Summary
يمكننا وصف أسلوب التحقيق في القدرة على نصيحة زراعة الخلايا النباتية، بما في ذلك أنابيب حبوب اللقاح، وجذور الشعر، وموس بروتونيماتا، تمديد عبر الفجوات ضيقة للغاية (~ 1 ميكرومتر) في جهاز موائع جزيئية.
Abstract
في فيفو، نصيحة زراعة الخلايا النباتية تحتاج إلى التغلب على سلسلة من الحواجز المادية؛ بيد أن الباحثين تفتقر إلى منهجية لتصور السلوك الخلوية في هذه الشروط التقييدية. لمعالجة هذه المسألة، وقد وضعنا دوائر النمو لنصيحة زراعة الخلايا النباتية التي تحتوي على سلسلة من الفجوات الضيقة، مايكرو ملفق (~ 1 ميكرومتر) في ركيزة بولي-ديميثيلسيلوكساني (PDMS). هذه مادة شفافة تسمح للمستخدم بمراقبة العمليات استطالة نصيحة في الخلايا الفردية أثناء الاختراق ميكروجاب بالوقت الفاصل بين التصوير. باستخدام هذا البرنامج التجريبي، لاحظنا التغييرات الشكلية في أنابيب اللقاح كما أنهم توغلوا في ميكروجاب. ألقينا القبض على خلايا الحيوانات المنوية في أنبوب اللقاح والتغيرات الدينامية في شكل نواة النباتي المسمى فلوريسسينتلي خلال هذه العملية. وعلاوة على ذلك، أثبتنا قدرة جذر الشعر وبروتونيماتا موس على اختراق الفجوة 1 ميكرومتر. يمكن استخدامها لدراسة كيف الفردية الخلايا تستجيب لمسافات مقيدة فعلياً هذا المنهاج في المختبر ويمكن أن يوفر رؤى آليات النمو تلميح.
Introduction
بعد أن تنبت حبوب اللقاح على وصمة عار، تنتج كل الحبوب أنبوب اللقاح واحد يحمل الخلايا المنوية لخلية البويضة والخلية المركزية في أبل للتسميد مزدوجة. تمديد من خلال النمط أنابيب اللقاح وفي نهاية المطاف التوصل إلى ovule واسطة الاستشعار إشارات التوجيه متعددة على طول هذه الطريق1. أثناء الاستطالة، أنابيب اللقاح تواجه سلسلة من الحواجز المادية؛ المسار يحيل مليء بالخلايا، ويجب إدخال اللقاح أنابيب دقيقة فتح ميكروبيلار أبل للوصول إلى تلك المستهدفة (الشكل 1A)2. ولذلك، يجب أن يكون لديك أنابيب اللقاح القدرة على اختراق الحواجز المادية، مع التغاضي عن إجهاد ضاغطة من البيئة المحيطة بهم. الشعر الجذر هي نوع آخر من تلميح زراعة الخلايا النباتية التي يجب أن تحمل العقبات المادية في البيئة، وفي شكل جسيمات التربة معبأة (الشكل 1B).
وقد درست مختلف الخصائص الميكانيكية للأنبوب حبوب اللقاح، بما في ذلك ضغط تورم وتصلب المنطقة قمي للخلية، والتي يمكن قياسها باستخدام3،بلاسموليسيس وليدة الأسلوب4 ومجهر القوة الخلوية (CFM) 5 , 6، على التوالي. ومع ذلك، هذه الأساليب وحدها لا تكشف عما إذا كانت أنابيب اللقاح قادرون على التمطيط من خلال الحواجز المادية على طول مسارات النمو. هو أسلوب بديل يتيح استطالة أنبوب اللقاح المرصودة في فيفو مجهرية فوتون اثنين7. ومع ذلك، باستخدام هذا الأسلوب، من الصعب مراقبة التغييرات الشكلية في أنابيب اللقاح الفردية العميقة داخل الأنسجة أبل. بالإضافة إلى ذلك، نمو الشعر الجذر في التربة يمكن تصور استخدام الأشعة السينية حسبت التصوير المقطعي (CT) والتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)8، أن كان ذلك مع دقة منخفضة. نقدم هنا، طريقة التي يمكن استخدامها للحصول على صور عالية الاستبانة لعملية تشوه لإحدى الخلايا في مجهر التقليدي.
