:1) in jedem 4-Zoll-Form.
  2. Entgasen Sie den Schimmel in Schritt 1.1 für 20 min in einer Vakuumkammer vorbereitet.
  3. Nach der Aushärtung bei 65 ° C für 90 min in einem Umluftofen, schälen der PDMS-Schicht aus der Form und Zugang Löcher in die fluidische Kanäle mit Biopsie-Stanzen Stanzen.
    Hinweis: Für die Pollen Rohr Gerät, muss die Größe des Lochs angepasst werden den Durchmesser des Stempels. Dieser Wert variiert daher von Arten. In diesem Experiment gestanzt wir ein 1 mm Loch für die Stempel-Eingänge und 1, 5 mm Löcher für die flüssigen Mittel Stauseen. Für das Moos Protonemata Gerät wurde ein 4 mm Loch für das Probe-Reservoir verwendet.
  4. Aussetzen der PDMS-Schicht und einer Glasschale unten (3,5-5 cm im Durchmesser) Luft-Plasma für 50 s.
  5. Drücken Sie die PDMS-Schicht in die untere Glasschale und Wärme bei 65 ° C für 30 min in einem nicht-Umluftofen, mikrofluidischen Netzwerk komplett abzuschotten.

2. Herstellung von PDMS Mikroapparat für Wurzelhaare

  1. Wiederholen Sie die Schritte 1.1-1.3 mit den Formen zwei PDMS-Schichten für die Wurzel und der Wurzelhaare abformverfahren vorzubereiten.
    Hinweis: Wir haben ein 2 mm Loch für den flüssigen mittlere Stauseen in der Wurzel mikroapparat.
  2. Setzen Sie beide PDMS-Layer, um Luft-Plasma für 50 s.
  3. Montieren Sie die beiden PDMS-Schichten unter einem Stereomikroskop mit einem maßgeschneiderten Desktop-Aligner.
    Hinweis: Die Mikrokanäle auf diese PDMS-Schichten müssen zueinander zeigen. Stellen Sie vor der Montage sicher, dass die Ausrichtungsmarken auf beiden Ebenen zusammenpassen.
  4. Erwärmen Sie auf 65 ° C für 30 min in einem nicht-Umluftofen, mikrofluidischen Netzwerk komplett abzuschotten.
  5. Entfernen Sie das Deckglas aus der konstruierten mikroapparat und stellen Sie das Gerät auf einer Glasschale unten, die 5 cm im Durchmesser ist.

3. Vorbereitung der In vitro- Zellkulturmedium Pollenschläuche (Torenia Fournieri)

  1. Bereiten Sie modifizierte Nitsch Medium wie zuvor beschrieben15 und Autoklaven das Medium bei 121 ° C für 20 min.
    Hinweis: Die Zusammensetzung des Mediums der veränderten Nitsch ist NH4NO3 (80 mg/L), KNO3 (125 mg/L), Ca (NO3)2‧4H2O (500 mg/L), MgSO4‧7H2O (125 mg/L), KH2PO4 (125 mg/L ), MnSO4‧4H2O (3 mg/L), ZnSO4‧7H2O (0,5 mg/L), H3BO3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0,025 mg/L), Na2MoO4‧2H2O (0,025 mg/L) Saccharose (50.000 mg/L) und Kasein (500 mg/L). Das vorbereitete Medium kann mindestens 4 Monate bei 4 ° C gespeichert werden.
  2. 26 % (w/V) Polyethylenglykol mit autoklaviert deionisiertes Wasser bereiten und die Lösung mit einem 0,3 µm-Poren-Filter filtern.
    Hinweis: Das vorbereitete Medium kann bei 4 ° C für 1 Monat gespeichert werden.
  3. Mischen der Reagenzien in Schritt 3.1 und 3.2 im Verhältnis 1:1 (V/V) vorbereitet.
    Hinweis: Dieses Medium sollte frisch für jeden Gebrauch vorbereitet werden.

4. Vorbereitung der In vitro- Zellkulturmedium Wurzelhaare (Arabidopsis Thaliana)

  1. Bereiten Sie eine Lösung aus 0.215 % (w/V) Murashige & Skoog Medium, 0,05 % (w/V) MES, 1 % (w/V) Saccharose und 1 % (w/V) Agar in entionisiertem Wasser. Autoklaven die Lösung bei 121 ° C für 20 Minuten.

5. Vorbereitung der In vitro- Zellkulturmedium für Moss Protonemata (Physcomitrella Patens)

  1. Pre-inkubieren Sie Moos Protonemata BCDAT mittlere16 in einer Petrischale.
    Hinweis: Die Zusammensetzung des BCDAT Mediums ist 1 mM MgSO4, 10 mM KNO3, 45 µM FeSO4, 1,8 mM KH2PO4 (pH 6,5 mit KOH angepasst), Spurenelement-Lösung (0,22 µM CuSO4, 0,19 µM ZnSO4, 10 µM H3BO 3, 0,1 µM Na2MoO4, 2 µM MnCl2, 0,23 µM CoCl2und 0,17 µM KI), 1 mM CaCl2und 5 mM Diammonium (+)-Tartrat.
  2. Kultur das Moos im BCDATG Medium in den mikroapparat.
    Hinweis: Das BCDATG Medium ist BCDAT Medium mit 0,5 % (w/V) Glucose. 1 Monat kann die vorbereitete Medium bei 4 ° C aufbewahrt werden.

6. in-vitro- Culturing von T. Fournieri Pollenschläuche in der Mikroapparat

  1. Legen Sie die Pollen Rohr mikroapparat in einer Vakuumkammer und für 20 min entgasen.
  2. Entfernen Sie die mikroapparat aus der Vakuumkammer und stellen Sie das Wachstumsmedium Stempel Einlauf mit einer Mikropipette mit einer sehr feinen Spitze. Füllen Sie die restlichen Brunnen, ihre Spitzen mit dem gleichen Medium. Warten Sie einige Minuten, bis die Mikrokanäle mit dem Medium durch das Vakuum im Inneren der Mikrokanäle gefüllt sind.
  3. Legen Sie einige feuchten Papiertuch in untere Glasschale halten die Feuchtigkeit in der Schale.
  4. Übertragen Sie die Pollenkörner von Wildtyp- T. Fournieri "blau und weiß" Blüte auf die Narbe mit einer Dissektion Nadel.
    Hinweis: Wir haben auch dieses Experiment mit einer transgenen T. Fournieri 'Crown violett' Blume ( RPS5Ap::H2B-TdTomato Linie17), mit pollenschläuche, eindringmittel beschrifteten Samenzellen und vegetative Kerne enthält.
  5. Schnitt der bestäubten Stil (1 cm lang) mit Hilfe einer Klinge.
  6. Einfügen Sie die geschliffenen Stil in den Einlass des Geräts, wie in Abbildung 2dargestellt.
  7. Setzen Sie einen Deckel auf die Schüssel und mit Klebeband versiegeln.
  8. Stellen Sie das Gerät in einem Inkubator bei 28 ° C für 5-6 h in der Dunkelheit.

7. in-vitro- Culturing von A. Thaliana Wurzelhaare in der Mikroapparat

Hinweis: Schritte 7.1-7.9 (mit Ausnahme von 7.3 und 7.5) sollten in einem Laminar-Flow-Abzug durchgeführt werden.

  1. Samen von A. Thaliana Columbia (Col-0) zu sterilisieren und die transgene Linie UBQ10pro::H2B-mClover (mit den nuklearen fluoreszierenden Marker) durch Einweichen in sterile Flüssigkeit (5 % (V/V) haushaltsbleiche und 0,02 % (V/V) Triton x-100) für 5 Minuten.
  2. Spülen Sie die sterilisierten Samen mit autoklaviert Wasser.
  3. Speichern Sie die gespülten Samen in Wasser für 2 Tage bei 4 ° C in der Dunkelheit.
  4. Sterilisieren Sie die mikroapparat unter UV-Licht über Nacht.
  5. Legen Sie die mikroapparat in einer Vakuumkammer und für 20 min entgasen.
  6. Die Brunnen in das Gerät mit einer Mikropipette stellen Sie das Wachstumsmedium vor. Warten Sie einige Minuten, bis das Vakuum die Mikrokanäle mit dem Medium füllt.
  7. Legen Sie autoklaviert feuchten Papiertuch in untere Glasschale halten die Feuchtigkeit in die Schüssel.
  8. Übertragen Sie eine sterilisierte Saat in den Einlass des Geräts.
  9. Setzen Sie einen Deckel auf die Schüssel und mit Klebeband versiegeln.
  10. Stellen Sie das Gerät vertikal in einem Inkubator bei 22 ° C unter weißes Dauerlicht.
  11. Überprüfen Sie Root Haarwachstum nach 4-10 Tagen Inkubationszeit. Erhalten Sie Hellfeld und fluoreszierende Bilder mit einem inversen Mikroskop.