والهدف العام للأسلوب الموصوفة هنا هو تصور قدرة استطالة نصيحة زراعة الخلايا النباتية، بما في ذلك أنابيب حبوب اللقاح، وجذور الشعر، وموس بروتونيماتا، في مساحات صغيرة للغاية. كما ميكروديفيسيس بولي-ديميثيلسيلوكساني (PDMS) قدم في هذه المخطوطة شفافة بصريا، والهواء نفاذية، يمكننا الثقافة الخلايا الحية داخل الجهاز ومراقبة سلوكهم النمو تحت مجهر. من الممكن أيضا لإنشاء الصغير ~ ممنوع مقياس نانومتر ب تقنية الطباعة الحجرية الناعمة9 باستخدام قوالب. هذه الميزات السماح لنا لدراسة قدرة استطالة نصيحة زراعة الخلايا النباتية في بيئة محصورة فعلياً.
في هذا العمل، نحن شيدت 1 ميكرومتر فجوات واسعة (4 ميكرومتر في الطول) في أجهزة موائع جزيئية وفحص قدرة أنابيب اللقاح على اختراق هذه العقبات المصطنعة التي أصغر بكثير من قطر أنبوب أسطواني حبوب اللقاح (حوالي 8 ميكرومتر). هذا منصة تجريبية تمكننا من تصور ردا على أنبوب اللقاح إلى ميكروجابس والتقاط الصور الوقت الفاصل بين الاستجابة، التي تتبع عملية التشوه للخلية. كما وضعنا أيضا ميكروديفيسيس التي يمكن استخدامها للتحقيق في القدرة على اختراق جذر الشعر وبروتونيماتا موس. ميكروديفيسيس عدة وردت حتى الآن تمكن من التصور من الجذر10،11،،من1213 وموس بروتونيماتا14 نمو النبات بدقة عالية. لدينا جهاز، سلسلة من القنوات نمو الشعر الجذر عمودياً متصلاً بدائرة نمو الجذري، وتسترشد كل جذر الشعر (حوالي 7 ميكرومتر في القطر) إلى قنوات فلويديك مع وجود فجوة واسعة 1 ميكرومتر. ونحن أيضا مثقف موس بروتونيماتا (حوالي 20 ميكرومتر في القطر) في ميكروديفيسي التي تحتوي على ميكروجابس للنظر في ردودهم على هذه الحواجز المادية. النهج القائم على موائع جزيئية المقترح الذي يسمح لنا باستكشاف قدرة مختلف نصيحة زراعة الخلايا النباتية على تمديد من خلال المساحات الصغيرة للغاية، لا يمكن دراستها بأي طريقة أخرى متاحة حاليا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تلفيق ميكروديفيسي PDMS لدراسة نمو أنابيب اللقاح وموس بروتونيماتا
ملاحظة: استخدمنا أداة التصويرية مسكلس لإعداد قوالب PDMS على رقائق السليكون. يتم حذف التفاصيل المتعلقة بتشغيل النظام في هذه المخطوطة. قد تستعمل أيضا تقنية الطباعة التصويرية قياسي9 استخدام النبائط لإنشاء قوالب PDMS الموصوفة في هذه المخطوطة.
- من أجل 11 غ خليط البوليمر قبل PDMS (الاستومر قاعدة: علاج عامل بنسبة 10:1) إلى كل العفن 4 بوصة.
- ديغا العفن إعدادها في الخطوة 1، 1 لمدة 20 دقيقة في فراغ غرفة.
- وبعد علاج عند 65 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة في فرن غير الحراري، قشر الطبقة PDMS قبالة العفن ولكمه ثقوب الوصول إلى القنوات فلويديك استخدام اللكمات خزعة.
ملاحظة: للجهاز أنبوب اللقاح، يجب ضبط حجم الحفرة تعكس قطر المدقة. ولذلك سوف تختلف هذه القيمة حسب الأنواع. في هذه التجربة، نحن لكمه ثقب 1 مم لمداخل المدقة وثقوب 1.5 مم للخزانات المتوسطة السائل. الجهاز بروتونيماتا موس، استخدمت ثقب 4 ملم للخزان عينة. - تعرض طبقة PDMS وطبق أسفل زجاج (3.5-5 سم في القطر) إلى الهواء البلازما لمدة 50 ثانية.