8. in-vitro- Culturing von p. Patens (Moos) Protonemata in mikrofluidischen Gerät

Hinweis: Schritte 8,2-8,6 (mit Ausnahme von 8,3) sollten in einem Laminar-Flow-Abzug durchgeführt werden.

  1. Preculture p. Patens Stamm Gransden 200418 auf BCDAT Medium bedeckt mit Cellophan in einer Petrischale für eine Woche unter weißes Dauerlicht bei 25 ° C.
  2. Sterilisieren Sie die mikroapparat unter UV-Licht über Nacht in einer Laminar-Flow-Haube.
  3. Legen Sie die mikroapparat in einer Vakuumkammer und für 20 min entgasen.
  4. Der Brunnen mit einer Mikropipette stellen Sie das Wachstumsmedium vor. Warten Sie einige Minuten, bis das Vakuum die Mikrokanäle mit dem Medium füllt.
  5. Fügen Sie autoklaviert Wasser in die Schüssel rund um die mikroapparat um die Feuchtigkeit in die Schüssel zu halten.
  6. Ein kleines Stück Moos Protonemata Gewebe mit dem Einlass der mikroapparat übertragen und Kultur das Gewebe in einem Inkubator bei 25 ° C unter weißes Dauerlicht.
  7. Überprüfen Sie das Moos Protonemata Wachstum nach 2-3 Wochen nach der Inkubation. Hellfeld-Bilder unter Verwendung eines Mikroskops zu erhalten.

9. Zeitraffer Bildgebung von T. Fournieri Pollen Rohr Wachstum

  1. Legen Sie die mikroapparat auf eine invertierte Fluoreszenzmikroskop mit Bild Datenerfassungshardware ausgestattet (zB., einer CCD-Kamera) und Software. Finden Sie die Mikrospalt Positionen.
    Hinweis: Für die Bild-Datenerfassungs-Software verwendeten wir ein handelsübliches Produkt (Table of Materials). Open-Source-Mikroskopie-Software wie µManager ist auch online verfügbar (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Wir empfehlen die Installation eines Mikroskop-Kondensators am Mikroskop Bilder mit höherer Auflösung zu erhalten.
  2. Hellfeld-Aufnahmen alle 10 s mit Mikroskop-Bild-Datenerfassungs-Software.
  3. Um das eindringmittel beschrifteten Spermien und vegetativen Kern in der Pollen-Röhre der Linie RPS5Ap::H2B-TdTomato zu beobachten, die Probe mit 561 nm Laser zu bestrahlen und verwenden einen optischen Bandpassfilter (578/105 nm).
    Hinweis: Obwohl die Zeitraffer-Bilder der Pollen Rohr Wachstum häufig erfasst wurden, Bildgebung schien nicht zu Wachstum beeinflussen. Es wird jedoch immer empfohlen zur Minimierung der Laserintensität, Belichtungszeit und Zeitraffer-Intervall, Phototoxizität und Immunofluoreszenz der Fluorophor zu minimieren.
  4. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast der Bilder und bereiten Sie eine Videodatei mit ImageJ-Software (https://imagej.nih.gov/ij/).

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Representative Results

Wie in Abbildung 1dargestellt, stoßen Spitze wachsenden Pflanzenzellen eine Reihe von physischen Barrieren entlang deren Wachstum Pfade in Vivo. Mikrofluidische in-vitro- Zelle Kultur Plattformen präsentiert in dieser Studie ermöglicht die Prüfung der Tipp-wachsender Prozess in drei Arten von Pflanzenzellen (pollenschläuche Wurzelhaare und Moos Protonemata) durch künstliche Lücken 1 µm (Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5). Für die Pollen Rohr-Studie wurde live Cell Imaging zur morphologischen Veränderungen in der apikalen Region der pollenschläuche sowie die vegetativen Kern und Samenzellen als Reaktion auf die Begegnung mit kleinstem Raum (Supplemental Movie 1 und 2) zu überwachen.