- اضغط طبقة PDMS في صحن أسفل الزجاج والحرارة عند 65 درجة مئوية مدة 30 دقيقة في فرن غير الحراري تماما إغلاق الشبكة موائع جزيئية.
2-تلفيق ميكروديفيسي PDMS لجذر الشعر
- كرر الخطوات من 1.1-1.3 باستخدام قوالب إعداد طبقتين PDMS للجذر وجذور الشعر ميكروديفيسيس.
ملاحظة: كنا ثقب 2 مم للخزانات المتوسطة السائل في ميكروديفيسي الجذر. - فضح كل طبقات PDMS الجوي البلازما لمدة 50 ثانية.
- تجميع طبقتين PDMS تحت ستيريوميكروسكوبي استخدام راصفة سطح مكتب حسب الطلب.
ملاحظة: يجب أن تواجه بعضها البعض ميكروتشانيلس على هذه الطبقات PDMS. قبل تجميع، تأكد من تطابق علامات محاذاة على حد سواء طبقات. - الحرارة عند 65 درجة مئوية مدة 30 دقيقة في فرن غير الحراري تماما إغلاق الشبكة موائع جزيئية.
- إزالة بكشف الغطاء عن ميكروديفيسي المشيدة ووضع الجهاز على طبق أسفل زجاج الذي 5 سم في القطر.
3-إعداد من "المتوسطة الثقافة الخلايا في المختبر" لأنابيب لقاح (فورنيري تورينيا)
- إعداد المتوسطة تعديل نيتش كما هو موضح مسبقاً15 والاوتوكلاف المتوسطة في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: يتم تكوين المتوسطة في نيتش موديفيد NH4لا3 (80 مغ/لتر)، كنو3 (125 مغ/لتر)، كاليفورنيا (لا3)2‧4H2س (500 مغ/لتر)، مجسو4‧7H2س (125 مغ/لتر)، خ2ص4 (125 مغ/لتر )، منسو4‧4H2س (3 مغ/لتر)، زنسو4‧7H2س (0.5 مغ/لتر)، ح3بو3 (10 مغ/لتر)، وخصصت4‧5H2س (0.025 ميلغرام/لتر)، غ2مو4‧2H2س (0.025 ميلغرام/لتر)، السكروز (50,000 مغ/لتر)، والكازين (500 مغ/لتر). ويمكن تخزين المتوسطة مستعدة عند 4 درجة مئوية لمدة 4 أشهر على الأقل. - إعداد 26% (w/v) البولي إيثيلين غليكول استخدام المياه يعقم وتصفية الحل مع عامل تصفية مسام 0.3 ميكرومتر.
ملاحظة: يمكن تخزين المتوسطة مستعدة عند 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد. - مزيج من الكواشف إعدادها في الخطوة 3.1 و 3.2 في نسبة 1:1 (v/v).
ملاحظة: هذا المتوسط ينبغي إعداد جديدة لكل استخدام.
4-الإعداد "المتوسطة الثقافة الخلايا في المختبر" لجذر الشعر (نبات التمويل)
- إعداد حل السكروز 1% (w/v) Murashige & سكوغ المتوسطة، 0.05% (w/v) مس، 0.215% (w/v)، واجار 1% (w/v) في المياه. اﻷوتوكﻻف الحل في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
5-إعداد من "المتوسطة الثقافة الخلايا في المختبر" "المعايير الأمنية التنفيذية الدنيا بروتونيماتا" (فيسكوميتريلا مفتوحة)
- قبل احتضانها بروتونيماتا موس في المتوسط16 بكدات في طبق بتري.
ملاحظة: يتم تكوين المتوسطة بكدات 1 مم MgSO4، 10 مم كنو3, 45 ميكرومتر FeSO4، 1.8 مم خ2ص4 (الرقم الهيدروجيني تعديلها إلى 6.5 مع كوه)، حل العناصر النزرة (0.22 ميكرومتر CuSO4، ميكرومتر 0.19 زنسو4، 10 ميكرون ح3بو 3و 0.1 ميكرومتر Na2مو4، 2 ميكرومتر الحركة2، 0.23 ميكرومتر كوكل2و 0.17 ميكرون كي)، كاكل 1 مم2، و 5 مم ثنائي الأمونيوم (+)-طرطرات. - الثقافة موس في المتوسط بكداتج في ميكروديفيسي.