Obwohl die meisten die Mikropausen erfolgreich durch den Einsatz der hier beschriebenen Methode hergestellt wurden, wir bemerkt, dass ein paar von ihnen komplett geschlossen (Abbildung 6). Weil die 1 µm Breite Kanäle erstellt auf dem Silizium-Schimmel zerbrechlich sind, kann die Lücken, führt um zu Lücken in der PDMS-Ebene blockiert wiederholter Gebrauch von dieser Form beschädigt werden. Daher, bevor Sie das Experiment durchführen, ist es wichtig zu prüfen, ob die Mikropausen PDMS intakt sind.

Figure 1
Abbildung 1: Eindringen der Spitze wachsenden Pflanzenzellen in körperlich eingeschränkte Räume. (A) Pollen Rohr verlängern durch mehrere physische Barrieren auf dem Weg zu einer Eizelle. Barrieren sind Übertragung Trakt Gewebe in den Stil und die Integumente rund um die mikropyle. (B) Wurzelhaare dichten Boden durchdringt. Kartenausschnitte in (A) und (B) zeigen Vergrößerungen der geschachtelten Regionen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Merkmale der abformverfahren pollenschläuche T. Fournieri , A. Thaliana Wurzelhaare und p. Patens Protonemata untersucht. In den schematischen Zeichnungen der Mikrokanäle, befindet sich ein Beispiel am Standort durch ein Sternchen-Zeichen (*) gekennzeichnet. Microchannel Designs, Fotos von jedem Gerät, Kanalstrukturen und Zelle Kultivierung Perioden werden zusammengefasst. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Yanagisawa Et al.modifiziert. 201719. Skala bar 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: T. Fournieri Pollen Rohr Dehnung durch einen Spalt von 1 µm. (A) Pollen Rohr 1 µm breit und 4 µm hohen Lücke auf der Durchreise. Die Zeitraffer-Hellfeld-Bilder wurden aufgenommen mit einem inversen Mikroskop mit einem konfokalen Spinning-Disk-System ausgestattet. Maßstabsleiste, Linie 20 µm. (B) Zeit Zeitraffer Bilder aus einem eindringmittel beschrifteten vegetativen Kern und Spermien in einem Pollen Rohr des RPS5Ap::H2B-TdTomato der Mikrospalt überqueren. Maßstabsleiste, 20 µm. Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Yanagisawa Et Al (A) und (B) geändert wurden. 201719. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. A. Thaliana Wurzelhaare Dehnung durch einen 1 µm Spalt. (A) Stamm und Wurzel Haar Wachstum in der mikroapparat. Die Mikropausen (1 µm Breite) und 4 µm in der Höhe befinden sich auf der linken Seite der Stammkanal Wachstum. Die Mikrokanäle auf der rechten Seite enthalten keine Mikropausen und kann als ein Steuerelement verwendet werden. Maßstabsleiste, 100 µm. (B) Hellfeld, Fluoreszenz (C) und (D) zusammengeführt Bilder der Wurzelhaare durch die Mikropausen. Die Kerne in Wurzelhaare sind eindringmittel in der UBQ10pro::H2B-mClover -Linie gekennzeichnet. Die Spitze des Haares Wurzel wird durch einen Pfeil angezeigt. Maßstabsleiste, 30 µm. Diese Zahlen wurden mit freundlicher Genehmigung von Yanagisawa Et al.geändert. 201719. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5. P. Patens Protonemata Dehnung durch einen 1 µm Spalt. Moos Protonemata Zellen durch eine Lücke von 1 µm (4 µm in der Höhe), die durch Turgor Druck von der Protonemata erweitert wurde. Maßstabsleiste, 20 µm. Die Figur wurde mit freundlicher Genehmigung von Yanagisawa Et al.modifiziert. 201719. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6. Mikropausen geschlossen. REM-Aufnahme von 1 µm-Lücke-Gebiet. Der Mikrospalt auf der rechten Seite ist komplett geschlossen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Film 1. Pollen Rohr Wachstum durch ein 1 µm Spalt. Time-Lapse Hellfeld Aufnahmen wurden alle 10 s mit einem inversen Mikroskop mit einer drehenden Scheibe confocal Mikroskop ausgestattet. Skala bar 20 µm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Film 2. Eindringen von den vegetativen Kern und Samenzellen durch ein 1 µm Spalt. Time-Lapse hellen Bereich und Fluoreszenz-Bilder wurden aufgenommen alle 20 s mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop. Skala bar 20 µm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