ملاحظة: هو المتوسط بكداتج المتوسطة بكدات مع جلوكوز 0.5% (w/v). يمكن تخزين المتوسطة مستعدة عند 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
6-كولتورينج في المختبر من أنابيب اللقاح ت. فورنيري في ميكروديفيسي
- ضع ميكروديفيسي أنبوب اللقاح في فراغ غرفة وديغا لمدة 20 دقيقة.
- إزالة ميكروديفيسي من فراغ الغرفة وإدخال المتوسطة النمو إلى مدخل المدقة باستخدام ميكروبيبيتي مع تلميح جيد جداً. ملء الآبار المتبقية إلى قمم بهم مع المتوسط نفسها. انتظر لبضع دقائق حتى تمتلئ جميع ميكروتشانيلس المتوسطة بالفراغ الناشئ داخل ميكروتشانيلس.
- ضع بعض منشفة ورقية رطبة في الطبق أسفل الزجاج للمحافظة على درجة الرطوبة في الطبق.
- نقل حبوب اللقاح من نوع البرية زهرة فورنيري ت. 'الأزرق والأبيض' للوصم استخدام إبرة تشريح.
ملاحظة: نحن أيضا إجراء هذه التجربة مع المعدلة وراثيا فورنيري ت. 'ولي العهد البنفسجي' زهرة ( RPS5Ap::H2B-تدتوماتو خط17)، مع أنابيب اللقاح الذي يحتوي على الخلايا المنوية المسماة فلوريسسينتلي ونوى الخضري. - قص نمط بوليناتيد (1 سم) باستخدام شفرة.
- إدراج نمط قطع في المدخل للجهاز كما هو موضح في الشكل 2.
- وضع غطاء على الطبق وختم ذلك بالشريط.
- ضع الجهاز في حاضنة في 28 درجة مئوية ح 5-6 في الظلام.
7-كولتورينج في المختبر التمويل (أ) جذر الشعر في ميكروديفيسي
ملاحظة: ينبغي إجراء الخطوات 7.1-7.9 (باستثناء 7.3 و 7.5) في غطاء الاندفاق الصفحي.
- تعقيم البذور من التمويل (أ) كولومبيا (Col-0) والمعدلة وراثيا خط UBQ10pro::H2B-مكلوفير (التي تحتوي على العلامة النووي الفلورسنت) التي نقع عليها في سائل معقم (التبييض المنزلي 5% (v/v) و 0.02% (v/v) Triton X-100) لمدة 5 دقائق.
- دقة شطف بذور معقمة مع يعقم ماء.
- تخزين البذور مشطوف في الماء لمدة يومين في 4 درجات مئوية في الظلام.
- تعقيم ميكروديفيسي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بين عشية وضحاها.
- وضع في ميكروديفيسي في فراغ غرفة وديغا لمدة 20 دقيقة.
- أعرض المتوسطة النمو للآبار في الجهاز باستخدام ميكروبيبيتي. انتظر لبضع دقائق حتى يملأ الفراغ جميع ميكروتشانيلس مع المتوسط.
- يعقم مكان الرطب منشفة ورقية في الطبق أسفل الزجاج للمحافظة على درجة الرطوبة في الطبق.
- نقل بذور معقمة في مدخل الجهاز.
- وضع غطاء على الطبق وختم ذلك بالشريط.
- وضع الجهاز رأسياً في حاضنة عند 22 درجة مئوية تحت الضوء الأبيض مستمر.
- تحقق نمو الشعر الجذر بعد 4-10 أيام حضانة. الحصول على حقل مشرق والفلورسنت الصور باستخدام مجهر مقلوب.
8-كولتورينج في المختبر البراءات P. (موس) بروتونيماتا في الجهاز موائع جزيئية
ملاحظة: ينبغي إجراء الخطوات 8.2 8.6 (باستثناء 8.3) في غطاء الاندفاق الصفحي.
- بريكولتوري P. مفتوحة سلالة جرانسدين 200418 في المتوسط بكدات مغطاة السيلوفان في طبق بتري لمدة أسبوع تحت الضوء الأبيض مستمر عند 25 درجة مئوية.
- تعقيم ميكروديفيسي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بين عشية وضحاها في غطاء الاندفاق الصفحي.
- وضع في ميكروديفيسي في فراغ غرفة وديغا لمدة 20 دقيقة.
- أعرض المتوسطة النمو للآبار باستخدام ميكروبيبيتي. انتظر لبضع دقائق حتى يملأ الفراغ جميع ميكروتشانيلس مع المتوسط.
- إضافة يعقم المياه إلى الطبق المحيطة ميكروديفيسي للحفاظ على نسبة الرطوبة في الطبق.
- نقل قطعة صغيرة من الأنسجة بروتونيماتا موس إلى المدخل ميكروديفيسي والثقافة الأنسجة في حاضنة عند 25 درجة مئوية تحت الضوء الأبيض مستمر.
- تحقق نمو بروتونيماتا موس بعد 2-3 أسابيع حضانة. الحصول على الصور الميدانية مشرقة باستخدام مجهر.
9-الوقت الفاصل بين التصوير من "نمو أنبوب اللقاح" فورنيري ت.
- وضع في ميكروديفيسي على مجهر مقلوب fluorescence مجهزة بصورة اقتناء الأجهزة (على سبيل المثال.، كاميرا CCD) والبرمجيات. العثور على المواقع ميكروجاب.
ملاحظة: للبرنامج الحصول على الصور، استخدمنا منتج متوفرة تجارياً (جدول المواد). برمجيات المصدر المفتوح مجهرية مثل µManager هي أيضا متاحة على الإنترنت (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). نوصي بتثبيت مكثف مجهر على المجهر للحصول على الصور دقة أعلى. - التقاط الصور الميدانية مشرق كل 10 s باستخدام مجهر صورة اقتناء البرمجيات.
- أن تلتزم بالخلايا المنوية المسماة فلوريسسينتلي ونواة الخضري في أنبوب اللقاح من خط RPS5Ap::H2B-تدتوماتو ، يتهددها العينة مع 561 نانومتر الليزر واستخدام عامل تصفية ممر الموجه ضوئية (578/105 nm).
ملاحظة: على الرغم من أن تم القبض على الصور الوقت الفاصل بين نمو أنبوب اللقاح مرارا، لا يبدو التصوير تؤثر على النمو. ومع ذلك، ينصح دائماً التقليل من كثافة الليزر، ووقت التعرض، والفاصل الزمني للوقت الفاصل، للتقليل من الضيائية وفوتوبليتشينج من فلوروفوري. - ضبط السطوع والتباين من الصور وإعداد ملف فيديو باستخدام برنامج إيماجيج (https://imagej.nih.gov/ij/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كما هو موضح في الشكل 1، نصيحة زراعة الخلايا النباتية تواجه سلسلة من الحواجز المادية على طول على مسارات النمو في فيفو. تمكين موائع جزيئية في المختبر خلية ثقافة الأنظمة الأساسية المقدمة في هذه الدراسة الدراسة تنامي نصيحة عملية في ثلاثة أنواع من الخلايا النباتية (أنابيب حبوب اللقاح، وجذور الشعر، وبروتونيماتا موس) من خلال ثغرات اصطناعية 1 ميكرومتر (الشكل 3، الرقم 4و الشكل 5). لدراسة أنبوب اللقاح، استخدمت خلية يعيش تصوير لرصد التغييرات الشكلية في منطقة قمي أنابيب اللقاح، فضلا عن نواة الخضري وخلايا الحيوانات المنوية واستجابة لتواجه مساحة صغيرة للغاية (تكميلية الفيلم 1 و 2).
على الرغم من أن معظم ميكروجابس كانت ملفقة بنجاح باستخدام الطريقة الموضحة هنا، فقد لاحظنا أن عدد قليل منهم كانوا تماما مغلقة (الشكل 6). لأن قنوات واسعة 1 ميكرومتر النشر العفن السليكون الهشة، الاستخدام المتكرر لهذا القالب قد تضر الثغرات، مما يؤدي إلى فجوة حظر على طبقة PDMS. ولذلك، قبل القيام بالتجربة، من المهم التحقق من أن ميكروجابس PDMS سليمة.