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Discussion

Mehrere wichtige Schritte im Protokoll müssen befolgt werden, um genau die oben dargestellten Ergebnisse zu erzielen. Erstens müssen die PDMS Schicht und Glas Schüssel Bodenflächen sowohl mit Plasma für eine ausreichende Menge an Zeit vor der Verklebung behandelt werden. Andernfalls kann die PDMS-Schicht lokal von der Glasoberfläche lösen, während Tipp erzeugenden Zellen die Mikropausen kreuzen. Ein weiterer entscheidender Schritt in der Wurzelhaare und Moos Protonemata-Protokoll ist die Sterilisation von der mikroapparat. Wurzelhaare und Moos Protonemata Zellen müssen in der Regel für ein paar Wochen in den mikroapparat kultiviert werden. Ohne das Gerät sterilisieren, können Mikroorganismen gedeihen, die könnten das Wachstum dieser Tipp erzeugenden Zellen beeinflussen. Sterilisation von Pollen Rohr-Gerät ist nicht so kritisch, da das Experiment innerhalb eines halben Tages abgeschlossen wird. Wir haben regelmäßig die Pollen Rohr Gerät ohne Sterilisation und beobachteten unerwünschten Nebenwirkungen während des Experiments.

Der Microchannel-Entwurf sollte nach der Zellen von Interesse geändert werden. In unserer Arbeit war die Kanaldesign verwendet für das A. Thaliana Wurzelhaare Experiment unterscheidet sich von der für das T. Fournieri Pollen Rohr und p. Patens Protonemata Experimente verwendet. Verschiedene Geräte sind erforderlich, da die Proben verschiedene Dimensionen haben; zum Beispiel sind Wurzelhaare viel kürzer als die pollenschläuche und Moos Protonemata. Daher wurde unser Wurzelhaare Gerät derart ausgebildet, dass die Mikrospalt Regionen neben der Hauptwurzel Kanal waren. Neben dem Kanaldesign variiert das Verfahren für die Vorbereitung der Wurzelhaare Gerät auch von Verfahren zur pollenschläuche oder Moos Protonemata. Für die Pollen Rohr und Moos Protonemata Studien verwendeten wir ein mikroapparat mit einem einlagigen PDMS mit der Mikrokanäle gegen eine Glasschale unten abgedichtet. Aber das Gerät zur Untersuchung der Wurzelhaare umfasst zwei PDMS-Schichten: die oberste Schicht mit einem Microchannel (Tiefe: 200 µm) denn die Hauptwurzel ist gegen die Unterschicht versiegelt, enthält Mikrokanäle (Tiefe: 4 µm) für Wurzelhaare. Die standard Photolithographie-Technik, die eingesetzt wurde, die Silikon-Form zu fabrizieren beschränkt sich auf ein Seitenverhältnis von 5:1. Daher erstellen Sie eine 1 µm tiefe Kluft, werden die Kanalhöhe auf etwa 5 µm begrenzt. Es ist auch technisch schwierig, eine Tiefe Rinne genau ausrichten (zB., 200 µm) in der Nähe von 1 µm Kluft auf einer Silikon-Form. Daher wir separate PDMS-Layer für die Hauptwurzel und der Wurzelhaare vorbereitet, und das Gerät durch das Versiegeln sie zusammen gebaut.

Während dieses Protokoll erfolgreich verwendet wurde, um die Spitze wachsenden Prozess der pollenschläuche durch die Mikropausen (ergänzende Movie 1 und 2), Time-Lapse imaging der Wurzelhaare visualisieren und Moos Protonemata Dehnung an der Mikrospalt Region mehr wäre eine Herausforderung. In der mikroapparat verwendet für die Kultivierung von A. Thaliana Wurzelhaare ist die Höhe der den Seitenarmen, wo die Mikropausen gelegen (4 µm) sind, viel flacher als die der Wurzel Wachstum Kammer (200 µm), so dass die meisten Wurzelhaare nicht in der Lage sind, in die seitlichen Kanäle gehen. Auch wenn die Wurzelhaare der seitlichen Kanaleingang finden, ist es schwer vorherzusagen, wann sie es betreten wird. Zeitraffer-Bilder der Wurzelhaare Wachstum bei der Mikrospalt zu erfassen, empfehlen wir, unter Verwendung eines Mikroskops, ausgestattet mit einem automatisierten Stadium, die programmiert werden kann, um an mehreren Positionen für die Bildaufnahme gelegen sein. Wenn solche Geräte nicht verfügbar ist, empfiehlt es sich, auf der Suche nach der Wurzelhaare, die die seitlichen Kanäle bereits eingegeben haben, aber die Mikropausen noch nicht überschritten haben. Da die Wachstumsrate von A. Thaliana Wurzelhaare viel langsamer ist (in der Regel 1 bis 2,5 µm/min20) als das von T. Fournieri pollenschläuche (in der Regel 22-23 µm/min19), es kann möglich sein, diese Wurzelhaare Zeitraffer Aufnahmen Das sollen die Mikropausen überqueren. Auf der anderen Seite erfordern Moos Protonemata Beobachtungen eine Zeitraffer-System, die ausschließlich für diese Studie verwendet werden kann, da ein längeren Beobachtungszeitraum aufgrund der langsamen Wachstumsrate erforderlich ist.

Die hier vorgestellten mikrofluidischen Ansatz ist die erste Methode, die uns erlaubt, die Fähigkeit der Pflanzenzellen Spitze wächst, durch extrem schmale Räume verlängern zu studieren. Diese abformverfahren möglicherweise hilfreich für screening-Tests, die die Funktionen von Genen verbunden mit Zellwand-Biosynthese und die Integrität der Spitze wachsenden untersuchen Zellen durch ihre Fähigkeit, eindringen. Darüber hinaus Denais Et Al. 21 vor kurzem gezeigt, einen Bruch der Kernhülle und Repair-Mechanismus durch quetschen eine Krebszelle durch einen geschlossenen Raum vorbereitet in einem mikrofluidischen Gerät, und es kann möglich sein, prüfen, ob ein ähnlicher Mechanismus Existiert in pollenschläuche mit unserer Gerät. Diese neu entwickelte experimentelle Plattform kann verwendet werden, zu untersuchen, wie die einzelnen Zellen reagieren auf körperlich eingeschränkte Räume und können damit unser Verständnis der Mechanismen der Tipp-Wachstum.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

H. Tsutsui und D. Kurihara danken wir für die uns mit transgenen Pflanzen, einschließlich der T. fournieriRPS5Ap::H2B-TdTomato -Linie und die Linie A. Thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , beziehungsweise. Diese Arbeit wurde durch das Institut der transformativen Biomoleküle der Universität Nagoya und Japan Advanced Plant Science Network unterstützt. Finanzieller Unterstützung für diese Arbeit wurde durch Zuschüsse zur Verfügung gestellt, von der Japan Science and Technology Agency (ERATO Projekt gewähren keine. JPMJER1004 für t.h.), eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (Nos. JP16H06465 und JP16H06464 für t.h.), und Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid für anspruchsvolle Pionierforschung (Grant Nr. 26600061 für New York und Grant Nr. 25650075 und 15 K 14542 für YS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Dow Corning Co. Sylgard184
Murashige & Skoog Medium Wako Pure Chemical 392-00591
MES Dojindo 345-01625
Sucrose Wako Pure Chemical 196-00015
50 mm glass-bottom dish Matsunami Glass D210402
35 mm glass-bottom dish Iwaki  3971-035
Surgical blade Feather No.11
biopsy punches Harris Uni-Core
Gel loading tips Bio-Bik 124-R-204
Inverted Microscope Olympus IX83
CSU-W1 Yokogawa Electric No Catalog number is avairable for this customized microscope
MetaMorph imaging software Molecular Devices

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References

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Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Higashiyama, T., Sato, Y. Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces. J. Vis. Exp. (135), e57262, doi:10.3791/57262 (2018).

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