رقم 1: اختراق متزايد نصيحة الخلايا النباتية إلى مساحات مقيدة فعلياً. (أ) أنبوب اللقاح التمطيط من خلال عدة حواجز مادية في طريقها إلى أوفولي. وتشمل الحواجز يحيل بها أنسجة المسالك في النمط وإينتيجومينتس المحيطة ميكروبيلي. (ب) جذر الشعر اختراق عن طريق التربة كثيفة. إظهار insets في (أ) و (ب) التوسعات في المناطق محاصر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: خصائص ميكروديفيسيس المستخدمة لدراسة أنابيب اللقاح ت. فورنيري و التمويل (أ) جذر الشعر بروتونيماتا P. مفتوحة . في رسومات تخطيطية ميكروتشانيلس، يتم وضع عينة في الموقع المشار إليه بعلامة نجمة (*). ويرد Microchannel التصاميم، صور فوتوغرافية لكل جهاز وهياكل القناة وخلية استزراع فترات. لقد تم تعديل هذا الرقم مع إذن من ياناغيساوا وآخرون. 19في عام 2017. مقياس بار، 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: ت. فورنيري أنبوب اللقاح استطالة من خلال فجوة 1 ميكرومتر. (أ) حبوب اللقاح أنبوب يمر عبر 1 ميكرومتر µm واسعة و 4 فجوة عالية. تم القبض على الصور الميدانية مشرق الوقت الفاصل بين استخدام مجهر مقلوب مجهزة بنظام القرص الغزل [كنفوكل]. مقياس بار، 20 ميكرومتر. (ب) الوقت الفاصل الصور نواة النباتي مسمى فلوريسسينتلي وخلايا الحيوانات المنوية في أنبوب اللقاح من RPS5Ap::H2B-تدتوماتو خط عبور في ميكروجاب. مقياس بار، 20 ميكرومتر. الشكل (أ) و (ب) قد عدلت بإذن من ياناغيساوا وآخرون. 19في عام 2017. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. استطالة الشعر الجذر (أ) التمويل من خلال فجوة 1 ميكرومتر. (أ) نمو الجذر وجذور الشعر في ميكروديفيسي. ميكروجابس (1 ميكرومتر في العرض) و 4 ميكرومتر في الطول الموجودة على الجانب الأيسر من قناة النمو الجذري. لا تحتوي على ميكروجابس ميكروتشانيلس على الجانب الأيمن ويمكن استخدامها كعنصر تحكم. مقياس بار، 100 ميكرومتر. (ب) مشرق حقل الأسفار (ج) و (د) دمج الصور من جذر الشعر مرورا ميكروجابس. تتم تسمية الأنوية في جذر الشعر فلوريسسينتلي في خط UBQ10pro::H2B-مكلوفير . يتم الإشارة إلى غيض الشعر الجذر كل سهم. مقياس بار، 30 ميكرون. تم تعديل هذه الأرقام مع إذن من ياناغيساوا وآخرون. 19في عام 2017. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5. استطالة بروتونيماتا P. مفتوحة من خلال فجوة 1 ميكرومتر. موس بروتونيماتا الخلايا العبور من خلال فجوة 1 ميكرومتر (4 ميكرومتر في الطول)، التي تم توسيع بسبب ضغط تورم بروتونيماتا. مقياس بار، 20 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم مع إذن من ياناغيساوا وآخرون. 19في عام 2017. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. إغلاق ميكروجابس. وزارة شؤون المرأة صورة المنطقة فجوة 1 ميكرومتر. ميكروجاب على اليمين مغلقة تماما. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الفيلم 1. نمو أنبوب اللقاح من خلال فجوة 1 ميكرومتر. تم القبض على الصور الميدانية مشرق الوقت الفاصل بين كل 10 s استخدام مجهر مقلوب مجهزة مجهر [كنفوكل] قرص غزل. مقياس بار، 20 ميكرومتر. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
التكميلية الفيلم 2. اختراق نواة الخضري وخلايا الحيوانات المنوية من خلال فجوة 1 ميكرومتر. تم القبض على الصور الميدانية والأسفار مشرق الوقت الفاصل بين كل 20 s باستخدام مجهر مقلوب fluorescence. مقياس بار، 20 ميكرومتر. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول يلزم اتباعها الضبط للحصول على النتائج المعروضة أعلاه. أولاً، السطوح PDMS الطبق أسفل طبقة والزجاج كلاهما يتعين علاجها بالبلازما لمدة كافية من الوقت قبل الربط. خلاف ذلك، قد فصل طبقة PDMS محلياً من سطح الزجاج بينما تعبر نصيحة زراعة الخلايا في ميكروجابس. آخر خطوة حاسمة في البروتوكول بروتونيماتا الشعر الجذر والمعايير الأمنية التنفيذية الدنيا من تعقيم ميكروديفيسي. عادة، جذر الشعر والخلايا بروتونيماتا موس بحاجة إلى مثقف في ميكروديفيسي أن يكون لبضعة أسابيع. دون تعقيم الجهاز، قد تزدهر الكائنات الدقيقة، التي يمكن أن تؤثر على نمو هذه الخلايا تنمو تلميح. تعقيم الجهاز أنبوب اللقاح ليست ذات أهمية حاسمة، منذ إبرام هذه التجربة خلال نصف يوم. ونحن قد تستخدم بانتظام الجهاز أنبوب اللقاح بدون تعقيم ولم يلاحظ أي آثار غير مرغوب فيها أثناء التجربة.
وينبغي تعديل تصميم microchannel وفقا للخلايا للفائدة. في عملنا، تم تصميم القناة المستخدمة لتجربة الشعر الجذر التمويل (أ) تختلف عن تلك المستخدمة لأنبوب اللقاح ت. فورنيري والتجارب بروتونيماتا P. مفتوحة . أجهزة مختلفة مطلوبة لأن العينات التي لها أبعاد مختلفة؛ على سبيل المثال، جذر الشعر أقصر بكثير من أنابيب اللقاح وبروتونيماتا موس. ولذلك، صمم لدينا جهاز جذر الشعر مثل أن كانت المناطق ميكروجاب المتاخمة للقناة الجذر الرئيسي. بالإضافة إلى تصميم القناة، ويختلف الإجراء لإعداد الجهاز الشعر الجذر أيضا من الإجراءات المستخدمة لأنابيب اللقاح أو بروتونيماتا موس. للدراسات بروتونيماتا أنبوب اللقاح والمعايير الأمنية التنفيذية الدنيا، كنا ميكروديفيسي التي تحتوي على طبقة واحدة PDMS مع ميكروتشانيلس مختومة ضد طبق أسفل زجاج. غير أن الجهاز المستخدم لدراسة جذور الشعر يضم طبقتين PDMS: الطبقة العليا مع microchannel (عمق: 200 ميكرومتر) للجذر الرئيسي هو مختومة ضد الطبقة السفلي، والتي تحتوي على ميكروتشانيلس (عمق: 4 ميكرومتر) لجذور الشعر. التقنية التصويرية القياسية التي تم استخدامها لافتعال العفن السيليكون يقتصر على نسبة العرض إلى الارتفاع لحوالي 5:1. ولذلك، خلق فجوة واسعة 1 ميكرومتر، ذروة القناة ستقتصر على حوالي 5 ميكرومتر. أنه يمثل تحديا تقنيا أيضا محاذاة قناة عميقة بشكل دقيق (مثلاً-، 200 ميكرومتر) بالقرب من 1 ميكرومتر الفجوة الواسعة في قالب سليكون. ولذلك، أعد PDMS طبقات منفصلة للشعر الجذر والجذر الرئيسي، وشيدت الجهاز بختم عليها معا.
في حين أن هذا البروتوكول قد استخدمت بنجاح لتصور تلميح تزايد عملية أنابيب اللقاح من خلال ميكروجابس (تكميلية الفيلم 1 و 2) والوقت الفاصل بين التصوير من جذر الشعر واستطالة بروتونيماتا موس في منطقة ميكروجاب سيكون أكثر تحدي. في ميكروديفيسي المستخدمة لاستزراع التمويل (أ) جذر الشعر، ارتفاع القنوات الجانبية ميكروجابس فيها يقع (4 ميكرومتر) ضحالة الكثير من ذلك في دائرة النمو الجذري (200 ميكرومتر)، حيث معظم جذر الشعر غير قادر على المضي قدما في القنوات الجانبية. حتى لو الشعر الجذر العثور على مدخل القناة الجانبية، من الصعب التنبؤ بها عند دخولها عليه. لالتقاط الصور الوقت الفاصل بين نمو الشعر الجذر في ميكروجاب، نوصي باستخدام مجهر مجهزة بمرحلة تلقائية التي يمكن برمجتها لتكون موجودة في مواقع متعددة للحصول على الصور. عندما لا تتوفر مثل هذه الأجهزة، فإننا نقترح البحث عن الشعر الجذرية التي دخلت بالفعل قنوات جانبية ولكن لم يعبروا بعد ميكروجابس. أن معدل النمو في التمويل (أ) جذر الشعر أبطأ بكثير (عادة 1-2.5 ميكرون في الدقيقة20) مقارنة بأنابيب اللقاح ت. فورنيري (عادة 22-23 ميكرون في الدقيقة19)، قد يكون من الممكن لالتقاط الصور الوقت الفاصل بين تلك الشعر الجذر التي على وشك عبور في ميكروجابس. من ناحية أخرى، تتطلب الملاحظات بروتونيماتا موس نظام الوقت الفاصل بين التي يمكن استخدامها حصرا لهذه الدراسة، نظراً لأن فترة مراقبة طويلة مطلوب نظراً لمعدل النمو البطئ.
أن النهج موائع جزيئية المعروضة هنا هو الأسلوب الأول الذي يسمح لنا بدراسة القدرة على نصيحة زراعة الخلايا النباتية تمديد عبر مسافات ضيقة للغاية. قد تكون هذه ميكروديفيسيس مفيدة لفحص فحوصات أن التحقيق في وظائف الجينات المرتبطة تخليق جدار الخلية الحيوي وسلامة زراعة نصيحة الخلايا من خلال قدرتها على الاختراق. وباﻹضافة إلى ذلك، دينيس وآخرون. 21 ثبت مؤخرا تمزق مغلف النووية وإصلاح إليه قبل عصر خلية سرطان عن طريق مكان ضيق أعدت في جهاز موائع جزيئية، وأنه قد يكون من الممكن لدراسة ما إذا كانت توجد إليه مشابهة في أنابيب اللقاح باستخدام موقعنا الجهاز. يمكن استخدام هذه المنصة التجريبية المطورة حديثا للتحقيق في الخلايا الفردية كيفية الاستجابة إلى مساحات مقيدة فعلياً، وقد يعزز فهمنا لآليات النمو تلميح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونحن نشكر تسوتسوي حاء ودال كوريهارا لتزويدنا بالنباتات المعدلة وراثيا، بما في ذلك خط ت. fournieriRPS5Ap::H2B-تدتوماتو وخط التمويل ألف-UBQ10pro::H2B-مكلوفير ، على التوالي. وأيد هذا العمل بالمعهد تحويلي بيو-الجزيئات جامعة ناغويا و "اليابان متقدمة شبكة علوم النبات". وقدمت الدعم المالي لهذا العمل بالمنح من اليابان وكالة العلوم والتكنولوجيا (منح المشروع ايراتو لا. JPMJER1004 ل T.H.)، معونات للبحث العلمي في مجالات مبتكرة (غ. JP16H06465 و JP16H06464 ل T.H.)، و "الجمعية اليابانية" لمعونة النهوض بالعلوم (JSPS) "البحوث الاستكشافية" الصعبة (منحة رقم 26600061 لنيويورك ومنحة رقم 25650075 و 15 ك 14542 Y.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
References
- Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
- Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. Obermeyer, G., Feijó, J. , Springer. 65-85 (2017).
- Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants. J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).
- Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. The turgor pressure of growing lily pollen tubes. Protoplasma. 198, 1-8 (1997).
- Vogler, H., et al. The pollen tube: a soft shell with a hard core. Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).
- Shamsudhin, N., et al. Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform. PloS one. 11 (12), e0168138 (2016).
- Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy. J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip. J Vis Exp. (65), (2012).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).
- Bascom, C. S., Wu, S. -Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. Long-Term Growth of Moss. in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).
- Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri. Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).
- Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis. DNA Res. 7, 9-17 (2000).
- Maruyama, D., et al. Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes. Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).
- Rensing, S., et al. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science. 319, 64-69 (2008).
- Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps. Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).
- Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 120, 2465-2474 (1994).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
